Summary
여기서 설명하는 낭포 성 섬유증에 결함이 클로라이드 채널에 대한 활성을 유지 정제 야생형 및 돌연변이 CFTR 단백질의 기능적 재구성을위한 신속하고 효율적인 절차이다. CFTR 의해 매개 재구성 테오에서 요오드화 유출 채널 활성의 연구 및 작은 분자의 효과를 허용한다.
Abstract
낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 레귤레이터 (CFTR)는 수송의 카세트 (ABC) 상과 바인딩 ATP의 고유 채널 형성 부재이다. CFTR의 인산화 및 뉴클레오티드 종속 클로라이드 채널 활성은 전 세포 자주 시스템 및 절제된 막 패치에서 단일 채널로 검토되고있다. 많은 낭포 성 섬유증을 유발하는 돌연변이 활성이 변화하는 것으로 나타났다. 정제 프로토콜 소수 게시되었지만, 채널 활성을 유지 빠른 재구성 방법 및 정화 시스템에 인구 채널 활동을 연구하기위한 적절한 방법이 결여되어있다. 여기서 빠른 방법 규제 할라이드 채널로서의 활성을 보유 정의 지질 조성물의 테오로 정제 및 전장 CFTR 단백질의 기능적 재구성을 위해 설명된다. 함께 채널 활성의 신규 한 플럭스 계 분석법이 재구성 방법에 적합한 시스템이다야생형 CFTR의 인구 채널 특성 및 질병을 일으키는 돌연변이 F508del- 및 G551D-CFTR 공부. 구체적으로, 상기 방법은 인산화, 뉴클레오티드 및 CFTR 채널 활동에 강화제와 같은 작은 분자 억제제의 직접적인 영향을 연구하는 유틸리티를 갖는다. 방법은 또한 음이온 기판 다른 막 채널 / 수송의 연구 의무가 있습니다.
Introduction
폐, 대장, 췌장 및 땀 분비 등의 조직에서 상피 세포의 세포막에 걸쳐 염화 수송은 주로 ABC의 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 레귤레이터 (CFTR), ATP- 인산화 조절 부재 (ATP-에 의해 매개된다 검토 한 막 단백질의 카세트) C 아과 ()를 바인딩. ABCC 서브 패밀리의 다른 구성원과 마찬가지로, CFTR는 뉴클레오티드 결합 도메인은 단일에 적당한 ATP 아제 활성을 갖는다 (NBDs)의 계면에서 형성된 2 개의 뉴클레오티드 결합 부위에서 ATP 결합 큰, 멀티 - 스패닝 막 관통 단백질 인 사이트. 그러나 다른 ABCC 아과 멤버는 달리, CFTR는 고유의 규제 CL 채널로보다는 활성 용질 수송로 진화하고있다.
morbi로 이어지는 CFTR 원인 낭포 성 섬유증, 폐, 위장관, 췌장 및 생식 기관을 포함한 여러 장기에 영향을 미치는 질병의 돌연변이,젊은 성인에서 dity과 사망률. 폐 질환은 일반적으로 전도성의기도 상피 표면에 CFTR 기능의 손실에 의해 발생 낭포 성 섬유증의 조기 사망에 대해 대부분의 경우에 차지한다. 호흡 섬모 상피의 선 단면 상에 유체 층을 수정 상피 표면을 가로 질러 물 운동 - CFTR 클로라이드 채널 활동의 부족 모두 CL의 감소를 야기한다. 이는 호흡 섬모 상피 세포의 기능을 손상 점성기도 표면 액체 초래기도 밖으로 효과적으로 병원체 클리어. 결과적으로, 대부분의 환자는 CF 폐 염증 및 감염으로 인한 폐 손상의 재발 발작 겪는다.
예상 한 바와 같이, 통상 CFTR 단백질의 작용 기전에 대한 연구는 주로 그 채널 게이팅 전기 생리 활성의 상세한 연구에 초점을 맞추었다. 단일 채널 연구 PKA 의존 CL 직접적 CFTR 그 기능을 보여 주었다- ATP 규제 게이트 2를 보유 채널. 연구되었다 특정 단일 채널의 특성 때문에 전체 CFTR 채널들의 모집단과 단일 채널의 반사 있는가에 대해 상세한 전기 생리학 연구 단일 CFTR 채널 1,3에 많은 정보를 제공하지만 우려가있을 수있다 결과는 항상 거시적 인구를 공부하는 방법과 함께 고려되어야한다. 정제 CFTR의 인구 채널 활동을 직접 분석은 질병 유발 돌연변이와 연관된 분자 결함에 대한 통찰을 제공하는 화학 조절제 수리 CFTR 돌연변이 단백질의 발견을 구동 할 수있는 잠재력을 갖는다. 현재까지, 낭포 성 섬유증 (4)을 야기하는 것으로 생각 CFTR 1,900 상이한 돌연변이 초과있다. 북미와 유럽에서 환자의 약 90 %에서 적어도 하나의 대립 유전자에서 발견 된 주요 돌연변이, F508del-CFTR은 단백질을 미스 폴딩 리드소포체 5 차 보유. F508del-CFTR은 결함이 채널 활동 6-9를 포함하여 다른 결과를 가지고 있습니다. 세포 표면에서 CFTR의 생성 부재 중증 질환과 연관된다. G551D-CFTR, 덜 일반적인 돌연변이가 제대로 아직 접힌 세포 표면 (6)에 염화 채널로 기능 장애하다 생각된다. 소분자 보정기 및 강화제의 개발은 각각 세포 표면 상에 존재하는 폴딩 및 / 또는 세포 표면에 F508del-CFTR 같은 돌연변이 매매 및 - 증대 보정이나 G551D 같은 돌연변이 채널 활성을 증가시키는 목적을 갖는다 . 150 mg의 CF 환자> 육년 적어도 하나의 G551D와의 모든 12 시간에서 사용되는 VX-770) 보정기 VX-809과 VX-661 (아직 환자에 사용하기 위해, 강화제 Kalydeco (ivacaftor을 승인하지 않은 상태 -CFTR 돌연변이, 그리고 최근 환자 G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255P 중 하나및 G1349D. Kalydeco CF는 질환의 임상 열 대책이 작은 분자의 작용하지만 저조한기구에 사용하기위한 환자의 FDA 승인시의 이해되었다 안전하고 개선 결과 모두이다.
CFTR 정제 방법 중 소수의 완료 이전에 상당한 시간을 필요로하는 많은 어느 2,11-18을 설명되었다. 최근 출판 (19), 고유 신속한 정제 및 재구성 방법은 S의 F 9 세포 발현 시스템에서 과발현 CFTR에 기술하고, 정의 된 지질 시스템에서 정제 된 단백질은 CFTR의 인구 CFTR 할라이드 채널 활성 분석법을 개발하는 데 사용 된 분자. 분석은 CFTR 기능에 인산화, 뉴클레오티드 억제제의 알려진 효과를 되풀이. 시스템의 강화제의 효과 심문을 사용 하였다 VX-770 / Kalydeco는 중량 (야생형)에, 그리고 F508del- G551D-CFTR 그리고 제 보여주는 바와약물에 인구의 관점에서 CFTR 및 뉴클레오티드와 작은 분자와 돌연변이의 상호 작용의 연구에 이러한 방법의 유용성과 적용 가능성을 입증, ATP 독립적 인 방식으로 자사의 채널 활동을 강화시키는 데 CFTR 단백질과 직접 상호 작용 시간 단백질에 대한 임상 적 질문에 대한 답변. 방법은 또한 다른 분자 강화제 및 이들의 유도체 (20)뿐만 아니라, 단백질의 활성 (21)에 작은 분자 보정기의 효과를 연구하기 위해 사용되었다.
유출 분석은 이전에 전극, 방사성 트레이서 형광체 (22, 23)를 사용하여 전체 세포 분석법, 이온 선택성 전극 (24)과 막 소체 포함 CFTR 돌연변이 활성 및 그 활성에 CFTR - 조절 성 화합물의 효과를 조사하기 위해 많은 연구에서 사용되어왔다 , 방사성 추적자 (25) 재구성 CFTR을 정제 하였다. 그러나 토륨정제 재구성 CFTR을 연구하는 이온 선택성 전극의 전자 사용은 먼저 최근 19보고되었다. 현재의 방법은 적응 재구성 녹농균, 공통 CF 병원균 두 막 단백질의 기능적 특성화를 위해 사용되어왔다. 요오드화 유출 측정과 결합 그래피 ALGE 외막 단백질의 재구성이 음이온 수송 체 (26)를 통해 알긴 분비 모델을 지원하기 위해 사용되었다. 재구성 요오드 유출 측정 모델 (27)에 의해 단백질이 세균 내막 걸쳐 지질 결합 당사슬 전좌에 대한 H + antiport 의존적 메카니즘을 제시한다고 제안 될 수 Wzx 단백질 정제에 적용 하였다. 하나는 기본 기판 예상보다 두 경우 요오드화 낮은 스루풋이라도 음이온 기판 용 대용으로 사용 하였다. 이 방법은 C와 다른 단백질에 대한 적응에 적합 할 수있다음이온 기판에 대한 ationic 전송 또는 전도 경로.
여기서 빠른 정제 절차 CFTR 단백질 및 지질의 정의 테오으로의 재구성을 위해 설명된다. 신속한 재구성 절차를 용이하게 정제에 사용되는 세제의 종류 여기에서 사용 된 방법에 의해 제거 의무 또는 재구성 절차 전에 적합한 세제 교환 될 수 있음을 제공하는 다른 방법으로 정제 CFTR 함께 사용하도록 맞추어 질 수있다. 정제 및 재구성 CFTR 단백질의 채널 활성을 측정하는 요오드화 유출 방법은 상세하게 설명되고,이 방법으로부터 얻을 수있는 몇 가지 전형적인 결과가 제시된다.
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Protocol
CFTR 1. 정제
참고 :이 프로토콜에 사용되는 장비 및 재료의 목록은 재료 표 및 장비를 참조하십시오. 상세한 프로토콜은 S F 9의 바쿨로 바이러스 발현 계에서 인간 17,28 WT-CFTR의 과발현 돌연변이 체에 대한 필요성이 존재한다. CFTR 과발현이 프로토콜에 따라 S f를 9 세포의 알약을 준비합니다.
- 원유 막 준비
- 신선한를 구하거나 표준 세포 배양 방법에 의해 성장, 과발현 C- 말단 그의 10 -tag와 wildtype-, F508del-, 또는 G551D-CFTR 단백질을 세포의 500ml의 문화에서 냉동 S F 9 세포 펠렛을 해동, 로 이전 17,28 설명했다. 세포 펠릿을 약 5 ml의 부피와 약 5g의 습윤 중량을 가질 것이다.
- 재현 탁의 S f를 보장 4 ° C에서 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 인산염 완충 생리 식염수 20 ㎖ (PBS)의 pH 7.4 (1 태블릿 50 mL 당) 9 셀,샘플은 시각적으로 균일 나타나고 세포의 어떤 덩어리가 남아 있지.
- 통로 당 2 분 동안 10,000 PSI (바람직하게는 15,000-20,000 PSI)의 최소 도달 고압 셀 장애 물질 (재료 및 장비 표)를 사용하여 세포를 Lyse. 용해 동안 4 ° C에서 샘플을 보관하십시오.
- 즉시 세포 장애 물질의 샘플을 다시 용해 기간 후 얼음에 튜브 샘플을 수집합니다. 반복 용해 과정 3 회. 10 % 이하가 잔류되도록 현미경으로 조사한다.
주 : 등 유리 비드와 같은 다른 방법으로 용해하는 세포는 엄격하지만, 사용자가 다른 방법이 적합 찾을 수이 시스템에 대해 검사되지 않았다.
- 즉시 세포 장애 물질의 샘플을 다시 용해 기간 후 얼음에 튜브 샘플을 수집합니다. 반복 용해 과정 3 회. 10 % 이하가 잔류되도록 현미경으로 조사한다.
- 20 분 동안 2,000 XG에 고속 원심 분리기에서 4 ℃에서 원심 분리 세포 용해 물질. 상층 액을 수집하고 펠렛 폐기하십시오. 20 튜브들 사이에서 뜨는을 나누고 ultracen 테이블 상단에 125,000 XG에서 4 ° C에서 1 시간 동안 원심 분리trifuge.
- 제거하고 사용까지 2 이하 개월 -80 ° C에서 같은 튜브에 펠릿 및 저장 펠렛을 방해하지 않도록주의, 상층 액을 제거, 또는 얼음에 보관하고 즉시 정화를 계속합니다.
- CFTR 가용화
- 1-4 신선 또는 냉동 S f를 9 원유 막 알약을 얻고 버퍼 1 1 ㎖의 각을 재현 탁 (2 % FOS -choline, 완벽한 조리법에 대한 표 1 참조) 얼음에 4 ° C에서 25 G 바늘과 1을 사용 용액까지 ㎖를 주사기를 볼 세포막 덩어리없이 눈으로 균질하다. 하나 이상의 펠릿 용해되고있는 경우, 단계 1.3.2에서 샘플을 풀링, 병렬로 아래에 하나의 펠렛에 대한 지침에 따라 각 샘플을 치료하기 위해 계속합니다.
- 1 버퍼 2 ml의 1 미니 프로테아제 억제제 정제를 용해 (10 mM의 이미 다졸, 표 1 참조) FOS -choline (14) 세제를 결여 한 (단백질 분해 효소 억제제는 10 배 더 콘센트입니다이 시점에서 자신의 권장 희석보다 평가) 및 재현 탁 원유 막 펠렛 100 μl를 (단백질 분해 효소 억제제는이 시점에서 자신의 권장 희석에있다)를 추가합니다. 반전에 의해 5 시간마다 5 분을 혼합하여 45 ~ 60 분 동안 얼음에 설정합니다.
- 원심 분리기는 125,000 XG, 4 ℃에서 25 분 동안 테이블 위에 초 원심 분리기에 원유 막 펠렛을 재현 탁. 용해 된 CFTR이 포함 된 상층 액을 유지하고 펠렛을 폐기합니다.
- 열 바인딩, 인산화 및 용출
- 니켈 - NTA (니트릴 로트리 아세트산) 아가로 오스 슬러리 또는 버퍼 2 1 ml의 동등한 수지의 400 μL 세척 (10 mM의 이미 다졸을, 표 1 참조) 세제를 결여되는 용매 제거하고 4 ℃에서 버퍼링. 반복 세척 두 번 더.
- (10 mM의 이미 다졸, 표 1 참조)를 버퍼 2로 10 ㎖의 총 가용화 CFTR, 나머지 프로테아제 억제제 (900 μL) 및 니켈 수지 (400 μL 슬러리로부터)을 겸용 wHICH는 추가 세제 없다. FOS -choline 14 농도는 효과적으로 (W / V)이 단계에서 0.2 %로 희석된다. 다수의 튜브가 있으면 가용화 CFTR, 프로테아제 저해제, 니켈 NTA 수지 0.2 %를 함유하는 모든 샘플을 풀 (W / V) -choline FOS-14이 때. 부드러운 흔들림 4 ° C에서 60 분 동안 품어.
- 작은 선별 열 (표 1) 또는 이와 동등한 빈 열을 CFTR 프로테아제 억제제 - 니켈 NTA 솔루션을 전달합니다.
- 버퍼 3의 초기 펠릿 당 4 ml로, 열에서 유지되는 니켈 NTA 수지, 세척 (10 mM의 이미 다졸 + DDM을, 표 1 참조) FOS -choline (14)이 부족하지만, 1 mM의 DDM (도데 실 말토 세제)를 포함, 4 ° C에서. DDM 세제의 추가는 크게 버퍼의 pH를 변경하지 않습니다.
- 2,500 단백질 키나제 촉매 서브 유니트의 cAMP 의존성의 U (P 25 μL를 MgATP (5 mM의 최종 농도)을 첨가함으로써 PKA-MgATP 솔루션을 준비표 1 참조) 칼럼, 버퍼 3 (10 mM의 이미 다졸 + DDM의 475 μL에 KA). 캡 또는 파라 필름 컬럼의 하단을 밀봉하고, 사용 된 각 초기 펠릿 PKA-MgATP 용액 500 μl를 첨가하여 단백질을 인산화.
- PKA는 니켈 NTA 수지의 전체 표면에 닿아 서되도록 부드럽게 혼합하고 1 ㎖의 피펫마다 2 분을 사용하여 수지의 부유로 20 분 동안 실온 (20 ℃ 온도) 부화.
- 캡을 제거하고 열에서 PKA / MgATP 솔루션을 용출. 버퍼 3의 2 ㎖로 열을 씻으 (10 mM의 이미 다졸 + DDM; 표 1 참조) 4 ° C에서.
- 허용 컬럼 완충액 4㎖를 첨가하여, 12 ° C에서 (표 1 참조 50mM의 이미 다졸 + DDM) 완충액 4 ㎖가이 번호 4. 세척 컬럼으로 실험에 사용 된 펠릿의 수를 곱 이 컬럼에 다음 4 mL를 추가를 통해 즉시 흐름합니다.
- 10 ml의 버퍼 (6)의 전체에, 이러한 재료 및 장비 또는 다른 유사한 장치의 표와 같이 (100,000 분자량 컷오프) 원심 분리 필터 장치를 이용하여 이미 다졸 및 저 분자량 저하 제품을 제거하는 단백질 샘플을 농축시켜 (75 mM의 KI + DDM는, 표 1 참조 2,000 XG에서 원심 분리하여,)와 4 ° C (예 : 비 요오드화 유출 실험에 대한 버퍼 7, 25 mM의 HEPES + DDM 표 1) 또는 1 mM의 DDM을 포함하는 선택의 다른 버퍼를 참조 샘플까지 약 20 분 200 μL에 집중하고 있습니다. 10 ml의 샘플을 희석 농도 단계를 반복합니다.
참고 : 우리의 경험에서 (미 출판), 이미 다졸 크게 INHICFTR의 ATP 아제 활성을 비트와 샘플 기능 측정에 사용되는 경우의 두 배 이상 희석 및 농축하여이 단계에서 제거되어야한다. - 농축 정제 CFTR를 수집합니다. 1~2일 내에서 사용할 때까지 DDM 버퍼의 존재에 4 ° C에서 보관 또는 재구성 단계로 즉시에 계속. 우리가 감소 활동을 관찰 우리의 경험에서와 같이 정제 된 단백질을 고정하지 마십시오.
CFTR의 2의 재구성
- 지질 준비
주 : CFTR 성공적 에그 PC, POPC으로이 재구성 한 내용 : 1 달걀 PC (w / w) : POPC (1 : 1 w / w) 혼합물, 또는 PE의 혼합물 : PS : PC : 에르고, 5 : 2 : 2 : 1 (w / w).- 요오드화 유출 실험 건조 에그 PC 5 ㎎ 들면 파이렉스 또는 다른 견고한 (비 붕규산 실온에서 20 분 동안 아르곤 기체 스트림하에 (25 ㎎ / ㎖ 스톡 200㎕를, 재료 및 장비의 표 참조) ) 유리관.
- 280 nm에서 흡광도를 사용하여, ELISAssay 또는 다른 방법은, 정제 된 CFTR 단백질 시료의 농도를 추정한다. 하나의 지질 비율 : 300-1 : 3000에 충분한 신호를 생성하기 위해 (w / w) 야생형 CFTR와 요오드화 유출 실험을 위해, 단백질을 사용한다. 유출 활성을 검출하기 위해 1,200 (w / w) : 200-1 : 1 정도의 비율 지질 : G551D- 및 F508del-CFTR 들어, 단백질을 사용한다.
- 각각의 특정 시스템에 대한 지질 비율 : 단백질을 최적화합니다. 필요한 정제 된 단백질의 양을 계산한다. 버퍼의 부피 = (필요한 단백질 용액의 부피) - 1 ㎖, 즉, 1 ml의 최종 부피를 위해 필요한 1 ㎜ DDM와 버퍼의 양을 계산한다.
- 건조 된 지질을 1 mM의 DDM으로 원하는 버퍼 시스템의 볼륨을 추가 계산 (그러나 이때 CFTR 단백질을 추가하지 않는 것) 파라 필름 유리관을 커버. 요오드 유출 실험을 위해, 버퍼 (6) 지질 재현 탁 (75 mM의 KI + DDM을, 표 1 참조). 다른 실험은 버퍼 8 재현 탁를 들어 (25 mM의 HEPES + DDM 참조표 1) 또는 1 mM의 DDM을 포함한 다른 원하는 내부 버퍼.
- 실온에서 2 분 동안 와동 DDM 버퍼 지질의 현탁액에 도움. 이와 달리, 전 텍싱 1-2 분 동안 37 ° C까지 샘플을 가열한다.
- 더 리피드 필름 튜브의 측면에 보이지 않을 때까지 1ml의 주사기 25 G 바늘을 실온에서 반복적 지질 서스펜드. 미세한 기포를 생성 및 요오드화 지질의 산화에 도움 것이다 용액에 공기를 주입하지 마십시오.
- 파라 필름의 중단 지질 목욕 초음파기 포함 얼음에 20 초 버스트에 대한 튜브를 적용 초음파 처리 한 후 1 분 동안 얼음에 바로 전송할 수 있습니다. 3 번 반복합니다.
참고 : 강렬한 초음파 산화로 인해 노란색 요오드 솔루션을집니다. 따라서 과도한 초음파을 피하십시오. 색상 변경에 대한 샘플을 모니터링합니다. 색상 변화가 주목되는 경우, 샘플을 폐기하고 다시 준비. 때문에 일부의 산화 색상의 변화요오드화 동일한 조건에서 지질의 산화를 초래할 것이다. 솔루션 초음파를하기 전에 아르곤 가스 튜브의 공기를 변위하는 지질과 요오드의 산화를 방지하는 데 도움이됩니다. 강렬한 초음파의 품질이 좋지 또는 샘플의 손실이 발생 긁힌 유리 튜브를 중단 할 수 있습니다. - 1 ml의 최종 부피를 달성에 초음파 지질 샘플 단계 2.1.3에서 계산 된 정제 CFTR의 볼륨을 추가합니다. 25 G 바늘과 1 ml를 주사기로 재 부상 10 회 지질 및 세제 용액으로 단백질을 섞는다.
- 튜브의 소용돌이와 함께 30 분 동안 얼음에 설정 지질과 단백질 샘플은 5 시간 5 분마다 혼합합니다.
- 세제 결합 열 준비를
- 1 ml의 볼륨 용량의 단일 사용 상업 세제 결합 스핀 열 (재료 및 장비의 표 참조)를 얻어 열이 흐르는 시작 하단 탭을 휴식.
- 저장 B를 제거하기 위해 2,000 XG에서 2 분 동안 열을 원심 분리기uffer는,이 버퍼를 폐기합니다.
- 버퍼 (7)의 5 ㎖ 추가 컬럼 (75 mM의 KI를, 표 1 참조) 한 후 세척 완충액을 용리 4 분 동안 200 XG 원심 분리기. 저장 버퍼의 모든 흔적을 제거하는 세척의 3 단계를 총 2 회 더 반복한다. 모든 흐름을 통해 폐기하십시오.
참고 : 열을 세척하는 데 사용되는 버퍼가 DDM 또는 다른 세제를 포함하지 않는 것이 중요합니다. 열은 세제 유한 결합능을 가지고 있으며, 세제를 함유하는 완충액을 사용하는 경우, 열은 단백질 - 지질 세제 샘플로부터 세제를 제거하는 데 효과적 일 것이다. - 조심스럽게 열 수지의 상부에 세제의 지질 단백질의 모든 샘플을 1ml의 분취 실온에서 2 분 동안 열 상단 샘플을 배양한다.
- 2000 XG에서 4 분 동안 실온에서 원심 분리 샘플을 깨끗한 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 또는 제 2 튜브에서 흐린 proteoliposome 샘플 또는 유리관을 수집하고 SAM을 배치얼음에 있도 록.
- 칼럼의 상부에 200 ㎕의 버퍼 (7) (75 mM의 KI, 표 1) 또는 (세제)없이 다른 버퍼를 첨가하여 컬럼에 잔류 테오 모아서 2 분 동안 원심 분리 단계를 반복한다.
- 이 흐린 보이는 경우 proteoliposome 샘플에 두 번째 용출액을 추가합니다.
- 밤새 4 ° C에서 샘플을 보관 또는 요오드 유출 측정을 위해 즉시 사용할 수 있습니다.
정화, 재구성 된 CFTR 3. 요오드 유출 측정
- proteoliposomal 막에서 요오드화 그라데이션의 생성
- 버퍼 (9)에 사전 팽윤 세파 덱스 G50 비즈 (약 5 g 건조 비드 50 ㎖ 완충액) 또는 원하는 외부 버퍼 실온에서 적어도 2 시간 동안 또는 4에서, (75 mM의 K-Glu가 칼륨 글루타메이트, 표 1 참조) 밤새 C를 °.
- 버퍼 포화 9 넷 세파 덱스 G50 컬럼을 준비 또는 다른 (K-75 mM의 글루을, 표 1 참조)¾ 적어도 열 전체 수지를로드하여 작은 심사 열의 버퍼.
- 수지의 과도한 버퍼를 제거하기 위해 2,000 XG에서 4 분 동안 원심 분리기. 원심 분리 단계의 끝에 컬럼에 충전 수화 된 수지의 약 2.25 ml를이 있어야한다.
참고 : 수지가 가볍게 수화하지만 액체에 담근 다음 간단한 스핀 버퍼의 상당한 볼륨을 용출 안되지해야합니다. 따라서, 칼럼 수지도 너무 젖은도 너무 건조하고, 사용자가 가장 성공적인 버퍼 교환 조건 숙지하기 위해 열을 실험 할 수도있다 proteoliposome 샘플의 성공적인 용출 중요하다. - 조심스럽게 2,000 x g에서 4 분 동안 각 컬럼 및 원심 분리기의 상단에 proteoliposome 샘플의 125-150 μl를 추가합니다.
- 풀 proteoliposome는 요오드 유출 또는 다른 실험에서 즉시 사용할 수 있도록 함께 용출액.
주 : 각 컬럼에서 용출 된 볼륨은 대략해야150 μL 샘플은 다소 흐린하지만, 원래의 샘플보다 흐린해야합니다. 큰 볼륨이나 명확한 용출액은 열이 충분히 건조되지 않은, 또는 너무 많이, 각각 건조되었으며, 성공적인 요오드 유출 실험이 유발되지 않음을하는 것이 좋습니다.
- 요오드 유출 분석
- 광범위하게 탈 이온수와 (재료 및 장비 표) 요오드화 선택적 미세 전극을 세척 한 다음 버퍼 (10)의 실험 전에 20 분 동안 품어 (15 μM KI, 표 1 참조). 탈 이온수로 다시 광범위하게 전극을 세척 할 것.
- 버퍼 9 (분석에서 10 μM의 최종 농도를 생성하기 위하여 20 μM 전형적인 농도) 약 150 μl를 추가 96- 웰 플레이트의 한 웰에 완충액 9 또는 비히클 (75 mM의 K-의 Glu가, 표 1 참조) 작은 벼룩 교반 막대와.
- 현재 기포가 없는지 확인합니다. 길잃를 제거하기 위해 피펫 팁을 사용하여거품. 약액이 사용되는 경우, 웰의 최종 DMSO 농도는 ((대표적으로 0.1-0.2 % V / V))로 1 % 이하 (V / V)인지 확인.
- 버퍼 9의 섹션 3.1에서 생성 된 재구성 CFTR 단백질 150 μL를 추가 플레이트의 웰에 300 ㎕의 총 부피를 생성하기 위해, 약물 또는 완충액 웰 (75 mM의 K-의 Glu를, 표 1 참조).
- 볶음 접시에 96 웰 플레이트를 놓고 130 rpm에서 (또는 약 ¼ 최대 속도의 완만 한 속도로) 약동하십시오.
- 조심스럽게 끝이 아니라 하단을 터치하지 않거나 교반 막대 박히는 있도록 샘플 우물에 요오드화 선택성 전극의 끝 부분을 삽입합니다. 기준 전극은, 별도의 경우, 잘 용액과 접촉도 있는지 확인합니다.
- 전극과의 인터페이스가 집에서 만든 또는 상업용 컴퓨터 프로그램을 사용하여 기록 트레이싱 (자세한 재료 표 및 장비 참조).로우 패스 필터를 통해 신호의 필터링이 Hz의 샘플링 레이트를 사용한다.
- 샘플을 촬영하면서는 평평한, 또는 가까운 평면 기준을 생산하는 5 분 동안 평형을 허용합니다.
- 3 μL MgATP (KOH와 dH보다 2 O에서 준비하고 pH를 7로 조정 100 mM의 주식을 1 mM의 최종 농도) 추가 샘플이 단백질을 활성화합니다. ~ 5 분 안정된 새 기준에 도달 할 수 있습니다. 항상 외부 버퍼의 pH의 변화를 방지하기 위해 사용하기 전에 중립에 100 mM의 MgATP 주식의 pH를 조정합니다.
- CFTR을 통해 요오드화 선택적 전도에 의해 생성 된 전위차의 변화를 션트 샘플 (20 nM의 최종 농도 2 μM) 주식을 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 3 μl를 추가합니다. 5 분 이상으로 인해 CFTR 매개 요오드 유출 활동의 감소 기울기 (MV 감소)을 기록한다.
- , proteoliposome 루멘의 요오드화 트래핑이 충분 있도록 10 %의 3 μl를 추가하려면 (v / v)의 트리톤 X-100 샘플. Significant 즉시 요오드화 자료는 충분한 요오드가 트래핑하는 3.2.9 결정 기울기의 변화가 아니라 CFTR 중재 활동에 대한 제한 요인이 아니었다하도록 소포에 갇혀되었음을 나타냅니다.
- 이 시약의 모든 흔적이 다음 샘플의 오염을 방지하기 위해 제거 된 확인하기 위해 약물 또는 트리톤 X-100과 샘플의 치료 후 탈 이온수로 깨끗이 전극과 교반 막대를 씻으십시오.
- 완충액 나노 몰 범위 9 마이크로 KI 묽은 농도의 일련의 준비 (K-Glu가 버퍼, 표 1 참조). 제조 높은 농도 0 내지 각 농도 전극의 MV 반응을 기록한다. 프로브 응답 (MV)를 몰 농도의 요오다 이드 대 로그 플롯 표준 곡선을 작도. 릴리스 요오드화 농도 유출 실험 동안 프로브 응답 MV 변환 표준 곡선을 사용한다.
참고 : 교정 똥개 준비사용자가 확신 할 때까지 매주 적이 얼마나 빨리 변경 프로브 응답. 시간에 따른 프로브 응답 및 감도 편차가있을 것이다. 프로브 노화되므로, 반응은 저하된다. 이것은 부분적으로 주기적으로 변화하는 내부 솔루션을 사용 후 물에 프로브 팁의 광범위한 세정, 표면에 프로브 분자의 부착 가능성 한계에 의해 폐기 될 수있다. - MgATP의 추가 전에 마지막 30 초 동안 각 proteoliposome 샘플에 대한 시간 플롯 대 농도의 라인의 평균 기울기를 결정하고 발리 노마 이신 (Valinomycin)을 첨가 한 후하지만 트리톤 X-100을 첨가하기 전에. 그 샘플에 대한 CFTR 매개 요오드 유출 행동을 결정하기 위하여 발리 노마 이신 (Valinomycin)에서 기준 기울기를 뺍니다.
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Representative Results
이 기록 문서에 설명은, 정화 재구성 및 CFTR 단백질의 조절 채널 활동을 측정하는 방법이 있습니다. 1a는 정제, 재구성 및 요오드화 유출 절차에 대한 워크 플로우를 보여줍니다. 요오드화 플럭스에 의해 재구성 된 채널 활동 및 측정을위한 방법이 또한 관련 영상보다 상세히 도시되어있다.
테오에 CFTR의 정제 및 재구성
CFTR 기능적 S f를 높은 수준에서 중량 또는 돌연변이 CFTR의 cDNA (2)를 포함하는 재조합 배큘로 바이러스를 사용하여 9 세포를 표현할 수있다. 하지 포유류 발현 시스템이지만, CFTR 표현의 수준을 높일 수 S F 9의 세포를 바쿨로 바이러스 발현 시스템을 사용 하였다. CFTR 생산은 총 세포 단백질 17,28 1 %만큼 높을 수있다. 바쿨로 바이러스 시스템 9- F S는 당화 단백질과 코어 인 이점을 갖는다이 시스템에서의 품질 제어와 기계 CFTR 돌연변이가 세포 표면 상에 제조 할 수 있다는 등의 비교적 관대하다. 10 히스티딘 태그는 니켈 - NTA이 태그의 친화력 덕분에 정화를 허용하도록 카르복시 말단에 설계되었다. C 터미널 태그가 잘립니다 CFTR 단백질 수율 ATP 아제의 기능 CFTR 단백질, 단일 채널 및 요오드화 유출 실험 17,19,24,28,29의 공동 정화을 방지하는 데 도움이됩니다. 그러나 여기에 설명 된 정제 프로토콜은 물론 N 말단 태그 CFTR에 적합해야한다.
이전에는 CFTR 단백질이 효과적으로 실온에서 15 NaPFO (나트륨 pentadecafluoro-옥 탄산)를 이용하여 S F 9 세포막 제제로부터 추출 될 수있는 것으로 밝혀졌다. 그러나 NaPFO의 감수성이 제대로 접힌 단백질 및 PFO를 제거하는 데 필요한 긴 투석을 유지에 도움이 4 ° C, 온도에서 침전하는 것은 랩에 순종하지 않았다ID 정화 및 재구성 방법은 CFTR 함수의 연속적인 분석에서 그 단백질의 활성을 최대화하기위한 것. 도데 실-β-D-말토 (DDM), (3)을 포함하여 세제 (의 패널의 평가 - [(3- cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- 프로판 (CHAPS), FOS -choline 12 FOS -choline (14)는 것을 보여 주었다 FOS -choline 14 S의 F (9) 막으로부터 인간 CFTR-그의 10 가용화 가장 효과적이었고, 그 DDM (데이타 미기재) 세제에 CFTR의 ATP 아제 활성을 유지한다. 따라서, FOS -choline 14 세제 추출 단계 효과적 단백질의 활성을 유지하기 위해 DDM 세제를 교환 한 후, 수행된다.
(; 실버 스테인도 2) 정제 및 농축 후에, 단백질 분획은 주요 성분으로서 ~ 150 kDa의 밴드를 포함 DDM 세제 얻어진다. 이 분자량은 S <인간 CFTR 표현에 대응EM> F 9cells하고 포유 동물 세포에서 글리코 실화 CFTR의 복잡한 특성의 종류가 부족 SDS-PAGE에 의해 분석 하였다. 150 kDa의 종은 SDS-PAGE 분석 및 실버 염색 다음 약 90 % 순수 것으로 보인다. M3A7 안티 CFTR 항체를 이용하여 웨스턴 블롯은 NBD2에 대해 감독이 마우스 단일 클론은 150 kDa의 밴드 (; 오점 그림 2)와 반응하여 확인합니다. 특정 연구에서, 저 분자량 성분이 미량 ~ 60, 겔상의 가시 부 밴드로서 존재하며 ~ 80 kDa의 (데이터 미기재). M3A7 항 CFTR 항체 60 및 80 kDa의 밴드와 반응하지만, 다른 비 CFTR 단백질과 반응하지 않는다 (데이터는 보이지 않음). 이것은 저 분자량 성분 CFTR 분해물 공동 정제 그들의 C 말단 His 태그를 통해 함께 CFTR 것을 시사한다. 정제는 단백질 분해 효소 억제제의 존재 하에서 수행하며 이러한 구성 요소의 정제 절차 I 전에 세포 내에 존재 함을 나타난다의 수행. 절차의 농축 단계는 사실상 모든 오염 저 분자량 단편을 제거한다. CFTR이 시점에서 재구성 될 수 있고, 또는 또 다른 정제 과정에서 단백질을 재구성 프로토콜에서 사용될 수있다.
규제로서 리포솜 플럭스 기재 분석법은 음이온 선택성 채널들을 재구성 정제 CFTR 분자의 인구의 기능적 재구성을보고
정제 CFTR의 상당 부분은 상술 한 방법을 이용하여 조정 된 염화 채널로 재구성되었는지 결정하기 위해, proteoliposomal 할라이드 플럭스 분석은 (도 1b에 개략적으로 도시 됨) 재구성 CFTR 분자 집단의 활성을보고하는 개발되었다. 최악의 경우, 재구성 CFTR 분자의 대다수는 미스 폴딩되고, 이러한 분자는 전도성을 부여하는 데 실패하게되면, 양이온과 음이온을 구별하지 못하는및 / 또는 게이트 PKA 인산화 및 뉴클레오타이드 규제 부족한 것이다. Lee 등은. 세포막 단백질의 30 퍼센트의 기능적 재구성을 허용 추정 방법을 공개 하였다.
(재구성 CFTR 베어링) 빈 리포좀 (CFTR 부족) 또는 테오는 KI (75 mM)을하고 여분의 리포좀 아이오다 이드로드는 겔 여과 칼럼을 통해 리포좀을 전달하여 칼륨 글루타민산 (75 mM)을 교환. KI는 테오가 아이오다 이드 바깥쪽으로 그라데이션을 만들 잘 포함하는 K-글루 (칼륨 글루타민산)에 추가되고 유출은 요오드에 민감한 미세 전극 (24)을 사용하여 시간이 지남에 잔류하는 리포좀 요오드의 증가로 모니터링로드. MV 신호의 감소 음전하 요오드화 결과 유출 (신호 더 마이너스가). 시간이 지남에 따라 방출 요오드화 농도를 플롯하면, 기울기 EX의 요오드화의 증가를 보여주고 (도 3에서와 같이)을 반전시간이 지남에 영원한 솔루션입니다.
K-의 Glu은 CFTR 단백질을 통과하지 않는 음이온의 일례로 사용 조건에서 기공의 현저한 차단을 일으킬 나타나지 않고 impermeant 반대 이온으로서 선택하고, 요오드화 선택적으로 간섭을 유발하지 않는다 전극. 분석은 이러한 기준을 충족 제공, 다른 음이온 주위를 최적화 할 수 있습니다. 칠십 오 mM의 음이온 농도는 경험적으로 설명 된 조건에서 분석에서 측정을 위해 좋은 트래핑 충분한 신호를 준 농도로 선정되었다. (; 제어 흔적을 그림 3) CFTR-재구성 반면, 요오드화로드 테오는 요오드가 첨가 한 후 외부 솔루션으로 출시 중재, 소포가 세제로 투과 가능 할 때까지 기본적으로 기능적으로 재구성 된 CFTR 부족한 요오드로드 리포좀로부터 요오드 방출 없을 것 MgATP (1 mM)을 CFTR 채널과 발리 노마 이신 (Valinomycin)를 엽니 다(20 nM의)는 막 잠재력의 개발을 방지하기 위해 (그림 3A를 단백질의 추적 참조 : 1의 지질 질량비 : 3000 (w / w)).
발리 노마 이신 (Valinomycin)는 본 시스템에서의 비어있는 리포좀 무결성을 교란하지 않은 높은 농도로 실험적으로 선택되었다 농도 구배 및 20 nM의 농도의 아래쪽, 즉 막을 통과를위한 셔틀 칼륨 이온 운반체이다. 이는 각각의 특정 시스템에 최적화 될 필요가있다. 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 첨가없이, 신속 고원 도달 몇 nm 인 약칭 요오드화 릴리스있다 (데이터는 보이지 않음). 이러한 조건이 다르게 극대 (도 3a에서와 같이) CFTR의 음이온 채널 활동을 활성화하는 것으로 알려져 있지만, 그것은 중요한 응답의 부족 CFTR의 음이온 선택적 기공을 통하여 요오드화 전도에 의해 매개되는 intraliposomal 양전하 순간 증가를 반영하는 것으로 보인다 즉시 제한 연속하여발리 노마 이신 (Valinomycin)가 포함되어 있지 않습니다 OU에 요오드 유출. 이는 발리 노마 이신 (Valinomycin) - 중재 반응은 요오드화 유출이 재구성 CFTR의 음이온 선택성을 지원하기 때문에 전하 축적 이전 실험에 한정되었음을 확인한다. CFTR 선택성이 부족하면, 요오드화 칼륨 및 양쪽함으로써 자속을 개시 발리 노마 이신 (Valinomycin)에 대한 필요성을 폐지 테오으로부터 유출 할 수 있었을 것이다.
이러한 초기 시점에서 측정 된 요오드 농도가 채용 요오드화 감지 전극을위한 최적의 감도 범위 내에 있도록 실험적으로 선택되었다. 다른 요오드 전극을 사용하면 이러한 요소의 최적화가 필요할 수 있습니다. 고원에 도달 한 후, 트리톤 X-100는 테오를 Permeabilize 하시려면되며 나머지 갇혀 요오드를 릴리스에 추가됩니다. (발리 노마 이신 (Valinomycin) 첨가 후 최소 1 ~ 2을 획득) 초기 요오드 측정과는 달리,이 엔드 포인트에서 판독 전극 칼리의 선형 범위에 있지bration 곡선 (데이타 미기재)하여 CFTR 단백질 분석에서의 리포솜의 총계, 또는 퍼센트 기능적 재구성을 요오드화 유출 상대적인을 매개 할 수있는 리포좀 분획의 정확한 평가를 배제.
요오드화 광속의 비율은 CFTR 단백질 분자의 수, 각 오픈 확률 CFTR 채널 유니 터리 컨덕턴스를 반영한다. 따라서, 요오드 유출의 비율은 수와 각 CFTR 분자의 개방 가능성에 의존해야한다. 예측은 리포솜 CFTR 당 분자의 수를 증가시킴으로써 이러한 시스템에서 시험 하였다. 지질 활성화 (인산화 MgATP 치료) CFTR 단백질의 비는 1에 이르는 비율이, 변화시킨 : 300-1 : 3000 (도 3a) (w / w). 테오에 존재 재구성 CFTR의 큰 양, 유출의 큰 속도는 예측 t을 지원하고, (또한 발리 노마 이신 (Valinomycin) 후 1 ~ 2 분 사이에서 측정)모자 유출 속도는 각 리포좀 CFTR 분자의 수에 의존한다. 따라서이 방법의 엄격함을 강조, 지질의 비율이 실험 일 및 단백질 정제를 사이 재현성 : 유출 속도는 특정 단백질을 사용하여 얻을.
요오드화의 유출 속도는이 시스템에서 재구성 된 CFTR 채널의 개방 가능성에 관한 것으로 보인다. PKA 의한 인산화는 (32에 의해 검토) CFTR 활성화 (31)에 요구되기 때문에, 이는 오픈 확률이 낮은 외인성 PKA 처리에 의해 인산화되지 않은 CFTR 함유 소체 요오드화 유출의 낮은 비율이있을 것으로 예상된다 . PKA 처리 된 테오에서 열린 확률은 유출의 훨씬 더 큰 기대 율의 결과로, 훨씬 더 높을 것이다. 이 시스템을 1mM의 MgATP의 존재를 CFTR PKA 처리를 위해 실제로, 요오드화의 유출 속도는 valinomyc 첨가 한 후 1-2분 측정약 4 CFTR 단백질의 비율은 MgATP하지만 PKA (그림 3B)를 실시 배에서입니다. 이러한 결과는 유출 속도가 오픈 확률 채널 관련된 가설을 뒷받침. 실제로는 이러한 전기 구동력 시간 의존적 변화와 같은 다른 요인이 관측 유출 활동에 영향을 미칠 것이다 주어진 확률을 열이 직접 분석에서 활성을 비교하기 어려울 수있다. 독자는이 분석 상세 단일 채널 활성 녹화를 대체하지 않습니다 있다는 사실에주의.
흥미롭게도, 통상적 CFTR (도 3B, C)를 결여 리포좀으로부터 유출보다 상당히 크다 MgATP의 존재 "인산화 된"단백질에 의한 요오다 이드의 유출 낮은 비율이 관찰된다. 이러한 낮은 비율은 33 정화하기 전에 S f를 9 세포 발현 시스템에서 CFTR의 기초 인산화를 반영 할 수있다. CFTR 다른 표현 정기적 복용로부터 정제MS 기저 인산화 상이한 레벨 따라서 상이한 잔존 활성을 가질 수있다.
S f를하지만 F508del- 및 G551D-CFTR에 대한 주변의 동질성에서 9 세포에서이 빠른 정화 프로토콜 수익률 WT-CFTR이 방법은 더 나은 농축 과정으로 설명되어 있습니다. 일부 오염 밴드 CFTR 항체에 반응성 및 세포 파괴 전에 존재하는 것으로 나타 CFTR 분해물을 반영 다수가 SDS-PAGE (19)를 통해 관찰된다. 재구성 및 요오드화 플럭스 방법은 임상 적으로 관련된 돌연변이의 이러한 풍부한 샘플에 적합하다. (약 1 지질의 질량 비율 : 600 단백질) 및 G551D-CFTR (단백질 약 1 지질의 비율 : 300)도 3d에 도시 된 바와 같이, 상당한 요오드화 유출 F508del-는 모두 측정된다. (1 지질의 질량비 단백질 1200) 두 돌연변이 WT-CFTR보다 낮은 절대 활성을 갖는 반면, 정량 시료로 직접 비교하는 것은 어렵다CFTR 저하 제품에 오염 된 돌연변이에 대한 정확하지 않을 수 있습니다. 그러나 F508del-CFTR 및 G551D 모두 이러한 방법으로 정제 재구성 및 유출 측정은 작은 분자 증강제 (그림 4)에 예상대로 반응하고,보다 엄격한 PFO 정제 방법 (19)에 의해 정제 단백질과 유사한 채널 기능을 보여주기 위해 실시.
정제 및 재구성 CFTR의 채널 활성은 소분자 억제제 및 강화제에 의해 변조 될 수있다
-172 34 INH CFTR 단일 채널 컨덕턴스 측정 35 CFTR 클로라이드 채널 오픈 확률을 억제하고, 다른 연구 22,36 CFTR의 활성을 억제하는 것으로 나타났다 가능한 가장 구체적인 CFTR 억제제이다. 도 3c에 도시 된 바와 같이, 첨가 후 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 유출 속도는 상당히 CFTR INH의 전처리에 의해 감소된다 UB> -172. 따라서, 정제 및 재구성 CFTR 분자의 인구의 채널 활동이 분석은 -172 INH 억제 리간드 CFTR 조절제로서보고 활동에 유효하다.
분석뿐만 아니라 작은 분자 강화제 치료 효과 시험에 매우 민감하고 적용 가능하다. 도 4에 도시 된 바와 같이, 테스트 한 모든 세 CFTR 유전자형 크게 같은 활성 소분자 강화제 의해 효력을 더하게된다 Kalydeco / VX-770 또는 VRT-532 (도 4C, G551D 위해 도시), 비활성 아날로그 요오드화 유출에 영향을주지는 않지만 CFTR의 활동 (F508del-CFTR에 대해 표시, 그림 4B). 분석은 강화제 농도 의존성의 시험 및 강화제 - 매개 활성에 CFTR ATP의 역할과 인산화에 적용 가능하다.
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그림 1 :.이 책에서 설명한 작업에 대한 분석 설계 및 워크 플로우 (A) 워크 플로우 (B) 요오드 유출 실험의 도식 표현.. 패널 B의 수정 된 버전은 원래 생물 화학 저널에 발표되었다. Eckford, PDW; 리, C; Ramjeesingh, M .; 그리고 곰, CE 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 레귤레이터 (CFTR) 강화제 VX-770 (Ivacaftor)는 인산화에 의존하지만, ATP에 의존하지 않는 돌연변이 체 CFTR의 결함 채널 문을 엽니 다. 2012; 287 : 36639-36649. © 생화학 및 분자 생물학에 대한 미국 사회.
그림 2 :. CFTR 빠른 정화 절차 수익률 정제 WT-CFTR 단백질 실버 SDS-PAGE 젤 웨스트 스테인드과도하게 표현하는 (그의) 10 -tagged 버전 (각각 1 μg의 겔과 오점 0.1 μg의) 정제 인간 WT-CFTR의 DDM 세제의 단백질에 대한 S의 F에서 고립 된 9 세포를 M3A7 CFTR 항체를 사용하여 ERN 오점 단백질. WT-CFTR은 (> 90 % 순수) 복합 당질 부족이 단백질에 적합한, 150 kDa의에서 감지된다. 이 연구는 원래 생물 화학 저널에 발표되었다. Eckford, PDW; 리, C; Ramjeesingh, M .; 그리고 곰, CE 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 레귤레이터 (CFTR) 강화제 VX-770 (Ivacaftor)는 인산화에 의존하지만, ATP에 의존하지 않는 돌연변이 체 CFTR의 결함 채널 문을 엽니 다. 2012; 287 : 36639-36649. © 생화학 및 분자 생물학에 대한 미국 사회.
그림 3 : Iodide 유출 분석 보고서는 정제 및 재구성 CFTR 단백질에 대한 채널 활성을 조절. (A) 정제 및 인산화 WT-CFTR 단백질에서 재구성 : 지질 비율을 1의 : 300 (w / w), 1 : 1200 (w w /) 및 1 : 3,000 (W / W)에 소포 루멘에서 요오드 유출을 매개 1mM의 MgATP, 20 nm의 발리 노마 이신 (Valinomycin)을 첨가 한 후 시간에 따른 벌크 욕조. (/ V W) 트리톤 X-100은 실험의 끝에 소포 루멘 요오드화 갇혀 테오 릴리스 Permeabilize 하시려면 0.1 %의 첨가. (B) 재구성 WT-CFTR 단백질 초기 요오드화 유출 시간 경과하지 않았다면 사전 인산화. (C) 초기 요오드화 유출 속도는 기능성 CFTR 단백질에서 관찰 된 활성의 의존성을 보여준다. 단백질의 PKA 인산화 -172 (20 μM) INH CTTR, CFTR 억제제의 첨가에 의해 억제되는 중요한 채널 활동을 위해 필요하다. 데이터는 평균 ± SEM이다; * P <0.05, *** p <0.0001 (D)는 복수의 유전자형 중량, 및 제어 F508del- 대 G551D-CFTR 포함 요오드화 유출 분석에서 CFTR 규제 신호를 생성한다. 데이터는 평균 ± SEM이다; * p <0.05; *** P <0.0004 대 제어 할 수 있습니다. 이 연구 (패널 A, C 및 D의 데이터 부분)는 원래 생물 화학 저널에 발표되었다. Eckford, PDW; 리, C; Ramjeesingh, M .; 그리고 곰, CE 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 레귤레이터 (CFTR) 강화제 VX-770 (Ivacaftor)는 인산화에 의존하지만, ATP에 의존하지 않는 돌연변이 체 CFTR의 결함 채널 문을 엽니 다. 2012; 287 : 36639-36649. © 생화학 및 분자 생물학에 대한 미국 사회.
그림 4 : 작은 분자에 의해 CFTR의 인산화에 의존 증강을 사용하여 심문 할 수있다중량, F508del- 및 G551D-CFTR에 대한 요오드 유출 시스템. (a) WT-CFTR은 PKA 인산화 상태에서, 강화제 VX-770 (10 μM)에 의해 효력을 더 크게된다. 데이터 * p <, 평균 ± SEM이다 PKA-VX-770. (b) VX-770 (10 μM) 아니라 비활성 아날로그, V는-09-1188 (10 μM)을 크게 요오드화 유출을 증강 + 0.01 대 인산화 F508del-CFTR의 활동. 데이터는 평균 ± SEM 아르, N = 3 *** P <0.001 대 -VX-770 제어. 10 μM VRT-532 또는 VX-770에 의해 G551D-CFTR의 (C) 증강. 데이터는 평균 ± SEM이며, N = 5, ** p <0.001, ** p <0.0001 대 -VX-770 제어. 이 연구 (패널 AC)는 원래 생물 화학 저널에 발표되었다. Eckford, PDW; 리, C; Ramjeesingh, M .; 그리고 곰, CE 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 레귤레이터 (CFTR) 강화제 VX-770 (Ivacaftor가)에서 돌연변이 CFTR의 결함 채널 게이트를 엽니 다 인산화에 의존하지만, ATP-독립적 인 방식으로. 2012; 287 : 36639-36649. © 생화학 및 분자 생물학에 대한 미국 사회.
| 버퍼 | 이름 | 내용 | pH를 | 사용의 pH를 조정 |
| 버퍼 1 | 2 % FOS -choline | 10 mM의 이미 다졸의 2 % (w / v)의 FOS -choline (14) 세제, 25 mM의 HEPES | 7.4 | 이미 다졸 / HEPES |
| 버퍼 2 | 10 mM의 이미 다졸 | 10 mM의 이미 다졸, 25 mM의 HEPES (NO 세제) | 7.4 | 이미 다졸 / HEPES |
| 버퍼 3 | 10 mM의 이미 다졸 + DDM | 10 mM의 이미 다졸, 25 mM의 HEPES, 1 mM의 도데-β-D-말토 | 7.4 | 이미 다졸 / HEPES | 버퍼 4 | 50 mM의 이미 다졸 + DDM | 50 mM의 이미 다졸, 25 mM의 HEPES, 1 mM의 도데-β-D-말토 | 7.4 | 이미 다졸 / HEPES |
| 버퍼 5 | 600 mM의 이미 다졸 + DDM | 600 mM의 이미 다졸, 25 mM의 HEPES, 1 mM의 도데-β-D-말토 | 7.4 | 이미 다졸 / HEPES |
| 버퍼 (6) | 75 mM의 KI + DDM | 75 mM의 KI, 20 mM의 MOPS, 1 mM의 도데-β-D-말토 | 7.4 | KOH |
| 버퍼 7 | 75 mM의 KI | 75 mM의 KI, 20mM의 MOPS | 7.4 | KOH |
| 버퍼 (8) | 25 mM의 HEPES + DDM | 25 mM의 HEPES, 25 mM의 염화나트륨, 1 mM의 도데-β-D-말토 | 7.4 | 염산 / NaOH를 |
| 버퍼 (9) | 75 mM의 K-글루 | 75 mM의 K 글루탐산, 20mM의 MOPS | 광명 "> 7.4KOH / 글루타민산 | |
| 버퍼 (10) | 15 mM의 KI | 15mM의 KI, 20mM의 MOPS | 7.4 | KOH |
표 1 : 버퍼의 표.
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Discussion
셀룰러 과발현 다양한 시스템에서, 전체 길이, 작용 성 CFTR 분리 정제를위한 프로토콜의 수가 제한되어왔다. 이 ATP 아제와 평면 이중층 단일 채널 측정을 포함한 채널 기능의 직접 측정을 포함하여 분석에 매우 기능적인 WT-CFTR 또는 적당한 양의 F508del- 및 G551D-CFTR의 높은 농축의 신속한 정화이 허용 여기에 설명 된 방법이 유리하다 작은 분자 19-21의 연구 관련성이 높은 시스템과 CFTR 인구 채널 기능의 시연 측정합니다. 정제 방법은 신속하고 효율적인 재구성 프로토콜에 통합되어, 그러나 다른 방법에서 정제 된 단백질은 물론이 재구성 프로토콜에 연결된 정화 세제 마찬가지로 제거 의무로되어 제공 될 수있다.
EXC에서 복잡하고 힘든 단일 채널 실험 달리에 다루지 막 패치는, 여기에 기재된 방법은 CFTR 채널 기능의 강력하면서도 간단 평가를 허용하고, 고유이 측정 CFTR 채널보다는 하나 또는 몇 분자의 큰 모집단의 기능을보고한다. 패치를 포함하는 막과는 달리,이 방법은 결합 된 정제 절차의 효과에 따라 연관된 단백질의 근처 또는 완전한 부재하에 채널 소분자 조절제의 효과를 직접적으로 평가한다.
프로토콜 내에서 중요한 단계
프로토콜에 표시된 노트와 같은 음이온 플럭스 분석을위한 CFTR의 기능 재구성 몇 가지 중요한 단계가 있기는하지만, 단백질의 최적화 : CFTR의 재구성 동안 지질 비율이 핵심입니다. 이러한 최적화는 각 CFTR 유전자형이 필요합니다.
기술의 수정 및 문제 해결
기준 MV 입술기술 된 바와 같이 제조 된 샘플 요오드 유출 분석하는 동안 여기에 사용되는 프로브 ponse은 일반적으로 -20 MV -50입니다. 이 범위에서 상당한 편차는 샘플에 문제가있을 수 있습니다 제안합니다. 다른 제조 업체에서 판매하는 다른 프로브는 여기에 제공된 지침과 다를 수 있습니다. 안정된 기준이 달성 될 수 없다면, 잔여 세제 또는 비활성 변성, 낮은 품질의 단백질은 요오드화 소체 permeabilizing 될 수있다.
실패 조사되어야 모두 몇 가지 문제를 반영 할 수있다 MgATP의 존재하에 인산화 CFTR 함유 리포좀 종속적 요오드화 유출을 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 속도의 현저한 변화를 검출한다. 이 문제는 다음과 같습니다 불량, 부분적으로 변성 CFTR 또는 불순한 CFTR을; 재구성하는 동안 세제의 불완전한 제거; 최적이 아닌 단백질 테오 지질 비율; 또는 불충분 한 발리 노마 이신 (Valinomycin)가 불완전 충전 분산 렌더링 덧붙였다.
내가odide 유출 분석은 분석 중에 사전 인산화 CFTR 단백질 (프로토콜에 기재된 바와 같이), 또는 인산화에 CFTR를 사용할 수있는 유연성을 제공한다. 재구성 된 단백질 정제 과정에서 인산화되지 않은 경우, 샘플 MgATP와 PKA 첨가하여, 단계 3.2.7에서 요오드화 유출 실험 중에 인산화 될 수있다. 이때 기준이 충분히 발리 노마 이신 (Valinomycin) 단백질의 기능을 추가로 측정하기 전에 PKA 효소에 의해 인산화 된 것을 보장하기 위해 적어도 5 분 동안 기록되도록. 유사한 결과가 하나의 방법으로 얻을 수있다.
프로토콜 동안, 변조기 분자이어서 MgATP 첨가하고 발리 노마 이신 (Valinomycin)에 의한 활성의 측정 전 5 분 동안 CFTR 단백질과 상호 작용시킨다. 대부분의 CFTR의 조절이 매우 친 유성이다, 그것은 CFTR 단백질과 욕조와 평형 협회뿐만 아니라 사이에 시간이 걸릴 수 있습니다. 분석은 일없이 진행할 수 없습니다전자 발리 노마 이신 (Valinomycin)을 첨가하고, 따라서 어떠한 정보도 이러한 방법으로 분석을 수행함으로써 손실된다. 사용자가 단백질과 소형 분자의 상호 작용 전에 지연 시간이있을 수도 있다는 우려없는 상황에서, 분석은, 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 첨가 후 변조기의 급성 첨가함으로써 수행 될 수의 초기 속도 단계에서 여전히 동안 측정.
기술의 한계
이전에 언급 한 바와 같이, 정제 및 재구성 전체 길이 CFTR 분자의 인구에 의해 조절 채널 활동이 proteoliposomal 플럭스 기반의 분석은 직접 활동을 수정 리간드 심문에 대해 고유 한 방법을 제공한다. 그러나,이 방법은 리간드 CFTR 통해 자속의 속도를 변경되는기구에 대한 통찰력을 제공하지 않는다는 점에서 제한된다. 이상적으로, 정제 및 재구성 CFTR의 proteoliposomal 플럭스 분석은 평면 입술과 함께 사용되어야한다단일 채널 활동의 ID 이중층 연구. 이 조합은 개방 및 / 또는 폐쇄 상태 즉, 리간드 결합 단백질의 상태에 대한 통찰력을 제공 할 것이다.
기존의 방법에 대한 의미
중요한 단백질 - 단백질의 통로 또는 중단을 조절 성을 통해, 간접적으로 예를 들면 채널 활동을 변경하는 다른 세포 성분과 상호 작용하는 소분자 조절제 대 CFTR 채널과 작은 분자의 직접적인 상호 작용을 평가 또는 시그널링을위한 방법의 부족 부분은 현재 상호 작용. 요오드화 유출 방법은 CFTR의 채널 활성을 조절하는 분자의 작은 단백질과의 직접적인 상호 작용을 보여준다. 측정의 처리량이 낮은 방식에도 불구하고, 소분자 및 강화제 CFTR 렉터와의 직접적인 상호 작용을 연구하기위한 유일한 방법이 상당한 값이 남아있다. 많은 작은 molecul이것은 현재 CF 연구의 주요 추력 같이 E 조절제는 학문적 그룹 및 임상 CF 환자를 치료하기위한 제약 산업 모두에 의해 개발 중에있다. 여기에 설명 된 방법은 이러한 분자의 가장 유망한의 작용기구의 개발 및 검증에 도움이 될 것으로 예상된다.
기술의 미래 응용 프로그램
여기에 사용 된 방법은 또한 관심의 다른 단백질에 적응하는 것이 매우 의무가 있습니다. 실제로 기재된 방법의 변형은 두 P.을 연구하기 위해 사용되었다 녹농균 세포막 단백질은이 방법의 유용성과 범용성을 보여주는, 멤브레인 (26, 27)에 걸쳐 음이온 기판의 이동에 관여. 추가적인 음이온 채널 및 전송기의 연구에서 이들의 사용은 미래에 예상된다.
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Disclosures
저자는 여기에 설명 된 정제 방법의 개발 과정에서 박사 Mohabir Ramjeesingh의 조언을 인정합니다. 이 연구는 건강 연구 (CIHR)과 낭성 섬유증 캐나다 (CFC)의 캐나다 연구소에서 CEB에 운영 보조금에 의해 지원되었다. PDWE는 CIHR 및 CFC를 통해 친목 상에 의해 부분적으로 지원되었다. 저자는 낭포 성 섬유증 재단 치료학 (CFFT)에 의해 보정, 강화제 박사 R. 교량 (의학 로잘린 대학과 과학)에서 억제제 화합물 및 유통의 제공을 인정합니다. 저자는 또한 배큘로 바이러스 시스템을 사용하여 중량 및 돌연변이 CFTR 단백질을 발현의 베일러 세포 배양 시설 (NIH 보조금 P30의 CA125123)에 의해 우수한 서비스를 인정합니다. 비활성 VX-770 아날로그, V-09-1188은, 버텍스 제약의 선물했다.
Acknowledgments
저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001) |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup. |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
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