Summary
Descrito aqui é um procedimento rápido e eficaz para a reconstituição funcional da purificado do tipo selvagem e proteína CFTR mutante que preserva a atividade para este canal de cloro, que está com defeito na Fibrose Cística. Efluxo de iodeto de proteoliposomes reconstituídos mediadas por CFTR permite estudos da atividade do canal e os efeitos de pequenas moléculas.
Abstract
A fibrose cística condutância transmembrana regulador (CFTR) é um membro de formação de canal único da ATP Binding Cassette (ABC) superfamília de transportadores. A atividade do canal fosforilação e nucleotídeos cloreto dependente de CFTR foi freqüentemente estudada em sistemas de células inteiras e como canais de solteiro em pedaços de membrana extirpado. Muitas mutações causadoras de fibrose cística têm sido mostrados para alterar esta actividade. Embora um pequeno número de protocolos de purificação foram publicados, um método de reconstituição rápida, que retém a actividade de canal e de um método adequado para o estudo da actividade do canal de população num sistema purificado têm faltado. Métodos aqui descritos são rápidos para a purificação e a reconstituição funcional da proteína CFTR de comprimento completo em proteolipossomas de composição lipidico definido que retém a actividade como um canal de halogeneto regulamentado. Este método de reconstituição em conjunto com um ensaio baseado em fluxo romance de actividade de canal é um sistema adequado paraestudando as propriedades do canal população do tipo CFTR selvagem e os causadores de doenças mutantes F508del- e G551D-CFTR. Especificamente, o método tem utilidade em estudar os efeitos directos da fosforilação, os nucleótidos e as moléculas pequenas, tais como potenciadores e inibidores sobre a actividade do canal CFTR. Os métodos também são passíveis ao estudo de outros canais de membrana / transportadores para substratos aniónicos.
Introduction
Transporte de cloreto através das membranas apicais das células epiteliais em tais tecidos como o pulmão, intestino, pâncreas e glândulas sudoríparas é mediado principalmente pela fibrose cística condutância transmembrana regulador (CFTR), um ATP e membro regulada por fosforilação do ABC (ATP Binding Cassete) C subfamília de proteínas de membrana (revisto em 1). Tal como outros membros da subfamília ABCC, CFTR é um multi-medindo proteína de membrana grande, integrante que se liga ao ATP dois locais de ligação de nucleótidos formadas na interface dos seus domínios de ligação a nucleótidos (NBDs), onde possui a actividade de ATPase modesta em uma única site. No entanto, ao contrário de outros membros da subfamília ABCC, CFTR evoluiu como um canal Cl regulamentado único e não como um transportador de soluto ativa.
Mutações em causa CFTR a fibrose cística, uma doença que afeta vários órgãos, incluindo os pulmões, o trato gastrintestinal, pâncreas e trato reprodutivo, levando a morbidity e mortalidade em adultos jovens. Doença pulmonar normalmente representa mortalidade precoce em fibrose cística e, na maioria dos casos é causada pela perda de função de CFTR no epitélio superficial das vias aéreas condutoras. A falta de actividade do canal de cloreto CFTR, causa uma redução no ambos Cl - e o movimento da água através do epitélio da superfície de modificar a camada de fluido sobre a superfície apical do epitélio respiratório ciliado. Isso resulta em um líquido viscoso superfície das vias aéreas que prejudica a capacidade das células epiteliais respiratórias ciliadas para efetivamente patógenos limpar das vias aéreas. Como consequência, a maioria dos pacientes com FC sofrem de crises recorrentes de infecção pulmonar e lesão pulmonar devido à inflamação.
Como esperado, os estudos do mecanismo de acção da proteína CFTR normal, focado primariamente em estudos electrofisiológicos detalhados da sua actividade de canal de propagação. Estudos de canal único mostraram diretamente que funções CFTR como PKA-dependente Cl- Canal que possui um portão regulamentado ATP 2. Estudos eletrofisiológicos detalhados fornecem uma grande quantidade de informações sobre os canais CFTR individuais 1,3, no entanto, pode haver preocupação quanto a saber se as características de qualquer canal único especial, que tem sido estudado é o reflexo de toda a população de canais CFTR e, portanto, o único canal resultados devem ser sempre considerados, juntamente com métodos para estudar a população macroscópica. Ensaio direta da atividade do canal população de CFTR purificado tem o potencial de fornecer informações sobre o defeito molecular associado com mutações causadoras de doenças e de conduzir a descoberta de moduladores químicos que reparo proteínas CFTR mutante. Até o momento, existem mais de 1.900 mutações diferentes em CFTR pensados para causar fibrose cística 4. A mutação major, F508del-CFTR, encontrado em pelo menos um alelo em aproximadamente 90% dos pacientes na América do Norte e Europa conduz a uma proteína misfoldingnd retenção no retículo endoplasmático 5. F508del-CFTR também tem outras consequências, incluindo a atividade do canal com defeito 6-9. A ausência resultante de CFTR a partir da superfície da célula está associada a doença grave. G551D-CFTR, uma mutação menos comum, é pensado para ser ainda devidamente dobrada é disfuncional como um canal de cloro na superfície da célula 6. O desenvolvimento de pequenas moléculas e correctores de potenciadores tem o objectivo de corrigir dobragem e / ou o tráfico de mutantes tais como F508del-CFTR à superfície da célula, e de potenciação ou aumentando a actividade do canal de mutações tais como G551D quando presente na superfície da célula, respectivamente . Enquanto os corretores VX-809 e VX-661 (ainda não está aprovado para uso em pacientes, o potenciador Kalydeco (ivacaftor; VX-770) está sendo usado em 150 mg a cada 12 horas em pacientes com FC> 6 anos com pelo menos um G551D -CFTR mutação, e, mais recentemente, para os pacientes com um dos G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pe G1349D. Kalydeco é seguro e resulta em melhoria das medidas clínicas da doença CF 10, no entanto, o mecanismo de ação desta pequena molécula foi mal compreendida no momento da aprovação do FDA para uso em pacientes.
Um punhado de métodos de purificação de CFTR foram descritos anteriormente 2,11-18, muitos dos quais exigem um considerável período de tempo para completar. Numa publicação recente 19, um método único de purificação e rápida reconstituição foi descrito para CFTR superexpresso no sistema de expressão de S f 9 célula, e esta proteína purificada em sistemas lipidicos definidos foi utilizada para desenvolver um ensaio de actividade de canal de halogeneto de CFTR para uma população de CFTR moléculas. O ensaio recapitula os efeitos conhecidos da fosforilação, nucleotídeos e inibidores sobre a função CFTR. O sistema foi utilizado para interrogar os efeitos do potenciador VX-770 / Kalydeco em WT (tipo selvagem), F508del- e G551D-CFTR e foi mostrado para o primeirovez que o fármaco interage directamente com a proteína CFTR para potenciar a sua actividade de canal de uma forma independente de ATP, demonstrando a utilidade e aplicabilidade destes métodos para o estudo da interacção de CFTR e os mutantes com nucleótidos e pequenas moléculas a partir de uma perspectiva de população responder a perguntas clinicamente relevantes sobre a proteína. Os métodos também têm sido utilizados para estudar outras moléculas potenciador e seus derivados 20, bem como os efeitos de uma pequena molécula corrector sobre a actividade da proteína de 21.
Os ensaios de efluxo de ter sido usado em muitos estudos anteriormente para investigar a actividade de mutantes CFTR e os efeitos dos compostos de CFTR-moduladores sobre a sua actividade, incluindo ensaios de células inteiras usando eléctrodos, marcadores radioactivos e fluoróforos 22,23, vesículas de membrana com eléctrodos selectivos de iões 24 e purificado CFTR reconstituído com traçadores radioativos 25. No entanto the utilização de eléctrodos selectivos de iões para estudar CFTR reconstituído purificado foi relatada pela primeira vez recentemente 19. Uma adaptação do método actual tem sido utilizada para a reconstituição e caracterização funcional de duas proteínas de membrana em Pseudomonas aeruginosa, um agente patogénico comum CF. Reconstituição de proteína de membrana purificado Alge exterior juntamente com medidas de efluxo iodeto foram utilizados para apoiar um modelo para a secreção de alginato aniônicos através deste transportador 26. A reconstituição e medições de efluxo de iodeto foram aplicados à proteína purificada Wzx, o que permitiu um modelo a ser proposto que sugere um mecanismo antiporte dependente de H + para o oligossacárido ligado a translocação-lípido através da membrana interna bacteriana por esta proteína de 27. Em ambos os casos foi utilizado o iodeto como um substituto para o substrato aniónico, embora em menor rendimento do que se poderia esperar de um substrato nativo. O método pode ser adequado para adaptação a outras proteínas com ctransporte ou condução ationic caminhos para substratos aniônicos.
Aqui, um processo de purificação rápida é descrito para a proteína CFTR, e sua reconstituição em proteolipossomas de lipidico definido. O procedimento de reconstituição rápida pode ser facilmente adaptado para utilização com CFTR purificado por outros métodos, desde que o tipo de detergente utilizado na purificação é passível de remoção através dos métodos utilizados aqui ou podem ser trocados por um detergente adequado, antes do procedimento de reconstituição. O método de efluxo de iodeto para medição da actividade de canal de purificado e reconstituído proteína CFTR é descrito em pormenor e alguns resultados típicos, que podem ser obtidos com este método são apresentados.
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Protocol
1. A purificação de CFTR
NOTA: Por favor, consulte a Tabela de Materiais e Equipamentos para uma lista de equipamentos e materiais utilizados neste protocolo. Existe um protocolo detalhado para a sobre-expressão de CFTR humano WT-e mutantes no S f sistema de expressão de baculovírus 9-17,28. Overexpress CFTR e preparar pellets de S f 9 células de acordo com este protocolo.
- Preparação de membrana em bruto
- Obter um doce ou uma descongelar S f 9 sedimento de células congelado a partir de uma cultura de 500 ml de células sobre-expressando wildtype-, proteína F508del-, ou G551D-CFTR com um C-terminal His-tag 10, crescidos por métodos padrão de cultura de células, como descrito anteriormente 17,28. Os sedimentos celulares terá um volume de aproximadamente 5 ml e um peso molhado de aproximadamente 5 g.
- Ressuspender S f 9 células em 20 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) de pH 7,4 com cocktail inibidor de protease (1 comprimido por 50 ml) a 4 ° C, garantindo oamostra aparece visualmente homogêneo e não há aglomerados de células permanecem.
- Lyse células usando um disruptor de células de alta pressão (Tabela de Materiais e Equipamentos), atingindo um mínimo de 10.000 psi (de preferência 15.000-20.000 psi) por 2 min por passagem. Manter a amostra a 4 ° C durante a lise.
- Recolher a amostra para um tubo em gelo, após o período de lise em seguida, recarregar imediatamente a amostra no disruptor celular. Procedimento de lise Repita 3 vezes. Examinar ao microscópio para garantir menos que 10% permanecem intactos.
NOTA: outros métodos para lisar as células, tais como contas de vidro, etc, não têm sido rigorosamente examinadas para este sistema, contudo, um utilizador pode encontrar uma alternativa adequada tal método.
- Recolher a amostra para um tubo em gelo, após o período de lise em seguida, recarregar imediatamente a amostra no disruptor celular. Procedimento de lise Repita 3 vezes. Examinar ao microscópio para garantir menos que 10% permanecem intactos.
- Centrifugar o material de lise celular a 4 ° C numa centrífuga de alta velocidade a 2000 xg durante 20 min. Recolher o sobrenadante e dispor do pellet. Divide-se o sobrenadante 20 entre os tubos e centrifugar as amostras durante 1 hora a 4 ° C a 125,000 xg em um tampo de mesa ultracentrifuge.
- Remova e descarte do sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet, e armazenar pelotas nos mesmos tubos a -80 ° C para menos de 2 meses até a sua utilização, ou manter no gelo e continuar com a purificação imediatamente.
- CFTR solubilização
- Obter 1-4 S f 9 peletes de membrana em bruto frescos ou congelados e ressuspender em cada 1 ml de tampão 1 (2% fos -choline; ver Quadro 1 para a receita completa) a 4 ° C em gelo, utilizando uma agulha de 25 G e 1 ml seringa até que a solução é homogênea por olho, sem aglomerados de membrana celular visíveis. Quando mais de uma pastilha é ser solubilizado, continuar a tratar cada amostra de acordo com as instruções para um único pellet abaixo em paralelo, de junção de amostras no passo 1.3.2.
- Dissolve-se um mini-comprimido de inibidor de protease em 1 ml de tampão 2 (imidazol 10 mM; ver Tabela 1), que carece de fos -choline detergente 14 (inibidores da protease são mais 10x concentclassificado do que a sua diluição recomendada neste ponto) e adicionar 100 ul para a pelete de membrana em bruto ressuspenso (inibidores da protease são a sua diluição recomendada neste ponto). Situado no gelo por 45-60 min, com mistura por inversão 5 vezes a cada 5 min.
- Centrifugar sedimento ressuspenso membrana em bruto em uma ultracentrífuga tampo da mesa durante 25 minutos a 125.000 xg e 4 ° C. Manter o sobrenadante, que contém CFTR solubilizado e descartar o pellet.
- Coluna de ligação, fosforilação e eluição
- Lavar 400 ul de níquel-NTA (ácido nitrilotriacético) ou lama de agarose resina equivalente com 1 ml de tampão 2 (imidazol 10 mM; ver Tabela 1), que carece de detergente, para remover o solvente e tampão a 4 ° C. Repita lavagem mais duas vezes.
- Combinar CFTR solubilizado, permanecendo inibidor de protease (900 ul) e a resina de níquel (suspensão de 400 ul) para um total de 10 ml com tampão 2 (10 mM de imidazole; ver Tabela 1) which carece de qualquer detergente acrescentou. Os fos -choline 14 concentração eficaz é diluída para 0,2% (w / v) neste passo. Se houver vários tubos, reunir todas as amostras contendo CFTR solubilizado, inibidores da protease, resina de níquel-NTA e 0,2% (w / v) fos -choline-14 neste ponto. Incubar durante 60 min a 4 ° C com agitação suave.
- Passa solução NTA-CFTR inibidor da protease-níquel para baixo de uma pequena coluna de triagem (Tabela 1) ou uma coluna vazia equivalente.
- Lava-se a resina NTA de níquel, que é retida na coluna, com 4 ml por pelete inicial de tampão 3 (10 mM de imidazole + DDM; ver Tabela 1), que carece de fos -choline mas contém 14 mM de 1 DDM (detergente maltósido de dodecilo), a 4 ° C. A adição de detergente DDM não altera significativamente o pH desta tampão.
- Preparar a solução de PKA-MgATP adicionando 25 ul (5 mM, concentração final) de MgATP, 2.500 L de cAMP-dependente da proteína cinase A, da subunidade catalítica (PKA) a 475 ul de tampão 3 (10 mM de imidazole + DDM; ver Tabela 1) para a coluna. Fosforilar a proteína por meio de selagem da extremidade de fundo da coluna com um tampão ou Parafilm, e adição de 500 ul de solução de PKA-MgATP para cada pelota inicial utilizado.
- Incubar à temperatura ambiente (20 ° C) durante 20 min com agitação suave e ressuspensão da resina utilizando uma pipeta de 1 ml cada 2 minutos para assegurar que a PKA entrar em contacto com toda a superfície da resina NTA níquel.
- Remover o tampão e elui-se a solução de PKA / MgATP a partir da coluna. Lava-se a coluna com 2 ml de tampão 3 (10 mM de imidazole + DDM; ver Tabela 1) a 4 ° C.
- Multiplicar o número de peletes utilizados no experimento por 4. Lavar a coluna com este número de ml da solução tampão 4 (50 mM de imidazole + DDM; ver Tabela 1) a 4 ° C, por adição de 4 ml de tampão à coluna, permitindo ele flua através e imediatamente a adição de 4 ml de aliquota próxima à coluna.
- Concentrado de proteína de amostra para remover imidazole e baixo peso molecular, produtos de degradação utilizando um dispositivo de filtro de centrifugação (100.000 de peso molecular cut-off) tal como descrito na Tabela de Materiais e Equipamento ou outro dispositivo semelhante, num total de 10 ml de tampão 6 (75 mM KI + DDM; ver Tabela 1), ou outro tampão de escolha DDM contendo 1 mM (Tampão tais como 7 para experiências de efluxo não-iodeto, 25 mM de HEPES + DDM; ver Tabela 1), por centrifugação a 2.000 x g e 4 ° C durante cerca de 20 min até que a amostra se concentra a 200 ul. Diluir a amostra para 10 ml e repetir o passo de concentração.
NOTA: Em nossa experiência (não publicado), imidazol significativamente inhios bits a actividade de ATPase de CFTR e deve ser removido neste passo de diluição e concentração, pelo menos, duas vezes, se a amostra irá ser utilizado para medições funcionais. - Recolha concentrado CFTR purificado. Manter a 4 ° C na presença de tampão de DDM até à sua utilização no prazo de 1-2 dias ou continuar imediatamente para a etapa de reconstituição. Não congelar a proteína purificada, como em nossa experiência, observamos atividade reduzida.
2. Reconstituição de CFTR
- Preparação Lipid
NOTA: CFTR foi reconstituída com sucesso em PC de ovo, POPC, 2: 1 (w / w) de PC de ovo: POPC (1: 1 w / w) de uma mistura, ou uma mistura de PE: PS: PC: ergosterol, 5: 2 : 2: 1 (w / w).- Para as experiências de efluxo iodados, seco 5 mg de PC de ovo (200 ul de 25 mg / ml, ver Tabela de Materiais e Equipamento) sob uma corrente de árgon gasoso, durante 20 min à temperatura ambiente em um Pyrex ou outro resistente (não-borosilicato ) tubo de vidro.
- Usando a absorvância a 280 nm, de um ELISA de umssay ou outro método, o cálculo da concentração da amostra de proteína CFTR purificada. Para as experiências de iodeto de efluxo com o tipo selvagem de CFTR, utilizar uma proteína: lípido de 1: 300-1: 3000 (w / w) para produzir um sinal suficiente. Para G551D- e F508del-CFTR, utilizar uma proteína: lípido de cerca de 1: 200-1: 1200 (w / w) de modo a detectar a actividade de efluxo.
- Optimizar a relação proteína: lípido para cada sistema particular. Calcular o volume de proteína purificada necessária. Calcula-se o volume de tampão com 1 mM de DDM necessária para fazer um volume final de 1 ml, ou seja, 1 ml - (volume de solução de proteína necessária) = volume de tampão.
- Adicionar o volume calculado do sistema tampão desejado com DDM 1 mM para o lípido seco (mas não adicionar a proteína CFTR no momento) e cobrir o tubo de vidro com Parafilm. Para experiências de efluxo iodeto, ressuspender lipídios no tampão 6 (75 mM KI + DDM, ver Tabela 1). Para outros experimentos ressuspender em tampão 8 (25 mM HEPES + DDM, consulteTabela 1) ou outro buffer interno desejado contendo DDM 1 mM.
- Vortex durante 2 minutos à temperatura ambiente para ajudar na suspensão do lípido no tampão de DDM. Alternativamente, a amostra é aquecida a 37 ° C durante 1-2 minutos antes da agitação em vórtice.
- Suspender o lípido repetidamente à temperatura ambiente com uma seringa de 1 ml e agulha de 25 G até que nenhum filme lipídico é visível nos lados do tubo. Evitar a injecção de ar para dentro da solução que iria produzir bolhas finas e auxiliar na oxidação de iodeto e lípidos.
- Sonicar o lípido suspenso no Parafilm coberto tubo para uma explosão de 20 segundos num banho de ultra-sons contendo gelo, e, em seguida, transferir imediatamente em gelo durante 1 min. Repita 3 vezes.
NOTA: sonicação Intense transforma soluções de iodeto amarelo devido à oxidação. Portanto evitar excessiva sonicação. Monitorar a amostra para mudanças de cor. Se uma mudança de cor é observado, descartar a amostra e preparar novamente. A mudança de cor devido à oxidação de algunso iodeto resultaria da oxidação dos lípidos nas mesmas condições. Deslocando o ar a partir do tubo com gás árgon antes da sonicação da solução irá ajudar a impedir a oxidação de lípidos e iodeto. Sonicação intenso pode quebrar má qualidade ou tubos de vidro, resultando em perda de riscado da amostra. - Adicionar o volume de CFTR purificado calculado no passo 2.1.3 para a amostra ultra-sons a um lípido atingir um volume final de 1 ml. Misturar a proteína com a solução de lípido e detergente por ressuspensão 10 vezes com uma agulha 25 G e seringa de 1 ml.
- Definir lípido e proteína da amostra em gelo durante 30 min com agitação de tubo para misturar 5 vezes a cada 5 min.
- Preparação da coluna de ligação detergente
- Obter um uso único comercial coluna spin-obrigatório detergente (ver Tabela de Materiais e Equipamentos), com uma capacidade de volume de 1 ml e quebrar a guia inferior para iniciar a coluna fluindo.
- Centrifuga-se a coluna durante 2 minutos a 2000 xg para remover o armazenamento buffer, e descartar este buffer.
- Adicionar 5 ml de Tampão 7 (Kl 75 mM, ver Tabela 1) para a coluna e depois centrifugar a 200 xg durante 4 min para eluir o tampão de lavagem. Repetir este passo mais 2 vezes para um total de 3 lavagens para remover todos os vestígios do tampão de armazenamento. Descartar tudo flow-through.
NOTA: É fundamental que o buffer usado para lavar a coluna não conter DDM ou qualquer outro detergente. A coluna tem uma capacidade de ligação finito para o detergente e se um tampão contendo detergente é utilizada, a coluna será ineficaz na remoção de detergente a partir da amostra de proteína-lípido-detergente. - Aliquotar cuidadosamente todos os 1 ml da amostra de lípido-detergente-proteína para o topo da resina da coluna e incuba-se a amostra do topo da coluna durante 2 minutos à temperatura ambiente.
- Centrifuga-se a amostra à temperatura ambiente durante 4 min a 2000 xg e recolher a amostra num proteolipossoma turva 1,5 ou 2 ml tubo de microcentrífuga limpo ou um tubo de vidro e coloque o samsoas em gelo.
- Recolhe proteolipossomas restantes na coluna por adição de 200 ul de tampão 7 (Kl 75 mM, a Tabela 1), ou outro tampão (sem detergente) para o topo da coluna e repetir o passo de centrifugação durante 2 min.
- Adicionar o segundo fluido à amostra proteolipossoma se parece nublado.
- Armazenar a amostra a 4 ° C durante a noite ou usar imediatamente para medições de efluxo de iodeto.
3. Medições de Iodeto de efluxo para purificada, CFTR reconstituída
- Geração de um gradiente de iodeto através da membrana proteoliposomal
- Grânulos pré-inchamento Sephadex G50 em tampão de 9 (75 mM de K-Glu; glutamato de potássio, ver Tabela 1), (cerca de 5 g de pérolas secas em tampão de 50 ml) ou tampão externo desejado, à temperatura ambiente durante pelo menos 2 horas ou a 4 ° C durante a noite.
- Prepare 4 colunas de Sephadex G50 saturados em Tampão 9 (75 mM de K-Glu, ver Tabela 1) ou outrostampão em pequenas colunas de rastreio por carga de resina para pelo menos até ¾ na coluna.
- Centrifugar durante 4 min a 2000 xg para remover o excesso de tampão a partir da resina. Não devem ser, aproximadamente, 2,25 mL de resina hidratada embalado na coluna no final do passo de centrifugação.
NOTA: resina deve ser levemente hidratado mas não imerso em líquido e um breve rodadas não deve eluir volumes significativos de buffer. É fundamental para o sucesso de eluição da amostra proteolipossoma que a resina coluna não é nem muito úmido, nem muito seco e o usuário pode precisar experimentar com as colunas, a fim de familiarizar-se com as condições de maior sucesso de câmbio buffer. - Adiciona-se cuidadosamente 125-150 ul de proteolipossoma amostra ao topo de cada coluna e centrifugar durante 4 minutos a 2000 x g.
- Piscina proteolipossoma eluatos juntos para uso imediato em efluxo iodeto ou outras experiências.
NOTA: O volume de fluido a partir de cada coluna deve ser mais ou menos150 ul da amostra e deve ser um pouco turva, mas menos turva do que a amostra original. Volumes maiores ou eluatos claras sugerem que as colunas não ter sido suficientemente seco, ou foram secos em demasia, respectivamente, e não resultará num experimento de iodeto de efluxo bem sucedida.
- Ensaio de efluxo iodeto
- Lave um eletrodo micro seletivo iodeto (Tabela de Materiais e Equipamentos) extensivamente com água deionizada, e, em seguida, incubar por 20 min antes do experimento em tampão 10 (15 mM KI, ver Tabela 1). Lave o eletrodo novamente extensivamente com água deionizada.
- Adicionar 150 ul de droga (20 uM de concentração típico para produzir uma concentração final de 10 uM no ensaio em tampão 9) (75 mM de K-Glu, ver Tabela 1) ou veículo em tampão 9 para um poço de uma placa de 96 poços com um pequeno bar de pulgas mexa.
- Certifique-se que não há bolhas de presentes. Use a ponta da pipeta para remover straybolhas. Se uma solução de um fármaco está a ser utilizado, garantir que a concentração final de DMSO no poço é inferior a 1% (v / v) (tipicamente 0,1-0,2% (v / v)).
- Adicionar 150 ul de proteína CFTR reconstituída que foi produzido na secção 3.1 em tampão 9 (75 mM de K-Glu, ver Tabela 1) para o poço com droga ou de tampão para produzir um volume total de 300 uL no poço da placa.
- Colocar a placa de 96 poços numa placa de agitação e agita-se a 130 rpm (ou a uma velocidade moderada de cerca de ¼ da velocidade máxima).
- Inserir a ponta do eléctrodo selectivo de iodeto cuidadosamente para dentro do poço, com a amostra de tal modo que a ponta não estiver em contacto com o fundo do poço, ou ser atingido pela barra de agitação. Certifique-se de que o eléctrodo de referência, se separado, está também em contacto com a solução no poço.
- Traçados gravar usando um programa de computador caseiro ou comercial que faz a interface com o eletrodo (ver Tabela de Materiais e Equipamentos para detalhes).Uma taxa de amostragem de 2 Hz, com filtragem do sinal através de um filtro passa-baixo.
- Deixar a amostra equilibrar durante 5 min para produzir uma linha de base plana e estável plano, ou próximo durante a gravação.
- Adiciona-se 3 ul MgATP (100 mM de estoque preparadas em dH 2 O e ajustou-se a pH 7 com KOH; 1 mM de concentração final) para a amostra para activar a proteína. Permitir ~ 5 min para chegar a uma nova linha de base estável. Sempre ajustar o pH do estoque 100 mM e MgATP neutro antes da utilização para evitar alterações no pH do tampão externo.
- Adicionar 3 mL de valinomicina estoque (2 uM; 20 nM de concentração final) para a amostra para curto-circuitar alterações na diferença de potencial gerada por iodeto de condutância-selectiva através do CFTR. Grave o declive decrescente (diminuição em mV) devido à actividade iodeto de efluxo mediado por CFTR por pelo menos 5 min.
- Para assegurar que o aprisionamento de iodeto no lúmen proteolipossoma foi suficiente, adicionar 3 mL de 10% (v / v) de Triton X-100 para a amostra. Significant e liberação iodeto de imediato indica que o iodeto suficiente foi preso nas vesículas de tal forma que não estava prendendo o fator limitante para as mudanças na inclinação determinados em 3.2.9, mas sim a atividade mediada pelo CFTR.
- Lava-se a barra do eléctrodo e agitar cuidadosamente com água desionizada após o tratamento das amostras com drogas ou com Triton X-100 para assegurar que todos os vestígios destes reagentes foram removidos para evitar a contaminação da amostra seguinte.
- Prepara-se uma série de concentrações diluídas KI na gama nanomolar a micromolar em tampão 9 (tampão K-Glu, ver Tabela 1). Grave mV a resposta do eléctrodo para cada concentração de 0 a mais alta concentração preparado. Preparar uma curva padrão, onde a resposta da sonda (mV) é representada graficamente contra o logaritmo da concentração molar de iodeto. Utilizar uma curva padrão para converter a resposta mV da sonda durante a experiência de efluxo de concentração de iodeto libertado.
NOTA: Prepare um cur calibraçãove numa base semanal até que um utilizador tem a certeza de quão rapidamente a resposta das alterações de sonda. Haverá um desvio na resposta e sensibilidade da sonda ao longo do tempo. Como as idades da sonda, a resposta irá degradar. Isto pode ser parcialmente anulada pela alterar as soluções internas periodicamente e extensa lavagem da ponta da sonda em água após a sua utilização, o que limita susceptíveis a adesão de moléculas para a superfície da sonda. - Determinar a inclinação média da linha da concentração vs. tempo para cada amostra proteolipossoma para os últimos 30 segundos antes da adição de MgATP, e após a adição de valinomicina, mas antes da adição de Triton X-100. Subtrair o declive da linha de base a partir do valinomicina para determinar a actividade de iodeto de efluxo mediado por CFTR para aquela amostra.
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Representative Results
Descritos nesta publicação escrita são métodos para purificar, reconstituir e medir a atividade do canal regulamentado da proteína CFTR. Figura 1a mostra o fluxo de trabalho para a purificação, a reconstituição e procedimentos de efluxo de iodeto. Os métodos para a reconstituição e por medições de actividade do canal de fluxo iodeto também são mostrados em maior detalhe no vídeo associado.
Purificação e reconstituição do CFTR em proteoliposomes
CFTR pode ser funcionalmente expresso em níveis elevados em células Sf 9, utilizando baculovírus recombinantes contendo Wt ou mutante de ADNc de CFTR 2. Embora não seja um sistema de expressão de mamífero, de CFTR foi expresso utilizando o sistema de baculovírus em células Sf 9 para assegurar um elevado nível de expressão. Produção de CFTR pode ser tão elevada quanto 1% da proteína total celular 17,28. O S f 9- sistema de baculovírus tem a vantagem de que a proteína é glicosilada e o núcleoMáquinas de controlo de qualidade no presente sistema é relativamente permissivo tal que CFTR e mutantes pode ser produzido na superfície da célula. A tag dez histidina foi projetado para o terminal carboxilo para permitir a purificação em virtude da afinidade desse tag para o níquel-NTA. A marcação do terminal C ajuda a evitar a co-purificação de proteínas CFTR truncados e os rendimentos de proteína CFTR funcional da ATPase, de canal único e experiências de iodeto de efluxo 17,19,24,28,29. No entanto, o protocolo de purificação aqui descrito deve ser adequado para CFTR N-terminalmente marcada bem.
Anteriormente, foi demonstrado que a proteína CFTR pode ser eficazmente extraído de preparações de membrana S f 9 de plasma utilizando NaPFO (pentadecafluoro-octanoato de sódio) à temperatura ambiente de 15. No entanto, a susceptibilidade de NaPFO para precipitar a 4 ° C, uma temperatura que conduz à preservação proteína correctamente enrolada, e a diálise prolongada requerida para remover PFO não eram passíveis de rapID de métodos de purificação e de reconstituição destina-se a maximizar a actividade da proteína em ensaios subsequentes de função de CFTR. Uma avaliação de um painel de detergentes (incluindo dodecil-β-D-maltósido (DDM), 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamónio] -1-propanossulfonato (CHAPS), fos e fos -choline 12 -choline 14, mostrou que fos -choline 14 foi mais eficaz na solubilização de CFTR humana-His a partir de 10 S f 9 membranas, e que DDM foi eficaz em manter a actividade de ATPase de CFTR na solução de detergente (dados não apresentados). Assim, um -choline fos 14 detergente passo de extracção é realizado, seguido por troca de DDM detergente para manter a actividade da proteína.
A seguir à purificação e concentração, uma fracção de proteína é obtido em DDM detergente que contém uma banda de ~ 150 kDa, como seu componente principal (Figura 2; mancha de prata). Este peso molecular corresponde a CFTR humana expressa em S <em> 9cells f e analisadas por SDS-PAGE, onde ele perde os tipos de características complexas de glicosilação de CFTR em células de mamífero. As espécies de 150 kDa parece ser aproximadamente 90% puro seguinte análise de SDS-PAGE e coloração com prata. Western blotting usando o anticorpo anti-CFTR M3A7 confirma que este anticorpo monoclonal de ratinho dirigido contra NBD2 reage com a banda de 150 kDa (Figura 2; blot). Em certos estudos, quantidades vestigiais de componentes de baixo peso molecular estão presentes como bandas menores visíveis no gel, em ~ 60 e ~ 80 kDa (dados não mostrados). O anticorpo anti-CFTR M3A7 reage com as bandas 60 e 80 kDa, mas não reage com outras proteínas não-CFTR (dados não mostrados). Isto sugere que os componentes de peso molecular inferior são produtos de degradação de CFTR co-purificado com CFTR através do seu C-terminal His tag. A purificação é realizada na presença de inibidores de protease e verifica-se que estes componentes estão presentes nas células antes do procedimento i purificaçãos realizados. O passo de concentração do procedimento remove virtualmente todos os contaminantes fragmentos de menor peso molecular. CFTR pode ser reconstituída, neste ponto, a proteína ou a partir de outro procedimento de purificação pode ser utilizado no protocolo de reconstituição.
Um ensaio baseado lipossomal fluxo relata a reconstituição funcional de uma população de moléculas de CFTR purificados e reconstituídos como regulada, canais selectivas aniónicas
A fim de determinar se uma proporção significativa de CFTR purificado foi reconstituído como um canal de cloreto regulado usando os métodos acima, um ensaio de fluxo de halogeneto proteoliposomal foi desenvolvido o qual relata a actividade de uma população de moléculas de CFTR reconstituídos (mostrado esquematicamente na Figura 1B). Se, na pior das hipóteses, a maioria das moléculas de CFTR reconstituídos são deformadas estas moléculas vai deixar de conferir a condutância, não conseguem discernir entre cátions e ânionse / ou o portão vai faltar regulamentação por PKA fosforilação e nucleotídeos. Lee et ai. Publicaram métodos que permitem a estimativa da percentagem de reconstituição funcional de uma proteína de membrana de 30.
Lipossomas vazios (sem CFTR) ou proteoliposomes (portadores de reconstituída CFTR) são carregados com KI (75 mM) e iodeto de extra-lipossomal trocadas com glutamato de potássio (75 mM), passando lipossomas através de uma coluna de filtração em gel. O KI carregado proteolipossomas são adicionados a um K-Glu (glutamato de potássio) bem contendo a criar um gradiente de ida e de iodeto de efluxo é monitorizada como um aumento de iodeto extraliposs�ico ao longo do tempo utilizando um iodeto de microeléctrodos sensíveis 24. O efluxo de resultados de iodeto de carga negativa em uma diminuição no sinal em mV (sinal se torna mais negativo). Quando a concentração de iodeto libertado ao longo do tempo é representado, o declive é invertido (como mostrado na Figura 3) para mostrar um aumento na iodeto na exsolução terna ao longo do tempo.
K-Glu foi escolhido como o contra-ião como impermeabilizante é um exemplo de um anião que não passa através da proteína CFTR, não parece causar bloqueio significativo dos poros sob as condições utilizadas, e não causar interferência com o iodeto selectiva eléctrodo. Um ensaio poderia ser otimizado em torno de outro ânion, desde que atenda a esses critérios. Setenta e cinco concentrações de ânions mm foram selecionados empiricamente como as concentrações que deram boa captura e sinais suficientes para a medição no ensaio nas condições descritas. Haverá essencialmente qualquer libertação de iodeto de lipossomas carregados com iodeto de falta de CFTR funcional reconstituído até que as vesículas são permeabilizadas com detergente (Figura 3; traços de controlo), ao passo que CFTR reconstituído, carregado proteolipossomas-iodeto iodeto de mediar a libertação para a solução após a adição externa de MgATP (1 mM) para abrir o canal CFTR e valinomicina(20 nM) para impedir o desenvolvimento de um potencial de membrana (Figura 3A; ver rastreio para proteína: proporção em massa de lípidos de 1: 3000 (w / w)).
Valinomicina é um ionóforo que transporta especificamente potássio através da membrana, do seu gradiente de concentração e a concentração de 20 nM foi escolhida empiricamente como a concentração mais elevada que não perturbar a integridade do lipossoma vazio no presente sistema. Isto pode necessitar de ser optimizado para cada sistema particular. Sem adição de valinomicina, existe uma versão abreviada iodeto de poucos nM que rapidamente atinge um patamar (dados não mostrados). Embora estas condições são conhecidos de outra maneira para activar a actividade do canal máximo anião de CFTR (como na Figura 3A), verifica-se que a falta de uma resposta significativa reflecte o aumento instantâneo em carga positiva intralipossómico mediada por condução através do anião iodeto poro selectiva de CFTR , imediatamente limitando continuefluxo iodeto ous onde valinomicina não está incluída. Esta resposta mediada por valinomicina confirma que o efluxo de iodeto estava limitado nas experiências anteriores devido a acumulação de carga, apoiando a selectividade anião de CFTR reconstituído. Se CFTR faltava essa seletividade, potássio e iodeto teria sido capaz de efluxo de proteoliposomes revoga assim a necessidade de valinomicina para iniciar fluxo.
As concentrações de iodo medidos em todos esses momentos iniciais foram empiricamente escolhidos para estar dentro do intervalo de sensibilidade ótima para o eletrodo sensor de iodeto de empregada. A utilização de outros eléctrodos de iodeto pode requerer optimização destes factores. Depois de atingir um platô, Triton X-100 é adicionado a permeabilizar as proteoliposomes e liberar qualquer iodeto preso restante. Ao contrário das medições iniciais de iodeto (obtido entre 1 e 2 minutos após adição valinomicina), as leituras a estes parâmetros não são na gama linear das cali eléctrodosbração curva (dados não mostrados), o que impede uma avaliação precisa da fracção de lipossomas a partir do qual a proteína CFTR é capaz de mediar o efluxo de iodeto em relação ao número total de lipossomas no ensaio, ou a sua reconstituição funcional por cento.
A taxa de fluxo de iodeto reflecte o número de moléculas de proteína CFTR, a probabilidade de abertura e condutância unitária de cada canal CFTR. Assim, as taxas de efluxo de iodeto deve ser dependente do número e da probabilidade de abertura de cada molécula de CFTR. A previsão foi testado neste sistema através do aumento do número de moléculas de CFTR por lipossoma. A proporção de activada (fosforilada e MgATP tratado) proteína CFTR para lípido foi variada, com os racios variando entre 1: 300-1: 3000 (w / w) (Figura 3A). Quanto maior a quantidade de CFTR reconstituído presente nas proteolipossomas, maior será a taxa de efluxo (medido entre 1-2 minutos após a adição valinomicina), suportando a predição ttaxas de efluxo do chapéu são dependentes do número de moléculas de CFTR em cada lipossoma. A taxa de efluxo obtidos utilizando proteína específica: lipídio são reprodutíveis entre os dias experimentais e purificações de proteínas, destacando, assim, o rigor do método.
A taxa de efluxo de iodeto parece estar relacionado com a probabilidade de abertura do canal CFTR neste sistema reconstituído. Como fosforilação pela PKA é necessário para a activação de CFTR 31 (e avaliação por 32), espera-se que haverá uma baixa taxa de efluxo de iodeto de vesículas contendo CFTR que não foi fosforilada por tratamento exógeno PKA, onde a probabilidade de abertura é baixo . Em proteoliposomes que foram tratados PKA, a probabilidade de abertura será muito maior, resultando em uma taxa antecipada muito maior de efluxo. Na prática, para a PKA-CFTR tratado na presença de 1 mM de MgATP neste sistema, a taxa de efluxo de iodeto medido a partir de um a dois minutos após a adição de valinomycna é aproximadamente quatro vezes a taxa de proteína CFTR submetido a MgATP mas não PKA (Figura 3B). Estes resultados suportam a hipótese de que a taxa de efluxo relacionar para canalizar probabilidade aberto. Na prática, pode ser difícil comparar actividade neste ensaio directamente para abrir probabilidade dado que outros factores, tais como alterações dependentes do tempo na força motriz electroquímico irá influenciar a actividade observada efluxo. O leitor é alertado de que este ensaio não é um substituto para gravações detalhadas única atividade do canal.
Curiosamente, não é normalmente observada uma baixa taxa de efluxo de iodeto de proteína por "não fosforilado" na presença de MgATP que é significativamente maior do que o efluxo de lipossomas sem CFTR (Figura 3B, C). Este baixo índice pode refletir fosforilação basal de CFTR na S f 9 células sistema de expressão antes da purificação 33. CFTR purificado a partir de outra expressão systems podem ter diferentes níveis de fosforilação basal e, portanto, diferente actividade residual.
Este protocolo de purificação rápida rendimentos Wt-CFTR a partir de células Sf 9 em quase homogeneidade, no entanto para F508del- e G551D-CFTR, o método é melhor descrita como um processo de enriquecimento. Algumas bandas contaminantes são observados através de SDS-PAGE a 19, muitos dos quais correspondem a produtos de degradação de CFTR que são reactivos com anticorpos CFTR e parecem estar presentes antes da ruptura da célula. Os métodos de reconstituição e iodeto de fluxo são adequados para estas amostras enriquecidas de mutantes clinicamente relevantes. Tal como mostrado na Figura 3D, iodeto de efluxo significativo é medida tanto para F508del- (proteína: lípido proporção de massa de aproximadamente 1: 600) e G551D-CFTR (proteína: lípido de cerca de 1: 300). Embora ambos os mutantes possuem uma actividade mais baixa do que absoluta Wt-CFTR (relação proteína: massa de lípidos de 1: 1200), é difícil comparar directamente as amostras como a quantificaçãonão pode ser tão precisos para os mutantes que estão contaminados com produtos de degradação CFTR. No entanto, tanto a F508del-CFTR e G551D purificado por estes métodos, reconstituída e sujeita a medições de efluxo respondem como esperado a pequenas potenciadores da molécula (Figura 4), e apresentam função semelhante ao canal de proteína purificada pelo método de purificação mais rigorosa PFO 19.
A actividade do canal de CFTR purificada e reconstituída pode ser modulada por inibidores de moléculas pequenas e potenciadores
CFTR inh -172 34 é o inibidor de CFTR mais específico disponível que foi mostrado para inibir a probabilidade de abertura dos canais de cloreto CFTR nas medições de condutância de canal único 35 e para inibir a actividade de CFTR em outros estudos 22,36. Como mostrado na Figura 3C, a taxa de efluxo após valinomicina adição é significativamente reduzida pelo pré-tratamento com INH CFTR ub> -172. Assim, este ensaio da actividade de canal de uma população de moléculas de CFTR purificados reconstituídos e é eficaz na actividade de moduladores de informação, tais como o ligando de CFTR inibidora inh -172.
O ensaio não é sensível e altamente aplicável para análise dos efeitos do tratamento de molécula pequena potenciador bem. Como mostrado na Figura 4, todos os três genótipos CFTR testados são significativamente potenciado por pequenas potenciadores de moléculas activas, tais como Kalydeco / VX-770 ou TRV-532 (Figura 4C; mostrado para G551D), enquanto um análogo inactivo não tem qualquer efeito sobre o efluxo de iodeto de actividade de CFTR (mostrado para F508del-CFTR; Figura 4B). O ensaio é aplicável à análise de dependência da concentração potenciador, e o papel da fosforilação em ATP e a actividade de CFTR mediada por potenciador.
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Figura 1: (A) Fluxo de trabalho para o trabalho descrito nesta publicação projeto Ensaio e fluxo de trabalho (B) Representação esquemática do experimento efluxo iodeto... Uma versão modificada do painel B foi originalmente publicado no The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; and Bear, CE fibrose cística condutância transmembrana regulador (CFTR) Potenciador VX-770 (Ivacaftor) Abre o defeito Canal Gate of Mutant CFTR em uma forma dependente da fosforilação mas ATP-independente. 2012; 287: 36639-36649. © A Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular.
Figura 2:. A Wt-CFTR proteína CFTR prata purificação rápida rendimentos procedimento purificado corado em gel de SDS-PAGE e Oesteern blot utilizando o anticorpo M3A7 CFTR humano para proteína purificada Wt-CFTR em detergente DDM (1 ug e 0,1 ug para o gel e blot, respectivamente), isolados a partir de S f 9 células que sobre-expressam um (His) 10 tagged versão a proteína. Wt-CFTR (> 90% pura) é detectada a 150 kDa, adequado para esta proteína sem glicosilação complexo. Esta pesquisa foi originalmente publicado no The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; and Bear, CE fibrose cística condutância transmembrana regulador (CFTR) Potenciador VX-770 (Ivacaftor) Abre o defeito Canal Gate of Mutant CFTR em uma forma dependente da fosforilação mas ATP-independente. 2012; 287: 36639-36649. © A Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular.
Figura 3: O irelatórios de ensaio de efluxo odide regulada a actividade de canal para a proteína CFTR purificada e reconstituída. (A) purificado e fosforilada Wt-CFTR reconstituído em proteína: lípido de 1: 300 (w / w), 1: 1200 (w / w) e 1: 3000 (w / w) é um mediador de efluxo de iodeto a partir do lúmen das vesículas a o banho de grandes quantidades ao longo do tempo após adição de MgATP 1 mM e 20 nM valinomicina. A adição de 0,1% (w / v) de Triton X-100 para permeabilizar as libertações de proteolipossomos iodeto presos no lúmen das vesículas no final da experiência. (B) de iodeto de efluxo curso inicial tempo para reconstituída proteína WT-CFTR que não tinha sido pré-fosforilados. (C) as taxas iniciais de iodeto de efluxo demonstrar a dependência da actividade observada na proteína CFTR funcional. PKA fosforilação da proteína é necessária para a actividade de canal significativa, que é inibida pela adição do inibidor de CFTR, CTTR inh -172 (20 uM). Os dados são médias ± SEM; * P <0,05, *** p <0,0001. (D) Vários genótipos produzem sinais CFTR regulamentados no ensaio de efluxo iodeto, incluindo em peso, F508del- e G551D-CFTR versus controle. Os dados são médias ± SEM; * P <0,05; *** P <0,0004 vs. controle. Esta pesquisa (porções de dados em painéis A, C e D) foi originalmente publicado no The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; and Bear, CE fibrose cística condutância transmembrana regulador (CFTR) Potenciador VX-770 (Ivacaftor) Abre o defeito Canal Gate of Mutant CFTR em uma forma dependente da fosforilação mas ATP-independente. 2012; 287: 36639-36649. © A Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular.
Figura 4: A potenciação dependente da fosforilação de CFTR por moléculas pequenas podem ser interrogado utilizando osistema de efluxo em peso de iodeto, F508del- e G551D-CFTR. (A) Peso-CFTR é potencializado significativamente pela potenciador VX-770 (10 mM), somente no estado PKA fosforilada. Os dados são médias ± SEM, * p <0,01 vs + PKA-VX-770. (B) VX-770 (10 uM), mas não um análogo inactivo, V-09-1188 (10 uM), potencia significativamente o efluxo de iodeto de actividade de fosforilada F508del-CFTR. Os dados são médias ± SEM, n = 3, *** p <0,001 vs -VX-770 (c) A potenciação de G551D-CFTR por 10 uM TRV-532 VX-770 ou controlo.. Os dados são médias ± SEM, n = 5, ** p <0,001, *** p <0,0001 vs. controlo -VX-770. Esta pesquisa (painéis ac) foi originalmente publicado no The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; and Bear, CE fibrose cística condutância transmembrana regulador (CFTR) Potenciador VX-770 (Ivacaftor) Abre o defeito Canal Gate of Mutant CFTR em um Phosphorylation-dependente, mas ATForma-P independente. 2012; 287: 36639-36649. © A Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular.
| Amortecedor | Nome | Conteúdo | pH | Ajustar o pH usando |
| Tampão 1 | 2% fos -choline | 2% (w / v) de detergente fos -choline 14 em 10 mM de imidazol, 25 mM de HEPES | 7,4 | Imidazol / HEPES |
| Tampão 2 | 10 mM de imidazol | 10 mM de imidazol, 25 mM de HEPES (sem detergente) | 7,4 | Imidazol / HEPES |
| Tampão 3 | 10 mM de imidazole + DDM | 10 mM de imidazol, 25 mM de HEPES, 1 mM de dodecil-β-D-maltósido | 7,4 | Imidazol / HEPES | Tampão 4 | Imidazole 50 mM + DDM | 50 mM de imidazol, 25 mM de HEPES, 1 mM de dodecil-β-D-maltósido | 7,4 | Imidazol / HEPES |
| Buffer de 5 | 600 mM imidazol + DDM | 600 mM de imidazol, 25 mM de HEPES, 1 mM de dodecil-β-D-maltósido | 7,4 | Imidazol / HEPES |
| 6 Tampão | 75 mM de KI + DDM | Kl 75 mM, 20 mM de MOPS, 1 mM de dodecil-β-D-maltósido | 7,4 | KOH |
| Tampão 7 | 75 mM de KI | KI 75 mM, 20 mM MOPS | 7,4 | KOH |
| Tampão 8 | 25 mM de HEPES + DDM | HEPES 25 mM, 25 mM de NaCl, 1 mM de dodecil-β-D-maltósido | 7,4 | HCl / NaOH |
| Tampão 9 | 75 mM de K-Glu | 75 mM de K-glutamato, 20 mM de MOPS | ight "> 7,4KOH / ácido glutâmico | |
| Tampão 10 | Kl 15 mM | KI 15 mM, 20 mM MOPS | 7,4 | KOH |
Tabela 1: Tabela de tampões.
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Discussion
Houve um número limitado de protocolos de purificação de comprimento completo, o isolamento de CFTR funcional, a partir de uma variedade de sistemas de sobre-expressão celulares. O método descrito aqui é vantajosa, pois permite rápida purificação do WT-CFTR ou altamente enriquecido de F508del- e G551D-CFTR em quantidades moderadas, que é altamente funcional em ensaios, incluindo ATPase e medidas diretas de função de canal, incluindo medições de canal único em bicamada planar sistemas e medidas comprovados da função do canal população CFTR que são altamente relevantes para o estudo de pequenas moléculas 19-21. O método de purificação está integrado num protocolo de reconstituição rápida e eficaz, no entanto, a proteína purificada a partir de outros métodos podem ser acoplados a reconstituição deste protocolo, bem como, desde que o detergente purificação é passível de remoção de forma semelhante.
Ao contrário de experiências de canal único complicadas e meticuloso de excpedaços de membrana zados, os métodos aqui descritos permitem uma avaliação robusta e simples da função do canal CFTR, e unicamente esta medida relata a função de uma população maior de canais de CFTR, em vez de uma ou poucas moléculas. Ao contrário das técnicas envolvendo pedaços de membrana, este método permite a avaliação directa dos efeitos moduladores de pequenas molécula do canal na ausência quase completa ou de proteínas associadas, dependendo da eficácia do processo de purificação acoplado.
As etapas críticas no âmbito do protocolo
Embora existam várias etapas críticas na reconstituição funcional da CFTR para o ensaio de fluxo de ânions, como notas constantes do Protocolo, a otimização da relação proteína: lipídico durante CFTR reconstituição é fundamental. Essa otimização é necessário para cada genótipo CFTR.
Modificações e solução de problemas da técnica
As res mV basaisponse para a sonda utilizada aqui, durante o ensaio de efluxo de iodeto com amostras preparadas como descrito é normalmente de -20 a -50 mV. Desvios significativos desse intervalo sugerem que pode haver problemas com a amostra. Outras sondas vendidos por diferentes fabricantes podem ser diferentes das diretrizes fornecidas aqui. Se uma linha de base estável não pode ser alcançado, o detergente residual ou inactivo, desnaturado, proteína de baixa qualidade podem ser permeabilização das vesículas de iodeto.
Não é possível detectar uma mudança significativa na taxa de efluxo valinomicina iodeto dependente de lipossomas contendo CFTR fosforilada na presença de MgATP pode refletir várias questões, as quais devem ser investigadas. Esses problemas incluem: má qualidade, CFTR parcialmente desnaturado ou CFTR impuro; remoção incompleta de detergente durante a reconstituição; proteína não ideal: relação lipídico em proteoliposomes; ou valinomicina insuficiente adicionado, tornando dissipação da carga incompleta.
O iOs ensaios de efluxo odide oferece a flexibilidade de utilização da proteína CFTR pré-fosforilado (como descrito no protocolo), ou a CFTR fosforilado durante o ensaio. Se a proteína não foi fosforilada reconstituído durante o processo de purificação, a amostra pode ser fosforilado durante o ensaio de efluxo de iodeto no passo 3.2.7, por adição de PKA com o MgATP. Neste caso, assegurar que a linha de base é registada por pelo menos 5 minutos para assegurar que a proteína tenha sido suficientemente fosforilada pela proteína quinase A função antes da medição com adição de valinomicina. Resultados semelhantes são obtidos por qualquer dos métodos.
Durante o protocolo, o modulador é permitido molécula para interagir com a proteína de CFTR por 5 min antes de a medição de actividade por adição de MgATP e, em seguida, valinomicina. Como a maioria dos moduladores CFTR são muito lipofílico, pode demorar algum tempo entre Além da associação banho e equilíbrio com a proteína CFTR. O ensaio não pode prosseguir sem the adição de valinomicina, e, assim, nenhuma informação é perdida através da realização do ensaio desta maneira. Em situações em que o utilizador não está em causa que pode haver um intervalo de tempo antes de interacção da molécula pequena com a proteína, o ensaio pode ser realizado pela adição de modulador aguda após a adição de valinomicina, enquanto ainda na fase inicial de taxa a medição.
Limitações da técnica
Como afirmado anteriormente, este ensaio baseado proteoliposomal fluxo de actividade do canal regulamentado por uma população de moléculas de CFTR de comprimento completo purificados e reconstituídos fornece um método único para interrogar ligandos que modificam directamente a actividade. No entanto, o método é limitado pelo facto de não proporcionar uma visão sobre o mecanismo através do qual os ligandos mudar a taxa de fluxo através de CFTR. Idealmente, o ensaio de fluxo de CFTR proteoliposomal purificado e reconstituído deve ser utilizado em combinação com o bordo planarestudos id bicamada de atividade de um único canal. Esta combinação daria a conhecer o estado da proteína que se liga a ligandos, isto é, a abertura e / ou o estado fechado.
Significado no que diz respeito aos métodos existentes
Existe actualmente uma falta de métodos para avaliar a interacção directa de moléculas pequenas com o canal CFTR contra pequenos moduladores de moléculas que interagem com um outro componente celular para alterar indirectamente a actividade do canal, por exemplo, através de um modulador ou via de sinalização ou de perturbação importante proteína-proteína interações. O método de efluxo iodeto demonstra uma interacção directa com a proteína de qualquer pequena molécula que modula a actividade do canal de CFTR. Apesar do baixo rendimento forma das medições, continua a haver um valor considerável nestes métodos únicos para estudar a interacção directa de CFTR com pequenas moléculas e potenciadores correctores. Muitas pequenas molecule moduladores estão em desenvolvimento por ambos os grupos acadêmicos e da indústria farmacêutica para o tratamento de pacientes com FC clinicamente, pois este é o maior objetivo da pesquisa CF atual. Prevê-se que os métodos descritos aqui irão auxiliar no desenvolvimento e validação do mecanismo de acção das mais promissoras destas moléculas.
Futuras aplicações da técnica
Os métodos empregados aqui também são altamente passíveis de adaptação a outras proteínas de interesse. Com efeito, uma modificação dos métodos descritos foi empregado para estudar dois P. proteínas da membrana aeruginosa implicado no movimento de substratos através da membrana aniónicos 26,27, demonstrando a utilidade e a versatilidade desses métodos. A sua utilização no estudo de canais e transportadores de aniões adicionais está previsto no futuro.
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Disclosures
Os autores reconhecem o conselho do Dr. Mohabir Ramjeesingh durante o desenvolvimento dos métodos de purificação descritos aqui. Estes estudos foram apoiados por subvenções de funcionamento a CEB dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) e fibrose cística Canadá (CFC). PDWE foi apoiado em parte pela Irmandade prêmios através do CIHR e CFC. Os autores reconhecem a prestação de corrector, potenciador e compostos inibidores de Dr. R. Pontes (Rosalind Universidade de Medicina e Ciência) e distribuição pelos Fundação de Fibrose Cística Therapeutics (CFFT). Os autores reconhecem também um excelente serviço pela facilidade de cultura celular Baylor (NIH concessão P30 CA125123) em expressar Wt e proteína CFTR mutante usando o sistema de baculovirus. O inativo VX-770 analógico, V-09-1188, foi um presente de Vertex Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001) |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup. |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
References
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
- Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
- Genetic Analysis Consortium. , http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
- Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
- Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
- Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
- Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
- Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
- Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
- Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
- Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
- Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
- Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
- Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
- Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
- Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
- Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
- Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
- Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. , Academic Press. 337-357 (2010).
- Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
- Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
- Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
- Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
- Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
- Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
- Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).
