Summary
Hier beschreven is een snelle en efficiënte procedure voor de functionele reconstitutie van gezuiverde wildtype en mutante CFTR-eiwit dat activiteit behoudt deze chloride kanaal, die defect in Cystic Fibrosis. Jodide efflux uit opgelost proteoliposomen gemedieerd door CFTR maakt studies van het kanaal en de effecten van kleine moleculen.
Abstract
De Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is een uniek-kanaal vormen lid van het ATP-binding cassette (ABC) superfamilie van transporteurs. De fosforylering en nucleotide afhankelijk chloride kanaal activiteit van CFTR is veelvuldig onderzocht in volledige cel systemen en als enkele kanalen in weggesneden membraan patches. Veel Cystic fibrosis veroorzaken mutaties bleken deze activiteit veranderen. Terwijl een klein aantal zuiveringsprotocollen gepubliceerd, zijn een snelle reconstructie methode kanaal activiteit behoudt en een geschikte methode voor het bestuderen populatie kanaal activiteit in een gezuiverd systeem ontbroken. Hier snelle werkwijzen beschreven voor zuivering en functionele reconstitutie van de volledige lengte CFTR-eiwit in proteoliposomen gedefinieerde lipiden die activiteit behoudt als gereglementeerde halogenide kanaal. Deze reconstructie methode om samen met een nieuw-flux gebaseerde test van de activiteit op het kanaal is een geschikt systeem voorhet bestuderen van de bevolking kanaal eigenschappen van wild-type CFTR en de ziekte veroorzaken mutanten F508del- en G551D-CFTR. Specifiek, de methode bruikbaarheid bij het bestuderen van de directe effecten van fosforylatie, nucleotiden en kleine moleculen zoals versterkers en inhibitoren op CFTR kanaalactiviteit. De werkwijzen zijn ook ontvankelijk voor de studie van andere membraankanalen / transporters voor anionische substraten.
Introduction
Chloride transport over de apicale membranen van epitheelcellen in dergelijke weefsels zoals de longen, darmen, alvleesklier en zweetklieren wordt voornamelijk gemedieerd door de Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), een ATP-en-fosforylering gereguleerd lid van de ABC (ATP- Binding Cassette) C subfamilie van membraaneiwitten (besproken in 1). Net als andere leden van de subfamilie ABCC, CFTR is een grote multi-spanning integraal membraaneiwit dat ATP bindt op twee nucleotide bindingsplaatsen gevormd op het grensvlak van de nucleotide-bindende domeinen (NBD), waar het bezit geringe ATPase activiteit op één het terrein. Anders dan andere ABCC subfamily leden CFTR heeft zich ontwikkeld als een uniek gereguleerde Cl kanaal niet als een actieve opgeloste stof transporter.
Mutaties in CFTR oorzaak Cystic Fibrosis, een ziekte die meerdere organen zoals de longen, maagdarmkanaal, pancreas en voortplantingsorganen, waardoor Morbidity en mortaliteit bij jonge volwassenen. Longziekten goed typisch voor vroege mortaliteit in Cystic Fibrosis en in de meeste gevallen wordt veroorzaakt door het verlies van CFTR-functie op het oppervlak epitheel van de geleidende luchtwegen. Het ontbreken van CFTR chloride kanaal activiteit veroorzaakt een reductie van zowel Cl - en waterbeweging over het oppervlak epitheel de vloeistoflaag op het apicale oppervlak van de trilhaar respiratoire epitheel wijzigen. Dit resulteert in een oppervlak viskeuze vloeistof luchtweg die het vermogen van trilharen respiratoire epitheelcellen vermindert effectief duidelijk ziektekiemen uit de luchtwegen. Bijgevolg meeste CF-patiënten lijden aan herhaalde aanvallen van longontsteking en longschade als gevolg van ontsteking.
Zoals verwacht, studies van het werkingsmechanisme van de normale CFTR-eiwit primair gericht op gedetailleerde elektrofysiologische studies zijn kanaal gating activiteit. Enkel kanaal studies hebben aangetoond direct dat CFTR functioneert als een PKA-afhankelijke Cl- Kanaal dat een ATP-gereglementeerde poort 2 bezit. Gedetailleerde elektrofysiologische studies veel informatie over één CFTR kanalen 1,3, maar er kan zorg of de kenmerken van een bepaald afzonderlijk kanaal dat is onderzocht weerspiegelt de gehele bevolking van CFTR kanalen en derhalve de enkelkanaals resultaten moet altijd worden beschouwd, samen met methoden om de macroscopische bevolking te bestuderen. Directe test van de bevolking kanaal activiteit van gezuiverd CFTR heeft de potentie om inzicht te geven in de moleculaire defect in verband met ziekte-veroorzakende mutaties en ontdekking van chemische modulators die reparatie gemuteerde CFTR-eiwitten rijden. Tot op heden zijn er meer dan 1900 verschillende mutaties in CFTR gedacht te veroorzaken Cystic Fibrosis 4. De belangrijkste mutatie, F508del-CFTR, bij ten minste één allel in ongeveer 90% van de patiënten in Noord-Amerika en Europa leidt tot een eiwit misfoldingnd retentie in het endoplasmatisch reticulum 5. F508del-CFTR heeft ook andere gevolgen, waaronder defecte kanaal activiteit 6-9. De resulterende afwezigheid van CFTR van het celoppervlak geassocieerd met ernstige ziekte. G551D-CFTR, een minder voorkomende mutatie wordt gedacht goed nog gevouwen disfunctioneel als chloride kanaal op het celoppervlak 6. Het ontwikkelen van moleculen correctors en versterkers heeft als doel het corrigeren vouwen en / of handel van mutanten zoals F508del CFTR naar het celoppervlak, en versterkende of verhogen van de kanaalactiviteit van mutaties zoals G551D wanneer aanwezig op het celoppervlak respectievelijk . Terwijl de correctors VX-809 en VX-661 (nog niet goedgekeurd voor gebruik bij patiënten, de potentiator Kalydeco (ivacaftor, VX-770) wordt gebruikt bij 150 mg elke 12 uur bij CF-patiënten> 6 jaar met ten minste één G551D -CFTR mutatie, en meer recent voor patiënten met een van G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pen G1349D. Kalydeco zowel veilig en resulteert in verbetering van de klinische metingen van CF ziekte 10, maar het werkingsmechanisme van deze kleine moleculen is slecht begrepen bij de FDA goedgekeurd voor gebruik bij patiënten.
Een handvol CFTR zuiveringsmethoden zijn eerder beschreven 2,11-18, waarvan vele vereisen een aanzienlijke tijd in beslag. In een recente publicatie 19, werd een unieke snelle zuivering en reconstitutie werkwijze beschreven voor CFTR overexpressie in de Sf 9 cellen expressiesysteem en het gezuiverde eiwit in bepaalde lipide systemen gebruikt om CFTR halogenide kanaalactiviteit assay te ontwikkelen voor een populatie van CFTR moleculen. De assay recapituleert de bekende effecten van fosforylering, nucleotiden en inhibitoren op CFTR-functie. Het systeem werd gebruikt om de effecten van de potentiator ondervragen VX-770 / Kalydeco op gew- (wild-type), F508del- en G551D-CFTR en werd voor het eersttijd dat het geneesmiddel direct een interactie met het CFTR-eiwit te zijn kanaal activiteit in een ATP-onafhankelijke wijze versterken, demonstreren het nut en de toepasbaarheid van deze werkwijzen voor het bestuderen van de interactie van CFTR en mutanten met nucleotiden en kleine moleculen uit een populatie perspectief beantwoorden klinisch relevante vragen over het eiwit. De werkwijzen zijn ook gebruikt om andere versterkingsmiddel moleculen en derivaten daarvan 20, alsook de effecten van een klein molecuul corrector op de activiteit van het eiwit 21 te bestuderen.
Efflux assay zijn gebruikt in vele studies die eerder voor de activiteit van CFTR mutanten en de effecten van CFTR-modulerende verbindingen op de activiteit, met inbegrip van hele cel assays met elektroden radioactieve tracers en fluoroforen 22,23, membraan blaasjes met ion selectieve elektroden 24 onderzoeken en gezuiverd gereconstitueerde CFTR met radioactieve tracers 25. Echter the gebruik van ion-selectieve elektroden aan gezuiverde gereconstitueerde CFTR studie werd voor het eerst onlangs 19 gemeld. Een aanpassing van de huidige methode is gebruikt voor de bereiding en functionele karakterisatie van twee membraaneiwitten in Pseudomonas aeruginosa, een gemeenschappelijk CF pathogeen. Reconstitutie van gezuiverde alge buitenmembraan eiwit gekoppeld jodide efflux metingen werden gebruikt om een model van anionische alginaat secretie ondersteunen door deze transporteur 26. Reconstitutie en jodide efflux metingen werden toegepast op gezuiverde Wzx eiwit, waardoor een model voorgesteld dat een H + -afhankelijke antiport mechanisme lipiden gekoppelde oligosaccharide translocatie over het bacteriële binnenmembraan suggereert van dit eiwit 27. In beide gevallen werd jodide gebruikt als een surrogaat voor de anionische substraat, zij het in lagere doorvoersnelheid dan men zou verwachten voor een native substraat. De werkwijze kan geschikt zijn voor aanpassing aan andere eiwitten met zijn cationic vervoer of geleidingsroutes voor anionische substraten.
Hier een snelle zuiveringsprocedure beschreven voor het CFTR-eiwit en reconstitutie in proteoliposomen gedefinieerde lipide. De snelle reconstitutie procedure kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met CFTR gezuiverd door andere methoden, mits het soort wasmiddel bij de zuivering vatbaar is voor verwijdering door de hier gebruikte methoden of kan worden vervangen door een geschikt reinigingsmiddel voor de reconstitutie procedure. Het jodide efflux Werkwijze voor het meten van kanaalactiviteit van gezuiverd en gereconstitueerd CFTR-eiwit wordt beschreven en enkele typische resultaten die kunnen worden verkregen uit deze werkwijze worden gepresenteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zuivering van CFTR
OPMERKING: Zie de tabel van materiaal en apparatuur voor een lijst van apparatuur en materialen die worden gebruikt in dit protocol. Een gedetailleerd protocol bestaat overexpressie van humaan WT-CFTR en mutanten in Sf 9-baculovirus expressiesysteem 17,28. Overexpressie van CFTR en pellets, van S f 9 cellen volgens dit protocol te bereiden.
- Ruwe membraanbereiding
- Verkrijgen van een vers of ontdooien van een bevroren Sf 9 celpellet van een kweek van 500 ml van cellen over-expressie wildtype-, F508del- of G551D CFTR-eiwit met een C-terminale His-tag 10, gekweekt door standaard celkweek werkwijzen, zoals eerder beschreven 17,28. Celpellets een volume van ongeveer 5 ml en een nat gewicht van ongeveer 5 g hebben.
- Resuspendeer Sf 9 cellen in 20 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 met protease inhibitor cocktail (1 tablet per 50 ml) bij 4 ° C, zodat demonster verschijnt visueel homogeen en geen klonten van cellen blijven.
- Lyse cellen met behulp van een hoge druk cel disruptor (tabel van materialen en apparatuur), het bereiken van een minimum van 10.000 psi (bij voorkeur 15.000-20.000 psi) gedurende 2 minuten per passage. Houd het monster bij 4 ° C gedurende lysis.
- Verzamel het monster in een buis op het ijs na de lysis periode direct daarna herladen het monster in de cel disruptor. Herhaal lysis procedure 3 keer. Onderzoek onder een microscoop te waarborgen minder dan 10% intact blijft.
OPMERKING: andere methodes lyseren cellen, zoals glasparels, enz. Zijn niet strikt voor dit systeem onderzocht hoewel een gebruiker te klikken een alternatieve methode geschikt is.
- Verzamel het monster in een buis op het ijs na de lysis periode direct daarna herladen het monster in de cel disruptor. Herhaal lysis procedure 3 keer. Onderzoek onder een microscoop te waarborgen minder dan 10% intact blijft.
- Centrifuge cellysis materiaal bij 4 ° C in een hoge snelheid centrifuge bij 2000 xg gedurende 20 min. Gebruik de bovenstaande vloeistof en gooi de pellet. Verdeel het supernatant tussen 20 en centrifugeer de monsters gedurende 1 uur bij 4 ° C bij 125.000 xg in een tafelblad ultracentrifuge.
- Verwijderen en gooi het supernatant, zorg dat u de pellet, en op te slaan pellets in dezelfde buizen bij -80 ° C niet te verstoren voor minder dan 2 maanden tot gebruik, of te behouden op ijs en ga verder met de zuivering onmiddellijk.
- CFTR oplosbaar
- Verkrijgen 1-4 vers of bevroren Sf 9 ruwe membraanpellets en resuspendeer elk in 1 ml buffer 1 (2% fos -choline; zie Tabel 1 voor de volledige receptuur) bij 4 ° C op ijs, met een 25 G naald en 1 ml spuit totdat de oplossing homogeen oog zonder zichtbare celmembraan klonten. Wanneer meer dan één pellet wordt oplosbaar blijven elk monster de instructies voor een enkele korrel parallel behandelen hieronder bundeling van monsters in stap 1.3.2.
- Los 1 mini proteaseremmer tablet 1 ml van Buffer 2 (10 mM imidazool, zie tabel 1) dat fos -choline 14 detergens mist (proteaseremmers 10x concentgewaardeerd dan hun aanbevolen verdunning op dit punt) en voeg 100 ul aan de geresuspendeerde onzuivere membraanpellet (proteaseremmers zijn dan de aanbevolen verdunning op dit punt). Ingesteld op ijs voor 45-60 min met het mengen door inversie 5 keer om de 5 min.
- Centrifugeer geresuspendeerde ruwe membraanpellet in een tafelblad ultracentrifuge gedurende 25 min bij 125.000 xg en 4 ° C. Bewaar de supernatant, die opgeloste CFTR bevat en de pellet weggooien.
- Column binding, fosforylering en elutie
- Was 400 ul van nikkel-NTA (nitrilotriazijnzuur) agarose slurrie of gelijkwaardige hars met 1 ml van Buffer 2 (10 mM imidazool, zie tabel 1) dat detergens mist, te verwijderen oplosmiddel en buffer bij 4 ° C. Herhaal wassen twee keer meer.
- Combineer oplosbaar CFTR, resterende proteaseremmer (900 ui) en nikkel hars (400 pl suspensie) tot een totaal van 10 ml met buffer 2 (10 mM imidazol; zie Tabel 1) which mist elke toegevoegd schoonmaakmiddel. De fos -choline 14 concentratie effectief verdund tot 0,2% (w / v) bij deze stap. Als er meerdere buizen zwembad alle monsters die oplosbaar CFTR, proteaseremmers, nikkel-NTA-hars en 0,2% (w / v) fos -choline-14 op dit punt. Incubeer gedurende 60 min bij 4 ° C onder zacht schudden.
- Pass CFTR-proteaseremmer-nikkel-NTA-oplossing in een kleine screening kolom (tabel 1) of een gelijkwaardige lege kolom.
- Was de nikkel NTA hars, die wordt vastgehouden in de kolom met 4 ml per initiële pellet buffer 3 (10 mM imidazool + DDM; zie tabel 1) dat fos -choline 14 mist maar bevat 1 mM DDM (dodecylmaltoside detergent), bij 4 ° C. Toevoeging van DDM reinigingsmiddel niet significant verandert de pH van deze buffer.
- Bereid PKA-MgATP door toevoeging van 25 ul (5 mM, eindconcentratie) van MgATP, 2500 U van cAMP-afhankelijke proteïne kinase A katalytische subeenheid (PKA) 475 gl buffer 3 (10 mM imidazool + DDM; zie tabel 1) op de kolom. Fosforyleren eiwitten door het afdichten van het ondereinde van de kolom met een pet of Parafilm, en het toevoegen van 500 pi van PKA-MgATP oplossing van elke eerste pellet gebruikt.
- Incubeer bij kamertemperatuur (20 ° C) gedurende 20 minuten onder zacht mengen en opnieuw suspenderen van de hars met een 1 ml pipet elke 2 minuten opdat PKA is in contact met het gehele oppervlak van de nikkel-NTA hars.
- Verwijder de dop en elueren de PKA / MgATP oplossing uit de kolom. Was de kolom met 2 ml buffer 3 (10 mM imidazool + DDM zie tabel 1) bij 4 ° C.
- Vermenigvuldig het aantal korrels in het experiment 4. Was de kolom met het aantal ml buffer 4 (50 mM imidazol + DDM zie tabel 1) bij 4 ° C door toevoeging van 4 ml buffer aan de kolom, waardoor dat het door en direct verwarmd toevoegen komende 4 ml portie aan de kolom.
- Concentreer eiwitmonster om imidazool en laag moleculair gewicht afbraakproducten te verwijderen met behulp van een centrifuge filter apparaat (100.000 moleculair gewicht cut-off), zoals in de tabel van materialen en apparatuur of ander soortgelijk apparaat beschreven, in een totaal van 10 ml buffer 6 (75 mm KI + DDM; zie Tabel 1) of andere buffer van keuze die 1 mM DDM (zoals buffer 7 voor niet-jodide efflux experimenten, 25 mM HEPES + DDM; zie Tabel 1), door centrifugeren bij 2000 xg en 4 ° C ongeveer 20 min tot het monster geconcentreerd tot 200 pl. Verdun het monster tot 10 ml en herhaal de concentratie stap.
LET OP: In onze ervaring (niet gepubliceerd), imidazool aanzienlijk inhibeetjes de ATPase activiteit van CFTR en dient deze stap door verdunning en concentratie worden verwijderd minste tweemaal indien het monster wordt gebruikt voor functionele metingen. - Verzamel geconcentreerde gezuiverd CFTR. Bewaar bij 4 ° C in aanwezigheid van DDM buffer tot gebruik binnen 1-2 dagen verder onmiddellijk aan de reconstitutie stap. Niet in de vriezer het gezuiverde eiwit, zoals in onze ervaring die we waarnemen verminderde activiteit.
2. Reconstructie van CFTR
- Lipidepreparaat
OPMERKING: CFTR is met succes opgelost in ei PC, POPC, 2: 1 (w / w) ei PC: POPC (1: 1 w / w) mengsel of een mengsel van PE: PS: PC: ergosterol, 5: 2 2: 1 (w / w).- Voor jodide efflux experimenten, droge 5 mg Egg PC (200 ul van 25 mg / ml bouillon, zie Tabel van materialen en apparatuur) onder een stroom van argon gas gedurende 20 min bij kamertemperatuur in een Pyrex of andere stevige (niet-borosilicaat ) glazen buis.
- Met absorptie bij 280 nm, een ELISA eenssay of andere wijze, de mogelijke concentratie van de gezuiverde CFTR eiwit monster. Voor jodide efflux experimenten met wildtype CFTR, gebruikt een eiwit: vet verhouding van 1: 300-1: 3000 (w / w) om een voldoende signaal te produceren. Voor G551D- en F508del-CFTR gebruikt een eiwit: vet verhouding van ongeveer 1: 200-1: 1200 (w / w) om efflux te detecteren.
- Optimaliseer het eiwit: lipide-ratio voor elke specifieke systeem. Bereken de hoeveelheid gezuiverde eiwit nodig. Bereken het volume van buffer met 1 mM DDM vereist om een uiteindelijke volume van 1 ml, dat wil zeggen 1 ml maak - (volume eiwitoplossing vereist) = volume buffer.
- Voeg de berekende volume van de gewenste buffer-systeem met 1 mM DDM naar de gedroogde lipide (maar niet toe het CFTR-eiwit op dit moment) en bedek de glazen buis met Parafilm. Voor jodide efflux experimenten, opnieuw in suspensie lipiden in Buffer 6 (75 mM KI + DDM; zie tabel 1). Voor andere experimenten opnieuw in suspensie in buffer 8 (25 mM HEPES + DDM, zieTabel 1) of een andere gewenste interne buffer bevattende 1 mM DDM.
- Vortex gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur te helpen bij suspensie van het lipide in de buffer DDM. Alternatief Verwarm het monster tot 37 ° C gedurende 1-2 min voor vortexen.
- Suspendeer het lipide herhaaldelijk bij kamertemperatuur met een 1 ml spuit en 25 G naald totdat geen lipide film zichtbaar aan de zijkanten van de buis. Vermijd het injecteren van lucht in de oplossing die fijne bubbels zou produceren en te helpen bij de oxidatie van jodide en lipiden.
- Ultrasone trillingen de geschorste lipide in de Parafilm bedekt buis voor een 20 sec uitbarsting in een badsonificeerinrichting met ijs, en dan meteen over te dragen aan ijs gedurende 1 min. Herhaal dit 3 keer.
OPMERKING: Intense sonicatiebuffer blijkt jodide oplossingen geel als gevolg van oxidatie. Vermijd daarom te hoge geluidsgolven. Bewaak het monster voor kleur verandert. Als een kleurverandering wordt opgemerkt, gooi het monster en opnieuw voor te bereiden. De kleurverandering door oxidatie van sommigehet jodide zou leiden tot oxidatie van de lipiden onder dezelfde omstandigheden. Het verplaatsen van de lucht uit de buis met argongas voor sonificeren de oplossing helpt oxidatie van lipiden en jodide voorkomen. Intense geluidsgolven kan een slechte kwaliteit of bekraste glazen buizen resulteert in het verlies van het monster te breken. - Voeg de hoeveelheid gezuiverde CFTR berekend in stap 2.1.3 het lipide gesoniceerd monster een een eindvolume van 1 ml te bereiken. Meng het eiwit met de lipide en schoonmaakmiddel door resuspensie 10 keer met een 25 G naald en 1 ml spuit.
- Stel lipiden en eiwitten monster op ijs gedurende 30 minuten met wervelende van de buis tot 5 keer om de 5 min mengen.
- -Detergent bindend column voorbereiding
- Zorg voor een eenmalig gebruik commercieel-detergent bindend spin-kolom (zie tabel van materialen en apparatuur) met een 1 ml volume capaciteit en breek het tabblad onderaan te beginnen met de kolom stroomt.
- Centrifugeer de kolom gedurende 2 min bij 2.000 xg om de opberg verwijderenUffer, en gooi deze buffer.
- Voeg 5 ml buffer 7 (75 mM KI, zie tabel 1) op de kolom en centrifugeer bij 200 xg gedurende 4 min aan de wasbuffer elueren. Herhaal deze stap nog 2 maal voor een totaal van 3 wassingen om alle sporen van de opslagbuffer te verwijderen. Gooi alle doorstroming.
LET OP: Het is cruciaal dat de buffer gebruikt om de kolom te wassen NIET DDM of enige andere reinigingsmiddel bevat. De kolom heeft een eindige bindingscapaciteit voor detergens en als een buffer die detergens wordt gebruikt, wordt de kolom effectief bij het verwijderen van het detergens uit de eiwit-lipide-detergens monster. - Aliquot zorgvuldig alle 1 ml van het lipide-detergens-eiwitmonster op de top van de kolom hars en incubeer monster bovenin de kolom gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer het monster bij kamertemperatuur gedurende 4 min bij 2000 xg en verzamel de troebel proteoliposome monster in een schone 1,5 of 2 ml microcentrifugebuis of een glazen buis en plaats de samPLE op ijs.
- Verzamel resterende proteoliposomen in de kolom door toevoeging van 200 ul buffer 7 (75 mM KI, Tabel 1) of andere buffer (zonder detergens) naar de top van de kolom en herhaal de centrifugatiestap gedurende 2 min.
- Voeg de tweede eluaat naar de proteoliposome monster als het ziet er bewolkt.
- Bewaar het monster bij 4 ° C overnacht of onmiddellijk gebruiken jodide efflux metingen.
3. Jodide Efflux Metingen voor Gezuiverd, Bereide CFTR
- Genereren van een jodide gradiënt over de proteoliposomal membraan
- Pre-swell Sephadex G50 kralen in buffer 9 (75 mM K-Glu kaliumglutamaat, zie tabel 1), (ongeveer 5 g droge korrels in 50 ml buffer) of gewenste externe buffer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur of 4 ° C gedurende de nacht.
- Bereid 4 Sephadex G50 kolommen verzadigd Buffer 9 (75 mM K-Glu, zie tabel 1) of anderebuffer in kleine screening kolommen geladen hars tenminste ¾ in de kolom.
- Centrifugeer gedurende 4 min bij 2000 xg om overtollige buffer van de hars te verwijderen. Er moet ongeveer 2,25 ml verpakt gehydrateerd hars in de kolom aan het einde van de centrifugatiestap.
OPMERKING: Hars moet licht worden gehydrateerd maar niet ondergedompeld in vloeistof en een daaropvolgende korte draai mag niet significant volume van de buffer te elueren. Het is van cruciaal belang voor de succesvolle elutie van de proteoliposome monster dat de kolom hars is niet te nat en niet te droog en de gebruiker kan het nodig zijn om te experimenteren met de kolommen om vertrouwd te raken met de meest succesvolle bufferuitwisseling voorwaarden geworden. - Voeg voorzichtig 125-150 pl proteoliposome monster aan de bovenkant van elke kolom en centrifugeer gedurende 4 minuten bij 2000 x g.
- Pool proteoliposome eluaten samen voor onmiddellijk gebruik in jodide efflux of andere experimenten.
OPMERKING: De geëlueerd volume van elke kolom moet ongeveer zijn150 pi en het monster moet enigszins bewolkt, maar minder bewolkt dan de oorspronkelijke monster. Grotere volumes of duidelijk eluaten suggereren dat de kolommen onvoldoende zijn gedroogd, of gedroogd zijn te veel respectievelijk, en niet tot een succesvolle jodide efflux experiment.
- Jodide efflux assay
- Was een jodide selectief micro-elektrode (Tabel van materialen en apparatuur) uitgebreid met gedeïoniseerd water, en vervolgens incubeer gedurende 20 minuten voor het experiment in buffer 10 (15 uM KI, zie tabel 1). Was de elektrode weer uitgebreid met gedeïoniseerd water.
- Voeg 150 ul geneesmiddel (20 uM gebruikelijke concentratie tot een uiteindelijke concentratie van 10 uM in de assay te produceren) in buffer 9 (75 mM K-Glu, zie tabel 1) of voertuig buffer 9 op een putje van een plaat met 96 putjes met een kleine vlo roerstaafje.
- Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Gebruik een pipet tip verdwaalde te verwijderenbubbels. Als een geneesmiddeloplossing wordt gebruikt, zorgen dat de uiteindelijke DMSO-concentratie in de put minder dan 1% (v / v) (meestal 0.1-0.2% (v / v)).
- Voeg 150 pi van gereconstitueerd CFTR-eiwit die in paragraaf 3.1 werd in buffer 9 (75 mM K-Glu, zie Tabel 1) om de put met geneesmiddel of buffer tot een totaal volume van 300 pl produceren in de put van de plaat.
- Plaats de plaat met 96 putjes op een roerplaat en roer bij 130 rpm (of bij een matige snelheid van ongeveer ¼ van de maximale snelheid).
- Steek de punt van de jodide elektrode voorzichtig in de put met het monster zodanig dat de punt niet raakt de bodem van de put of aanstoten door de roerstaaf. Zorg ervoor dat de referentie-elektrode, indien afzonderlijk, ook in contact met de oplossing in de put.
- Record traces met behulp van een zelfgemaakte of commerciële computerprogramma dat interfaces met de elektrode (zie tabel van materiaal en apparatuur voor details).Gebruik een sampling rate van 2 Hz, met filtering van het signaal door een laagdoorlaatfilter.
- Laat het monster equilibreren 5 minuten om een stabiele vlakke of bijna stabiel basislijn produceren tijdens het opnemen.
- Voeg 3 ul MgATP (100 mM stock bereid in dH 2 O en ingesteld op pH 7 met KOH, 1 mM eindconcentratie) verdund om het eiwit te activeren. Laat ~ 5 min naar een nieuwe stabiele basislijn te bereiken. Altijd de pH van de 100 mM MgATP stock neutraal voor gebruik om veranderingen in de pH van de externe buffer vermijden.
- Voeg 3 ul van valinomycine voorraad (2 uM, 20 nM eindconcentratie) verdund veranderingen in potentiaalverschil opgewekt door jodide-selectieve geleiding door CFTR shunt. Noteer de dalende helling (afname in mV) door CFTR-gemedieerde jodide efflux activiteit ten minste 5 min.
- Om het vangen van jodide in het proteoliposoom lumen voldoende, voeg 3 ui 10% (v / v) Triton X-100 aan het monster. Significant en jodide onmiddellijke afgifte aangeeft dat voldoende jodide is gevangen in de vesicles zodat vangen niet de beperkende factor voor de veranderingen in helling bepaald 3.2.9 maar het CFTR-gemedieerde activiteit.
- Was de elektrode en roerstaaf grondig met gedeïoniseerd water na behandeling van de monsters met drugs of Triton X-100 te garanderen alle sporen van deze reagentia zijn verwijderd om verontreiniging van het volgende monster te voorkomen.
- Bereid een reeks verdunde KI concentraties in het micromolaire tot nanomolaire gebied in buffer 9 (K-Glu buffer, zie Tabel 1). Noteer de mV respons van de elektrode elke concentratie van 0 tot de hoogste concentratie bereid. Teken een standaard curve waarin de probe response (mV) uitgezet tegen log van de molaire concentratie jodide. Gebruik de standaardcurve de mV respons van de sonde zetten tijdens de efflux experiment concentratie jodide vrijgegeven.
OPMERKING: Bereid een kalibratie curve wekelijks totdat een gebruiker zeker van hoe snel de reactie van de sonde verandert. Er zal een drift in de reactie en gevoeligheid van de probe in de tijd. Omdat de probe ouder wordt, reactie afgebroken. Dit kan gedeeltelijk worden ingetrokken door het veranderen van de interne oplossingen regelmatig en uitgebreid wassen van de sonde in het water na gebruik, die waarschijnlijk grenzen hechting van moleculen aan de sonde oppervlak. - Bepaal de gemiddelde helling van de lijn van de concentratie versus tijdgrafiek per proteoliposoom monster gedurende de laatste 30 seconden vóór toevoeging van MgATP en na toevoeging van valinomycine maar vóór toevoeging van Triton X-100. Aftrekken van de basislijn helling van de valinomycine naar het CFTR-gemedieerde jodide efflux activiteit voor dat monster te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beschreven in deze schriftelijke publicatie zijn methoden om te zuiveren, te reconstrueren en te meten gereglementeerde kanaal activiteit van het CFTR-eiwit. Figuur 1a toont de workflow voor de zuivering, de bereiding en jodide efflux procedures. Werkwijzen voor de bereiding en kanaalactiviteit metingen via jodide flux zijn ook nader weergegeven in de bijbehorende video.
Zuivering en reconstitutie van CFTR in proteoliposomen
CFTR kan functioneel worden uitgedrukt op hoge niveaus in Sf 9 cellen met recombinant baculovirus bevattende Wt of mutante CFTR cDNA 2. Hoewel niet een zoogdierlijk expressiesysteem werd CFTR uitgedrukt in het baculovirus systeem Sf 9 cellen om een hoog expressieniveau te waarborgen. CFTR productie kan oplopen tot 1% van het totale cellulaire eiwit 17,28 zijn. De Sf 9- baculovirus systeem heeft het voordeel dat het eiwit geglycosyleerd kern en dekwaliteitscontrole machines in dit systeem betrekkelijk tolerant zodanig dat CFTR en mutanten kunnen worden geproduceerd op het celoppervlak. Een tien histidine tag is ontworpen op de carboxyuiteinde om zuivering toestaan op grond van affiniteit van deze tag voor nikkel-NTA. De C-terminale tag helpt co-zuivering van afgeknotte CFTR eiwitten en opbrengsten functioneel CFTR proteïne in ATPase, enkel kanaal en jodide efflux experimenten 17,19,24,28,29 voorkomen. Maar het zuiveringsprotocol beschreven moet op N-terminaal gelabeld CFTR ook.
Eerder is aangetoond dat CFTR proteïne effectief uit Sf 9 plasmamembraan preparaten met NaPFO (natrium pentadecafluoro-octanoaat) bij kamertemperatuur 15 kan worden onttrokken. De gevoeligheid van NaPFO neerslaan bij 4 ° C, een temperatuur bevorderlijk behoud correct gevouwen proteïne, en de langdurige dialyse nodig PFO verwijderen niet vatbaar rapid zuivering en reconstitutie methoden bedoeld om de activiteit van het eiwit in daaropvolgende testen van CFTR-functie te maximaliseren. Een evaluatie van een panel van detergentia (waaronder dodecyl-β-D-maltoside (DDM), 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propaansulfonaat (CHAPS), fos -choline 12 en fos -choline 14 gebleken dat fos -choline 14 was het meest effectief bij het oplosbaar menselijk CFTR-His 10 van Sf 9 membranen, en dat DDM was effectief in het handhaven van de ATPase activiteit van CFTR in detergent oplossing (gegevens niet getoond). Aldus wordt een fos -choline 14 detergens extractiestap wordt uitgevoerd, gevolgd door uitwisseling detergens DDM om de activiteit van het eiwit behouden.
Na zuivering en concentratie, is een eiwit verkregen fractie in DDM detergent dat een ~ 150 kDa band als belangrijkste component bevat (figuur 2; Silver Stain). Het molecuulgewicht overeen met menselijke CFTR uitgedrukt in S <em> f 9cells en door SDS-PAGE, wanneer hij niet de soort complexe glycosylering kenmerkend CFTR in zoogdiercellen geanalyseerd. De 150 kDa soort wordt ongeveer 90% zuiver na SDS-PAGE-analyse en zilverkleuring. Western blotting met de M3A7 anti-CFTR antilichaam bevestigt dat deze muis monoklonaal gericht tegen NBD2 reageert met de 150 kDa band (figuur 2; blot). In sommige studies, sporen van componenten met laag molecuulgewicht aanwezig als kleinere banden zichtbaar op de gel, bij ~ 60 en ~ 80 kDa (gegevens niet getoond). De M3A7 anti-CFTR-antilichaam reageert met de 60 en 80 kDa, maar niet reageert met andere niet-CFTR-eiwitten (gegevens niet getoond). Dit suggereert dat de laagmoleculaire componenten CFTR afbraakproducten co-gezuiverd met CFTR via hun C-terminale His-tag. De zuivering wordt uitgevoerd in aanwezigheid van proteaseremmers en het blijkt dat deze componenten aanwezig zijn in de cellen vóór de zuiveringsprocedure is uitgevoerd. De concentratiestap van de procedure verwijdert nagenoeg alle verontreinigende lager gewicht fragmenten molecuulgewicht. CFTR kan worden gereconstitueerd op dit punt, of eiwit van een andere zuiveringswerkwijze kunnen worden gebruikt in de reconstitutie protocol.
Een liposomaal flux gebaseerde test meldt het functioneel herstel van een populatie van gezuiverd en opnieuw CFTR moleculen zoals geregeld, anionselectieve kanalen
Om te bepalen of een aanzienlijk deel van gezuiverd CFTR werd gereconstitueerd als gereguleerde chloride kanaal met de bovenstaande methoden, werd een proteoliposomal halogenide flux assay ontwikkeld die de activiteit van een populatie van gereconstitueerd CFTR moleculen (schematisch weergegeven in figuur 1B) meldt. Indien, in het ergste geval, de meerderheid van de gereconstitueerde CFTR moleculen worden misfolded, deze moleculen zullen niet tot een geleiding te verlenen, niet om te discrimineren tussen kationen en anionenen / of de poort zal ontbreken regulering door PKA fosforylatie en nucleotiden. Lee et al. Hebben methoden schatting van het percentage functionele reconstitutie van een membraaneiwit 30 mogelijk gepubliceerd.
Lege liposomen (ontbreekt CFTR) of proteoliposomen (lager gereconstitueerde CFTR) worden geladen met KI (75 mm) en extra-liposomaal jodide uitgewisseld met kalium glutamaat (75 mm) door het passeren van liposomen door een gelfiltratiekolom. De KI geladen proteoliposomen worden toegevoegd aan een putje met K-Glu (kaliumglutamaat) een buitenwaartse helling jodide maken en efflux wordt gevolgd zoals verhogingen extraliposomal jodide tijd met een jodide gevoelige micro-elektrode 24. De efflux van negatief geladen jodide leidt tot een afname in de mV signaal (signaal wordt negatiever). Wanneer de concentratie van jodide Vrijgegeven tijd wordt uitgezet, wordt de helling omgekeerd (zoals in figuur 3) een toename van jodide in de ex toneninterne oplossing in de tijd.
K-Glu werd gekozen als impermeant tegenion omdat het een voorbeeld van een anion dat niet door het CFTR-eiwit, blijkt geen significante blokkering van de poriën onder de gebruikte omstandigheden veroorzaken, en geen interferentie veroorzaken met de jodide selectieve elektrode. Een bepaling kan worden geoptimaliseerd om een ander anion, mits aan deze criteria. Vijfenzeventig mM anionconcentraties geselecteerd empirisch concentratiewaarden die goed trapping en voldoende signalen gegeven voor metingen in de assay onder de beschreven omstandigheden. Er zal in wezen geen jodide vrijlating uit-jodide geladen liposomen ontbreekt functioneel gereconstitueerde CFTR zijn totdat de blaasjes zijn gepermeabiliseerd met detergent (figuur 3; controle sporen), terwijl CFTR-opgeloste, jodide geladen proteoliposomen bemiddelen jodide vrij in de externe oplossing na toevoeging van MgATP (1 mm) in de CFTR-kanaal en valinomycine openen(20 nM) de ontwikkeling van een membraanpotentiaal te voorkomen (Figuur 3A; zie trace voor eiwit: lipide massaverhouding van 1: 3000 (w / w)).
Valinomycin een ionofoor die kalium shuttles specifiek over het membraan, beneden de concentratiegradiënt en de concentratie van 20 nM werd empirisch gekozen als de hoogste concentratie die geen integriteit van lege liposomen leverde verstoren in het huidige systeem. Dit moet worden geoptimaliseerd voor elk bepaald systeem. Zonder toevoeging van valinomycine, is er een verkorte versie van jodide enkele nM dat snel een plateau bereikt (gegevens niet getoond). Hoewel deze condities bekend zijn anders maximaal activeren anion kanaalactiviteit van CFTR (zoals in figuur 3A), blijkt dat het ontbreken van een significante respons weerspiegelt de instantane toename intraliposomaal positieve lading gemedieerd door jodide geleiding door het anion selectieve porie van CFTR onmiddellijk beperken continulende jodide efflux waar valinomycine niet is inbegrepen. Deze-valinomycine gemedieerde respons bevestigt dat jodide efflux beperkt was in de vorige experimenten vanwege lading accumulatie, het ondersteunen van de anion selectiviteit van gereconstitueerde CFTR. Als CFTR ontbrak dit selectiviteit zouden zowel kalium- jodide en kunnen uitstromen van proteoliposomen intrekking waardoor de noodzaak valinomycine flux leiden zijn.
Het jodide concentraties gemeten bij deze eerste keer punten waren empirisch Gekozen binnen het optimale gevoeligheidsbereik voor de jodide sensorelektrode werkzaam te vallen. Het gebruik van andere jodide elektrodes optimaliseren van deze factoren vereisen. Na het bereiken van een plateau is Triton X-100 toegevoegd aan de proteoliposomen doorlaatbaar en laat de resterende opgesloten jodide. Anders dan de initiële jodide metingen (verkregen tussen 1 en 2 minuten na toevoeging valinomycine), het cijfer dat bij deze eindpunten niet in het lineaire bereik van de elektrode calibratie kromme (gegevens niet getoond), onmogelijk maakt een nauwkeurige evaluatie van de fractie van liposomen waaruit CFTR-eiwit kan mediëren jodide efflux opzichte van het totale aantal liposomen in de test, of de functionele reconstitutie procent.
Het tarief van jodide flux weerspiegelt het aantal CFTR eiwit moleculen, de open kans en unitaire geleiding van elk CFTR kanaal. Derhalve moet de percentages van jodide efflux afhankelijk van het aantal open waarschijnlijkheid van elk CFTR molecuul. De voorspelling werd getest in dit systeem door het aantal van CFTR moleculen per liposoom. De verhouding van geactiveerd (gefosforyleerd en MgATP behandelde) CFTR-eiwit tot lipide werd gevarieerd, de verhoudingen tussen 1: 300-1: 3000 (w / w) (figuur 3A). Hoe groter de hoeveelheid gereconstitueerd CFTR in de proteoliposomen, hoe groter de snelheid van efflux (gemeten tussen 1-2 min na toevoeging valinomycine), ondersteunen de voorspelling that efflux tarieven zijn afhankelijk van het aantal CFTR moleculen in elk liposoom. De uitstroom snelheid verkregen met behulp van specifieke eiwitten: lipideverhoudingen reproduceerbaar zijn tussen de experimentele dagen en eiwit zuiveringen, waardoor de aandacht van de strengheid van deze methode.
De snelheid van jodide efflux lijkt betreffen de open waarschijnlijkheid van het CFTR kanaal Deze gereconstitueerde systeem. Zoals fosforylatie door PKA is vereist voor CFTR activering 31 (en herziening 32), wordt verwacht dat er een lage jodide efflux in vesicles bevat CFTR dat niet is gefosforyleerd door exogene PKA behandeling, waarbij de open waarschijnlijkheid laag zijn . In proteoliposomen die zijn PKA behandeld, zal de open waarschijnlijkheid veel hoger zijn, waardoor een veel hogere verwachte snelheid van efflux. In de praktijk, voor PKA-behandelde CFTR in aanwezigheid van 1 mM MgATP in dit systeem de snelheid van jodide efflux gemeten van één tot twee minuten na toevoeging van valinomycin wordt ongeveer vier vouw het tarief van de CFTR-eiwit onderworpen aan MgATP maar niet PKA (Figuur 3B). Deze bevindingen ondersteunen de hypothese dat de efflux percentage betrekking open waarschijnlijkheid kanaal. In de praktijk kan het moeilijk zijn activiteit vergelijken in deze assay direct waarschijnlijkheid aangezien andere factoren zoals tijdsafhankelijke veranderingen in de elektrochemische drijfkracht de waargenomen efflux activiteit beïnvloeden geopend. De lezer wordt gewaarschuwd dat deze test is geen vervanging voor gedetailleerde enkel kanaal activiteit opnames.
Interessant genoeg wordt kenmerkend waargenomen een lage jodide efflux door "gefosforyleerde" eiwit in aanwezigheid van MgATP die aanzienlijk groter is dan efflux van liposomen ontbreekt CFTR (Figuur 3B, C). Dit lage percentage kan basale fosforylering van CFTR in de S f 9 celexpressiesysteem voorafgaand aan de zuivering 33 weerspiegelen. CFTR gezuiverd van andere uitdrukking systems kan hebben verschillende niveaus van basale fosforylering en dus verschillende residuele activiteit.
Deze snelle zuivering protocol opbrengsten Wt-CFTR van S f 9 cellen in de buurt van homogeniteit, maar voor F508del- en G551D-CFTR, wordt de methode beter beschreven als een verrijking procedure. Sommige verontreinigende banden worden waargenomen via SDS-PAGE 19, waarvan vele tijdens CFTR afbraakproducten die reactief CFTR antilichamen en aanwezig lijken voor celverstoring te zijn. De reconstitutie en jodide flux methoden zijn geschikt voor deze verrijkte monsters van klinisch relevante mutanten. Zoals getoond in figuur 3D, wordt significant jodide efflux gemeten zowel F508del- (eiwit: lipide gewichtsverhouding van ongeveer 1: 600) en G551D-CFTR (eiwit: vet verhouding van ongeveer 1: 300). Hoewel beide mutanten lagere absolute activiteit dan WT-CFTR (eiwit: lipide massaverhouding van 1: 1200), is het moeilijk om de monsters direct vergelijken als kwantificeringkan niet zo nauwkeurig voor de mutanten die zijn verontreinigd met CFTR afbraakproducten. Echter zowel F508del CFTR en G551D gezuiverd met deze werkwijzen bereide en aan efflux metingen reageert zoals verwacht klein molecuul versterkers (figuur 4), en vertonen gelijkaardige kanaal functie eiwit gezuiverd door de strengere PFO zuiveringsmethode 19.
Het kanaal activiteit van gezuiverd en opnieuw CFTR kan gemoduleerd worden door kleine molecule inhibitoren en potentiators
CFTR inh -172 34 de meest specifieke CFTR remmer beschikbaar die is aangetoond dat de open waarschijnlijkheid van CFTR chloridekanalen in eenkanaals geleidingsmetingen 35 te remmen en CFTR remmen in andere studies 22,36. Zoals getoond in figuur 3C, wordt de snelheid van efflux na valinomycine bovendien aanmerkelijk gereduceerd door voorbehandeling met CFTR inh ub> -172. Vandaar dat deze test van de kanaalactiviteit van een populatie gezuiverd en gereconstitueerd CFTR moleculen effectief rapportageactiviteit van modulatoren zoals de remmende ligand CFTR inh -172.
De test is gevoelig en inzetbaar voor onderzoek naar de effecten van moleculen versterkingsmiddel behandeling ook. Zoals getoond in figuur 4, worden drie CFTR genotypes getest aanzienlijk versterkt door actief klein molecuul versterkers zoals Kalydeco / VX-770 of VRT-532 (Figuur 4C, getoond G551D), terwijl een inactief analogon geen effect heeft op het jodide efflux activiteit van CFTR (getoond F508del CFTR Figuur 4B). De test is van toepassing op het onderzoek van potentiator concentratie afhankelijkheid, en de rol van ATP en fosforylering on-potentiator gemedieerde CFTR-activiteit.
27fig1highres.jpg "width =" 700px "/>
Figuur 1:. Assay ontwerp en workflow (A) Workflow voor de in deze publicatie beschreven werk (B) Schematische weergave van de jodide efflux experiment.. Een aangepaste versie van het paneel B werd oorspronkelijk gepubliceerd in The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; en Bear, CE Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (Ivacaftor) Opent het Defecte Channel Poort van Mutant CFTR in een Phosphorylation-afhankelijke maar ATP-onafhankelijke wijze. 2012; 287: 36.639-36.649. © De Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie.
Figuur 2:. Het CFTR snelle zuiveringsprocedure levert gezuiverd Wt-CFTR-eiwit zilver gekleurde SDS-PAGE gel en Western vlek met behulp van de M3A7 CFTR antilichaam voor gezuiverd humaan Wt-CFTR eiwit in DDM detergent (1 pg en 0,1 ug voor de gel en vlek, respectievelijk), geïsoleerd van S f 9 cellen over-expressie van een (His) 10-gelabeld versie van het eiwit. Wt-CFTR (> 90% zuiver) wordt gedetecteerd bij 150 kDa, geschikt voor dit eiwit ontbreekt complex glycosylering. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; en Bear, CE Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (Ivacaftor) Opent het Defecte Channel Poort van Mutant CFTR in een Phosphorylation-afhankelijke maar ATP-onafhankelijke wijze. 2012; 287: 36.639-36.649. © De Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie.
Figuur 3: iodide efflux assay rapporten geregeld kanaal activiteit voor de gezuiverde en opnieuw CFTR eiwit. (A) Gezuiverde en gefosforyleerde Wt CFTR gereconstitueerd op eiwit: lipide-verhoudingen van 1: 300 (w / w), 1: 1200 (w / w) en 1: 3000 (w / w) medieert jodide efflux van het blaasje lumen het grootste bad tijd na toevoeging van 1 mM MgATP en 20 nM valinomycine. De toevoeging van 0,1% (w / v) Triton X-100 aan de proteoliposomen releases gevangen jodide in de vesicle lumen aan het einde van het experiment permeabilize. (B) Aanvankelijke jodide efflux tijdsverloop voor gereconstitueerd Wt CFTR-eiwit dat niet had pre-gefosforyleerd. (C) Aanvankelijke jodide efflux percentages tonen de afhankelijkheid van de waargenomen activiteit op functioneel CFTR-eiwit. PKA fosforylering van het eiwit behoeven belangrijke kanaal activiteit die wordt geremd door de toevoeging van het CFTR-remmer, CTTR inh -172 (20 uM). Gegevens zijn gemiddelden ± SEM; * P <0,05, *** p <0.0001. (D) Meerdere genotypes produceren gereguleerd CFTR signalen in de jodide efflux assay, zoals gew, F508del- en G551D-CFTR versus controle. Gegevens zijn gemiddelden ± SEM; * P <0,05; *** P <0,0004 versus controle. Dit onderzoek (delen van gegevens in panelen A, C en D) werd oorspronkelijk gepubliceerd in The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; en Bear, CE Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (Ivacaftor) Opent het Defecte Channel Poort van Mutant CFTR in een Phosphorylation-afhankelijke maar ATP-onafhankelijke wijze. 2012; 287: 36.639-36.649. © De Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie.
Figuur 4: De fosforylatie-afhankelijke versterking van CFTR door kleine moleculen kan worden opgevraagd via dejodide efflux systeem voor gew, F508del- en G551D-CFTR. (A) Wt-CFTR aanzienlijk versterkt door de potentiator VX-770 (10 uM), alleen in de PKA-gefosforyleerde toestand. Gegevens zijn gemiddelden ± SEM, * p <0,01 vs. + PKA-VX-770. (B) VX-770 (10 uM), maar niet een inactieve analoog, V-09-1188 (10 uM), aanzienlijk versterkt het jodide efflux activiteit van gefosforyleerd F508del-CFTR. Gegevens zijn gemiddelden ± SEM, n = 3, *** p <0,001 vs. -VX-770 control. (C) versterking van G551D CFTR 10 uM VRT-532 en VX-770. Gegevens zijn gemiddelden ± SEM, n = 5, ** p <0,001, *** p <0.0001 vs -VX-770 controle. Dit onderzoek (panelen ac) werd oorspronkelijk gepubliceerd in The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; en Bear, CE Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (Ivacaftor) Opent het Defecte Channel Poort van Mutant CFTR in een Phosphorylation-afhankelijke maar ATP-onafhankelijke wijze. 2012; 287: 36.639-36.649. © De Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie.
| Buffer | Naam | Inhoud | pH | Stel de pH met behulp |
| Buffer 1 | 2% fos -choline | 2% (w / v) fos -choline 14 detergens op 10 mM imidazool, 25 mM HEPES | 7.4 | Imidazool / HEPES |
| Buffer 2 | 10 mM imidazool | 10 mM imidazool, 25 mM HEPES (geen wasmiddel) | 7.4 | Imidazool / HEPES |
| Buffer 3 | 10 mM imidazool + DDM | 10 mM imidazool, 25 mM HEPES, 1 mM dodecyl-β-D-maltoside | 7.4 | Imidazool / HEPES | Buffer 4 | 50 mM imidazool + DDM | 50 mM imidazool, 25 mM HEPES, 1 mM dodecyl-β-D-maltoside | 7.4 | Imidazool / HEPES |
| Buffer 5 | 600 mM imidazool + DDM | 600 mM imidazool, 25 mM HEPES, 1 mM dodecyl-β-D-maltoside | 7.4 | Imidazool / HEPES |
| Buffer 6 | 75 mM KI + DDM | 75 mM KI, 20 mM MOPS, 1 mM dodecyl-β-D-maltoside | 7.4 | KOH |
| Buffer 7 | 75 mM KI | 75 mM KI, 20 mM MOPS | 7.4 | KOH |
| Buffer 8 | 25 mM HEPES + DDM | 25 mM HEPES, 25 mM NaCl, 1 mM dodecyl-β-D-maltoside | 7.4 | HCl / NaOH |
| Buffer 9 | 75 mM K-Glu | 75 mM K-glutamaat, 20 mM MOPS | echts "> 7.4KOH / Glutaminezuur | |
| Buffer 10 | 15 mM KI | 15 mM KI, 20 mM MOPS | 7.4 | KOH |
Tabel 1: Tabel van Buffers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een beperkt aantal zuiveringsprotocollen volledige lengte, functioneel CFTR afgezonderd, uit verschillende cellulaire overexpressie systemen. De hier beschreven methode is voordelig omdat hiermee snelle zuivering van WT-CFTR of hoog verrijkt F508del- en G551D-CFTR in matige hoeveelheden die zeer functioneel in assays zoals ATPase en directe metingen van kanaalfunctie, waaronder enkel kanaal metingen vlakke dubbellaag systemen en bewezen maatregelen van CFTR bevolking kanaal functie die zeer relevant zijn voor de studie van kleine moleculen 19-21 zijn. De zuiveringswerkwijze is geïntegreerd in een snelle en efficiënte reconstitutie protocol kan echter gezuiverd eiwit van andere methoden worden gekoppeld met deze reconstitutie protocol ook, op voorwaarde dat de zuivering detergens vatbaar is voor verwijdering dezelfde.
In tegenstelling tot ingewikkelde en moeizame single channel experimenten uit excseerde membraan patches, de hier beschreven methoden kan een robuuste maar ongecompliceerde beoordeling van CFTR kanaal functie, en uniek deze maatregel meldt de functie van een grotere populatie van CFTR-kanalen in plaats van één of enkele moleculen. Unlike technieken met membraan patches, deze methode maakt directe beoordeling van de effecten van moleculen modulatoren op het kanaal in de buurt van of volledige afwezigheid van geassocieerde eiwitten, afhankelijk van de doeltreffendheid van de gekoppelde zuiveringsprocedure.
Kritische stappen in het protocol
Hoewel er verschillende kritische stappen in functionele reconstitutie van CFTR het anion flux assay, zoals aangegeven aantekeningen in het protocol optimaliseren van de proteïne: lipideverhouding in CFTR reconstitutie sleutel. Dergelijke optimalisatie is vereist voor elke CFTR genotype.
Wijzigingen en het oplossen van problemen van de techniek
De basislijn mV resPonse de sonde hier tijdens de jodide efflux assay monsters bereid zoals beschreven is typisch -20 tot -50 mV. Significante afwijkingen van dit bereik suggereren dat er mogelijk problemen met het monster. Andere probes verkocht door verschillende fabrikanten kunnen afwijken van de hier gegeven richtlijnen. Als een stabiele basislijn kan worden verwezenlijkt, kan zeepresten of inactief, gedenatureerd, slechte kwaliteit proteïne doordringbaar de vesicles te jodide.
Het uitblijven van een significante verandering in de snelheid van valinomycine afhankelijk jodide efflux van liposomen die gefosforyleerd CFTR in aanwezigheid van MgATP kan enkele problemen, die allemaal moeten worden onderzocht weerspiegelen detecteren. Deze onderwerpen zijn: slechte kwaliteit, gedeeltelijk gedenatureerde CFTR of onzuiver CFTR; onvolledige verwijdering van wasmiddel tijdens reconstitutie; niet optimale eiwit: lipideverhouding in proteoliposomen; of onvoldoende valinomycine toegevoegd, waardoor lading dissipatie onvolledig.
De iodide efflux assay biedt de flexibiliteit om pre-gefosforyleerd CFTR-eiwit (zoals beschreven in het protocol), of gefosforyleerd CFTR tijdens de test. Indien het gereconstitueerde eiwit niet is gefosforyleerd tijdens de zuiveringswerkwijze kan het monster worden gefosforyleerd tijdens de jodide efflux experiment bij stap 3.2.7, door toevoeging van PKA met MgATP. In dit geval zorgen dat de basislijn wordt genoteerd voor ten minste 5 minuten zodat het eiwit voldoende door de PKA enzym gefosforyleerd voordat meetfunctie met toevoeging van valinomycine. Soortgelijke resultaten worden verkregen bij elk van beide.
In het protocol wordt de modulator molecuul interactie aangaan met het CFTR-eiwit gedurende 5 min voor het meten van de activiteit door toevoeging van MgATP en Valinomycin. Aangezien de meeste CFTR modulatoren zijn zeer lipofiel kan het even duren tussen naast het bad en evenwicht associatie met het CFTR-eiwit. De test kan niet doorgaan zonder the toevoeging van valinomycine, en dus geen informatie verloren door het uitvoeren van de test op deze manier. In situaties waarin de gebruiker niet bezorgd dat er een vertraging voor interactie van het kleine molecuul met het eiwit kunnen zijn, kan de test worden uitgevoerd door toevoeging van acute modulator na de toevoeging van valinomycine, terwijl de initiële snelheid fase van de meting.
Beperkingen van de techniek
Zoals eerder vermeld, deze proteoliposomal flux gebaseerde test gereguleerde kanaalactiviteit een populatie gezuiverd en gereconstitueerd volledige lengte CFTR moleculen verschaft een unieke werkwijze voor het ondervragen van liganden die rechtstreeks activiteit wijzigen. Echter, wordt de methode beperkt dat het niet geven inzicht in het mechanisme waardoor liganden verandert de snelheid van de flux door CFTR. Idealiter zou de proteoliposomal flux assay gezuiverd en gereconstitueerd CFTR worden gebruikt in combinatie met vlakke lipid dubbellaag studies van één kanaal activiteit. Deze combinatie zou inzicht geven in de toestand van het eiwit dat de liganden bindt, namelijk de open en / of gesloten toestand.
Belang met betrekking tot de bestaande methoden
Er is momenteel een gebrek aan methoden voor de beoordeling van de directe interactie van kleine moleculen met het CFTR kanaal versus klein molecuul modulators die interageren met andere cellulaire component kanaal activiteit, bijvoorbeeld indirect te veranderen, door middel van een modulerende of signaleringsroute of verstoring van belangrijke eiwit-eiwit interacties. Het jodide efflux Werkwijze illustratie directe interactie met het eiwit van kleine moleculen die de kanaalactiviteit van CFTR moduleert. Ondanks de lage doorvoer wijze van de metingen bestaan er veel waarde in deze unieke werkwijzen voor het bestuderen van de rechtstreekse interactie van CFTR met kleine moleculen versterkers en correctors. Veel kleine molecule modulatoren zijn in ontwikkeling zowel academische groepen en de farmaceutische industrie CF patiënten klinisch behandelen, aangezien dit het speerpunt van de huidige CF onderzoek. Verwacht wordt dat de hier beschreven methoden zullen helpen bij de ontwikkeling en validatie van het werkingsmechanisme van de meest veelbelovende van deze moleculen.
Toekomstige toepassingen van de techniek
De hier toegepaste methoden zijn ook zeer vatbaar voor aanpassing aan andere eiwitten van belang. Inderdaad een modificatie van de beschreven methoden werd gebruikt om twee P. bestuderen aeruginosa membraaneiwitten betrokken bij de beweging van anionische substraten over het membraan 26,27, tonen de bruikbaarheid en veelzijdigheid van deze methoden. Het gebruik ervan in de studie van bijkomende anionkanalen en vervoerders wordt verwacht in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs erkennen het advies van Dr. Mohabir Ramjeesingh tijdens de ontwikkeling van de zuiveringsmethoden hier beschreven. Deze studies werden ondersteund door exploitatiesubsidies aan CEB van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) en Cystic Fibrosis Canada (CFC). PDWE werd mede ondersteund door Fellowship awards door de CIHR en CFC. De auteurs erkennen het verstrekken van corrector, potentiator en remmer verbindingen van Dr. R. Bridges (Rosalind Universiteit van Geneeskunde en Wetenschap) en de distributie door de Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT). De auteurs ook een uitstekende service te erkennen door de Baylor Cell Culture Facility (NIH-subsidie P30 CA125123) in het uiten van Wt en gemuteerde CFTR eiwit met behulp van de baculovirussysteem. De inactieve VX-770 analoge, V-09-1188, was een geschenk van Vertex Pharmaceuticals.
Acknowledgments
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001) |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup. |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
References
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
- Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
- Genetic Analysis Consortium. , http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
- Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
- Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
- Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
- Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
- Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
- Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
- Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
- Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
- Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
- Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
- Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
- Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
- Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
- Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
- Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
- Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. , Academic Press. 337-357 (2010).
- Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
- Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
- Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
- Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
- Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
- Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
- Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).
