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Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

Published: March 9, 2015 doi: 10.3791/52427
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Programme in Molecular Structure and Function, Hospital for Sick Children, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Physiology, University of Toronto

Summary

Descrito aquí es un procedimiento rápido y eficaz para la reconstitución funcional de tipo silvestre purificado y proteína CFTR mutante que conserva la actividad de este canal de cloro, que es defectuoso en la fibrosis quística. Flujo de salida de yoduro de proteoliposomas reconstituidas mediadas por CFTR permite estudios de actividad de los canales y los efectos de las moléculas pequeñas.

Abstract

La fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana (CFTR) es un miembro de formación de canal único de la casete de unión a ATP (ABC) superfamilia de transportadores. La actividad de los canales de la fosforilación y cloruro dependiente de nucleótidos de CFTR se ha estudiado con frecuencia en los sistemas de células enteras y como canales individuales en fragmentos de membrana rotos. Muchas mutaciones de fibrosis quística causantes se han mostrado alteraciones en esta actividad. Si bien un pequeño número de protocolos de purificación se han publicado, un método de reconstitución rápida que retiene la actividad del canal y un método adecuado para el estudio de la actividad del canal población en un sistema purificado han faltado. Aquí métodos rápidos se describen para la purificación y reconstitución funcional de la proteína CFTR de longitud completa en proteoliposomas de composición de lípidos definida que retiene la actividad como un canal de haluro regulado. Este método de reconstitución junto con un nuevo ensayo basado en flujo de la actividad del canal es un sistema adecuado parael estudio de las propiedades del canal población de tipo salvaje CFTR y los mutantes que causan enfermedades F508del- y G551D-CFTR. Específicamente, el método tiene utilidad en el estudio de los efectos directos de la fosforilación, nucleótidos y moléculas pequeñas tales como potenciadores e inhibidores sobre la actividad del canal CFTR. Los métodos también son susceptibles al estudio de otros canales / transportadores de membrana para sustratos aniónicos.

Introduction

El transporte de cloruro a través de las membranas apicales de las células epiteliales en tejidos tales como las glándulas de pulmón, intestino, páncreas y sudoríparas está mediada principalmente por la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana (CFTR), un miembro de ATP y la fosforilación regulada de la ABC (ATP Binding Cassette) C subfamilia de proteínas de membrana (revisado en 1). Como otros miembros de la subfamilia ABCC, CFTR es un multi-que abarca proteína de membrana grande, integral que se une ATP en dos sitios de unión de nucleótidos formados en la interfaz de sus dominios de unión a nucleótidos (NBDs), donde posee actividad ATPasa modesta en un solo sitio. Sin embargo, a diferencia de otros miembros de la subfamilia ABCC, CFTR se ha desarrollado como un canal Cl regulado única y no como un transportador de soluto activa.

Las mutaciones en CFTR causa fibrosis quística, una enfermedad que afecta a múltiples órganos, como los pulmones, el tracto gastrointestinal, páncreas y tracto reproductivo, lo que lleva a la morbidity y mortalidad en adultos jóvenes. Enfermedad pulmonar normalmente representa la mortalidad temprana en la fibrosis quística y en la mayoría de los casos es causada por la pérdida de la función de CFTR en el epitelio de la superficie de las vías respiratorias conductoras. La falta de actividad del canal de cloruro CFTR causa una reducción en tanto Cl - y el movimiento del agua a través del epitelio superficial para modificar la capa de fluido en la superficie apical del epitelio respiratorio ciliado. Esto resulta en un líquido viscoso que la superficie de las vías respiratorias deteriora la capacidad de las células epiteliales ciliadas respiratorias a eficazmente patógenos claros fuera de las vías respiratorias. Como consecuencia, la mayoría de los pacientes con FQ sufren de episodios recurrentes de infección pulmonar y daño pulmonar debido a la inflamación.

Como era de esperar, los estudios del mecanismo de acción de la proteína CFTR normal centran principalmente en estudios electrofisiológicos detallados de su actividad gating canal. Estudios de canal individuales han demostrado directamente que las funciones de CFTR como un dependiente de PKA Cl- Canal que posee una puerta regulado ATP 2. Estudios electrofisiológicos detallados proporcionan una gran cantidad de información sobre los canales individuales CFTR 1,3, sin embargo puede haber preocupación en cuanto a si las características de cualquiera de un solo canal particular que ha sido estudiado es el reflejo de toda la población de los canales de CFTR y por lo tanto el canal único Los resultados se deben considerar siempre junto con los métodos para el estudio de la población macroscópica. Ensayo directo de la actividad de los canales población de CFTR purificada tiene el potencial de proporcionar información sobre el defecto molecular asociado con mutaciones que causan enfermedades y para impulsar el descubrimiento de moduladores químicos que la reparación proteínas CFTR mutante. Hasta la fecha, hay más de 1.900 mutaciones diferentes en CFTR se cree causan fibrosis quística 4. La mutación principal, F508del-CFTR, que se encuentra en al menos un alelo en aproximadamente el 90% de los pacientes en América del Norte y Europa conduce a un mal plegamiento de proteínasnd retención en el retículo endoplásmico 5. F508del-CFTR también tiene otras consecuencias, incluyendo la actividad del canal defectuoso 6-9. La ausencia resultante de CFTR de la superficie celular se asocia con la enfermedad severa. G551D-CFTR, una mutación menos común, se cree que aún no se ha plegado correctamente es disfuncional como un canal de cloruro en la superficie celular 6. El desarrollo de pequeñas correctores molécula y potenciadores tiene el objetivo de corregir el plegado y / o el tráfico de mutantes tales como F508del-CFTR a la superficie celular, y de potenciación o el aumento de la actividad de los canales de mutaciones tales como G551D cuando está presente en la superficie celular, respectivamente . Mientras que los correctores VX-809 y VX-661 (todavía no están aprobados para su uso en pacientes, el potenciador Kalydeco (ivacaftor; VX-770) está siendo utilizado en 150 mg cada 12 h en pacientes con FQ> 6 años con al menos un G551D mutación -CFTR, y más recientemente en los pacientes con una de G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Py G1349D. Kalydeco es seguro y los resultados en la mejora de las medidas clínicas de la enfermedad CF 10, sin embargo, el mecanismo de acción de esta pequeña molécula fue mal entendido en el momento de aprobación de la FDA para su uso en pacientes.

Un puñado de métodos de purificación CFTR se han descrito anteriormente 2,11-18, muchas de las cuales requieren un período considerable de tiempo para completar. En una publicación reciente 19, un método de purificación y reconstitución rápida única fue descrito por CFTR sobreexpresa en el sistema de expresión de células 9 S f, y esta proteína purificada en sistemas lipídicos definidos se utilizó para desarrollar un haluro de CFTR ensayo de actividad de canal para una población de CFTR moléculas. El ensayo recapitula los efectos conocidos de la fosforilación, nucleótidos y los inhibidores sobre la función de CFTR. Se utilizó el sistema para interrogar a los efectos de la potenciador VX-770 / Kalydeco en peso (de tipo salvaje), F508del- y G551D-CFTR y se demostró por primerael tiempo que el fármaco interactúa directamente con la proteína CFTR para potenciar su actividad de los canales de una manera independiente de ATP, lo que demuestra la utilidad y aplicabilidad de estos métodos para el estudio de la interacción de CFTR y mutantes con nucleótidos y moléculas pequeñas desde una perspectiva de la población a responder a las preguntas clínicamente relevantes sobre la proteína. Los métodos también se han utilizado para estudiar otras moléculas potenciadoras y sus derivados 20, así como los efectos de una pequeña molécula corrector sobre la actividad de la proteína 21.

Ensayos de eflujo se han utilizado en muchos estudios previamente para investigar la actividad de mutantes CFTR y los efectos de los compuestos CFTR-moduladores en su actividad, incluyendo los ensayos de células enteras utilizando electrodos, trazadores radiactivos y fluoróforos 22,23, vesículas de membrana con electrodos selectivos de iones 24 y se purificaron CFTR reconstituido con trazadores radiactivos 25. Sin embargo the uso de electrodos selectivos de iones para estudiar CFTR reconstituido purificado se informó por primera vez recientemente 19. Una adaptación del método actual se ha utilizado para la reconstitución y la caracterización funcional de dos proteínas de membrana en Pseudomonas aeruginosa, un patógeno CF común. Reconstitución de purificado proteína de membrana externa AlgE junto con mediciones de flujo de salida de yoduro se utilizaron para apoyar un modelo para la secreción de alginato aniónico a través de este transportador 26. Reconstitución y mediciones de yoduro de eflujo se aplicaron a la proteína purificada Wzx, lo que permitió un modelo que se propone que sugiere un mecanismo de antiport dependiente de H + para lípidos ligado oligosacárido translocación a través de la membrana interna bacteriana por esta proteína 27. En ambos casos yoduro fue utilizado como un sustituto para el sustrato aniónico, aunque a un menor rendimiento que uno podría esperar para un sustrato nativo. El método puede ser adecuado para la adaptación a otras proteínas con cvías de transporte o de conducción ationic para sustratos aniónicos.

Aquí un procedimiento de purificación rápida se describe para la proteína CFTR y su reconstitución en proteoliposomas de lípidos definida. El procedimiento de reconstitución rápida se puede adaptar fácilmente para su uso con CFTR purificada por otros métodos, siempre que el tipo de detergente usado en la purificación es susceptible a la eliminación por los métodos utilizados aquí o puede ser intercambiado por un detergente adecuado antes de que el procedimiento de reconstitución. El método de yoduro de eflujo para la medición de la actividad del canal de la proteína CFTR purificada y reconstituida se describe en detalle y se presentan algunos resultados típicos que se pueden obtener a partir de este método.

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Protocol

1. Purificación de CFTR

NOTA: Por favor consulte la Tabla de Materiales y Equipo para una lista de los equipos y materiales utilizados en este protocolo. Existe un protocolo detallado para la sobreexpresión de humano Peso-CFTR y mutantes en el S f sistema de expresión de baculovirus-9 17,28. Sobreexpresan CFTR y preparar pellets de S f 9 células de acuerdo con este protocolo.

  1. Preparación de membrana bruta
    1. Obtener un fresco o congelado descongelar una S f 9 sedimento celular de un cultivo de 500 ml de las células que sobre-expresan wildtype-, la proteína F508del-, o G551D-CFTR con un C-terminal Su -tag 10, crecido mediante métodos estándar de cultivo celular, como se describió anteriormente 17,28. Los sedimentos celulares tendrán un volumen de aproximadamente 5 ml y un peso húmedo de aproximadamente 5 g.
    2. Resuspender S f 9 células en 20 ml de salina tamponada con fosfato (PBS) de pH 7,4 con cóctel inhibidor de la proteasa (1 comprimido por 50 ml) a 4 ° C, asegurando lamuestra parece visualmente homogénea y sin grumos de células permanecen.
    3. Lyse células utilizando un disruptor celular de alta presión (Tabla de Materiales y Equipos), llegando a un mínimo de 10.000 psi (preferiblemente 15.000-20.000 psi) durante 2 minutos por cada pasaje. Mantenga la muestra a 4 ° C durante la lisis.
      1. Recoger la muestra en un tubo en hielo después del período de lisis vuelva a cargar de inmediato la muestra en el disruptor celular. Procedimiento de lisis Repetir 3 veces. Se examinan bajo un microscopio para asegurarse de menos de 10% permanecen intactos.
        NOTA: otros métodos para lisar las células, tales como perlas de vidrio, etc., no han sido rigurosamente examinados para este sistema, sin embargo, un usuario puede encontrar un método alternativo tales adecuado.
    4. Centrifugar material de lisis celular a 4 ° C en una centrífuga de alta velocidad a 2000 xg durante 20 min. Recoger el sobrenadante y desechar el sedimento. Divida el sobrenadante entre 20 tubos, y centrifugar las muestras durante 1 hora a 4 ° C a 125.000 xg en una tapa ultracen mesatrifuge.
    5. Retirar y desechar el sobrenadante, teniendo cuidado de no molestar el pellet y almacenar bolitas en los mismos tubos a -80 ° C durante menos de 2 meses hasta su uso, o mantener en hielo y continuar la depuración de inmediato.
  2. Solubilización CFTR
    1. Obtener 1-4 S F 9 sedimentos de membrana en bruto frescas o congeladas y resuspender cada una en 1 ml de tampón 1 (2% de FOS -colina; véase la Tabla 1 para la receta completa) a 4 ° C en hielo, usando una aguja de 25 G y 1 ml jeringa hasta que la solución es homogénea por el ojo sin grumos visibles de la membrana celular. Cuando más de un pellet es ser solubilizado, seguir tratando a cada muestra de acuerdo con las instrucciones para que una sola pastilla debajo en paralelo, la agrupación de las muestras en el paso 1.3.2.
    2. Disolver 1 tableta de inhibidor de proteasa Mini en 1 ml de Tampón 2 (imidazol 10 mM; véase la Tabla 1) que carece de fos -colina 14 detergente (inhibidores de la proteasa son 10 veces más concentpuntuación que su dilución recomendada en este punto) y añadir 100 l al sedimento de membrana se resuspendió en bruto (inhibidores de la proteasa están en su dilución recomendada en este punto). Establecer en hielo durante 45 a 60 minutos con la mezcla por inversión 5 veces cada 5 min.
    3. Centrífuga resuspendió sedimento de membrana crudo en un top ultracentrifugadora mesa durante 25 minutos a 125.000 xg y 4 ° C. Conserve el sobrenadante, que contiene CFTR solubilizado y desechar el sedimento.
  3. Columna de unión, la fosforilación y la elución
    1. Lavar 400 l de níquel-ácido nitrilotriacético (NTA) de suspensión de agarosa o equivalente de resina con 1 ml de Tampón 2 (imidazol 10 mM; véase la Tabla 1) que carece de detergente, para eliminar el disolvente y tampón a 4 ° C. Repita el lavado dos veces más.
    2. Combinar CFTR solubilizado, inhibidor de la proteasa restante (900 l) y resina de níquel (a partir de 400 l de suspensión) a un total de 10 ml con Tampón 2 (imidazol 10 mM; véase la Tabla 1) which carece de cualquier detergente añadido. Los fos -colina 14 concentración se diluye eficazmente a 0,2% (w / v) en este paso. Si hay múltiples tubos, en común todas las muestras que contiene CFTR solubilizado, inhibidores de la proteasa, resina de níquel-NTA y 0,2% (w / v) -colina fos-14 en este punto. Incubar durante 60 min a 4 ° C con agitación suave.
    3. Pasar la solución NTA-CFTR inhibidor de la proteasa-níquel por una columna pequeña de cribado (Tabla 1) o una columna vacía equivalente.
    4. Lavar la resina NTA de níquel, que es retenida en la columna, con 4 ml por pellet inicial de 3 Buffer (10 mM imidazol + DDM; véase la Tabla 1) que carece de fos -colina 14, pero contiene 1 mM DDM (detergente maltósido de dodecilo), a 4 ° C. La adición de detergente DDM no altera significativamente el pH de este tampón.
    5. Preparar la solución de PKA-MgATP mediante la adición de 25 l (5 mM, concentración final) de MgATP, 2500 U de AMPc dependiente de la proteína quinasa A, subunidad catalítica (PKA) a 475 l de imidazol + DDM Buffer 3 (10 mM; ver Tabla 1) a la columna. Fosforilar la proteína mediante el sellado del extremo inferior de la columna con una tapa o Parafilm, y la adición de 500 l de solución de PKA-MgATP para cada pellet inicial utilizado.
    6. Incubar a temperatura ambiente (20 ° C) durante 20 minutos con mezcla suave y resuspensión de la resina usando una pipeta de 1 ml cada 2 min para asegurar que PKA ha entrado en contacto con toda la superficie de la resina de NTA de níquel.
    7. Retire la tapa y eluir la solución PKA / MgATP de la columna. Lavar la columna con 2 ml de Tampón 3 (imidazol 10 mM + DDM; véase la Tabla 1) a 4 ° C.
    8. Multiplicar el número de gránulos usados ​​en el experimento por 4. Lavar la columna con este número de ml de Tampón 4 (50 mM imidazol + DDM; véase la Tabla 1) a 4 ° C, mediante la adición de 4 ml de tampón a la columna, permitiendo que fluya a través e inmediatamente la adición de la siguiente parte alícuota de 4 ml a la columna.
      9. la Tabla 1) 1 ml de Tampón 5 eluyen a 4 ° C por pellet inicial utilizado a través de la columna, 1 ml a la vez sin una pausa para permitir que la columna se seque, y recoger todo el eluato que contiene CFTR purificada en un solo tubo.
    9. Concéntrese muestra de proteína para eliminar imidazol y de degradación de bajo peso molecular productos usando un dispositivo de filtro de centrifugación (100.000 de peso molecular de corte), tal como se describe en la Tabla de Materiales y Equipo u otro dispositivo similar, en un total de 10 ml Buffer 6 (75 mM KI + DDM; véase la Tabla 1) u otro tampón de elección que contiene 1 mM DDM (tal como tampón 7 para los experimentos de flujo de salida no yoduro, 25 mM HEPES + DDM; véase la Tabla 1), por centrifugación a 2000 xg y 4 ° C durante unos 20 minutos hasta que la muestra se concentra a 200 l. Diluir la muestra de 10 ml y repetir la etapa de concentración.
      NOTA: En nuestra experiencia (no publicado), imidazol significativamente INHIbits de la actividad ATPasa de CFTR y debe ser eliminado en este paso de dilución y concentración al menos dos veces si la muestra se utiliza para mediciones funcionales.
    10. Recoger CFTR purificada concentrada. Mantener a 4 ° C en presencia de tampón de DDM hasta su uso dentro de 1-2 días o continuar inmediatamente a la etapa de reconstitución. No congele la proteína purificada, como en nuestra experiencia observamos una actividad reducida.

2. Reconstitución de CFTR

  1. Preparación lipídica
    NOTA: CFTR se ha reconstituido con éxito en PC de huevo, POPC, 2: 1 (w / w) PC de huevo: POPC (1: 1 w / w) mezcla, o una mezcla de PE: PS: PC: ergosterol, 5: 2 : 2: 1 (w / w).
    1. Para los experimentos de flujo de salida de yoduro, seco 5 mg de PC de huevo (200 l de 25 mg / ml, véase la Tabla de Materiales y Equipos) bajo una corriente de gas argón durante 20 minutos a temperatura ambiente en un Pyrex u otro robusto (no borosilicato ) tubo de vidrio.
    2. Utilizando la absorbancia a 280 nm, un ELISA unassay u otro método, estiman la concentración de la muestra purificada proteína CFTR. Para los experimentos de yoduro de eflujo con CFTR de tipo salvaje, utilizar una proteína: lípido de 1: 300-1: 3000 (w / w) para producir una señal suficiente. Para G551D- y F508del-CFTR, utilizar una proteína: lípido de aproximadamente 1: 200-1: 1200 (w / w) con el fin de detectar la actividad de flujo de salida.
    3. Optimizar la proteína: lípido ratio para cada sistema en particular. Calcular el volumen de proteína purificada requerida. Calcular el volumen de tampón con 1 mM DDM requerida para hacer un volumen final de 1 ml, es decir, 1 ml - (volumen de solución de proteína requerido) = volumen de tampón.
      1. Añadir el volumen calculado del sistema tampón deseada con 1 mM DDM al lípido seco (pero no agregue la proteína CFTR en este momento) y cubrir el tubo de vidrio con Parafilm. Para los experimentos de yoduro de eflujo, los lípidos en tampón 6 resuspender (75 mM KI + DDM; véase la Tabla 1). Para otros experimentos se resuspenden en tampón de 8 (25 mM HEPES + DDM, consulteTabla 1) u otro buffer interno deseado que contiene 1 mM DDM.
      2. Vortex durante 2 min a temperatura ambiente para ayudar en la suspensión de lípido en el tampón de DDM. Alternativamente, calentar la muestra a 37 ° C durante 1-2 min antes de vórtex.
    4. Suspender el lípido repetidamente a temperatura ambiente con una jeringa de 1 ml y 25 g de la aguja hasta que no película de lípido es visible en los lados del tubo. Evitar la inyección de aire en la solución que produciría burbujas finas y ayudar en la oxidación de yoduro y los lípidos.
    5. Sonicar el lípido en suspensión en el Parafilm tubo cubierto por una ráfaga de 20 segundos en un baño de ultrasonido que contiene hielo, y luego transferir inmediatamente en hielo durante 1 min. Repetir 3 veces.
      NOTA: sonicación intensa gira soluciones de yoduro de color amarillo debido a la oxidación. Por lo tanto evitar la sonicación excesiva. Supervisar la muestra para cambios de color. Si se observa un cambio de color, desechar la muestra y prepararse de nuevo. El cambio de color debido a la oxidación de algunos deel yoduro de daría lugar a la oxidación de los lípidos en las mismas condiciones. Desplazando el aire desde el tubo de gas argón antes de sonicación la solución ayudará a prevenir la oxidación de los lípidos y yoduro. Sonicación intensa puede romper mala calidad o tubos de vidrio rayados resulta en la pérdida de la muestra.
    6. Añadir el volumen de CFTR purificada calculado en el paso 2.1.3 a la muestra de lípidos sonicado a un alcanzar un volumen final de 1 ml. Mezclar la proteína con la solución de lípidos y detergente mediante resuspensión 10 veces con una aguja 25 G y jeringa de 1 ml.
    7. Juego de muestra de lípidos y proteínas en hielo durante 30 min con agitación de tubo para mezclar 5 veces cada 5 min.
  2. Preparación de la columna de unión de detergente-
    1. Obtener una columna de centrifugación de un solo uso comercial vinculante detergente (véase la Tabla de Materiales y Equipos) con una capacidad de 1 ml y romper la pestaña inferior para empezar la columna que fluye.
    2. Centrifugar la columna durante 2 minutos a 2000 xg para eliminar el almacenamiento bUffer, y desechar este buffer.
    3. Añadir 5 ml de Tampón 7 (KI 75 mM, véase la Tabla 1) a la columna y centrifugar a 200 xg durante 4 min para eluir el tampón de lavado. Repita este paso 2 veces más para un total de 3 lavados para eliminar todos los rastros de la memoria intermedia de almacenamiento. Deseche todo el flujo a través.
      NOTA: Es fundamental que el tampón utilizado para lavar la columna NO contiene DDM o cualquier otro detergente. La columna tiene una capacidad de unión finita para el detergente, y si se utiliza un tampón que contiene detergente, la columna será ineficaz en la eliminación del detergente de la muestra de proteína-lípido-detergente.
    4. Alícuota cuidadosamente todas las 1 ml de la muestra de detergente lípido-proteína en la parte superior de la resina de la columna y se incuba la muestra en la parte superior de la columna durante 2 minutos a temperatura ambiente.
    5. Centrifugar la muestra a temperatura ambiente durante 4 min a 2.000 xg y recoger la muestra proteoliposoma nublado en un tubo limpio 1,5 o 2 ml de microcentrífuga o un tubo de vidrio y colocar el samPLE en hielo.
    6. Recoger restantes proteoliposomas en la columna mediante la adición de 200 l de tampón de 7 (KI 75 mM, Tabla 1) u otro tampón (sin detergente) a la parte superior de la columna y repetir la etapa de centrifugación durante 2 min.
    7. Añadir el segundo eluato a la muestra proteoliposoma si se ve borroso.
    8. Conservar la muestra a 4 ° C durante la noche o utilizar de inmediato para las mediciones de flujo de salida de yoduro.

3. El yoduro de eflujo mediciones para Purificada, CFTR reconstituida

  1. Generación de un gradiente de yoduro través de la membrana proteoliposomal
    1. Perlas de Pre-oleaje Sephadex G50 en tampón 9 (75 mM de K-Glu; glutamato de potasio, ver Tabla 1), (aproximadamente 5 g de perlas secas en 50 ml de tampón) o tampón externo deseado a temperatura ambiente durante al menos 2 horas o en 4 ° C durante la noche.
    2. Preparar 4 columnas Sephadex G50 saturadas en Tampón 9 (75 mM de K-Glu, véase la Tabla 1) u otrobúfer en pequeñas columnas de cribado mediante la carga de resina de al menos ¾ de su capacidad en la columna.
    3. Centrifugar durante 4 min a 2000 xg para eliminar el exceso de tampón de la resina. No debe ser de aproximadamente 2,25 ml de resina hidratada embalado en la columna al final de la etapa de centrifugación.
      NOTA: Resina debe ser ligeramente hidratada pero no sumergido en líquido y una breve vuelta siguiente no debe eluir importantes volúmenes de tampón. Es fundamental para el éxito de elución de la muestra proteoliposoma que la resina de la columna no es ni demasiado húmedo ni demasiado seco y el usuario puede tener que experimentar con las columnas con el fin de familiarizarse con las condiciones de intercambio de búfer de mayor éxito.
    4. Añadir cuidadosamente 125-150 l de proteoliposoma muestra a la parte superior de cada columna y centrifugar durante 4 min a 2000 x g.
    5. Piscina proteoliposoma eluidos juntos para uso inmediato en el eflujo de yoduro o otros experimentos.
      Nota: El volumen eluido de cada columna debe ser más o menos150 l, y la muestra debe ser algo nublado, pero menos turbia que la muestra original. Los volúmenes más grandes o eluidos claras sugieren que las columnas no se han secado suficientemente, o se han secado demasiado, respectivamente, y no se traducirá en un exitoso experimento yoduro de eflujo.
  2. Ensayo de yoduro de eflujo
    1. Lavar un micro electrodo selectivo de yoduro (Tabla de Materiales y Equipos) extensivamente con agua desionizada, y luego se incuba durante 20 min antes del experimento en Tampón 10 (15 mM KI, véase el cuadro 1). Lavar el electrodo de nuevo exhaustivamente con agua desionizada.
    2. Añadir 150 l de fármaco (20 mM concentración típica para producir una concentración final de 10 mM en el ensayo) en tampón de 9 (75 mM K-Glu, véase la Tabla 1) o vehículo en Tampón 9 a un pocillo de una placa de 96 pocillos con una pequeña barra de agitación de pulgas.
      1. Asegúrese de que no haya burbujas. Utilice una punta de pipeta para eliminar callejeroburbujas. Si se utiliza una solución de fármaco, asegurar que la concentración final de DMSO en el pozo es de menos de 1% (v / v) (típicamente 0,1-0,2% (v / v)).
    3. Añadir 150 l de proteína CFTR reconstituida que se produjo en la sección 3.1 en Tampón 9 (75 mM K-Glu, véase la Tabla 1) a la droga o bien con tampón, para producir un volumen total de 300 l en el pocillo de la placa.
    4. Coloque la placa de 96 pocillos en una placa de agitación y se agita a 130 rpm (o a una velocidad moderada de aproximadamente ¼ de la velocidad máxima).
    5. Inserte la punta del electrodo selectivo de yoduro de cuidado en el pozo con la muestra de tal manera que la punta no toque el fondo del pozo o de ser golpeado por la barra de agitación. Asegúrese de que el electrodo de referencia, si está separado, también está en contacto con la solución en el pocillo.
    6. Trazados grabar usando un programa de computadora casera o comercial que se conecta con el electrodo (véase la Tabla de Materiales y Equipo para más detalles).Utilice una velocidad de muestreo de 2 Hz, con el filtrado de la señal a través de un filtro de paso bajo.
    7. Permita que la muestra se equilibre durante 5 minutos para producir una línea de base estable y plana plana, o cerca durante la grabación.
    8. Añadir 3 l MgATP (100 mM de stock preparada en dH 2 O y se ajustó a pH 7 con KOH; 1 mM de concentración final) a la muestra para activar la proteína. Permita ~ 5 min para llegar a una nueva línea de base estable. Siempre ajustar el pH de la mM MgATP madre 100 a neutro antes de su uso para evitar cambios en el pH del tampón externo.
    9. Añadir 3 l de valinomycin de stock (2 M; 20 nM concentración final) a la muestra para derivar los cambios en la diferencia de potencial generada por la conductancia-yoduro selectiva a través de CFTR. Registre la pendiente decreciente (disminución en mV) debido a la actividad de eflujo de yoduro de CFTR mediada por al menos 5 min.
    10. Para asegurarse de que la captura de yoduro en el lumen proteoliposoma era suficiente, añadir 3 l de 10% (v / v) de Triton X-100 a la muestra. Significativos llevadost y la liberación inmediata de yoduro indica que suficiente yoduro ha sido atrapado en las vesículas de tal manera que la captura no era el factor limitante para los cambios en la pendiente determinadas en 3.2.9, sino más bien la actividad CFTR mediada.
    11. Lavar la barra de electrodo y de agitación a fondo con agua desionizada después del tratamiento de las muestras con fármaco o con Triton X-100 para asegurar que todos los rastros de estos reactivos se han eliminado para evitar la contaminación de la muestra siguiente.
    12. Preparar una serie de concentraciones de KI diluidas en el rango nanomolar a micromolar en Tampón 9 (tampón K-Glu, véase la Tabla 1). Registrar la respuesta mV del electrodo para cada concentración de 0 a la concentración más alta preparado. Construir una curva estándar en el que la respuesta de la sonda (mV) se representa frente a log de la concentración molar de yoduro. Utilice la curva estándar para convertir la respuesta mV de la sonda durante el experimento de flujo de salida a la concentración de yoduro liberado.
      NOTA: Prepare un perro de calibraciónve sobre una base semanal hasta que un usuario está seguro de la rapidez con la respuesta de los cambios de la sonda. Habrá una deriva en la respuesta y sensibilidad de la sonda con el tiempo. Como las edades de la sonda, la respuesta se degradará. Esto puede ser parcialmente abrogada por el cambio de las soluciones internas periódicamente y lavado extensivo de la punta de la sonda en agua después de su uso, lo que probablemente los límites de la adherencia de moléculas a la superficie de la sonda.
    13. Determinar la inclinación de la línea de la concentración frente al gráfico de tiempo para cada muestra proteoliposoma para el último 30 seg antes de la adición de MgATP, y después de la adición de valinomycin pero antes de la adición de Triton X-100. Restar la pendiente de línea de base de la valinomicina para determinar la actividad de eflujo de yoduro de CFTR mediada para esa muestra.

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Representative Results

Se describe en esta publicación escrita son métodos para purificar, reconstituir y medir la actividad del canal regulado de la proteína CFTR. Figura 1a muestra el flujo de trabajo para la purificación, la reconstitución y procedimientos de flujo de salida de yoduro. Métodos para la reconstitución y la actividad del canal mediciones de flujo de yoduro también se muestran en más detalle en el vídeo asociado.

La purificación y reconstitución de CFTR en proteoliposomas

CFTR puede expresarse funcionalmente en altos niveles en S f 9 células usando baculovirus recombinantes que contienen WT o cDNA mutante CFTR 2. Aunque no es un sistema de expresión de mamífero, CFTR se expresó usando el sistema de baculovirus en células de S f 9 para asegurar un alto nivel de expresión. La producción de CFTR puede ser tan alta como 1% del total de proteína celular 17,28. El S f 9- sistema de baculovirus tiene la ventaja de que la proteína glicosilada es el núcleo y lamáquinas de control de calidad en este sistema es relativamente permisivo tal que CFTR y los mutantes se pueden producir en la superficie celular. Una etiqueta de diez histidina fue diseñado en el extremo carboxi terminal para permitir la purificación en virtud de la afinidad de esta etiqueta para níquel-NTA. El C-terminal etiqueta ayuda a prevenir la co-purificación de las proteínas y los rendimientos de proteína CFTR funcional en ATPasa, un solo canal y experimentos de flujo de salida de yoduro 17,19,24,28,29 CFTR truncado. Sin embargo, el protocolo de purificación descrito aquí debe ser adecuado para CFTR N-terminalmente etiquetado también.

Anteriormente, se ha demostrado que la proteína CFTR se puede extraer de manera efectiva a partir de preparaciones de membrana de S f 9 plasma usando NaPFO (sodio pentadecafluoro-octanoato) a temperatura ambiente 15. Sin embargo, la susceptibilidad de NaPFO para precipitar a 4 ° C, una temperatura propicia para la preservación de la proteína correctamente plegada, y el largo de diálisis requerido para retirar el PFO no eran susceptibles de rapmétodos de purificación ID y la reconstitución destinadas para maximizar la actividad de la proteína en ensayos posteriores de la función de CFTR. Una evaluación de un panel de detergentes (incluyendo dodecil-β-D-maltósido (DDM), 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propanosulfonato (CHAPS), fos -colina 12 y fos -colina 14, mostró que fos -colina 14 era más eficaz en la solubilización de CFTR-His humano de 10 S F 9 membranas, y que DDM fue eficaz en el mantenimiento de la actividad de ATPasa de CFTR en solución de detergente (datos no mostrados). Así etapa de extracción 14 de detergente -colina un fos se lleva a cabo, seguido por intercambio de DDM detergente para mantener la actividad de la proteína.

Después de la purificación y concentración, se obtiene una fracción de proteína en el detergente DDM que contiene una banda de ~ 150 kDa como su componente principal (Figura 2; Silver Stain). Este peso molecular corresponde a CFTR humano, expresado en S <em> 9cells f y se analizaron por SDS-PAGE, en la que carece de los tipos de glicosilación complejo característico de CFTR en células de mamífero. Las especies de 150 kDa parece ser aproximadamente 90% pura siguiente análisis SDS-PAGE y tinción con plata. Transferencia de Western usando el anticuerpo anti-CFTR M3A7 confirma que esta monoclonal de ratón dirigido contra NBD2 reacciona con la banda de 150 kDa (Figura 2; blot). En ciertos estudios, cantidades de trazas de componentes de menor peso molecular están presentes como bandas menores visibles en el gel, en ~ 60 y ~ 80 kDa (datos no mostrados). El anticuerpo anti-CFTR M3A7 reacciona con las bandas de 60 y 80 kDa, pero no reacciona con otras proteínas no-CFTR (datos no mostrados). Esto sugiere que los componentes de menor peso molecular son CFTR productos de degradación co-purifica con CFTR a través de su C-terminal de His. La purificación se realiza en la presencia de inhibidores de la proteasa y parece que estos componentes están presentes en las células antes de que el procedimiento de purificación is lleva a cabo. La etapa de concentración del procedimiento elimina prácticamente la totalidad de los fragmentos de menor peso molecular contaminantes. CFTR puede ser reconstituido en este punto, o proteína de otro procedimiento de purificación se puede utilizar en el protocolo de reconstitución.

Un ensayo basado en flujo liposomal informa la reconstitución funcional de una población de moléculas de CFTR purificadas y reconstituidos como regulado, canales selectivos de aniones

Con el fin de determinar si una proporción significativa de CFTR purificado se reconstituyó como un canal de cloruro regulado usando los métodos anteriores, un ensayo de flujo de haluro proteoliposomal fue desarrollado que informa de la actividad de una población de moléculas de CFTR reconstituidas (mostrado esquemáticamente en la Figura 1B). Si, en el peor de los casos, la mayoría de las moléculas de CFTR reconstituidas son mal plegada, estas moléculas fallarán para conferir una conductancia, dejar de discriminar entre cationes y anionesy / o la puerta carecerá de regulación por PKA fosforilación y nucleótidos. Lee et al., Han publicado métodos que permiten la estimación del porcentaje de la reconstitución funcional de una proteína de membrana 30.

Liposomas vacíos (que carece de CFTR) o proteoliposomas (teniendo reconstituido CFTR) se cargan con KI (75 mM) y yoduro de extra-liposomal intercambiaron con glutamato de potasio (75 mM) haciendo pasar los liposomas a través de una columna de filtración en gel. El KI cargado proteoliposomas se añaden a un K-Glu (glutamato de potasio) que contiene bien para crear un gradiente hacia el exterior de yoduro y de flujo de salida se controla a medida que aumenta en yoduro de extraliposómico lo largo del tiempo usando un microelectrodo sensible yoduro de 24. El flujo de salida de resultados de yoduro de carga negativa en una disminución de la señal mV (señal se hace más negativa). Cuando se representa gráficamente la concentración de yoduro liberado con el tiempo, la pendiente se invierte (como en la Figura 3) para mostrar un aumento en yoduro en la exsolución interna a través del tiempo.

K-Glu fue elegido como el contraión impermeant ya que es un ejemplo de un anión que no pasa a través de la proteína CFTR, no parece causar bloqueo significativo de los poros bajo las condiciones utilizadas, y no causa interferencia con la selectiva yoduro de electrodo. Un ensayo puede optimizarse en torno a otro anión, siempre que cumpla con estos criterios. Concentraciones de aniones mM Setenta y cinco fueron seleccionados empíricamente como las concentraciones que dieron buena señales suficientes de captura y para la medición en el ensayo en las condiciones descritas. No habrá esencialmente ninguna liberación de yoduro de liposomas de yoduro-cargado que carecen de CFTR funcionalmente reconstituido hasta que las vesículas se permeabilizaron con el detergente (Figura 3; trazas de control), mientras que reconstituida-CFTR, proteoliposomas yoduro cargado median yoduro de liberación en la solución externa después de la adición de MgATP (1 mM) para abrir el canal CFTR y valinomicina(20 nM) para prevenir el desarrollo de un potencial de membrana (Figura 3A; ver traza para la proteína: relación de masa lipídica de 1: 3.000 (w / w)).

Valinomicina es un ionóforo de potasio que transporta específicamente través de la membrana, por debajo de su gradiente de concentración y la concentración de 20 nM fue elegido empíricamente como la concentración más alta que no perturba la integridad de liposoma vacío en el sistema actual. Esto puede necesitar ser optimizado para cada sistema particular. Sin adición de valinomicina, hay una liberación de yoduro abreviada de unos pocos nm, que rápidamente alcanza una meseta (datos no mostrados). Aunque se sabe que estas condiciones para activar de otro modo al máximo la actividad de los canales de aniones de CFTR (como en la Figura 3A), parece que la falta de una respuesta significativa refleja el aumento instantáneo en la carga positiva intraliposómica mediada por conducción yoduro a través del poro selectivo anión de CFTR , continu inmediatamente limitandoyoduro de eflujo ous donde valinomicina no está incluido. Esta respuesta mediada por valinomicina confirma que yoduro de eflujo se limitó en los experimentos anteriores, debido a la acumulación de carga, apoyando la selectividad anión de CFTR reconstituido. Si CFTR carecía de esta selectividad, tanto de potasio y yoduro habrían sido capaces de flujo de salida de proteoliposomas derogando así la necesidad de valinomycin para iniciar el flujo.

Las concentraciones de yoduro medidos en estos puntos de tiempo iniciales fueron elegido empíricamente a caer dentro de la gama de sensibilidad óptima para el electrodo de detección yoduro de empleado. El uso de otros electrodos de yoduro puede requerir la optimización de estos factores. Después de llegar a una meseta, se añade Triton X-100 para permeabilizar las proteoliposomas y liberar cualquier resto de yoduro atrapado. A diferencia de las mediciones de yoduro iniciales (obtenidas entre 1 y 2 min después de la adición valinomicina), las lecturas en estos puntos finales no están en el intervalo lineal de la cali electrodoscurva de calibra- (datos no mostrados), impidiendo de ese modo una evaluación precisa de la fracción de liposomas a partir del cual la proteína CFTR es capaz de mediar yoduro de eflujo en relación con el número total de los liposomas en el ensayo, o su reconstitución funcional por ciento.

La tasa de flujo de yoduro refleja el número de moléculas de proteína CFTR, la probabilidad de apertura y la conductancia unitaria de cada canal CFTR. Por lo tanto, las tasas de flujo de salida de yoduro deben depender del número y la probabilidad de apertura de cada molécula CFTR. La predicción se puso a prueba en este sistema mediante el aumento del número de moléculas de CFTR por liposoma. La relación de activado (fosforilada y MgATP tratada) proteína CFTR a lípido era variada, con las proporciones que van desde 1: 300-1: 3000 (w / w) (Figura 3A). Cuanto mayor sea la cantidad de CFTR reconstituida presente en los proteoliposomas, mayor es la tasa de flujo de salida (medida entre 1-2 min después de valinomycin adición), apoyando la predicción tlas tasas de flujo de salida del sombrero dependen del número de moléculas de CFTR en cada liposoma. La tasa de flujo de salida obtenida usando proteína específica: ratios de lípidos son reproducibles entre los días experimentales y purificaciones de proteínas, destacando así el rigor de este método.

La tasa de flujo de salida de yoduro parece referirse a la probabilidad de apertura del canal CFTR en este sistema reconstituido. Como se requiere la fosforilación por PKA para la activación de CFTR 31 (y revisión por 32), se espera que habrá una baja tasa de flujo de salida de yoduro en vesículas que contienen CFTR que no ha sido fosforilada por tratamiento exógeno PKA, donde la probabilidad abierta es baja . En proteoliposomas que han sido tratados PKA, la probabilidad de apertura será mucho mayor, lo que resulta en una mayor tasa prevista de flujo de salida. En la práctica, para tratados con PKA CFTR en presencia de 1 mM MgATP en este sistema, la tasa de eflujo de yoduro de medida a partir de uno a dos minutos después de la adición de valinomycen es aproximadamente cuatro veces la tasa de proteína CFTR sometido a MgATP pero no PKA (Figura 3B). Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que la tasa de flujo de salida se refieren a canalizar probabilidad de apertura. En la práctica puede ser difícil de comparar la actividad en este ensayo directamente a abrir probabilidad dado que otros factores tales como cambios dependientes del tiempo en la fuerza de conducción electroquímica influirán en la actividad de eflujo observada. Se advierte al lector que este ensayo no es un reemplazo para las grabaciones de la actividad de canales individuales detallados.

Curiosamente, no se observa típicamente una baja tasa de flujo de salida de yoduro por la proteína "no fosforilada" en presencia de MgATP que es significativamente mayor que el eflujo de los liposomas que carecen de CFTR (Figura 3B, C). Esta baja tasa puede reflejar la fosforilación basal de CFTR en el sistema de expresión de 9 celdas S f antes de la purificación 33. CFTR purificada a partir de otra syste expresiónms puede tener diferentes niveles de fosforilación basal y, por tanto, diferente actividad residual.

Este rápido rendimientos protocolo de purificación Wt-CFTR de S f 9 células en cerca de homogeneidad, sin embargo para F508del- y G551D-CFTR, el método se describe mejor como un proceso de enriquecimiento. Algunas bandas contaminantes se observan a través de SDS-PAGE 19, muchas de las cuales reflejan los productos de degradación CFTR que son reactivos a anticuerpos CFTR y parecen estar presentes antes de la ruptura celular. Los métodos de reconstitución y el flujo de yoduro son adecuados para estas muestras enriquecidas de mutantes clínicamente relevantes. Como se muestra en la figura 3D, significativa yoduro de eflujo se mide tanto para F508del- (proteína: lípido relación de masa de aproximadamente 1: 600) y G551D-CFTR (proteína: lípido de aproximadamente 1: 300). Mientras que ambos mutantes tienen menor actividad absoluta de WT-CFTR (proteína: relación de masa lipídica de 1: 1200), es difícil comparar las muestras directamente como la cuantificaciónno puede ser tan preciso para los mutantes que están contaminados con productos de degradación CFTR. Sin embargo, tanto F508del-CFTR y G551D purificaron mediante estos métodos, se reconstituyeron y se sometieron a mediciones de flujo de salida responde como se espera a las pequeñas potenciadores de la molécula (Figura 4), ​​y muestran la función del canal similar a la proteína purificada por el método de purificación PFO más riguroso 19.

La actividad de los canales de CFTR purificada y reconstituida puede ser modulada por inhibidores de moléculas pequeñas y potenciadores

CFTR hab -172 34 es el inhibidor más específico CFTR disponible que se ha demostrado que inhibe la probabilidad de apertura de los canales de cloruro CFTR en las mediciones de conductancia de canal único 35 y para inhibir la actividad de CFTR en otros estudios 22,36. Como se muestra en la Figura 3C, la tasa de flujo de salida después de valinomycin Además se reduce significativamente por el pretratamiento con inh CFTR ub> -172. Por lo tanto, este ensayo de la actividad de los canales de una población de moléculas de CFTR purificados y reconstituidos es eficaz en la actividad de la presentación de informes de moduladores tales como la CFTR ligando inhibidor inh -172.

El ensayo es sensible y altamente aplicable a examen de los efectos de la pequeña molécula de tratamiento potenciador también. Como se muestra en la Figura 4, los tres genotipos ensayados CFTR se potencian significativamente por pequeñas potenciadores de moléculas activas, tales como Kalydeco / VX-770 o VRT-532 (Figura 4C; se muestra para G551D), mientras que un análogo inactivo no tiene ningún efecto sobre el flujo de salida de yoduro de actividad del CFTR (mostrado para F508del-CFTR; Figura 4B). El ensayo es aplicable al examen de dependencia de la concentración potenciador, y el papel de ATP y la fosforilación en la actividad de CFTR potenciador mediada.

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Figura 1:. Diseño Ensayo y flujo de trabajo (A) Flujo de trabajo para el trabajo descrito en esta publicación (B) Representación esquemática del experimento de flujo de salida de yoduro.. Una versión modificada del panel B fue originalmente publicado en The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; y Bear, CE fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana (CFTR) Potenciador VX-770 (ivacaftor) Abre la Puerta Canal defectuosa de mutantes CFTR de Manera fosforilación dependiente pero independiente de ATP. 2012; 287: desde 36.639 hasta 36.649. © La Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular.

Figura 2
Figura 2:. El WT-CFTR proteína CFTR Plata purificación rápida procedimiento produce purificado manchado gel SDS-PAGE y Westblot utilizando el anticuerpo ern M3A7 CFTR purificada para proteína humana WT-CFTR en el detergente DDM (1 mg y 0,1 g para el gel y blot, respectivamente), aislado de S f 9 células sobre-expresión de una (His) 10-etiquetados versión de la proteína. Wt-CFTR (> 90% de pureza) se detecta a 150 kDa, apropiado para esta proteína que carece de glicosilación compleja. Esta investigación fue publicado originalmente en The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; y Bear, CE fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana (CFTR) Potenciador VX-770 (ivacaftor) Abre la Puerta Canal defectuosa de mutantes CFTR de Manera fosforilación dependiente pero independiente de ATP. 2012; 287: desde 36.639 hasta 36.649. © La Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular.

Figura 3
Figura 3: El iinformes de ensayo de flujo de salida odide regulan la actividad del canal para la proteína CFTR purificada y reconstituida. (A) purificada y fosforilados Wt-CFTR reconstituyó en proteína: proporciones de lípidos de 1: 300 (w / w), 1: 1.200 (w / w) y 1: 3.000 (w / w) media yoduro de eflujo desde el lumen de la vesícula a el baño de mayor con el tiempo después de la adición de 1 mM MgATP y 20 nM valinomicina. La adición de 0,1% (w / v) de Triton X-100 para permeabilizar las liberaciones proteoliposomas atrapados yoduro en el lumen de la vesícula al final del experimento. (B) de yoduro supuesto tiempo de flujo inicial para reconstituida proteína Wt-CFTR que no habían sido . (C) iniciales tasas de eflujo de yoduro de pre-fosforilados demuestran la dependencia de la actividad observada en la proteína CFTR funcional. Se requiere PKA fosforilación de la proteína para la actividad del canal significativa, que es inhibida por la adición del inhibidor de la CFTR, CTTR inh -172 (20 mM). Los datos son medias ± SEM; * P <0,05, *** p <0.0001. (D) múltiples genotipos producen señales CFTR regulados en el ensayo de yoduro de eflujo, incluyendo peso, F508del- y G551D-CFTR versus control. Los datos son medias ± SEM; * P <0,05; *** P <0,0004 vs. el control. Esta investigación (porciones de datos en los grupos A, C y D) fue originalmente publicado en The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; y Bear, CE fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana (CFTR) Potenciador VX-770 (ivacaftor) Abre la Puerta Canal defectuosa de mutantes CFTR de Manera fosforilación dependiente pero independiente de ATP. 2012; 287: desde 36.639 hasta 36.649. © La Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular.

Figura 4
Figura 4: La potenciación dependiente de la fosforilación de CFTR por pequeñas moléculas puede ser interrogado utilizando elsistema de flujo de salida de yoduro de peso, F508del- y G551D-CFTR. (A) Peso-CFTR se potencia significativamente por el potenciador VX-770 (10 M), sólo en el estado de PKA-fosforilada. Los datos son medias ± SEM, * p <0,01 vs. + PKA-VX-770. (B) VX-770 (10 M), pero no un análogo inactivo, V-09 hasta 1188 (10 M), potencia de forma significativa el flujo de salida de yoduro actividad de fosforilados F508del-CFTR. Los datos son medias ± SEM, n = 3, *** p <0,001 vs. -VX-770 (c) Potenciación de la G551D-CFTR por 10 mM VRT-532 o VX-770 de control.. Los datos son medias ± SEM, n = 5, ** p <0,001, *** p <0,0001 vs. -VX-770 de control. Esta investigación (paneles ac) fue originalmente publicado en The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; y Bear, CE fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana (CFTR) Potenciador VX-770 (ivacaftor) Abre la Puerta Canal defectuosa de mutantes CFTR en una fosforilación dependiente pero AT-P independiente Cortesía. 2012; 287: desde 36.639 hasta 36.649. © La Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular.

r> ight "> 7.4
Buffer Nombre Contenido pH Ajustar el pH utilizando
Buffer 1 2% fos -colina 2% (w / v) fos -colina 14 de detergente en imidazol 10 mM, 25 mM HEPES 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 2 Imidazol 10 mM Imidazol 10 mM, HEPES 25 mM (sin detergente) 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 3 Imidazol 10 mM + DDM Imidazol 10 mM, 25 mM HEPES, 1 mM dodecil-β-D-maltósido 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 4 Imidazol 50 mM + DDM Imidazol 50 mM, 25 mM HEPES, 1 mM dodecil-β-D-maltósido 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 5 Imidazol + DDM 600 mM Imidazol 600 mM, 25 mM HEPES, 1 mM dodecil-β-D-maltósido 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 6 75 mM KI + DDM KI 75 mM, MOPS 20 mM, 1 mM dodecil-β-D-maltósido 7.4 KOH
Buffer 7 KI 75 mM KI 75 mM, MOPS 20 mM 7.4 KOH
Buffer 8 25 mM HEPES + DDM 25 mM HEPES, NaCl 25 mM, 1 mM dodecil-β-D-maltósido 7.4 HCl / NaOH
Buffer 9 75 mM K-Glu 75 mM de K-glutamato, MOPS 20 mM KOH / ácido glutámico
Buffer 10 15 mM KI 15 mM de KI, MOPS 20 mM 7.4 KOH

Tabla 1: Tabla de tampones.

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Discussion

Ha habido un número limitado de protocolos de purificación para de longitud completa, el aislamiento CFTR funcional, a partir de una variedad de sistemas de sobreexpresión celulares. El método descrito aquí es ventajosa, ya que permite la purificación rápida de WT-CFTR o alto enriquecimiento de F508del- y G551D-CFTR en cantidades moderadas que es altamente funcional en ensayos que incluyen ATPasa y mediciones directas de la función del canal, incluyendo mediciones de canal individuales en bicapa planar sistemas y medidas demostradas de la función del canal CFTR población que son altamente relevantes para el estudio de moléculas pequeñas 19-21. El método de purificación se integra en un protocolo de reconstitución rápida y eficaz, sin embargo la proteína purificada a partir de otros métodos puede ser acoplado a este protocolo de reconstitución, así, a condición de que el detergente de purificación es susceptible de extirpación de manera similar.

A diferencia de los complicados y laboriosos experimentos de un solo canal de excparches de membrana zados, los métodos descritos aquí permiten una evaluación sólida pero sencillo de la función del canal CFTR, y únicamente esta medida informes de la función de una población más grande de canales de CFTR en lugar de una o unas pocas moléculas. A diferencia de las técnicas que implican parches de membrana, este método permite la evaluación directa de los efectos de moduladores de molécula pequeña en el canal en la casi ausencia o completa de proteínas asociadas, dependiendo de la eficacia del procedimiento de purificación junto.

Los pasos críticos dentro del protocolo

Aunque hay varios pasos críticos en la reconstitución funcional de CFTR para el ensayo de flujo de aniones, como notas indicadas en el Protocolo, la optimización de la proteína: lípido durante CFTR reconstitución es clave. Se requiere Dicha optimización para cada genotipo CFTR.

Modificaciones y solución de problemas de la técnica

Las res mV basalesPonse para la sonda utilizada aquí durante el ensayo de yoduro de eflujo con muestras preparadas como se describe es típicamente -20 a -50 mV. Las desviaciones significativas de este rango sugieren que puede haber problemas con la muestra. Otras sondas vendidas por diferentes fabricantes pueden diferir de las directrices proporcionadas aquí. Si una línea de base estable no se puede lograr, detergente residual o inactivo, desnaturalizado, proteína de mala calidad se pueden permeabilizar las vesículas de yoduro.

Si no se detecta un cambio significativo en la tasa de flujo de salida de yoduro valinomicina dependiente de liposomas que contienen CFTR fosforilada en presencia de MgATP puede reflejar varios temas, todos los cuales deben ser investigados. Estos temas incluyen: mala calidad, CFTR parcialmente desnaturalizado o CFTR impuro; eliminación incompleta de detergente durante la reconstitución; proteína no óptimo: lípido en proteoliposomas; o valinomicina insuficiente añadió, haciendo disipación de la carga incompleta.

El iensayos de eflujo odide ofrece la flexibilidad de utilizar la proteína CFTR pre-fosforilada (tal como se describe en el protocolo), o para CFTR fosforilada durante el ensayo. Si la proteína reconstituida no se fosforiló durante el procedimiento de purificación, la muestra puede ser fosforilada durante el experimento yoduro de eflujo en el paso 3.2.7, mediante la adición de PKA con el MgATP. En este caso, garantizará que la línea de base se registra durante al menos 5 minutos para asegurar que la proteína ha sido suficientemente fosforilado por la enzima PKA antes de la función de medición con la adición de valinomicina. Resultados similares se obtienen por cualquiera de los métodos.

Durante el protocolo, se permite que la molécula de modulador de interactuar con la proteína CFTR durante 5 min antes de la medición de la actividad por adición de MgATP y luego valinomicina. Como la mayoría de los moduladores CFTR son muy lipofílica, puede tomar tiempo entre la adición al baño y el equilibrio de asociación con la proteína CFTR. El ensayo no puede proceder sin ªe adición de valinomicina, y por lo tanto no se pierde información realizando el ensayo de esta manera. En situaciones en las que el usuario no está preocupado de que puede haber un tiempo de retraso antes de la interacción de la molécula pequeña con la proteína, el ensayo podría realizarse mediante la adición aguda del modulador después de la adición de valinomicina, mientras que todavía en la fase inicial de la tasa la medición.

Limitaciones de la técnica

Como se dijo anteriormente, este ensayo basado en flujo proteoliposomal de la actividad del canal regulado por una población de larga duración moléculas CFTR purificadas y reconstituidos proporciona un método único para interrogar ligandos que modifican directamente la actividad. Sin embargo, el método está limitado en que no proporciona información sobre el mecanismo a través del cual ligandos cambian la tasa de flujo a través de CFTR. Idealmente, el ensayo proteoliposomal flujo de CFTR purificada y reconstituida debe utilizarse en combinación con el labio planarestudios bicapa Identificación de la actividad de un solo canal. Esta combinación podría proporcionar información sobre el estado de la proteína que se une a los ligandos, es decir, la abierta y / o el estado cerrado.

Importancia con respecto a los métodos existentes

Actualmente, existe una falta de métodos para evaluar la interacción directa de moléculas pequeñas con el canal CFTR frente moduladores de molécula pequeña que interactúan con otro componente celular para alterar indirectamente la actividad del canal, por ejemplo, a través de un modulador o vía de señalización o la interrupción de proteína-proteína importante interacciones. El método de yoduro de eflujo demuestra la interacción directa con la proteína de cualquier molécula pequeña que modula la actividad de los canales de CFTR. A pesar de la baja de manera rendimiento de las mediciones, sigue existiendo un valor considerable en estos métodos únicos para el estudio de la interacción directa de CFTR con pequeñas potenciadores molécula y correctores. Muchos pequeños molecule moduladores están en desarrollo por ambos grupos académicos y de la industria farmacéutica para el tratamiento de los pacientes con FQ clínicamente, ya que esta es la idea central de la investigación CF actual. Se prevé que los métodos descritos aquí serán ayudar en el desarrollo y validación del mecanismo de acción de los más prometedores de estas moléculas.

Las futuras aplicaciones de la técnica

Los métodos empleados aquí también son muy susceptibles de adaptación a otras proteínas de interés. De hecho se empleó una modificación de los métodos descritos para estudiar dos P. proteínas de la membrana aeruginosa implicados en el movimiento de sustratos aniónicos través de la membrana 26,27, lo que demuestra la utilidad y la versatilidad de estos métodos. Su uso en el estudio de canales y transportadores de aniones adicionales se prevé en el futuro.

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Disclosures

Los autores agradecen el asesoramiento del Dr. Mohabir Ramjeesingh durante el desarrollo de los métodos de purificación descritos aquí. Estos estudios fueron apoyados por subvenciones de funcionamiento a la Junta de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) y fibrosis quística Canadá (CFC). PDWE fue financiada en parte por los premios de becas a través de la CIHR y CFC. Los autores reconocen la prestación de corrector, potenciador y compuestos inhibidores de Dr. R. Bridges (Rosalind Universidad de Medicina y Ciencia) y la distribución de los Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT). Los autores también reconocen servicio excepcional por el Fondo para el cultivo celular Baylor (NIH subvención P30 CA125123) en la expresión de WT y proteína CFTR mutante utilizando el sistema de baculovirus. El inactivo analógico VX-770, V-09-1188, fue un regalo de Vertex Pharmaceuticals.

Acknowledgments

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fos-choline 14 detergent Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) F312 Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche (www.roche-applied-science.com) 04 693 132 001 EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack  Roche (www.roche-applied-science.com) 05 892 791 001
Ni-NTA Agarose Qaigen GmbH 1018240
Fisherbrand Screening columns Fisher Healthcare 11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K Millipore (www.millipore.com) UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840051C
POPC Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 850457C
PS, Porcine Brain Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840032C CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 841118C
Ergosterol Sigma (www.sigmaaldrich.com) 45480
Pierce Detergent removal spin column Thermo Scientific 87779 1 ml capacity columns
valinomycin Sigma (www.sigmaaldrich.com) V-0627
VX-770 (ivacaftor) Selleck Chemicals S1144
iodide selective microelectrode Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) LIS-146ICM  
 
 
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
Clampex 8.1 software Axon Instruments (www.axon.com) we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System  Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) LIS-146LICM-XS Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars Big Science Inc (www.stirbars.com) SBM-0502-CMB choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine GE Health Care (www.gelifesciences.com) 17-0042-01
Sonicator Laboratory Supplies Co, Inc. G112SP1G Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable

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References

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Bioquímica Número 97 fibrosis quística CFTR la purificación la reconstitución canal de cloruro la función del canal yoduro de eflujo la potenciación
Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína
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Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).

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