Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين

doi: 10.3791/52427 Published: March 9, 2015

Summary

الموصوفة هنا هو إجراء سريع وفعال لإعادة الوظيفية للتنقية من النوع البري والبروتين CFTR الطافرة التي تحافظ على نشاط لهذه القناة كلوريد، وهو عيب في التليف الكيسي. هروب رأس المال من يوديد proteoliposomes تشكيلها بوساطة CFTR يسمح دراسات النشاط قناة وآثار جزيئات صغيرة.

Abstract

والتليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR) هو عضو لتشكيل قناة فريد من ATP ملزم كاسيت (ABC) الفصيلة من الناقلين. وقد النشاط قناة الفسفرة والنوكليوتيدات كلوريد يعتمد في كثير من الأحيان من CFTR درس في نظم خلية كاملة وكقنوات واحدة في بقع غشاء استئصاله. وقد تبين أن العديد من الطفرات المسببة للالتليف الكيسي لتغيير هذا النشاط. في حين تم نشر عدد قليل من بروتوكولات تنقية، وهي طريقة إعادة سريع أن يحتفظ النشاط القناة وطريقة مناسبة لدراسة النشاط قناة السكان في نظام تنقية تم متوفرة. يتم وصف طرق السريعة هنا لتنقية وإعادة الوظيفية للبروتين CFTR طول كامل في proteoliposomes من يعرف تركيبة الدهون التي تحتفظ النشاط كقناة هاليد المنظمة. هذه الطريقة إعادة جنبا إلى جنب مع مقايسة على أساس تدفق رواية النشاط قناة هو نظام مناسب لدراسة خصائص قناة السكان من النوع البري CFTR والمسببة للأمراض المسوخ F508del- وG551D-CFTR. على وجه التحديد، والطريقة لها فائدة في دراسة الآثار المباشرة للالفسفرة، النيوكليوتيدات والجزيئات الصغيرة مثل potentiators ومثبطات على النشاط قناة CFTR. الطرق هي أيضا قابلة للدراسة أخرى قنوات غشاء / نواقل للركائز الأيونية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وبوساطة وسائل النقل كلوريد عبر الأغشية قمية من الخلايا الظهارية في مثل هذه الأنسجة كما الغدد الرئة والأمعاء والبنكرياس والعرق في المقام الأول من قبل التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR)، وهو ATP- وعضو التنظيم الفسفرة من ABC (ATP- ملزمة كاسيت) C فصيلة من البروتينات الغشاء (مراجعة في 1). مثل أعضاء آخرين من فصيلة ABCC، CFTR هو كبير ومتعددة تمتد من البروتين الغشاء لا يتجزأ التي تربط ATP في موقعين ملزمة النوكليوتيدات شكلت في واجهة من المجالات ملزم النوكليوتيدات لها (NBDs)، حيث أنها تمتلك النشاط أتباز متواضع في واحد الموقع. ومع ذلك، على عكس أعضاء آخرين فصيلة ABCC، تطورت CFTR كقناة الكلور المنظمة فريدة بدلا من أن يكون نقل المذاب النشط.

الطفرات في CFTR سبب التليف الكيسي، وهو مرض يصيب أجهزة متعددة بما في ذلك الرئتين والجهاز الهضمي والبنكرياس والجهاز التناسلي، مما يؤدي إلى مرضيdity والوفيات في البالغين الصغار. حسابات أمراض الرئة عادة لالوفاة المبكرة في التليف الكيسي وفي معظم الحالات الناجمة عن فقدان وظيفة CFTR على ظهارة سطح الشعب الهوائية إجراء. عدم وجود CFTR نشاط قناة كلوريد يسبب انخفاضا في كل من الكلور - وحركة المياه عبر البشرة السطحية لتعديل طبقة السائل على سطح قمية من ظهارة مهدبة الجهاز التنفسي. وهذا يؤدي في سائل لزج سطح مجرى الهواء أن يضعف من قدرة الخلايا الظهارية في الجهاز التنفسي مهدبة لمسببات الأمراض واضحة على نحو فعال من الشعب الهوائية. ونتيجة لذلك، فإن معظم المرضى الذين يعانون من نوبات CF المتكررة من التهاب في الرئتين وتلف الرئتين بسبب التهاب.

كما هو متوقع، ركزت دراسات لآلية عمل البروتين CFTR العادي في المقام الأول على دراسات مفصلة الكهربية من النشاط قناة النابضة به. وقد أظهرت الدراسات قناة واحدة مباشرة أن وظائف CFTR باعتباره PKA التي تعتمد على الكلور- القناة التي تمتلك بوابة للتنظيم ATP 2. وتوفر دراسات الكهربية مفصلة على قدر كبير من المعلومات عن قنوات CFTR واحدة 1،3، ولكن قد يكون هناك قلق حول ما إذا كانت الخصائص في أي قناة واحدة خاصة أن تمت دراستها هي انعكاس للسكان قنوات CFTR وبالتالي فإن قناة واحدة ينبغي النظر دائما النتائج جنبا إلى جنب مع أساليب لدراسة السكان العيانية. الفحص المباشر للنشاط قناة سكان CFTR تنقيته لديه القدرة على توفير نظرة ثاقبة على عيب الجزيئية المرتبطة الطفرات المسببة للأمراض ودفع اكتشاف جهري الكيميائية التي إصلاح البروتينات CFTR متحولة. حتى الآن، هناك ما يزيد على 1،900 طفرات مختلفة في CFTR يعتقد أن تسبب التليف الكيسي 4. الطفرة الكبرى، F508del-CFTR، وجدت على أليل واحد على الأقل في ما يقرب من 90٪ من المرضى في أمريكا الشمالية وأوروبا يؤدي إلى بروتين misfolding لالاحتفاظ الثانية في الشبكة الإندوبلازمية 5. لديها F508del-CFTR أيضا عواقب أخرى، بما في ذلك النشاط المعيبة قناة 6-9. ويرتبط غياب الناتجة من CFTR من سطح الخلية مع المرض الشديد. G551D-CFTR، طفرة أقل شيوعا، ويعتقد أن تكون مطوية بعد غير مختلة كقناة كلوريد على سطح الخلية 6 بشكل صحيح. تطوير المصححين جزيء صغير وpotentiators لديه هدف تصحيح قابلة للطي و / أو الاتجار المسوخ مثل F508del-CFTR إلى سطح الخلية، وبالتالي يؤدي إلى زيادة نشاط أو قناة من الطفرات مثل G551D عندما موجودة على سطح الخلية، على التوالي . في حين أن المصححين VX-809 وVX-661 (لا يتم بعد الموافقة عليها لاستخدامها في المرضى، وpotentiator Kalydeco (ivacaftor، VX-770) يتم استخدامه عند 150 ملغ كل 12 ساعة في المرضى الذين CF> 6 سنوات مع واحد على الأقل G551D طفرة -CFTR، ومؤخرا للمرضى مع واحدة من G178R، S549N، S549R، G551S، G1244E، S1251N، S1255PوG1349D. Kalydeco على حد سواء آمنة والنتائج في تحسين التدابير السريرية للمرض CF 10، إلا أن آلية عمل هذا الجزيء الصغير وغير مفهومة في وقت موافقة ادارة الاغذية والعقاقير للاستخدام في المرضى.

وقد وصفت حفنة من طرق تنقية CFTR سابقا 2،11-18، وكثير منها يتطلب فترة طويلة من الوقت لإكمال. في منشور صدر مؤخرا 19، وقد وصفت لتنقية وإعادة السريع طريقة فريدة لCFTR overexpressed في 9 خلايا S و نظام التعبير، وكان يستخدم هذا البروتين النقي في أنظمة الدهون محددة لتطوير CFTR هاليد النشاط قناة فحص لعدد سكانها CFTR الجزيئات. الفحص يلخص آثار معروفة من الفسفرة، النيوكليوتيدات ومثبطات على وظيفة CFTR. تم استخدام نظام لاستجواب آثار potentiator VX-770 / Kalydeco على Wt- (البرية من نوع)، وقد تبين F508del- وG551D-CFTR وذلك لأولالوقت أن الدواء يتفاعل مباشرة مع البروتين CFTR لتحفيز النشاط قناتها بطريقة ATP-مستقلة، مما يدل على المرافق العامة وتطبيق هذه الأساليب لدراسة تفاعل CFTR والمسوخ مع النيوكليوتيدات والجزيئات الصغيرة من منظور السكان ل الإجابة على الأسئلة ذات الصلة سريريا عن البروتين. كما تم استخدام أساليب لدراسة الجزيئات الأخرى potentiator ومشتقاتها 20، فضلا عن الآثار المترتبة على مصحح جزيء صغير على نشاط البروتين 21.

وقد استخدمت المقايسات هروب رأس المال في العديد من الدراسات سابقا للتحقيق في نشاط المسوخ CFTR وآثار المركبات CFTR-تغييري على نشاطها، بما في ذلك المقايسات خلية كاملة باستخدام الأقطاب، استشفاف المشعة وfluorophores 22،23، الحويصلات الغشاء مع أيون أقطاب انتقائية 24 وتنقيته CFTR تشكيلها مع استشفاف المشعة 25. ومع ذلك ثوذكر استخدام (ه) من أيون أقطاب انتقائية لدراسة تنقية CFTR تشكيلها مؤخرا لأول مرة 19. وقد استخدم للتكيف من الطريقة الحالية لإعادة تشكيل وتوصيف وظيفي لاثنين من البروتينات الغشاء في الزائفة الزنجارية، الممرض CF المشترك. واستخدمت إعادة تشكيل تنقية AlgE بروتين الغشاء الخارجي إلى جانب قياسات هروب رأس المال يوديد لدعم نموذجا لإفراز الجينات أنيوني من خلال هذا نقل 26. طبقت إعادة والقياسات هروب رأس المال يوديد للبروتين Wzx النقي، والذي سمح نموذجا لأن اقترح أن يشير إلى وجود H + آلية تنادل متعاكس معتمد على لالمرتبطة الدهون قليل السكاريد النبات عبر الغشاء الداخلي للبكتيريا عن طريق هذا البروتين 27. في كلتا الحالتين كان يستخدم يوديد كبديل للالركيزة أنيوني، وإن كان أقل سرعة مما قد يتوقع المرء لالركيزة الأم. طريقة قد تكون مناسبة للتكيف مع بروتينات أخرى مع جالنقل أو التوصيل مسارات ationic لركائز الأيونية.

هنا يوصف إجراء تنقية السريع للبروتين CFTR وإعادة حيز proteoliposomes من الدهون محددة. يمكن بسهولة إجراء إعادة السريع تكون مصممة للاستخدام مع CFTR تنقيته بواسطة طرق أخرى، شريطة أن يكون نوع من المنظفات المستخدمة في تنقية هو قابل للإزالة من قبل الأساليب المستخدمة هنا أو يمكن تبادل لالمنظفات مناسب قبل إجراء إعادة. يتم وصف طريقة هروب رأس المال يوديد لقياس النشاط قناة النقي وإعادة تشكيل البروتين CFTR بالتفصيل ويتم عرض بعض النتائج النموذجية التي يمكن الحصول عليها من هذا الأسلوب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. تنقية CFTR

ملاحظة: يرجى الاطلاع على جدول المواد والمعدات اللازمة لقائمة بالمعدات والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول. ويوجد بروتوكول مفصلة لoverexpression من الإنسان WT-CFTR والمسوخ في S و نظام التعبير 9-الفيروسة العصوية 17،28. بإفراط عن CFTR وإعداد الكريات من S و 9 خلايا وفقا لهذا البروتوكول.

  1. إعداد غشاء الخام
    1. الحصول على طازجة أو ذوبان الجليد وS و 9 بيليه الخلية المجمدة من ثقافة 500 مل من خلايا الإفراط في التعبير عن wildtype- والبروتين F508del-، أو G551D-CFTR مع محطة C صاحب 10 -tag، ونمت عن طريق أساليب زراعة الخلايا القياسية، كما هو موضح سابقا 17،28. سوف الكريات خلية لديها حجم ما يقرب من 5 مل والوزن الرطب من حوالي 5 ز.
    2. في resuspend S و 9 خلايا في 20 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 مع مثبط البروتياز كوكتيل (1 قرص لكل 50 مل) في 4 درجات مئوية، وضمانيبدو عينة متجانسة بصريا وتبقى عدم وجود كتل من الخلايا.
    3. خلايا ليز باستخدام اختلال وخلية الضغط العالي (جدول المواد والمعدات)، ليصل إلى ما لا يقل عن 10،000 رطل (ويفضل 15،000-20،000 رطل) لمدة 2 دقيقة لكل المرور. الحفاظ على عينة عند 4 درجات مئوية خلال تحلل.
      1. جمع العينة في أنبوب على الجليد بعد فترة تحلل ثم إعادة تحميل على الفور العينة في اختلال الخلية. إجراء تحلل كرر 3 مرات. فحص تحت المجهر لضمان بقاء أقل من 10٪ سليمة.
        ملاحظة: أساليب أخرى لليز الخلايا، مثل الخرز الزجاجي، وما إلى ذلك لم يتم فحصها بدقة لهذا النظام، ومع ذلك يمكن للمستخدم العثور على مثل أسلوب بديل مناسب.
    4. الطرد المركزي مواد تحلل الخلايا في 4 درجات مئوية في أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة 2،000 x ج لمدة 20 دقيقة. جمع طاف والتخلص من بيليه. تقسيم طاف بين 20 الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية في 125،000 x ج في أعلى الجدول ultracentrifuge.
    5. إزالة وتجاهل طاف، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه، وتخزين الكريات في نفس الأنابيب في -80 درجة مئوية لمدة أقل من 2 أشهر حتى استخدامها، أو الاحتفاظ بها على الجليد والاستمرار في عملية تنقية الفور.
  2. CFTR الإذابة
    1. الحصول على 1-4 S و 9 الكريات غشاء الخام الطازجة أو المجمدة و resuspend كل في 1 مل من العازلة 1 (2٪ منظمات المزارعين -choline؛ انظر الجدول 1 وصفة كاملة) في 4 درجات مئوية على الجليد، وذلك باستخدام إبرة G 25 و 1 مل حقنة حتى الحل هو متجانسة من العين بدون مرئية كتل غشاء الخلية. حيث بيليه أكثر من واحد يجري تذوب، ومواصلة لعلاج كل عينة فقا للتعليمات لبيليه واحد أدناه في موازاة ذلك، تجميع العينات في خطوة 1.3.2.
    2. حل 1 مصغرة قرص مثبط البروتياز في 1 مل من العازلة 2 (10 ملي إيميدازول؛ انظر الجدول 1) التي تفتقر منظمات المزارعين -choline 14 المنظفات (مثبطات الأنزيم البروتيني هي 10X المزيد من تناسقتصنيف من التخفيف الموصى بها في هذه المرحلة) وإضافة 100 ميكرولتر من معلق بيليه غشاء الخام (مثبطات الأنزيم البروتيني هي في التخفيف الموصى بها في هذه المرحلة). تعيين على الجليد لمدة 45-60 دقيقة مع خلط من قبل انقلاب 5 مرات كل 5 دقائق.
    3. الطرد المركزي معلق بيليه غشاء الخام في أعلى الجدول نابذة فائقة السرعة لمدة 25 دقيقة في 125،000 x ج و 4 ° C. الاحتفاظ طاف، والذي يحتوي CFTR تذوب وتجاهل بيليه.
  3. العمود ملزمة، الفسفرة وشطف
    1. غسل 400 ميكرولتر من النيكل وNTA (nitrilotriacetic الحمضيه) الطين الاغاروز أو الراتنج تعادل مع 1 مل من العازلة 2 (10 ملي إيميدازول؛ انظر الجدول 1) التي تفتقر إلى المنظفات، لإزالة المذيبات والعازلة عند 4 درجة مئوية. تكرار غسل مرتين أكثر من ذلك.
    2. الجمع بين CFTR تذوب، وتبقى مثبط البروتياز (900 ميكرولتر) والراتنج النيكل (من 400 ميكرولتر الطين) إلى ما مجموعه 10 مل مع العازلة 2 (10 ملي إيميدازول؛ انظر الجدول 1) ثhich يفتقر إلى أي المنظفات المضافة. يتم تخفيف منظمات المزارعين -choline 14 تركيز بشكل فعال إلى 0.2٪ (ث / ت) في هذه الخطوة. إذا كان هناك أنابيب متعددة، تجميع جميع العينات التي تحتوي على CFTR يذوب، مثبطات الأنزيم البروتيني، الراتنج النيكل وNTA و 0.2٪ (ث / ت) منظمات المزارعين -choline-14 في هذه المرحلة. احتضان لمدة 60 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الهز لطيف.
    3. تمرير CFTR-مثبط البروتياز والنيكل NTA حل أسفل عمود صغير الفرز (الجدول 1) أو عمود فارغ ما يعادلها.
    4. غسل النيكل NTA الراتنج، والتي يتم الاحتفاظ في العمود، مع 4 مل لكل بيليه الأولي من الواق 3 (10 ملي إيميدازول + DDM؛ انظر الجدول 1) التي تفتقر منظمات المزارعين -choline 14 ولكن يحتوي على 1 ملم DDM (المنظفات مالتوزيد دوديسيل)، في 4 درجات مئوية. إضافة المنظفات DDM لا يغير كثيرا من درجة الحموضة من هذا المخزن المؤقت.
    5. يعد حل PKA-MgATP بإضافة 25 ميكرولتر (5 ملي، التركيز النهائي) من MgATP، 2،500 U من معسكر تعتمد بروتين كيناز A، الوحيدات الحفاز (PKA) إلى 475 ميكرولتر من العازلة 3 (10 ملي إيميدازول + DDM؛ انظر الجدول 1) إلى العمود. الفوسفات البروتين عن طريق ختم نهاية الجزء السفلي من العمود مع قبعة أو بارافيلم، وإضافة 500 ميكرولتر من حل PKA-MgATP لكل بيليه الأولي المستخدمة.
    6. يحضن في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة مع خلط لطيف وإعادة تعليق من الراتنج باستخدام pipettor 1 مل كل 2 دقيقة للتأكد من أن PKA قد تأتي في اتصال مع كامل سطح النيكل NTA الراتنج.
    7. إزالة الغطاء وأزل الحل PKA / MgATP من العمود. غسل العمود مع 2 مل من العازلة 3 (10 ملي إيميدازول + DDM؛ انظر الجدول 1) في 4 درجات مئوية.
    8. مضاعفة عدد الكريات المستخدمة في التجربة من قبل 4. غسل العمود مع هذا العدد من مل من العازلة 4 (50 ملي إيميدازول + DDM؛ انظر الجدول 1) في 4 درجات مئوية، وذلك بإضافة 4 مل من العازلة إلى العمود، مما يسمح لل لها بالتدفق من خلال وعلى الفور مضيفا المقبلة قسامة 4 مل إلى العمود.
    9. الجدول 1) في 4 درجات مئوية في بيليه الأولي المستخدمة من خلال عمود، 1 مل في وقت دون توقف للسماح العمود لتجف، و جمع شطافة كلها تحتوي على CFTR تنقيته في أنبوب واحد.
    10. التركيز عينة البروتين لإزالة إيميدازول وانخفاض وتدهور الوزن الجزيئي المنتجات باستخدام جهاز فلتر الطرد المركزي (100،000 الوزن الجزيئي قطع) مثل كما هو موضح في الجدول المواد والمعدات أو جهاز مماثل آخر، في ما مجموعه 10 مل العازلة 6 (75 ملي KI + DDM؛ انظر الجدول 1) أو عازلة آخر يختاره تحتوي على 1 ملم DDM (مثل الواق 7 لالتجارب هروب رأس المال غير يوديد، 25 ملي HEPES + DDM؛ انظر الجدول 1)، عن طريق الطرد المركزي في 2،000 x ج و 4 ° C ل حوالي 20 دقيقة حتى يركز عينة إلى 200 ميكرولتر. تمييع العينة إلى 10 مل وكرر الخطوة التركيز.
      ملاحظة: في تجربتنا (غير منشورة)، إميدازول يتنهى بشكل كبيربت النشاط أتباز من CFTR وينبغي إزالتها في هذه الخطوة من قبل التخفيف والتركيز على الأقل مرتين إذا كان سيتم استخدام العينة لقياس وظيفية.
    11. جمع المركزة CFTR تنقيته. الحفاظ على 4 درجات مئوية في وجود من العازلة DDM حتى استخدام في غضون 1-2 أيام أو الاستمرار على الفور إلى الخطوة إعادة. لا تجمد البروتين النقي، كما في تجربتنا نلاحظ انخفاض النشاط.

2. إعادة تشكيل CFTR

  1. إعداد الدهون
    ملاحظة: تم تشكيلها CFTR بنجاح في البيض PC، POPC، 2: 1 (ث / ث) PC البيض: POPC (1: 1 ث / ث) خليط أو مزيج من PE: PS: PC: إرغوستيرول، 5: 2 : 2: 1 (ث / ث).
    1. للتجارب هروب رأس المال يوديد وجافة 5 ملغ من البيض PC (200 ميكرولتر من 25 ملغ / مل الأسهم، انظر جدول المواد والمعدات) تحت تيار من غاز الأرجون لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في بيركس أو قوي الآخر (غير البورسليكات- ) أنبوب زجاجي.
    2. باستخدام الامتصاصية في 280 نانومتر، وهو ELISA لssay أو أي طريقة أخرى، ويقدر تركيز البروتين المنقى عينة CFTR. للتجارب هروب رأس المال يوديد مع wildtype CFTR، واستخدام البروتين: نسبة الدهون 1: 300-1: 3،000 (ث / ث) لإنتاج إشارة كافية. لG551D- وF508del-CFTR، واستخدام البروتين: نسبة الدهون ما يقرب من 1: 200-1: 1،200 (ث / ث) من أجل الكشف عن النشاط هروب رأس المال.
    3. تحسين البروتين: الدهون نسبة لكل نظام معين. حساب حجم البروتين المنقى المطلوبة. حساب حجم عازلة مع 1 ملم DDM اللازمة لجعل الحجم النهائي من 1 مل، أي 1 مل - (حجم محلول البروتين مطلوب) = حجم العازلة.
      1. إضافة حجم المحسوبة لنظام المخزن المطلوب مع 1 ملم DDM إلى الدهون المجففة (ولكن لا تضيف البروتين CFTR في هذا الوقت) وتغطية أنبوب زجاجي مع بارافيلم. للتجارب هروب رأس المال يوديد، و resuspend الدهون في الواق 6 (75 ملم KI + DDM؛ انظر الجدول 1). لتجارب أخرى resuspend في الواق 8 (25 ملي HEPES + DDM، انظرالجدول 1) أو لآخر المخزن المؤقت الداخلي المطلوب تحتوي على 1 ملم DDM.
      2. دوامة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للمساعدة في وقف الدهون في المخزن المؤقت DDM. بالتناوب، تسخين العينة إلى 37 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة قبل vortexing ل.
    4. تعليق الدهون مرارا وتكرارا في درجة حرارة الغرفة مع حقنة 1 مل و 25 G الإبرة حتى أي فيلم الدهون مرئيا على جانبي الأنبوب. تجنب حقن الهواء إلى الحل الذي من شأنه أن تنتج فقاعات غرامة وتساعد في أكسدة يوديد والدهون.
    5. يصوتن الدهون العالقة في بارافيلم تغطية أنبوب لانفجار 20 ثانية في الجليد sonicator باث تحتوي على، ومن ثم نقل على الفور الى الثلج لمدة 1 دقيقة. كرر 3 مرات.
      ملاحظة: صوتنة مكثفة تتحول حلول يوديد الصفراء بسبب الأكسدة. لذلك تجنب صوتنة المفرط. رصد عينة لإجراء تغييرات اللون. إذا لاحظت تغيير اللون، تجاهل العينة وإعداد مرة أخرى. التغيير في اللون نتيجة لأكسدة بعضان يوديد يؤدي إلى أكسدة الدهون تحت نفس الظروف. سوف تشريد الهواء من أنبوب مع غاز الأرجون قبل sonicating الحل تساعد على منع أكسدة الدهون ويوديد. صوتنة الشديد قد تكسر نوعية رديئة أو أنابيب زجاجية خدش مما أدى إلى فقدان العينة.
    6. إضافة حجم CFTR تنقية المحسوبة في الخطوة 2.1.3 لعينة من المادة الدهنية sonicated إلى تحقيق الحجم النهائي من 1 مل. مزيج من البروتين مع الحل الدهون والمنظفات بواسطة إعادة تعليق 10 مرات مع 25 G إبرة وحقنة 1 مل.
    7. ضبط الدهون والبروتين عينة على الجليد لمدة 30 دقيقة مع دوامات من أنبوب لخلط 5 مرات كل 5 دقائق.
  2. إعداد العمود ملزم المنظفات
    1. الحصول على استخدام مرة واحدة التجاري ملزم المنظفات تدور العمود (انظر الجدول من المواد والمعدات) بسعة حجم 1 مل وكسر علامة التبويب السفلي لبدء العمود يتدفق.
    2. أجهزة الطرد المركزي العمود لمدة 2 دقيقة في 2،000 x ج لإزالة تخزين بuffer، وتجاهل هذا المخزن المؤقت.
    3. إضافة 5 مل من العازلة 7 (75 ملم KI، انظر الجدول 1) إلى العمود ثم الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 4 دقائق إلى أزل غسل العازلة. كرر هذه الخطوة 2 مرات أكثر ليصبح المجموع 3 يغسل لإزالة كل آثار المخزن المؤقت التخزين. تجاهل كل التدفق من خلال.
      ملاحظة: ومن الأهمية بمكان أن المخزن المؤقت تستخدم لغسل العمود لا يحتوي DDM أو أي منظف آخر. العمود لديه قدرة محدودة ملزمة لالمنظفات وإذا تم استخدام العازلة التي تحتوي على المنظفات، وسيكون العمود غير فعالة في إزالة المنظفات من العينة البروتين الدهني المنظفات.
    4. قسامة بعناية كل مل 1 من العينة للدهون، المنظفات البروتين على الجزء العلوي من الراتنج العمود واحتضان عينة في الجزء العلوي من العمود لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. الطرد المركزي العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق عند 2،000 x ج وجمع عينة proteoliposome غائم في نظيفة 1.5 أو 2 مل microfuge أنبوب أو أنبوب زجاجي ووضع سامسبيل على الجليد.
    6. جمع المتبقية proteoliposomes في العمود بإضافة 200 ميكرولتر من العازلة 7 (75 ملم KI، الجدول رقم 1) أو عازلة الآخر (دون المنظفات) إلى الجزء العلوي من العمود وكرر الخطوة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة.
    7. إضافة شطافة الثانية على عينة proteoliposome إذا كان يبدو غائما.
    8. تخزين العينة في 4 درجات مئوية خلال الليل أو استخدامها على الفور لقياس هروب رأس المال يوديد.

3. القياسات يوديد الدفق لتنقية، CFTR اعادة تشكيل

  1. جيل من التدرج يوديد عبر الغشاء proteoliposomal
    1. حبات قبل تضخم Sephadex G50 في الواق 9 (75 ملي K-حمض الغلوتاميك، الغلوتامات البوتاسيوم، انظر الجدول 1)، (حوالي 5 غ حبات جافة في 50 مل عازلة) أو عازلة الخارجي المطلوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على الأقل أو على 4 ° C بين عشية وضحاها.
    2. إعداد 4 أعمدة Sephadex G50 المشبعة في الواق 9 (75 ملي K-حمض الغلوتاميك، انظر الجدول 1) أو غيرهاعازلة في الأعمدة فحص صغيرة عن طريق تحميل الراتنج على الأقل ¾ كامل في العمود.
    3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق عند 2،000 x ج لإزالة عازلة الزائدة من الراتنج. ينبغي أن يكون هناك ما يقرب من 2.25 مل من معبأة الراتنج رطب في العمود في نهاية الخطوة الطرد المركزي.
      ملاحظة: الراتنج يجب رطب طفيفة ولكن ليس مغمورة في سائل، وينبغي أن تدور موجز لاحق لم أزل كميات كبيرة من العازلة. فمن الأهمية بمكان لشطف الناجح لعينة proteoliposome أن الراتنج العمود ليست رطبة جدا ولا جافة جدا ويمكن أن يحتاج المستخدم لهذه التجربة مع الأعمدة من أجل أن تصبح مألوفة مع الظروف الصرف عازلة الأكثر نجاحا.
    4. إضافة بعناية 125-150 ميكرولتر من proteoliposome العينة إلى أعلى كل عمود وأجهزة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق عند 2،000 ز س.
    5. تجمع proteoliposome eluates معا للاستخدام الفوري في هروب رأس المال يوديد أو تجارب أخرى.
      ملاحظة: حجم مزال من كل عمود يجب أن يكون تقريباوينبغي أن يكون 150 ميكرولتر والعينة غائم إلى حد ما، ولكن أقل غائم من العينة الأصلية. كميات أكبر أو eluates واضحة تشير إلى أن الأعمدة لم يتم تجفيفها بما فيه الكفاية، أو قد جفت أكثر من اللازم، على التوالي، وسوف لا تؤدي إلى تجربة يوديد هروب رأس المال ناجحة.
  2. يوديد هروب رأس المال الفحص
    1. غسل إلكترود الجزئي الانتقائي يوديد (جدول المواد والمعدات) على نطاق واسع مع دي المتأينة المياه، ومن ثم احتضان لمدة 20 دقيقة قبل التجربة في الواق 10 (15 ميكرومتر KI، انظر الجدول 1). غسل الكهربائي مرة أخرى على نطاق واسع مع دي المتأينة المياه.
    2. إضافة 150 ميكرولتر من المخدرات (20 ميكرومتر تركيز نموذجي لإنتاج تركيز النهائي من 10 ميكرومتر في مقايسة) في الواق 9 (75 ملي K-حمض الغلوتاميك، انظر الجدول 1) أو مركبة في الواق 9 إلى بئر واحدة من لوحة 96-جيدا مع شريط برغوث ضجة صغيرة.
      1. ضمان عدم وجود فقاعات الحالية. استخدام غيض ماصة لإزالة طائشةالفقاعات. إذا كان يتم استخدام محلول الدواء، تأكد من أن تركيز DMSO النهائية في البئر هو أقل من 1٪ (ت / ت) (عادة 0.1-0.2٪ (ت / ت)).
    3. إضافة 150 ميكرولتر من إعادة تشكيل البروتين CFTR التي تم إنتاجها في القسم 3.1 في الواق 9 (75 ملي K-حمض الغلوتاميك، انظر الجدول 1) إلى البئر مع المخدرات أو العازلة، لإنتاج إجمالي حجم 300 ميكرولتر في البئر من لوحة.
    4. وضع لوحة 96-جيدا على لوحة ضجة ويقلب في 130 دورة في الدقيقة (أو بسرعة معتدلة من حوالي ¼ من الحد الأقصى للسرعة).
    5. إدراج غيض من يوديد القطب الانتقائي بعناية في البئر مع العينة بحيث غيض لا تلامس قاع البئر أو يجري ضرب من قبل بقضيب. تأكد من أن القطب إشارة، إذا منفصلة، ​​هو أيضا على اتصال مع الحل في البئر.
    6. اقتفاء أثر سجل باستخدام برنامج كمبيوتر محلية الصنع أو التجارية التي واجهات مع القطب (انظر الجدول المواد والمعدات اللازمة لمزيد من التفاصيل).استخدام معدل أخذ العينات من 2 هرتز، مع تصفية إشارة من خلال مرشح الترددات المنخفضة.
    7. السماح للعينة لكي تتوازن لمدة 5 دقائق لإنتاج خط الأساس شقة شقة مستقر، أو بالقرب منها أثناء التسجيل.
    8. إضافة 3 ميكرولتر MgATP (100 ملي الأسهم التي أعدت في DH 2 O وتعديلها لدرجة الحموضة 7 مع KOH، 1 ملم التركيز النهائي) على عينة لتنشيط البروتين. السماح ~ 5 دقائق للوصول إلى خط الأساس مستقر الجديد. ضبط دائما الرقم الهيدروجيني للملي MgATP الأسهم 100 إلى محايد قبل استخدامها لتجنب التغيرات في الرقم الهيدروجيني للعازلة الخارجي.
    9. إضافة 3 ميكرولتر من valinomycin الأسهم (2 ميكرومتر، و 20 نانومتر تركيز النهائي) على عينة إلى إنتقل التغيرات في فرق الجهد التي تولدها-يوديد انتقائية تصرف من خلال CFTR. تسجيل المنحدر تناقص (النقص في بالسيارات) وذلك بسبب النشاط يوديد هروب رأس المال بوساطة CFTR لمدة 5 دقائق على الأقل.
    10. للتأكد من أن محاصرة من يوديد في التجويف proteoliposome كان كافيا، إضافة 3 ميكرولتر من 10٪ (V / V) تريتون X-100 للعينة. Significanر، والإفراج الفوري يوديد يشير إلى أن يوديد كافية وقد حوصر في الحويصلات بحيث محاصرة لم يكن العامل المحدد للتغييرات في منحدر المحددة في 3.2.9 وإنما النشاط بوساطة CFTR.
    11. غسل شريط الكهربائي ويقلب جيدا مع دي المتأينة المياه بعد المعالجة من العينات مع المخدرات أو مع تريتون X-100 لضمان أن يتم نقل جميع آثار هذه الكواشف لتجنب تلوث العينة القادمة.
    12. إعداد سلسلة من تركيزات KI مخفف في مكرومولي لمجموعة nanomolar في الواق 9 (K-حمض الغلوتاميك العازلة، انظر الجدول 1). تسجيل استجابة بالسيارات من القطب إلى تركيز كل من 0 إلى أعلى تركيز إعدادها. بناء منحنى القياسية حيث يتم رسم استجابة التحقيق (بالسيارات) مقابل سجل للتركيز يوديد المولي. استخدام المنحنى القياسي لتحويل استجابة بالسيارات لجنة التحقيق أثناء التجربة هروب رأس المال إلى تركيز يوديد الإفراج عنه.
      ملاحظة: إعداد لئيم المعايرةهاء على أساس أسبوعي حتى هو مستخدم متأكدا من مدى سرعة الاستجابة للتغيرات التحقيق. سوف يكون هناك انحراف في الاستجابة والحساسية لجنة التحقيق مع مرور الوقت. كما تتراوح أعمارهم التحقيق، فإن استجابة تتحلل. هذا قد تلغى جزئيا عن طريق تغيير الحلول الداخلية بشكل دوري والغسيل واسعة من تلميح التحقيق في المياه بعد الاستخدام، الأمر الذي يحد من المرجح انضمام جزيئات على سطح التحقيق.
    13. تحديد متوسط ​​المنحدر من خط تركيز مقابل مؤامرة الوقت لكل عينة proteoliposome لمدة 30 ثانية قبل الماضي إضافة MgATP، وبعد إضافة valinomycin ولكن قبل إضافة تريتون X-100. طرح المنحدر الأساسي من valinomycin لتحديد النشاط يوديد هروب رأس المال بوساطة CFTR لأن العينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الموضحة في هذا الكتاب مكتوبة هي وسائل لتنقية، إعادة تشكيل وقياس النشاط قناة المنظم من البروتين CFTR الشكل يظهر 1A سير العمل لتنقية، وإجراءات إعادة هروب رأس المال يوديد. وتظهر أساليب لإعادة النشاط وقناة القياسات بواسطة تدفق يوديد أيضا بمزيد من التفصيل في الفيديو المرتبطة بها.

تنقية وإعادة تشكيل CFTR إلى proteoliposomes

CFTR يمكن التعبير وظيفيا عند مستويات مرتفعة في S و 9 الخلايا باستخدام الفيروسة العصوية المؤتلف تحتوي على بالوزن أو متحولة CFTR [كدنا 2. في حين ليس نظاما التعبير الثدييات، وأعرب عن CFTR باستخدام نظام الفيروسة العصوية في S و 9 خلايا لضمان مستوى عال من التعبير. إنتاج CFTR يمكن أن تصل إلى 1٪ من إجمالي 17،28 البروتين الخلوي. وS و 9- نظام الفيروسة العصوية لديه ميزة أن البروتين هو جوهر السكري وماكينات مراقبة الجودة في هذا النظام هو متساهلة نسبيا بحيث CFTR والمسوخ يمكن أن تنتج على سطح الخلية. تم تأليفها بصمة الحامض الاميني عشرة على محطة كربوكسي للسماح تنقية بحكم تقارب من هذا شعارا لالنيكل وNTA. العلامة C-الطرفية يساعد على منع شارك في تنقية البروتينات CFTR اقتطاع وعوائد بروتين وظيفي CFTR في أتباز، قناة واحدة والتجارب هروب رأس المال يوديد 17،19،24،28،29. ومع ذلك بروتوكول تنقية الموصوفة هنا يجب أن تكون مناسبة لCFTR N-عضال الموسومة كذلك.

سابقا، وقد تبين أن البروتين CFTR يمكن استخراج نحو فعال من الاستعدادات غشاء S و 9 البلازما باستخدام NaPFO (الصوديوم pentadecafluoro-أوكتانوات) في درجة حرارة الغرفة 15. ومع ذلك، فإن قابلية NaPFO ليعجل في 4 درجات مئوية، ودرجة حرارة تساعد على الحفاظ على البروتين مطوية بشكل صحيح، وغسيل الكلى طويلة اللازمة لإزالة PFO لم تكن قابلة للالرابتنقية الهوية وإعادة أساليب تهدف إلى تحقيق أقصى قدر من النشاط من البروتين في فحوصات لاحقة من وظيفة CFTR. وأظهر [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS)، منظمات المزارعين -choline 12 و 14 منظمات المزارعين -choline ذلك - تقييم لجنة من المنظفات (بما في ذلك دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM)، 3 منظمات المزارعين -choline 14 كان الأكثر فعالية في الانحلال CFTR-صاحب البشري 10 من S و 9 الأغشية، وكان ذلك DDM فعال في الحفاظ على النشاط أتباز من CFTR في حل المنظفات (لا تظهر البيانات). وهكذا منظمات المزارعين -choline 14 المنظفات خطوة الاستخراج يتم تنفيذ، تليها الصرف لDDM المنظفات للحفاظ على النشاط من البروتين.

وبعد تنقية وتركيز، يتم الحصول على جزء من البروتين في DDM المنظفات التي تحتوي على ~ 150 كيلو دالتون الفرقة كمكون رئيسي لها (الشكل 2، الفضة وصمة عار). هذا الوزن الجزيئي يتوافق مع CFTR البشري المعبر عنها في S <م> 9cells F وتحليلها بواسطة SDS-PAGE، حيث أنها تفتقر إلى أنواع معقدة من سمات بالغليكوزيل من CFTR في خلايا الثدييات. الأنواع كيلو دالتون 150 يبدو أن ما يقرب من 90٪ نقية التالية تحليل SDS-PAGE والفضة تلطيخ. النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة CFTR M3A7 يؤكد أن هذا وحيدة النسيلة الماوس الموجهة ضد NBD2 يتفاعل مع 150 كيلو دالتون الفرقة (الشكل 2، وصمة عار). في بعض الدراسات، كميات ضئيلة من أقل مكونات الوزن الجزيئي موجودة كما العصابات الطفيفة مرئية على هلام، في ~ 60 و 80 كيلو دالتون ~ (لا تظهر البيانات). الأجسام المضادة المعادية للCFTR M3A7 يتفاعل مع 60 و 80 كيلو دالتون العصابات، ولكن لا تتفاعل مع غيرها من البروتينات غير CFTR (لا تظهر البيانات). هذا يشير إلى أن انخفاض مكونات الوزن الجزيئي هي CFTR منتجات تحلل مع CFTR عبر بهم-C محطة بطاقة صاحب تنقية المشارك. ويتم تنقية في وجود مثبطات الأنزيم البروتيني، ويبدو أن هذه المكونات موجودة في الخلايا قبل تنقية الإجراء طالصورة التي يؤدونها. الخطوة تركيز الإجراء يزيل تقريبا جميع من تلوث أقل شظايا الوزن الجزيئي. يمكن إعادة CFTR في هذه المرحلة، أو البروتين من إجراء تنقية أخرى يمكن استخدامها في بروتوكول إعادة.

تقارير مقايسة تدفق liposomal يستند إعادة الوظيفية للسكان الجزيئات CFTR تنقية وإعادة تشكيله كما ينظم وقنوات انتقائية أنيون

من أجل تحديد ما إذا أعيد نسبة كبيرة من CFTR تنقية كقناة كلوريد المنظمة باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه، تم تطوير proteoliposomal هاليد تدفق الفحص الذي تقارير النشاط من السكان من جزيئات CFTR المعاد (كما هو موضح في الشكل تخطيطي 1B). إذا، في أسوأ الحالات، وتتجمع معظم الجزيئات CFTR تشكيلها، هذه الجزيئات سوف تفشل في إضفاء تصرف، غير قادرة على التمييز بين الكاتيونات والأنيوناتو / أو سوف بوابة تفتقر التنظيم من قبل PKA الفسفرة والنيوكليوتيدات. لي وآخرون. وقد نشرت الأساليب التي تسمح تقدير بالمئة إعادة الوظيفية للبروتين غشاء 30.

يتم تحميل الجسيمات الشحمية فارغة (تفتقر CFTR) أو proteoliposomes (تحمل أعيد CFTR) مع KI (75 ملم) ويوديد خارج liposomal تبادلها مع الغلوتامات البوتاسيوم (75 ملم) عن طريق تمرير الجسيمات الشحمية من خلال عمود الترشيح هلام. وKI تحميل تضاف proteoliposomes إلى تحتوي أيضا K-حمض الغلوتاميك (الغلوتامات البوتاسيوم) لإنشاء التدرج الخارجي ليوديد ويتم رصد هروب رأس المال مع زيادة في يوديد extraliposomal مع مرور الوقت باستخدام مسرى مكروي حساسة يوديد 24. هروب رأس المال من النتائج يوديد المشحونة سلبا في انخفاض في إشارة بالسيارات (إشارة يصبح أكثر سلبية). عندما يتم رسم تركيز يوديد صدر على مر الزمن، هو مقلوب المنحدر (كما في الشكل 3) لتظهر زيادة في يوديد في السابقحل ternal مع مرور الوقت.

وقد تم اختيار K-حمض الغلوتاميك باسم counterion impermeant كما هو مثال واحد من أنيون أن لا يمر من خلال البروتين CFTR، لا يبدو أن يسبب حجب كبير من المسام وفقا للشروط استخدامها، ولا يتسبب في حدوث تداخل مع يوديد انتقائية القطب. يمكن أن يكون الأمثل مقايسة حول أنيون آخر، شريطة أن يلبي هذه المعايير. وقد تم اختيار خمسة وسبعين تركيزات أنيون ملي تجريبيا كما تركيزات التي أعطت محاصرة جيد وإشارات كافية لقياس في مقايسة وفقا للشروط وصفها. سيكون هناك في الأساس ليست الإفراج يوديد من الجسيمات الشحمية محملة يوديد تفتقر CFTR تشكيلها وظيفيا حتى يتم permeabilized الحويصلات مع المنظفات (الشكل 3؛ آثار السيطرة)، في حين CFTR تشكيلها، proteoliposomes محملة يوديد التوسط يوديد الإفراج إلى حل خارجي بعد إضافة MgATP (1 ملم) لفتح قناة CFTR وvalinomycin(20 نانومتر) لمنع تطور غشاء المحتملة (الشكل 3A، وانظر أثر للبروتين: نسبة الدهون جماعية من 1: 3،000 (ث / ث)).

Valinomycin هو حامل الأيون أن ينقل سريعا البوتاسيوم تحديدا عبر الغشاء، بانخفاض التدرج تركيزه وتركيز 20 نانومتر تم اختيار تجريبيا كأعلى التركيز التي لم التشويش على سلامة الحويصلية فارغة في النظام الحالي. قد تحتاج هذه إلى أن يكون الأمثل لكل نظام معين. دون إضافة valinomycin، هناك إطلاق يوديد مختصرة من عدد قليل نانومتر التي تصل بسرعة هضبة (لا تظهر البيانات). وعلى الرغم من يعرف هذه الشروط لتفعيل خلاف ذلك اقصى حد من نشاط قناة أنيون من CFTR (كما في الشكل 3A)، يبدو أن عدم وجود استجابة كبيرة يعكس زيادة فورية في شحنة موجبة intraliposomal بوساطة التوصيل يوديد من خلال أنيون المسام الانتقائي للCFTR ، مما يحد فورا continuالأوس هروب رأس المال يوديد حيث لم يتم تضمين valinomycin. وتؤكد هذه الاستجابة بوساطة valinomycin أن هروب رأس المال يوديد كان محدودا في التجارب السابقة بسبب تراكم تهمة، ودعم الانتقائية أنيون من CFTR تشكيلها. إذا افتقر CFTR هذه الانتقائية، سواء البوتاسيوم ويوديد كان يمكن أن يكون قادرا على هروب رأس المال من proteoliposomes بذلك تلغي الحاجة إلى valinomycin للشروع في تغير مستمر.

وكانت تركيزات يوديد تقاس في هذه النقاط مرة الأولى التي يتم اختيارها تجريبيا لتقع ضمن نطاق حساسية الأمثل لالقطب يوديد الاستشعار المستخدمة. استخدام أقطاب يوديد أخرى قد تتطلب الاستفادة المثلى من هذه العوامل. بعد التوصل إلى الهضبة، يضاف تريتون X-100 لpermeabilize في proteoliposomes والإفراج عن أي المتبقية يوديد المحاصرين. وخلافا للقياسات يوديد الأولية (التي تم الحصول عليها في الفترة بين 1 و 2 دقيقة بعد valinomycin بالإضافة)، وقراءات في هذه النهاية ليست في مجموعة خطية من كالي القطبمنحنى bration (لا تظهر البيانات)، وبالتالي حال دون إجراء تقييم دقيق للجزء من الجسيمات الشحمية التي البروتين CFTR قادر على التوسط هروب رأس المال يوديد نسبة إلى إجمالي عدد الجسيمات الشحمية في الفحص، أو إعادة الوظيفية في المئة.

ويعكس معدل تدفق يوديد عدد CFTR جزيئات البروتين، واحتمال فتح وتصرف الوحدوي من كل قناة CFTR. وبالتالي، يجب أن تكون معدلات هروب رأس المال يوديد يعتمد على عدد واحتمال فتح من كل جزيء CFTR. تم اختبار التنبؤ في هذا النظام عن طريق زيادة عدد جزيئات CFTR في الحويصلية. كانت نسبة تفعيلها (فسفرته وMgATP المعالجة) البروتين CFTR إلى الدهون متنوعة، مع نسب تتراوح بين 1: 300-1: 3،000 (ث / ث) (الشكل 3A). وكلما زاد مقدار CFTR تشكيلها الحالي في proteoliposomes، وكلما زاد معدل هروب رأس المال (قياس بين 1-2 دقيقة بعد valinomycin بالإضافة)، ودعم ر التنبؤمعدلات هروب رأس المال قبعة تعتمد على عدد من الجزيئات CFTR في كل الحويصلية. الحصول على معدل هروب رأس المال باستخدام بروتين معين: نسب الدهون هي استنساخه بين أيام التجريبية والتنقيات البروتين، وبالتالي تسليط الضوء على صرامة هذا الأسلوب.

ويبدو أن معدل هروب رأس المال يوديد أن تتصل احتمال فتح القناة CFTR في هذا النظام المعاد. كما الفسفرة التي كتبها PKA مطلوب لتفعيل CFTR 31 (والمراجعة من قبل 32)، فمن المتوقع أن يكون هناك انخفاض معدل هروب رأس المال يوديد في الحويصلات التي تحتوي على CFTR التي لم يتم فسفرته عن طريق العلاج PKA الخارجية، حيث احتمال فتح منخفض . في proteoliposomes التي تم PKA المعالجة، فإن احتمال فتح أن يكون أعلى من ذلك بكثير، مما أسفر عن معدل المتوقعة أكبر بكثير من هروب رأس المال. في الممارسة العملية، لPKA المعالجة CFTR بحضور 1 ملم MgATP في هذا النظام، فإن معدل هروب رأس المال يوديد قياس من واحد إلى دقيقتين بعد إضافة valinomycفي وما يقرب من أربعة أضعاف معدل البروتين CFTR تعرض لMgATP ولكن ليس PKA (الشكل 3B). هذه النتائج تدعم فرضية أن معدل هروب رأس المال تتصل توجيه الاحتمال مفتوحا. في واقع الامر انه قد يكون من الصعب مقارنة النشاط في هذا الاختبار مباشرة لفتح الاحتمال بالنظر إلى أن عوامل أخرى مثل الوقت التغييرات تعتمد في القوة الدافعة الكهروكيميائية سوف تؤثر على النشاط الملحوظ هروب رأس المال. القارئ وحذر من أن هذا الاختبار ليست بديلا عن واحدة تسجيلات مفصلة النشاط القناة.

ومن المثير للاهتمام، وعادة ما لوحظ وجود انخفاض معدل هروب رأس المال يوديد بواسطة بروتين "unphosphorylated" في وجود MgATP الذي هو أكبر بكثير من هروب رأس المال من الجسيمات الشحمية تفتقر CFTR (الشكل 3B، C). قد يعكس هذا المعدل المنخفض الفسفرة القاعدية من CFTR في 9 خلايا S و نظام التعبير مسبق لتنقية 33. CFTR تنقيته من الآخرين التنفسي التعبيرمللي قد يكون لها مستويات مختلفة من الفسفرة القاعدية والنشاط المتبقية بالتالي مختلف.

هذا السريعة عوائد بروتوكول تنقية WT-CFTR من S و 9 خلايا في القريب التجانس، ولكن لF508del- وG551D-CFTR، هو أفضل وصف طريقة كإجراء تخصيب اليورانيوم. ويلاحظ بعض العصابات تلويث عبر SDS-PAGE 19، وكثير منها تعكس CFTR منتجات التحلل التي هي رد الفعل إلى الأجسام المضادة CFTR ويبدو أن تكون موجودة قبل انقطاع الخلية. أساليب إعادة وتدفق يوديد هي مناسبة لهذه العينات المخصب من المسوخ ذات الصلة سريريا. كما هو مبين في الشكل 3D، يتم قياس هروب رأس المال يوديد كبير لكلا F508del- (البروتين: الدهون نسبة كتلة حوالي 1: 600) وG551D-CFTR (البروتين: نسبة الدهون ما يقرب من 1: 300). في حين أن كلا المسوخ لها نشاط أقل المطلق من WT-CFTR (البروتين: نسبة الدهون جماعية من 1: 1،200)، فمن الصعب مقارنة العينات مباشرة كما الكمياتلا يمكن أن تكون دقيقة لالمسوخ التي تلوثت المنتجات تدهور CFTR. لكن كلا F508del-CFTR وG551D تنقيته من خلال هذه الأساليب، أعادت وتعرض لقياسات هروب رأس المال تستجيب كما هو متوقع لpotentiators جزيء صغير (الشكل 4)، وتظهر وظيفة قناة مماثلة لالبروتين المنقى من قبل أكثر صرامة طريقة تنقية PFO 19.

النشاط قناة CFTR النقى وأعيد يمكن عن طريق التضمين مثبطات جزيء صغير وpotentiators

CFTR INH -172 34 هو المانع CFTR الأكثر تحديدا المتاحة التي قد تظهر لمنع احتمال فتح قنوات كلوريد CFTR في واحدة القياسات قناة تصرف 35 و لكبح النشاط CFTR في دراسات أخرى 22،36. كما هو مبين في الشكل 3C، فإن معدل هروب رأس المال بعد valinomycin بالإضافة تخفض بشكل كبير من المعالجة مع INH CFTR UB> -172. وبالتالي، هذا الاختبار للنشاط القناة للسكان من الجزيئات CFTR تنقية وإعادة تشكيل فعال في النشاط الإبلاغ عن جهري مثل CFTR يجند المثبطة INH -172.

الفحص حساس للغاية وقابلة للتطبيق لفحص آثار صغيرة العلاج جزيء potentiator كذلك. كما هو مبين في الشكل 4، وجميع الأنماط الجينية CFTR ثلاثة اختبارها وpotentiated بشكل كبير من قبل potentiators نشط جزيء صغير مثل Kalydeco / VX-770 أو VRT-532 (الشكل 4C، تعرض لG551D)، في حين أن التناظرية الخاملة لها أي تأثير على هروب رأس المال يوديد نشاط CFTR (تظهر لF508del-CFTR، الشكل 4B). فحص ينطبق على فحص تركيز potentiator الاعتماد، ودور ATP والفسفرة على النشاط CFTR بوساطة potentiator.

27fig1highres.jpg "العرض =" 700px "/>
الشكل 1: تصميم الفحص وسير العمل (A) سير العمل للعمل وصفها في هذا المنشور (B) تمثيل تخطيطي للتجربة هروب رأس المال يوديد. ونشرت نسخة معدلة من لوحة B أصلا في مجلة الكيمياء البيولوجية. Eckford، PDW. لي، C؛ Ramjeesingh، M .؛ والدب، CE التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR) Potentiator VX-770 (Ivacaftor) فتح بوابة قناة المعيبة من المسخ CFTR في الطريقة التي تعتمد على الفسفرة لكن ATP-مستقلة. 2012؛ 287: 36639-36649. © الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية.

الشكل 2
الشكل 2: إن WT-CFTR البروتين الفضة CFTR تنقية السريعة عوائد إجراء تنقية ملطخة جل SDS-PAGE والغربيةوصمة عار ERN باستخدام الأجسام المضادة M3A7 CFTR لتنقية البروتين البشري WT-CFTR في المنظفات DDM (1 ميكروغرام و 0.1 ميكروغرام للجل وصمة عار، على التوالي)، معزولة عن S و 9 خلايا الإفراط في التعبير عن (صاحب) 10 -tagged نسخة من البروتين. تم الكشف عن WT-CFTR (> 90٪ نقية) في 150 كيلو دالتون، مناسبة لهذا البروتين تفتقر بالغليكوزيل تعقيدا. وقد نشر هذا البحث أصلا في مجلة الكيمياء البيولوجية. Eckford، PDW. لي، C؛ Ramjeesingh، M .؛ والدب، CE التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR) Potentiator VX-770 (Ivacaftor) فتح بوابة قناة المعيبة من المسخ CFTR في الطريقة التي تعتمد على الفسفرة لكن ATP-مستقلة. 2012؛ 287: 36639-36649. © الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية.

الشكل (3)
الرقم 3: طتقارير هروب رأس المال فحص odide ينظم النشاط قناة للبروتين CFTR النقى والمعاد. (A) تنقية وفسفرته WT-CFTR أعيد تشكيلها في البروتين: نسب الدهون من 1: 300 (ث / ث)، 1: 1،200 (ث / ث) و 1: 3،000 (ث / ث) يتوسط هروب رأس المال من يوديد تجويف الحويصلة ل الحمام بالجملة مع مرور الوقت بعد إضافة 1 ملم MgATP و 20 نانومتر valinomycin. إضافة 0.1٪ (ث / ت) تريتون X-100 لpermeabilize الإصدارات proteoliposomes المحاصرين يوديد في التجويف حويصلة في نهاية التجربة. (B) الأولي يوديد هروب رأس المال بالطبع الوقت لإعادة تشكيل البروتين WT-CFTR التي لم تكن قبل فسفرته. (C) الأولية معدلات هروب رأس المال يوديد تثبت اعتماد النشاط الملحوظ على البروتين CFTR وظيفية. مطلوب PKA الفسفرة من البروتين للنشاط قناة كبيرا، وهو ما يحول دون بإضافة المانع CFTR، CTTR INH -172 (20 ميكرومتر). بيانات وسائل ± SEM. * P <0.05 ***، ص <0.0001. (D) المورثات متعددة تنتج إشارات CFTR المنظمة في يوديد هروب رأس المال الفحص، بما في ذلك Wt-، F508del- وG551D-CFTR مقابل السيطرة. بيانات وسائل ± SEM. * P <0.05. *** P <0.0004 مقابل السيطرة. وقد نشر هذا البحث (أجزاء من البيانات في لوحات A، C و D) في الأصل في مجلة الكيمياء البيولوجية. Eckford، PDW. لي، C؛ Ramjeesingh، M .؛ والدب، CE التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR) Potentiator VX-770 (Ivacaftor) فتح بوابة قناة المعيبة من المسخ CFTR في الطريقة التي تعتمد على الفسفرة لكن ATP-مستقلة. 2012؛ 287: 36639-36649. © الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية.

الشكل (4)
الرقم 4: التقوية التي تعتمد على الفسفرة من CFTR من قبل جزيئات صغيرة يمكن التحقيق معهم باستخدامنظام هروب رأس المال يوديد لWt-، F508del- وG551D-CFTR. (أ) potentiated WT-CFTR بشكل كبير من قبل potentiator VX-770 (10 ميكرومتر)، إلا في حالة PKA-فسفرته. البيانات هي وسائل ± SEM، * P <0.01 مقابل + PKA-VX-770. (ب) VX-770 (10 ميكرومتر) ولكن لا تناظرية الخاملة، V-09-1188 (10 ميكرومتر)، يقوي بشكل كبير من هروب رأس المال يوديد نشاط فسفرته F508del-CFTR. البيانات هي وسائل ± SEM، ن = 3، ص *** <0.001 مقابل -VX-770 السيطرة. (ج) التقوية من G551D-CFTR بنسبة 10 ميكرومتر VRT-532 أو VX-770. البيانات هي وسائل ± SEM، ن = 5، ** P <0.001 ***، P <0.0001 مقابل -VX-770 السيطرة. وقد نشر هذا البحث (لوحات ميلان) في الأصل في مجلة الكيمياء البيولوجية. Eckford، PDW. لي، C؛ Ramjeesingh، M .؛ والدب، CE التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR) Potentiator VX-770 (Ivacaftor) فتح بوابة قناة المعيبة من المسخ CFTR في الفسفرة التي تعتمد ولكن ATمستقلة-P الطريقة. 2012؛ 287: 36639-36649. © الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية.

ص> آيت "> 7.4
عازلة اسم محتويات درجة الحموضة ضبط الأس الهيدروجيني باستخدام
عازلة 1 منظمات المزارعين -choline 2٪ (ث / ت) منظمات المزارعين -choline 14 المنظفات في 10 ملي إيميدازول، 25 ملي HEPES 7.4 إميدازول / HEPES
عازلة 2 10 ملي إيميدازول 10 ملي إيميدازول، 25 ملي HEPES (لا المنظفات) 7.4 إميدازول / HEPES
عازلة 3 10 ملي إيميدازول + DDM 10 ملي إيميدازول، 25 ملي HEPES، 1 ملم دوديسيل-β-D-مالتوزيد 7.4 إميدازول / HEPES
عازلة 4 50 ملي إيميدازول + DDM 50 ملي إيميدازول، 25 ملي HEPES، 1 ملم دوديسيل-β-D-مالتوزيد 7.4 إميدازول / HEPES
عازلة 5 600 ملي إيميدازول + DDM 600 ملي إيميدازول، 25 ملي HEPES، 1 ملم دوديسيل-β-D-مالتوزيد 7.4 إميدازول / HEPES
عازلة 6 75 ملي KI + DDM 75 ملي KI، 20 ملي اجتماعات الأطراف، 1 ملم دوديسيل-β-D-مالتوزيد 7.4 KOH
عازلة 7 75 ملي KI 75 ملي KI، 20 ملي اجتماعات الأطراف 7.4 KOH
عازلة 8 25 ملي HEPES + DDM 25 ملي HEPES، 25 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم دوديسيل-β-D-مالتوزيد 7.4 حمض الهيدروكلوريك / هيدروكسيد الصوديوم
عازلة 9 75 ملي K-حمض الغلوتاميك 75 ملي K-الغلوتامات، 20 ملي اجتماعات الأطراف KOH / حمض الجلوتاميك
عازلة 10 15 ملي KI 15 ملي KI، 20 ملي اجتماعات الأطراف 7.4 KOH

الجدول 1: جدول المخازن المؤقتة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

كان هناك عدد محدود من بروتوكولات تنقية لكامل طول والوظيفية العزلة CFTR، من مجموعة متنوعة من أنظمة overexpression الخلوية. الطريقة الموصوفة هنا هو مفيد لأنه يسمح تنقية السريع لWT-CFTR أو تخصيب عال من F508del- وG551D-CFTR بكميات معتدلة غير وظيفية للغاية في المقايسات بما في ذلك أتباز والقياسات المباشرة من وظيفة القناة، بما في ذلك القياسات قناة واحدة في طبقة ثنائية مستو النظم والتدابير أثبتت وظيفة CFTR قناة السكان التي هي ذات أهمية كبيرة لدراسة الجزيئات الصغيرة 19-21. تم دمج طريقة تنقية في بروتوكول إعادة السريع والفعال، والبروتين ولكن تنقيته من أساليب أخرى يمكن أن يقترن إلى هذا البروتوكول إعادة كذلك، شريطة أن يكون المنظفات تنقية هو قابل للإزالة بالمثل.

وعلى عكس التجارب قناة واحدة معقدة ومضنية من مريض بالحبISED بقع الغشاء، الأساليب المذكورة هنا تسمح بتقييم قوي بعد مباشرة من CFTR ظيفة القناة، وفريد ​​هذا الإجراء تقارير وظيفة عدد أكبر من السكان من قنوات CFTR بدلا من واحدة أو عدد قليل من الجزيئات. وخلافا للتقنيات التي تنطوي على بقع غشاء، وهذا الأسلوب يسمح التقييم المباشر للآثار جهري جزيء صغير على القناة في غياب القريب أو كاملة من البروتينات المرتبطة بها، اعتمادا على فعالية الإجراء تنقية جانب.

الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول

على الرغم من أن هناك العديد من الخطوات الهامة في إعادة الوظيفية للCFTR لأنيون تدفق الفحص، كما الملاحظات المشار إليها في هذا البروتوكول، والتحسين من البروتين: نسبة الدهون خلال CFTR إعادة هي المفتاح. مطلوب مثل هذا التحسين الوراثي لكل CFTR.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للتقنية

على الدقة بالسيارات الأساسيةponse للتحقيق المستخدمة هنا خلال فحص هروب رأس المال يوديد مع عينات أعد كما هو موضح هي عادة -20 إلى -50 بالسيارات. وتشير انحرافات كبيرة من هذا النطاق قد تكون هناك مشاكل مع العينة. تحقيقات الأخرى التي تباع من قبل الشركات المصنعة مختلفة قد تختلف من المبادئ التوجيهية المقدمة هنا. إذا لا يمكن أن يتحقق من خط الأساس مستقرة، والمنظفات المتبقية أو غير نشط، التشويه والتحريف، وسوء نوعية البروتين يمكن permeabilizing الحويصلات إلى يوديد.

الفشل في الكشف عن تغيير كبير في معدل valinomycin يعتمد هروب رأس المال يوديد من الجسيمات الشحمية التي تحتوي على CFTR فسفرته في وجود MgATP قد يعكس العديد من القضايا، والتي ينبغي التحقيق فيها. وتشمل هذه القضايا: نوعية رديئة، وCFTR التشويه والتحريف جزئيا أو CFTR نجس. إزالة كاملة من المنظفات خلال إعادة. غير الأمثل البروتين: نسبة الدهون في proteoliposomes. أو إضافتها كافية valinomycin، مما يجعل تهمة تبديد غير مكتملة.

طالمقايسات هروب رأس المال odide توفر المرونة في استخدام البروتين CFTR قبل فسفرته (كما هو موضح في البروتوكول)، أو لCFTR فسفرته أثناء الفحص. إذا لم يكن فسفرته البروتين أعيد أثناء إجراء التنقية، يمكن فسفرته عينة خلال التجربة هروب رأس المال يوديد في خطوة 3.2.7، من خلال إضافة PKA مع MgATP. في هذه الحالة تأكد من أن خط الأساس يتم تسجيل لمدة 5 دقائق على الأقل للتأكد من أن البروتين قد تم فسفرته بما فيه الكفاية بواسطة انزيم PKA قبل قياس وظيفة مع اضافة valinomycin. ويتم الحصول على نتائج مماثلة من قبل أي طريقة.

خلال البروتوكول، يسمح للجزيء المغير للتفاعل مع البروتين CFTR لمدة 5 دقائق قبل قياس النشاط بإضافة MgATP ثم Valinomycin. حيث أن معظم جهري CFTR محبة للدهون جدا، قد يستغرق وقتا بين بالإضافة إلى جمعية الحمام والتوازن مع البروتين CFTR. الفحص لا يمكن أن تتم دون عشريتم فقدان إضافة (ه) من valinomycin، وبالتالي ليس لديه معلومات عن طريق إجراء الفحص بهذه الطريقة. في الحالات التي يكون فيها المستخدم غير قلق من أن قد يكون هناك تأخر الوقت قبل تفاعل جزيء صغير مع البروتين، ومقايسة يمكن أن يؤديها من خلال إضافة الحادة من المغير بعد إضافة valinomycin، في حين لا يزال في المرحلة الأولية من معدل القياس.

القيود المفروضة على تقنية

وكما ذكر سابقا، وهذا على أساس فحص تدفق proteoliposomal النشاط قناة المنظم من قبل سكان كامل طول جزيئات CFTR المنقى وأعيد يوفر طريقة فريدة من نوعها لاستجواب بروابط أن تعديل النشاط مباشرة. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة محدودة في أنه لا يوفر نظرة ثاقبة الآلية التي من خلالها بروابط تغيير معدل التدفق من خلال CFTR. ومن الناحية المثالية، وفحص proteoliposomal تدفق CFTR النقى وأعيد ينبغي أن تستخدم في تركيبة مع شفة مستودراسات طبقة ثنائية الهوية من النشاط قناة واحدة. وهذا من شأنه الجمع توفر نظرة ثاقبة للدولة من البروتين الذي يربط بروابط، أي العراء و / أو الدولة مغلقة.

أهمية فيما يتعلق بأساليب القائمة

هناك حاليا عدم وجود طرق لتقييم التفاعل المباشر من جزيئات صغيرة مع قناة CFTR مقابل جهري جزيء صغير التي تتفاعل مع عنصر آخر الخلوي لتغيير بشكل غير مباشر النشاط قناة، على سبيل المثال، من خلال تغييري أو يشير مسار أو تعطيل المهم البروتين البروتين التفاعلات. يوضح طريقة هروب رأس المال يوديد التفاعل المباشر مع البروتين من أي جزيء صغير أن ينظم النشاط قناة CFTR. على الرغم من الطريقة الإنتاجية منخفضة من القياسات، لا يزال هناك قيمة كبيرة في هذه الأساليب الفريدة لدراسة التفاعل المباشر من CFTR مع potentiators جزيء صغير والمصححين. العديد من molecul صغيرجهري البريد قيد التطوير من قبل كل من الأوساط الأكاديمية والصناعة الدوائية لعلاج مرضى التليف الكيسي سريريا، وهذا هو التوجه الرئيسي للبحوث CF الحالي. ومن المتوقع أن الأساليب المذكورة هنا سوف تساعد في تطوير والمصادقة على آلية عمل واعدة أكثر من هذه الجزيئات.

التطبيقات المستقبلية للتقنية

الأساليب المستخدمة هنا هي أيضا قابلة للغاية لالتأقلم مع البروتينات الأخرى ذات الاهتمام. في الواقع كان يعمل على تعديل الطرق الموضحة لدراسة اثنين P. بروتينات الغشاء الزنجارية تورط في حركة ركائز الأيونية عبر غشاء 26،27، مما يدل على فائدة وبراعة من هذه الأساليب. ومن المتوقع استخدامها في دراسة قنوات أنيون إضافية والنقل في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعترف واضعو نصيحة الدكتور Mohabir Ramjeesingh خلال تطوير أساليب تنقية موضح هنا. ودعمت هذه الدراسات التي المنح التشغيل لمجلس الرؤساء التنفيذيين من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) والتليف الكيسي كندا (CFC). وأيد PDWE في جزء من جوائز زمالة من خلال CIHR وCFC. المؤلفون تعترف توفير مصحح، potentiator والمركبات المانع من الدكتور R. الجسور (جامعة روزاليند الطب والعلوم) وتوزيعها من قبل التليف الكيسي مؤسسة التداوي (CFFT). المؤلفون أيضا يعترف الخدمة المتميزة من قبل بايلور مرفق خلية الثقافة (NIH منحة P30 CA125123) في التعبير عن بالوزن والبروتين CFTR الطافرة باستخدام نظام الفيروسة العصوية. والخاملة VX-770 التناظرية، V-09-1188، كان هدية من فيرتكس الصيدلة.

Acknowledgments

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fos-choline 14 detergent Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) F312 Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche (www.roche-applied-science.com) 04 693 132 001 EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack  Roche (www.roche-applied-science.com) 05 892 791 001
Ni-NTA Agarose Qaigen GmbH 1018240
Fisherbrand Screening columns Fisher Healthcare 11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K Millipore (www.millipore.com) UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840051C
POPC Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 850457C
PS, Porcine Brain Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840032C CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 841118C
Ergosterol Sigma (www.sigmaaldrich.com) 45480
Pierce Detergent removal spin column Thermo Scientific 87779 1 ml capacity columns
valinomycin Sigma (www.sigmaaldrich.com) V-0627
VX-770 (ivacaftor) Selleck Chemicals S1144
iodide selective microelectrode Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) LIS-146ICM  
 
 
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
Clampex 8.1 software Axon Instruments (www.axon.com) we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System  Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) LIS-146LICM-XS Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars Big Science Inc (www.stirbars.com) SBM-0502-CMB choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine GE Health Care (www.gelifesciences.com) 17-0042-01
Sonicator Laboratory Supplies Co, Inc. G112SP1G Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50, (1), 233-248 (2011).
  2. Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68, (4), 809-818 (1992).
  3. Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
  4. Genetic Analysis Consortium. http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
  5. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245, (4922), 1073-1080 (1989).
  6. Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2, (8), 1253-1261 (1993).
  7. Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148, (1-2), 164-274 (2012).
  8. Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148, (1-2), 150-163 (2012).
  9. Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419, (1-2), 41-60 (2012).
  10. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365, (18), 1663-1672 (2011).
  11. Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270, (28), 17033-17043 (1995).
  12. Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
  13. Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267, (36), 26142-26149 (1992).
  14. Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4, (2), 95-100 (1993).
  15. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327, (1), 17-21 (1997).
  16. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, (37), 39051-39057 (2004).
  17. Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
  18. Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
  19. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, (44), 36639-36649 (2012).
  20. Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54, (24), 8693-8701 (2011).
  21. Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21, (5), 666-678 (2014).
  22. Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78, (3), 411-418 (2010).
  23. Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8, (2), 153-171 (2009).
  24. Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418, (1), 185-190 (2009).
  25. Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3, (2), 119-121 (2004).
  26. Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (32), 13083-13088 (2011).
  27. Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4, (5), e00678-e00613 (2013).
  28. Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. Academic Press. 337-357 (2010).
  29. Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75, (6), 1430-1438 (2009).
  30. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387, (5), 1055-1060 (2009).
  31. Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268, (15), 11304-11311 (1993).
  32. Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
  33. Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271, (45), 28463-28468 (1996).
  34. Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110, (11), 1651-1658 (2002).
  35. Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136, (6), 659-671 (2010).
  36. Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89, (4), 417-425 (2004).
إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).More

Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter