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Biology

Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR

doi: 10.3791/52427 Published: March 9, 2015

Summary

Décrit ici est un procédé rapide et efficace pour la reconstitution fonctionnelle de type sauvage purifiée et une protéine de CFTR mutante qui conserve l'activité de ce canal de chlorure, qui est défectueux dans la fibrose kystique. Efflux d'iodure de protéoliposomes reconstituées médiées par CFTR permet des études de l'activité du canal et les effets de petites molécules.

Abstract

La fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire (CFTR) est un élément de formation de canal unique de l'ATP Binding Cassette (ABC) superfamille des transporteurs. L'activité du canal chlorure nucléotidique et la phosphorylation dépendant de la CFTR a été étudié fréquemment dans des systèmes de cellules entières et que les canaux individuels dans patches membranaires excisées. De nombreuses mutations de fibrose kystique qui causent ont été montré de modification de cette activité. Bien qu'un petit nombre de protocoles de purification ont été publiées, un procédé de reconstitution rapide qui conserve l'activité de canal et un procédé approprié pour l'étude de l'activité du canal de la population dans un système purifié ont fait défaut. Ici méthodes rapides sont décrites pour la purification et la reconstitution fonctionnelle de la protéine CFTR pleine longueur dans des protéoliposomes de composition lipidique défini qui conserve une activité de canal à l'halogénure réglementé. Cette méthode de reconstitution avec un nouvel essai à base de flux de l'activité de canal est un système adapté pourétudier les propriétés du canal de la population de CFTR sauvage et les mutants pathogènes F508del- et G551D-CFTR. Plus précisément, le procédé est utile pour l'étude des effets directs de la phosphorylation, les nucleotides et les petites molécules telles que potentialisateurs et des inhibiteurs sur l'activité du canal CFTR. Les méthodes sont également prêtent à l'étude d'autres canaux / transporteurs membranaires pour les substrats anioniques.

Introduction

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transport de chlorure à travers les membranes apicales des cellules épithéliales dans les tissus tels que poumons, intestins, le pancréas et les glandes sudoripares est principalement médiée par la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire (CFTR), un ATP et membre de phosphorylation réglementés de l'ABC (ATP Binding Cassette) C sous-famille de protéines membranaires (revue dans 1). Comme d'autres membres de la sous-famille SCBA, CFTR est un grand multi-enjambant protéine membranaire intégrale qui se lie l'ATP à deux sites de liaison de nucleotides formée à l'interface de ses domaines de nucleotides de liaison (NBD), où il possède une activité d'ATPase modeste à une seule place. Cependant, contrairement à d'autres membres de la sous-famille ABCC, CFTR a évolué comme un canal Cl réglementé unique, plutôt que comme un soluté transporteur actif.

Des mutations dans la cause de la fibrose kystique CFTR, une maladie affectant plusieurs organes, y compris les poumons, tractus gastro-intestinal, du pancréas et des voies de reproduction, conduisant à morbidité et de la mortalité chez les jeunes adultes. Maladie pulmonaire représente généralement au début de la mortalité et de la fibrose kystique dans la plupart des cas est provoqué par la perte de fonction de la protéine CFTR à la surface de l'épithélium des voies aériennes conductrices. L'absence de l'activité des canaux chlorure CFTR entraîne une réduction à la fois de Cl - et de circulation de l'eau à travers l'épithélium de surface pour modifier la couche de fluide sur la surface apicale de l'épithélium cilié respiratoire. Il en résulte un liquide de surface des voies respiratoires visqueux qui altère la capacité des cellules epitheliales ciliées des voies respiratoires à des agents pathogènes efficacement claires sur les voies respiratoires. En conséquence, la plupart des patients atteints de mucoviscidose souffrent d'épisodes récurrents d'infection pulmonaire et une atteinte des poumons due à l'inflammation.

Comme prévu, les études du mécanisme d'action de la protéine CFTR normale concentrent principalement sur les études électrophysiologiques détaillées de son activité voie de fenêtrage. Des études simples de canal ont montré directement que les fonctions de CFTR comme PKA-dépendante Cl- Canal qui possède une porte ATP réglementé 2. Études électrophysiologiques détaillés fournissent beaucoup d'informations sur les canaux CFTR simples 1,3, mais il peut y avoir des préoccupations quant à savoir si les caractéristiques d'un seul canal particulier qui a été étudié est le reflet de l'ensemble de la population de canaux CFTR et donc le seul canal résultats doivent toujours être considérés ainsi que des méthodes pour étudier la population macroscopique. Dosage direct de l'activité de canal de population de CFTR purifié a le potentiel de donner un aperçu du défaut moléculaire associée à des mutations pathogènes et à conduire la découverte de modulateurs chimiques qui la réparation des protéines CFTR mutant. À ce jour, il ya plus de 1900 mutations différentes dans CFTR pensé pour provoquer la fibrose kystique 4. La mutation majeure, F508del-CFTR, trouvé sur au moins un allèle dans environ 90% des patients en Amérique du Nord et en Europe conduit à un mauvais repliement des protéinesnd rétention dans le réticulum endoplasmique 5. F508del-CFTR a aussi d'autres conséquences, y compris l'activité du canal défectueux 6-9. L'absence résultante de la protéine CFTR à la surface de cellule est associée à une maladie grave. G551D-CFTR, la mutation moins fréquente, est considérée comme étant encore correctement pliée est dysfonctionnel comme un canal chlorure à la surface de la cellule 6. Le développement de petits correcteurs de molécules et potentialisateurs a pour but de corriger de pliage et / ou le trafic de mutants tels que F508del-CFTR à la surface cellulaire, et potentialisant ou en augmentant l'activité de canal de mutations telles que G551D lorsqu'ils sont présents sur la surface des cellules, respectivement . Alors que les correcteurs VX-809 et VX-661 (ne sont pas encore approuvés pour une utilisation chez les patients, le potentialisateur Kalydeco (ivacaftor; VX-770) est utilisé à 150 mg toutes les 12 h chez les patients FC> 6 ans avec au moins un G551D -CFTR mutation, et plus récemment pour les patients avec l'un des G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pet G1349D. Kalydeco est à la fois sûr et des résultats dans l'amélioration des mesures cliniques de la maladie CF 10, mais le mécanisme d'action de cette petite molécule a été mal compris au moment de l'approbation de la FDA pour une utilisation chez les patients.

Une poignée de méthodes de purification CFTR ont été décrits précédemment 2,11-18, dont beaucoup exigent une longueur considérable de temps pour terminer. Dans une publication récente 19, un procédé de purification et reconstitution rapide unique a été décrit pour la protéine CFTR surexprimé dans le S f système d'expression neuf cellulaire, et cette protéine purifiée dans les systèmes lipidiques définies a été utilisé pour développer un essai de l'activité des canaux à l'halogénure d'CFTR pour une population de CFTR molécules. Le dosage récapitule les effets connus de phosphorylation, des nucléotides et des inhibiteurs sur la fonction de la protéine CFTR. Le système a été utilisé pour interroger les effets de la potentialisateur VX-770 / Kalydeco sur poids (-type sauvage), F508del- et G551D-CFTR et il a été montré pour la premièretemps que le médicament interagit directement avec la protéine CFTR à potentialiser son activité de canal de façon ATP-indépendant, ce qui démontre l'utilité et l'application de ces méthodes pour l'étude de l'interaction de la protéine CFTR et mutants avec des nucleotides et des petites molécules à partir d'un point de vue de la population de répondre à des questions cliniquement pertinentes sur la protéine. Les procédés ont également été utilisés pour étudier d'autres molécules de potentialisateur et de leurs dérivés 20, ainsi que les effets d'un correcteur de petite molécule de l'activité de la protéine 21.

des dosages d'efflux ont été utilisées dans de nombreuses études précédemment pour étudier l'activité de mutants CFTR et les effets des composés CFTR-modulateurs sur son activité, y compris des dosages de cellules entières en utilisant des électrodes, des traceurs radioactifs et des fluorophores 22,23, des vésicules membranaires avec électrodes sélectives d'ions 24 , et purifié CFTR reconstitué avec des traceurs radioactifs 25. Cependant thl'utilisation de l'e des électrodes sélectives d'ions pour étudier CFTR reconstitué purifié a été rapporté récemment 19. Une adaptation de la méthode actuelle a été utilisé pour la reconstitution et la caractérisation fonctionnelle de deux protéines membranaires de Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène CF commun. Reconstitution de Alge purifié la protéine de la membrane externe couplé avec des mesures d'efflux iodure ont été utilisés pour soutenir un modèle pour les tensioactifs anioniques alginate la sécrétion par ce transporteur 26. La reconstitution et les mesures de efflux d'iodure ont été appliqués à la protéine purifiée wzx, ce qui a permis un modèle à proposer qui suggère un mécanisme de H + antiport dépendante de la translocation de lipide d'oligosaccharide liée à travers la membrane bactérienne interne de 27 cette protéine. Dans les deux cas iodure a été utilisé comme un substitut pour le substrat anionique, mais à débit plus faible que l'on pourrait attendre d'un substrat natif. Le procédé peut être adapté pour l'adaptation à d'autres protéines ayant des cconduction des voies de transport ou pour des substrats anioniques ationic.

Voici une procédure de purification rapide est décrit pour la protéine CFTR et sa reconstitution dans des protéoliposomes de lipide défini. La procédure de reconstitution rapide peut facilement être adapté pour une utilisation avec CFTR purifié par d'autres procédés, à condition que le type de détergent utilisé dans la purification se prête à l'élimination par des méthodes utilisées ici ou peut être remplacé par un détergent approprié avant la procédure de reconstitution. Procédé d'efflux d'iodure pour la mesure de l'activité du canal CFTR de protéine purifiée et reconstituée est décrit en détail et certains résultats typiques qui peuvent être obtenus par cette méthode sont présentés.

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Protocol

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1. Purification de la protéine CFTR

NOTE: Se il vous plaît voir le tableau des matériaux et équipements pour une liste du matériel et des matériaux utilisés dans ce protocole. Il existe un protocole détaillé pour la surexpression de l'homme WT-CFTR et des mutants dans le S f système d'expression 9-baculovirus 17,28. Surexpriment la protéine CFTR et préparer des pastilles de S f 9 cellules selon ce protocole.

  1. Préparation membranaire brut
    1. Obtenir un état ​​frais ou décongeler une cellule Sf 9 culot congelé à partir d'une culture de 500 ml de cellules sur-exprimant la wildtype-, F508del- protéine, ou G551D-CFTR avec un C-terminal Son -tag 10, cultivés par des procédés de culture cellulaire standard, 17,28, comme décrit précédemment. Les culots cellulaires auront un volume d'environ 5 ml et un poids humide d'environ 5 g.
    2. Remettre en suspension les cellules Sf 9 dans 20 ml de tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4 avec cocktail inhibiteur de protease (1 comprimé pour 50 ml) à 4 ° C, en assurant laéchantillon apparaît visuellement homogène et sans grumeaux de cellules restent.
    3. Lyse des cellules en utilisant un perturbateur cellule à haute pression (Table des matières et équipements), atteignant un minimum de 10 000 psi (de préférence 15.000-20.000 psi) pendant 2 min par passage. Conserver l'échantillon à 4 ° C pendant la lyse.
      1. Recueillir l'échantillon dans un tube sur la glace après la période de lyse puis recharger immédiatement l'échantillon dans le perturbateur de la cellule. Procédure de lyse Répétez trois fois. Examiner au microscope pour assurer au moins 10% restent intactes.
        NOTE: d'autres méthodes pour la lyse des cellules, telles que des perles de verre, etc. ne ont pas été examinées avec rigueur pour ce système, mais un utilisateur peut trouver une telle autre méthode appropriée.
    4. Centrifugeuse matériau de lyse de cellules à 4 ° C dans une centrifugeuse à grande vitesse à 2000 xg pendant 20 min. Recueillir le surnageant et jeter le culot. Divisez le surnageant entre 20 tubes et centrifuger les échantillons pendant 1 heure à 4 ° C à 125 000 xg dans une table ultracentrifuge.
    5. Retirer et jeter le surnageant, en faisant attention de ne pas perturber le culot, et de boulettes de magasin dans les mêmes tubes à -80 ° C pendant moins de deux mois jusqu'à l'utilisation, ou de conserver sur de la glace et continuer avec la purification immédiatement.
  2. CFTR solubilisation
    1. Obtenir 1-4 S f 9 culots membranaires brut frais ou congelés et remettre chacun dans 1 ml de tampon 1 (2% fos -choline; voir le tableau 1 pour la recette complète) à 4 ° C sur la glace, en utilisant une aiguille 25 G et une ml seringue jusqu'à ce que la solution est homogène à l'oeil nu sans grumeaux visibles de la membrane cellulaire. Lorsque plus d'une pastille est d'être solubilisé, continuer à traiter chaque échantillon par les instructions pour une seule pastille ci-dessous en parallèle, mettre en commun les échantillons à l'étape 1.3.2.
    2. Dissoudre une mini-comprimé d'inhibiteur de protease dans 1 ml de tampon 2 (10 mM imidazole; voir Tableau 1) qui est dépourvu de détergent 14 fos (inhibiteurs de la protéase sont 10 fois plus concentclassé que leur dilution recommandée à ce stade) et ajouter 100 pi à le culot membranaire brut remis en suspension (inhibiteurs de la protéase sont à leur dilution recommandée à ce stade). Situé sur la glace pendant 45 à 60 min en mélangeant par inversion 5 fois toutes les 5 min.
    3. Centrifugeuse remis en suspension brut culot de membrane dans un top ultracentrifugation de table pendant 25 min à 125 000 xg et 4 ° C. Conserver le surnageant, qui contient CFTR solubilisé et jeter le culot.
  3. Colonne de liaison, la phosphorylation et l'élution
    1. Laver 400 ul de nickel-NTA (acide nitrilotriacétique) suspension d'agarose ou de résine équivalente à 1 ml de tampon 2 (10 mM imidazole; voir Tableau 1) qui est dépourvu de détergent, pour éliminer le solvant et le tampon à 4 ° C. Répétez lavage deux fois de plus.
    2. Moissonneuse CFTR solubilisé, inhibiteur de protease restante (900 ul) et de la résine de nickel (à partir de 400 ul de suspension) pour un total de 10 ml avec du tampon 2 (10 mM d'imidazole; voir le tableau 1) wHICH manque de détergent ajouté. Les fos de 14 concentration est effectivement diluée à 0,2% (p / v) à cette étape. Se il ya plusieurs tubes, en commun tous les échantillons contenant CFTR solubilisé, les inhibiteurs de protéase, de la résine de nickel-NTA et 0,2% (p / v) fos -choline-14 à ce stade. Incuber pendant 60 min à 4 ° C sous agitation douce.
    3. Passez solution CFTR-inhibiteur de la protéase-nickel NTA bas une petite colonne de dépistage (tableau 1) ou une colonne vide équivalent.
    4. Laver la résine NTA de nickel, qui est retenu dans la colonne avec 4 ml par culot initial de tampon 3 (10 mM d'imidazole + DDM; voir Tableau 1) qui est dépourvu fos -choline 14 mais contient 1 mM DDM (détergent maltoside de dodécyle), à 4 ° C. L'addition de détergent DDM ne modifie pas significativement le pH de ce tampon.
    5. Préparer la solution PKA-MgATP en ajoutant 25 ul (5 mM, concentration finale) de MgATP, 2500 U d'AMPc-dépendante protéine kinase A, sous-unité catalytique (PKA) à 475 ul de tampon de 3 mM d'imidazole (10 + DDM; voir tableau 1) à la colonne. Phosphoryler la protéine en scellant l'extrémité inférieure de la colonne avec un capuchon ou Parafilm, et en ajoutant 500 ul de solution PKA-MgATP pour chaque pastille initial utilisé.
    6. Incuber à température ambiante (20 ° C) pendant 20 minutes en mélangeant doucement et remise en suspension de la résine en utilisant une pipette de 1 ml toutes les 2 min pour se assurer que la PKA a été en contact avec toute la surface de la résine de nickel NTA.
    7. Retirer le couvercle et éluer la solution PKA / MgATP de la colonne. Laver la colonne avec 2 ml de tampon 3 (mM d'imidazole 10 + DDM; voir le tableau 1) à 4 ° C.
    8. Multiplier le nombre de pellets utilisés dans l'expérience par 4. Laver la colonne avec ce nombre de 4 ml de tampon (50 mM imidazole + DDM; voir le tableau 1) à 4 ° C, en ajoutant 4 ml de tampon à la colonne, permettant il se écouler à travers et immédiatement ajouter le suivant aliquote de 4 ml sur la colonne.
    9. voir le tableau 1) 1 ml de tampon 5 à 4 ° C par pastille initial utilisé dans la colonne, 1 ml à la fois sans une pause pour permettre à la colonne sécher, et collecter l'ensemble éluat contenant la protéine CFTR purifié dans un seul tube.
    10. Concentrez-échantillon de protéine pour éliminer imidazole et une faible dégradation de poids moléculaire produits en utilisant un dispositif de filtration de la centrifugeuse (100 000 poids moléculaire de coupure) tel que décrit dans le tableau des matériaux et équipements ou tout autre dispositif similaire, dans un total de 10 ml de tampon 6 (75 mM KI + DDM; voir le tableau 1) ou d'un autre tampon de choix, contenant 1 mM DDM (tel qu'un tampon 7 pour des expériences d'efflux non-iodure, 25 mM de HEPES + DDM; voir tableau 1), par centrifugation à 2000 x g et 4 ° C pendant environ 20 min jusqu'à ce que l'échantillon se concentre à 200 ul. Diluer échantillon à 10 ml et répéter l'étape de concentration.
      NOTE: Dans notre expérience (non publié), imidazole significativement INHIles bits de l'activité d'ATPase de la protéine CFTR et doit être supprimé à cette étape par dilution et de concentration au moins deux fois si l'échantillon sera utilisé pour les mesures fonctionnelles.
    11. Recueillir CFTR purifié concentré. Conserver à 4 ° C en présence de tampon DDM jusqu'à son utilisation dans les 1-2 jours ou continuer immédiatement à l'étape de reconstitution. Ne pas congeler la protéine purifiée, comme dans notre expérience, nous observons une activité réduite.

2. Reconstitution de CFTR

  1. préparation lipidique
    REMARQUE: CFTR a été reconstitué avec succès dans Egg PC, POPC, 2: 1 (p / p) de PC d'oeuf: POPC (1: 1 en poids / poids) du mélange, ou un mélange de PE: PS: PC: ergostérol, 5: 2 : 2: 1 (p / p).
    1. Pour les expériences efflux d'iodure, sèche 5 mg de Egg PC (200 pi de 25 mg / ml ml, voir le tableau des matériaux et équipements) sous un courant de gaz d'argon pendant 20 min à température ambiante dans un pyrex ou autre solide (non-borosilicate ) tube de verre.
    2. Utilisation de l'absorbance à 280 nm, un test ELISA aéssayé ou toute autre méthode, estimer la concentration de l'échantillon de protéine de CFTR purifiée. Pour les expériences avec les efflux d'iodure CFTR sauvage, en utilisant un rapport protéine: lipide de 1: 300 à 1: 3000 (p / p) pour produire un signal suffisant. Pour G551D- et F508del-CFTR, utiliser un rapport protéine: lipide d'environ 1: 200 à 1: 1200 (p / p), afin de détecter l'activité d'efflux.
    3. Optimiser la protéine: lipide ratio pour chaque système particulier. Calculer le volume de protéine purifiée nécessaire. Calculer le volume de tampon avec 1 mM DDM requis pour obtenir un volume final de 1 ml, soit 1 ml, - (volume de solution de protéine requise) = volume de tampon.
      1. Ajouter le volume calculé du système tampon désiré avec 1 mM DDM au lipide séchée (mais ne pas ajouter de la protéine CFTR à cette époque) et couvrir le tube de verre avec du Parafilm. Pour les expériences efflux d'iodure, lipides dans le tampon 6 remettre en suspension (75 mM KI + DDM; voir le tableau 1). Pour les autres expériences remettre en suspension dans le tampon 8 (25 mM HEPES + DDM, voirTableau 1) ou un autre tampon interne désiré contenant 1 mM DDM.
      2. Vortex pendant 2 minutes à la température ambiante pour aider à la suspension du lipide dans le tampon DDM. En variante, chauffer l'échantillon à 37 ° C pendant 1-2 min avant vortex.
    4. Suspendre le lipide à plusieurs reprises à la température ambiante avec une seringue de 1 ml et 25 aiguille G jusqu'à ce que pas de film lipidique est visible sur les côtés du tube. Éviter d'injecter de l'air dans la solution qui produirait fines bulles et aider à oxydation de l'iodure et de lipides.
    5. Soniquer le lipide en suspension dans le tube de Parafilm couvert pour une salve de 20 secondes dans un bain de glace sonicateur contenant, puis transférer immédiatement à la glace pendant 1 min. Répétez 3 fois.
      REMARQUE: sonication intense tourne solutions iodure jaune due à l'oxydation. Il faut donc éviter sonication excessive. Surveiller l'échantillon pour les changements de couleur. Si un changement de couleur est à noter, jeter l'échantillon et de préparer à nouveau. La variation de couleur due à l'oxydation de certains desl'iodure conduirait à l'oxydation des lipides dans les mêmes conditions. Déplacement de l'air du tube avec du gaz argon avant soniquant la solution aidera à prévenir l'oxydation des lipides et iodure. Sonication intense peut briser mauvaise qualité ou des tubes de verre rayés entraînant la perte de l'échantillon.
    6. Ajouter le volume de CFTR purifié calculé à l'étape 2.1.3 pour l'échantillon de lipide soniqué à une atteindre un volume final de 1 ml. Mélanger la protéine avec la solution de lipide et d'un détergent fois par remise en suspension 10 avec une seringue à aiguille 25 G et 1 ml.
    7. Ensemble lipides et des protéines échantillon sur de la glace pendant 30 minutes en agitant de tube pour mélanger 5 fois toutes les 5 min.
  2. Détergent contraignant Préparation de la colonne
    1. Obtenir une colonne à usage unique commerciale de détergent contraignant spin (voir le tableau des matériaux et équipements) avec une capacité de volume de 1 ml et de briser l'onglet du bas pour commencer la colonne qui coule.
    2. Centrifuger la colonne pendant 2 min à 2000 xg pour éliminer le stockage buffer, et jeter ce tampon.
    3. Ajouter 5 ml de tampon 7 (mM KI 75, voir le tableau 1) à la colonne et puis centrifuger à 200 g pendant 4 min pour éluer le tampon de lavage. Répéter cette étape deux fois de plus pour un total de trois lavages pour éliminer toute trace de la mémoire tampon de stockage. Jetez tous accréditives.
      NOTE: Il est essentiel que le tampon utilisé pour laver la colonne NE contient DDM ou tout autre détergent. La colonne a une capacité de liaison finie de détergent et si un tampon contenant un détergent est utilisé, la colonne sera inefficace pour éliminer le détergent de l'échantillon de protéine-lipide-détergent.
    4. Aliquoter soigneusement toutes les 1 ml de l'échantillon de lipide-détergent-protéine sur la partie supérieure de la colonne de résine et incuber l'échantillon dans la partie supérieure de la colonne pendant 2 minutes à température ambiante.
    5. Centrifuger l'échantillon à température ambiante pendant 4 min à 2000 xg et de recueillir l'échantillon de protéoliposome trouble dans un 1,5 ou 2 ml tube de centrifugeuse propre ou un tube de verre et placez le samPLE sur la glace.
    6. Recueillir protéoliposomes restantes dans la colonne par addition de 200 ul de tampon 7 (mM KI 75, tableau 1) ou d'un autre tampon (sans détergent) vers le haut de la colonne et répéter l'étape de centrifugation pendant 2 min.
    7. Ajouter la deuxième éluat à l'échantillon de protéoliposome se il semble trouble.
    8. Conserver l'échantillon à 4 ° C pendant la nuit ou utiliser immédiatement pour les mesures d'efflux iodure.

3. Mesures iodure efflux pour purifiée, CFTR reconstitué

  1. La génération d'un gradient à travers la membrane de l'iodure de proteoliposomal
    1. Perles pré-houle Sephadex G50 dans le tampon neuf (75 mM K-Glu; glutamate de potassium, voir le tableau 1), (environ 5 g de billes sèches dans 50 ml de tampon) ou tampon externe souhaitée à la température ambiante pendant au moins 2 h ou à 4 ° C jusqu'au lendemain.
    2. Préparer 4 colonnes Sephadex G50 saturés dans le tampon neuf (75 mM K-Glu, voir le tableau 1) ou autretampon dans de petites colonnes de dépistage en chargeant la résine au moins ¾ dans la colonne.
    3. Centrifuger pendant 4 min à 2000 xg pour éliminer l'excès de tampon de la résine. Il devrait être d'environ 2,25 ml de résine hydratée emballé dans la colonne à la fin de l'étape de centrifugation.
      REMARQUE: Résine doit être légèrement hydratée mais pas immergé dans le liquide et une brève rotation ultérieure ne devrait pas éluer d'importants volumes de tampon. Il est essentiel à la réussite élution de l'échantillon de protéoliposome que la résine de la colonne ne est ni trop humide ni trop sec et l'utilisateur peut avoir besoin d'expérimenter avec les colonnes afin de se familiariser avec les conditions de change tampon le plus de succès.
    4. Ajouter délicatement 125-150 pi de protéoliposome échantillon en haut de chaque colonne et centrifuger pendant 4 min à 2000 x g.
    5. Piscine protéoliposome éluats ensemble pour une utilisation immédiate en efflux d'iodure ou d'autres expériences.
      NOTE: Le volume élue de chaque colonne doit être à peu près150 pi et l'échantillon devraient être quelque peu nuageux, mais moins trouble que l'échantillon original. Les volumes plus importants ou des éluats claires indiquent que les colonnes ne ont pas été suffisamment séchée, ou ont été séchés trop, respectivement, et ne donneront pas lieu à une expérience d'efflux d'iodure de succès.
  2. Dosage d'efflux d'iodure de
    1. Laver une micro électrode sélective iodure (Table des matières et équipements) abondamment avec de l'eau déminéralisée, puis incuber pendant 20 minutes avant l'expérience dans le tampon 10 (15 uM KI, voir le tableau 1). Laver l'électrode à nouveau abondamment avec de l'eau déminéralisée.
    2. Ajouter 150 ul de médicament (20 pM concentration typique pour produire une concentration finale de 10 pM dans l'essai 9) dans un tampon (75 mM de K-Glu, voir le tableau 1) ou d'un véhicule dans un tampon neuf à un puits d'une plaque à 96 puits avec un petit bar puces d'agitation.
      1. Vérifiez qu'il n'y a pas de bulles présentes. Utiliser un embout de pipette pour enlever parasitebulles. Si une solution de médicament est utilisée, se assurer que la concentration finale de DMSO dans le puits est inférieure à 1% (v / v) (typiquement de 0,1 à 0,2% (v / v)).
    3. Ajouter 150 pi de reconstitué protéine CFTR qui a été produit à la section 3.1 dans le tampon neuf (75 mM K-Glu, voir le tableau 1) pour le bien avec un médicament ou un tampon, pour produire un volume total de 300 ul dans le puits de la plaque.
    4. Placer la plaque à 96 puits sur une plaque d'agitation et agiter à 130 rpm (ou à une vitesse modérée d'environ ¼ de la vitesse maximale).
    5. Insérer la pointe de l'iodure électrode sélective attentivement dans le puits avec l'échantillon de telle sorte que la pointe ne touche pas le fond du puits ou d'être frappé par le barreau d'agitation. Se assurer que l'électrode de référence, se il est distinct, est également en contact avec la solution dans le puits.
    6. tracés d'enregistrement en utilisant un programme informatique fait maison ou commercial qui se interface avec l'électrode (voir le tableau des matériaux et équipements pour plus de détails).Utilisez un taux d'échantillonnage de 2 Hz, avec filtrage du signal par un filtre passe-bas.
    7. Laisser l'échantillon se équilibrer pendant 5 min pour produire une ligne de base plate plane et stable, ou à proximité lors de l'enregistrement.
    8. Ajouter 3 ul MgATP (100 mM préparée dans dH 2 O et ajusté à pH 7 avec du KOH; 1 mM de concentration finale) à l'échantillon pour activer la protéine. Laisser ~ 5 min pour atteindre un nouveau niveau de référence stable. Toujours ajuster le pH de la mM MgATP stock 100 au neutre avant utilisation pour éviter les changements dans le pH du tampon externe.
    9. Ajouter 3 ul de valinomycine stock (2 uM; 20 nM concentration finale) à l'échantillon pour dériver des changements dans la différence de potentiel engendrée par l'iodure sélectif conductance à travers CFTR. Notez la pente décroissante (diminution en mV) en raison de l'activité CFTR efflux iodure médiation pendant au moins 5 min.
    10. Pour se assurer que le piégeage de l'iodure dans la lumière de protéoliposomes était suffisante, ajouter 3 ul de 10% (v / v) de Triton X-100 à l'échantillon. Significant et de l'iodure libération immédiate indique que l'iodure suffisante a été piégé dans les vésicules de telle sorte que le piégeage ne était pas le facteur limitant pour les changements de pente déterminées 3.2.9 mais plutôt l'activité CFTR médiation.
    11. Laver la barre d'électrode et mélanger soigneusement avec de l'eau désionisée après le traitement d'échantillons avec le médicament ou avec du Triton X-100 pour assurer toutes les traces de ces réactifs ont été éliminés pour éviter la contamination de l'échantillon suivant.
    12. Préparer une série de concentrations diluées KI dans le micromolaire à nanomolaire dans le tampon 9 (tampon K-Glu, voir le tableau 1). Enregistrer la réponse de l'électrode mV à chaque concentration de 0 à la concentration la plus élevée préparé. Construire une courbe d'étalonnage où la réponse de la sonde (mV) est tracée en fonction du log de la concentration en mole d'iodure. Utilisez la courbe standard pour convertir la réponse mV de la sonde pendant l'expérience d'efflux de la concentration d'iodure libéré.
      NOTE: Préparer un chien d'étalonnageve sur une base hebdomadaire jusqu'à ce que l'utilisateur est certain de la rapidité de la réponse des modifications de la sonde. Il y aura une dérive de la réponse et la sensibilité de la sonde dans le temps. Avec le vieillissement de la sonde, la réponse se dégrade. Ceci peut être partiellement supprimé par la modification des solutions internes et périodiquement un lavage poussé de la pointe de la sonde dans l'eau après utilisation, ce qui limite l'adhésion susceptibles de molécules à la surface de la sonde.
    13. Déterminer la pente moyenne de la ligne de la concentration en fonction du tracé de temps pour chaque échantillon de protéoliposome pour les 30 dernières secondes avant l'addition de MgATP, et après addition de la valinomycine, mais avant l'addition de Triton X-100. Soustraire la pente de référence de la valinomycine pour déterminer l'activité d'efflux d'iodure à médiation par la protéine CFTR pour cet échantillon.

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Representative Results

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Décrit dans cette publication écrite sont des méthodes pour purifier, reconstituer et de mesurer l'activité des canaux réglementé de la protéine CFTR. Figure 1a montre le flux de travail pour la purification, la reconstitution et procédures d'efflux d'iodure. Méthodes pour la reconstitution et l'activité du canal de flux iodure mesures sont également présentés plus en détail dans la vidéo associée.

Purification et la reconstitution de la protéine CFTR dans protéoliposomes

CFTR peut être exprimée fonctionnellement à des niveaux élevés dans S f 9 cellules en utilisant baculovirus recombinants contenant Poids ou mutant CFTR ADNc 2. Bien que pas un système d'expression de mammifère, la protéine CFTR a été exprimé en utilisant le système de baculovirus dans des cellules Sf 9 pour assurer un niveau élevé d'expression. la production de la protéine CFTR peut être aussi élevée que 1% du total des protéines cellulaires 17,28. Le S f 9- système baculovirus offre l'avantage que la protéine est glycosylée et le noyaumachines de contrôle de qualité dans ce système est relativement permissif telle que la protéine CFTR et mutants peuvent être produits sur la surface de la cellule. Une balise de dix histidine a été conçu sur la terminaison carboxy pour permettre la purification en vertu de l'affinité de cette balise pour le nickel-NTA. L'étiquette C-terminal permet d'éviter la co-purification des protéines et des rendements fonctionnelle protéines CFTR dans ATPase, monocanal et expériences efflux d'iodure 17,19,24,28,29 CFTR tronqués. Toutefois, le protocole de purification décrit ici doit être approprié pour CFTR N-terminale étiqueté ainsi.

Auparavant, il a été montré que la protéine CFTR peut être extrait efficacement à partir de préparations de membranes 9 S f de plasma utilisant NaPFO (pentadécafluoro-octanoate de sodium) à température ambiante 15. Cependant, la sensibilité des NaPFO pour précipiter à 4 ° C, une température propice à la préservation de la protéine repliée correctement, et la longue besoin de dialyse pour éliminer PFO ne se prêtaient pas au rapdes procédés de purification et d'identification destiné à maximiser la reconstitution de l'activité de la protéine dans des analyses suivantes de la fonction de la protéine CFTR. Une évaluation d'un panneau de détergents (y compris dodécyl-β-D-maltoside (DDM), 3 - [(3-cholamidopropyl) diméthylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), fos -choline 12 et fos -choline 14, a montré que fos -choline 14 était la plus efficace pour solubiliser la protéine CFTR-His humain 10 à partir de S F 9 membranes, et que DDM a été efficace dans le maintien de l'activité d'ATPase de la protéine CFTR dans une solution détergente (données non présentées). Ainsi, 14 détergent étape d'extraction -choline un fos est effectuée, suivie d'un échange de détergent DDM pour maintenir l'activité de la protéine.

Après purification et concentration, une fraction protéique, on obtient DDM détergent qui contient un groupe ~ 150 kDa en tant que composant majeur (Figure 2; Stain argent). Ce poids moléculaire correspond à CFTR humaine exprimée en S <em> 9cells f et analysées par SDS-PAGE, où il manque les types de complexe caractéristique de glycosylation de la protéine CFTR dans les cellules de mammifères. Les 150 espèces kDa semble être environ 90% pure après analyse SDS-PAGE et coloration à l'argent. Western blot en utilisant l'anticorps anti-CFTR M3A7 confirme que cette monoclonal de souris dirigé contre NBD2 réagit avec la bande 150 kDa (Figure 2; blot). Dans certaines études, des quantités infimes de composants de plus bas poids moléculaire sont présents en tant que bandes mineures visibles sur le gel, à ~ 60 et ~ 80 kDa (données non présentées). L'anticorps anti-CFTR M3A7 réagit avec les bandes 60 et 80 kDa, mais ne réagit pas avec d'autres protéines non-CFTR (données non présentées). Ceci suggère que les composants de plus bas poids moléculaire sont des produits de dégradation CFTR co-purifiée avec la protéine CFTR grâce à leur extrémité C-terminale His tag. La purification est effectuée en présence d'inhibiteurs de protéase et il semble que ces composants sont présents dans les cellules avant la purification procédure is effectuée. L'étape de concentration du procédé permet d'éliminer pratiquement tous les contaminants fragments de poids moléculaire inférieur. CFTR peut être reconstitué à ce point, ou d'une protéine d'une autre opération de purification peut être utilisé dans le protocole de reconstitution.

Un test basé liposomale flux rapporte la reconstitution fonctionnelle d'une population de molécules d'CFTR purifiées et reconstituées tel que réglementé, anions canaux sélectifs

Afin de déterminer si une proportion importante de la protéine CFTR purifié a été reconstituée comme un canal chlorure régulée en utilisant les méthodes ci-dessus, un dosage de flux à l'halogénure d'proteoliposomal a été développé qui rend compte de l'activité d'une population de molécules d'CFTR reconstituées (représenté schématiquement sur ​​la figure 1B). Si, dans le pire des cas, la majorité des molécules de CFTR reconstituées sont mal repliées, ces molécules ne parviendront pas à conférer une conductance, ne parviennent pas à une discrimination entre les cations et anionset / ou la porte manquera régulation par phosphorylation PKA et les nucléotides. Lee et al. Ont publié des méthodes permettant d'estimer pour cent reconstitution fonctionnelle d'une protéine de la membrane 30.

Liposomes vides (manque CFTR) ou protéoliposomes (portant reconstitué CFTR) sont chargés avec KI (75 mM) et de l'iodure extra-liposomale échangé avec le glutamate de potassium (75 mM) en passant liposomes à travers une colonne de filtration sur gel. La KI chargé protéoliposomes sont ajoutés à un puits contenant K-Glu (glutamate de potassium) pour créer un gradient vers l'extérieur pour efflux iodure et est surveillé comme des augmentations en iodure extraliposomique au fil du temps en utilisant une microélectrode sensible iodure 24. L'efflux d'iodure de résultats chargées négativement par une diminution dans le signal mV (signal devient plus négatif). Lorsque la concentration d'iodure libéré au cours du temps est tracée, la pente est inversée (comme sur la figure 3) afin de faire apparaître un accroissement de l'iodure dans l'exsolution interne au fil du temps.

K-Glu a été choisi comme le contre-ion perméant car ce est un exemple d'un anion qui ne passe pas par la protéine CFTR, ne semble pas causer le blocage significatif du pore dans les conditions utilisées, et ne provoque aucune interférence avec le sélectif iodure électrode. Un essai pourrait être optimisée autour d'un autre anion, à condition qu'il réponde à ces critères. Soixante-cinq concentrations d'anions mM ont été choisis de façon empirique que les concentrations qui ont donné bonne piégeage et suffisamment de signaux pour la mesure dans l'essai dans les conditions décrites. Il n'y aura pratiquement pas de libération de l'iodure de liposomes d'iodure chargé qui ne ont pas la protéine CFTR fonctionnelle reconstituée jusqu'à ce que les vésicules sont perméabilisées avec du détergent (Figure 3; traces de commande), alors que la protéine CFTR reconstitué, protéoliposomes d'iodure chargé médient l'iodure de presse dans la solution externe après l'addition de MgATP (1 mM) pour ouvrir le canal CFTR et la valinomycine(20 nM) pour empêcher le développement d'un potentiel de membrane (Figure 3A; voir trace de protéine: lipide rapport massique de 1: 3000 (p / p)).

Un ionophore est la valinomycine que la navette spécifiquement potassium à travers la membrane, vers le bas de son gradient de concentration et la concentration de 20 nM a été choisi de manière empirique comme la concentration la plus élevée qui ne perturbe pas l'intégrité des liposomes vides dans le système actuel. Ce peut-être besoin d'être optimisé pour chaque système particulier. Sans addition de valinomycine, il existe une libération d'iodure abrégée de quelques nm qui atteint rapidement un plateau (données non présentées). Bien que ces conditions sont connues pour activer autrement au maximum l'activité de canal d'anions de CFTR (comme sur la figure 3A), il apparaît que l'absence d'une réponse significative reflète l'augmentation instantanée de charge positive intraliposomale médiée par conduction iodure par l'anion poreux sélectif de la protéine CFTR , continu limiter immédiatementous efflux d'iodure où valinomycine ne est pas inclus. Cette réponse de la valinomycine médiation confirme que efflux d'iodure a été limitée dans les expériences précédentes en raison de l'accumulation de charges, soutenir la sélectivité d'anions de CFTR reconstitué. Si CFTR ne avait pas cette sélectivité, à la fois du potassium et de l'iodure aurait été en mesure de l'efflux de protéoliposomes abrogeant ainsi la nécessité d'ouvrir de valinomycine flux.

Les concentrations d'iodure mesurées à ces points de temps initiales étaient empiriquement Chosen à tomber dans la plage de sensibilité optimale pour l'électrode iodure de détection employée. L'utilisation d'autres électrodes d'iodure peut nécessiter une optimisation de ces facteurs. Après avoir atteint un plateau, Triton X-100 est ajouté à perméabiliser les protéoliposomes et libérer toute iodure piégé restant. À la différence des mesures initiales (iodure obtenues entre 1 et 2 minutes après l'addition valinomycine), les lectures à ces paramètres ne sont pas dans la plage linéaire des électrodes calicourbe d'étalon- (données non présentées), ce qui empêche une évaluation précise de la fraction de liposomes à partir de laquelle la protéine CFTR est capable de médier l'efflux d'iodure par rapport au nombre total de liposomes dans le dosage ou la reconstitution fonctionnelle pour cent.

Le taux de flux iodure reflète le nombre de molécules de protéine CFTR, la probabilité d'ouverture et la conductance unitaire de chaque canal CFTR. Par conséquent, les taux des efflux d'iodure devraient être en fonction du nombre et de la probabilité ouverte de chaque molécule de la protéine CFTR. La prédiction a été testé dans ce système en augmentant le nombre de molécules de CFTR par liposome. Le rapport entre activée (phosphorylée et MgATP traitée) protéine CFTR de lipide a été varié, avec des rapports allant de 1: 300 à 1: 3000 (p / p) (Figure 3A). Plus la quantité de la protéine CFTR reconstitué présente dans les protéoliposomes est élevé, plus le taux d'efflux (mesurée entre 1-2 min après addition valinomycine), supportant la prédiction ttaux d'efflux de chapeau dépendent du nombre de molécules de la protéine CFTR dans chaque liposome. Le taux d'écoulement obtenu en utilisant une protéine spécifique: ratios lipidiques sont reproductibles entre les jours expérimentaux et purifications de protéines, mettant ainsi en évidence la rigueur de cette méthode.

Le taux d'efflux d'iodure semble se rapporter à la probabilité d'ouverture du canal CFTR dans ce système reconstitué. Comme phosphorylation par la PKA est requise pour l'activation de CFTR 31 (et l'examen de 32), il est prévu qu'il y aura un faible taux d'efflux d'iodure dans des vésicules contenant CFTR qui n'a pas été phosphorylée par traitement PKA exogène, où la probabilité ouverte est faible . Dans protéoliposomes qui ont été traités PKA, la probabilité ouverte sera beaucoup plus élevé, résultant en un taux beaucoup plus attendu de l'efflux. Dans la pratique, par PKA traité CFTR en présence de 1 mM MgATP dans ce système, le taux d'efflux d'iodure mesurée à partir de une à deux minutes après l'addition de valinomycen est environ quatre fois le taux de la protéine CFTR soumis à MgATP mais pas PKA (figure 3B). Ces résultats soutiennent l'hypothèse que le taux d'efflux rapportent à canaliser probabilité d'ouverture. En pratique, il peut être difficile de comparer l'activité dans ce test directement à ouvrir probabilité étant donné que d'autres facteurs tels que les changements dépendant du temps dans la force motrice électrochimique vont influencer l'activité d'efflux observée. Le lecteur est prié de noter que ce test ne est pas un remplacement pour les enregistrements individuels détaillés de l'activité du canal.

Fait intéressant, il est typiquement observé un faible taux d'efflux d'iodure par la protéine «non phosphorylée" en présence de MgATP qui est nettement supérieure à l'efflux des liposomes dépourvus de la protéine CFTR (figure 3B, C). Ce faible taux peut refléter phosphorylation basale de CFTR dans le S f système d'expression 9 cellules avant la purification 33. CFTR purifié des autres syste d'expressionms peut avoir différents niveaux de phosphorylation basale et l'activité résiduelle donc différente.

Cette rapides rendements de protocole de purification WT-CFTR de S f 9 cellules à proximité de l'homogénéité, mais pour F508del- et G551D-CFTR, la méthode est mieux décrit comme une procédure d'enrichissement. Certaines bandes contaminantes sont observées par 19 SDS-PAGE, dont beaucoup reflètent produits de dégradation de la protéine CFTR qui sont réactifs aux anticorps de la protéine CFTR et semblent être présents avant la rupture des cellules. Les méthodes de reconstitution et de flux iodure conviennent pour ces échantillons enrichis de mutants cliniquement pertinentes. Comme le montre la figure 3D, significatif efflux d'iodure est mesuré à la fois pour F508del- (protéine: lipide rapport massique d'environ 1: 600) et G551D-CFTR (rapport protéine: lipide d'environ 1: 300). Bien que les deux mutants ont une activité inférieure absolue que WT-CFTR (protéine: rapport masse lipidique de 1: 1200), il est difficile de comparer les échantillons directement quantificationne peut pas être aussi précis pour les mutants qui sont contaminés par les produits de dégradation de la protéine CFTR. Toutefois, les deux F508del-CFTR et G551D purifiés par ces méthodes, reconstituées et soumis à des mesures d'efflux réagissent comme prévu aux petites potentialisateurs de molécules (figure 4), et montrent la fonction du canal similaire à la protéine purifiée par le procédé de purification de PFO plus rigoureuse 19.

L'activité du canal CFTR de purifié et reconstitué peut être modulée par des inhibiteurs et des potentialisateurs de petites molécules

CFTR est inh -172 34 inhibiteur de la protéine CFTR plus spécifique disponible qui a été montré pour inhiber la probabilité d'ouverture des canaux chlorure CFTR dans les mesures de conductance canal unique 35 et à inhiber l'activité de CFTR dans d'autres études 22,36. Comme le montre la figure 3C, le taux d'efflux, après addition valinomycine est considérablement réduit par prétraitement avec inh CFTR ub> -172. Par conséquent, ce dosage de l'activité de canal d'une population de molécules d'CFTR et reconstituées purifiées est efficace pour l'activité de modulateurs de rapport tel que le ligand d'inhibition Inh -172 CFTR.

L'essai est très sensible et applicable à l'examen des effets de traitement petite molécule ainsi potentialisateur. Comme le montre la figure 4, les trois génotypes CFTR testés sont considérablement potentialisée par petites potentialisateurs de molécules actives telles que Kalydeco / VX-770 ou VRT-532 (figure 4C; visualisée pour G551D), tandis que un analogue inactif n'a aucun effet sur ​​l'efflux d'iodure l'activité de la protéine CFTR (montré pour F508del-CFTR; figure 4B). Le dosage est applicable à l'examen de la dépendance à la concentration de potentiateur, et le rôle de l'ATP et de la phosphorylation sur l'activité de CFTR potentialisateur médiée.

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Figure 1:. Conception Assay et de workflow (A) flux de travail pour les travaux décrits dans la présente publication (B) Représentation schématique de l'expérience d'efflux iodure.. Une version modifiée du panneau B a été initialement publié dans The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; and Bear, CE de la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire (CFTR) Potentialisateur VX-770 (ivacaftor) Ouvre la Channel Gate défectueuse de Mutant CFTR dans une manière dépendant de la phosphorylation, mais ATP-indépendante. 2012; 287: 36639-36649. © La Société américaine de biochimie et de biologie moléculaire.

Figure 2
Figure 2:. Le WT-CFTR protéine CFTR Argent procédure purification rapide rendements purifié gel coloré SDS-PAGE et de l'Ouestern blot en utilisant l'anticorps purifié M3A7 CFTR humain pour la protéine CFTR dans WT-DDM détergent (1 ug et 0,1 ug pour le gel et blot, respectivement), isolés à partir de cellules Sf 9 sur-exprimant une version (His) de 10 -tagged la protéine. Wt-CFTR (> 90% de pureté) est détectée à 150 kDa, correspondant pour cette protéine dépourvue de glycosylation complexe. Cette recherche a été initialement publié dans The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; and Bear, CE de la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire (CFTR) Potentialisateur VX-770 (ivacaftor) Ouvre la Channel Gate défectueuse de Mutant CFTR dans une manière dépendant de la phosphorylation, mais ATP-indépendante. 2012; 287: 36639-36649. © La Société américaine de biochimie et de biologie moléculaire.

Figure 3
Figure 3: iles rapports de dosage d'efflux odide réglementés activité de canal pour la protéine CFTR purifiée et reconstituée. (A) purifié et phosphorylé Wt-CFTR reconstitué à la protéine: ratios lipidiques de 1: 300 (p / p), 1: 1200 (p / p) et de 1: 3000 (p / p) médie efflux d'iodure dans la lumière de la vésicule à le bain vrac au fil du temps après l'addition de 1 mM MgATP et 20 nM valinomycine. L'addition de 0,1% (p / v) de Triton X-100 à perméabiliser les protéoliposomes rejets piégés iodure dans la lumière de la vésicule à la fin de l'expérience. (B) décours temporel initiale en iodure d'efflux pour reconstituer la protéine WT-CFTR qui ne avaient pas été pré-phosphorylés. (c) les taux d'efflux d'iodure initiaux montrent la dépendance de l'activité observée sur protéine CFTR fonctionnelle. PKA phosphorylation de la protéine est nécessaire pour l'activité de canal notable, laquelle est inhibée par l'addition de l'inhibiteur de la protéine CFTR, CTTR inh -172 (20 uM). Les données sont des moyennes ± SEM; * P <0,05, *** p <0,0001. (D) génotypes multiples produisent des signaux de CFTR réglementés dans l'essai de efflux d'iodure, y compris les poids, F508del- et G551D-CFTR par rapport au contrôle. Les données sont des moyennes ± SEM; * P <0,05; *** P <0,0004 contrôle de contre. Cette recherche (portions de données dans les panneaux A, C et D) a été initialement publié dans The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; and Bear, CE de la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire (CFTR) Potentialisateur VX-770 (ivacaftor) Ouvre la Channel Gate défectueuse de Mutant CFTR dans une manière dépendant de la phosphorylation, mais ATP-indépendante. 2012; 287: 36639-36649. © La Société américaine de biochimie et de biologie moléculaire.

Figure 4
Figure 4: La potentialisation de phosphorylation dépendant de la CFTR par de petites molécules peut être interrogé à l'aide dusystème d'efflux iodure de poids, F508del- et G551D-CFTR. (A) WT-CFTR est potentialisé de manière significative par le potentialisateur VX-770 (10 uM), uniquement à l'état phosphorylé PKA. Les données sont des moyennes ± SEM, * p <0,01 par rapport au + PKA-VX-770. (B) le VX-770 (10 M), mais pas un analogue inactif, V-09 à 1188 (10 M), potentialise de façon significative l'efflux d'iodure activité de phosphorylé F508del-CFTR. Les données sont des moyennes ± SEM, n = 3, *** p <0,001 par rapport au VX-770 (c) Potentialisation de G551D-CFTR par 10 uM VRT-532 ou VX-770 contrôle.. Les données sont des moyennes ± SEM, n = 5, ** p <0,001, *** p <0,0001 vs VX-770 contrôle. Cette recherche (panneaux ac) a été initialement publié dans The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; and Bear, CE de la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire (CFTR) Potentialisateur VX-770 (ivacaftor) Ouvre la Channel Gate défectueuse de Mutant CFTR dans une phosphorylation dépendante mais ATP-indépendante Manner. 2012; 287: 36639-36649. © La Société américaine de biochimie et de biologie moléculaire.

r> ight "> 7.4
Tampon Nom Contenu pH Ajuster le pH à l'aide
Buffer 1 2% fos -choline 2% (p / v) 14 détergent -choline fos dans 10 mM d'imidazole, 25 mM d'HEPES 7.4 Imidazole / HEPES
Buffer 2 10 mM d'imidazole Imidazole 10 mM, HEPES 25 (pas de détergent) 7.4 Imidazole / HEPES
Buffer 3 Imidazole 10 mM + DDM Imidazole 10 mM, 25 mM d'HEPES, 1 mM de dodécyl-β-D-maltoside 7.4 Imidazole / HEPES
Tampon 4 + 50 mM d'imidazole DDM 50 mM d'imidazole, 25 mM d'HEPES, 1 mM de dodécyl-β-D-maltoside 7.4 Imidazole / HEPES
Buffer 5 600 mM imidazole + DDM Imidazole 600 mM, HEPES 25 mM, 1 mM de dodécyl-β-D-maltoside 7.4 Imidazole / HEPES
Buffer 6 75 mM KI + DDM KI 75 mM, MOPS 20 mM, 1 mM de dodécyl-β-D-maltoside 7.4 KOH
Buffer 7 MM KI 75 MM KI 75, 20 mM MOPS 7.4 KOH
Buffer 8 25 mM de HEPES + DDM 25 mM d'HEPES, 25 mM de NaCl, 1 mM de dodécyl-β-D-maltoside 7.4 HCl / NaOH
Buffer 9 75 mM K-Glu 75 mM K-glutamate, 20 mM MOPS KOH / acide glutamique
Buffer 10 MM KI 15 MM KI 15, 20 mM MOPS 7.4 KOH

Tableau 1: Tableau des tampons.

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Discussion

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Il n'y a eu qu'un nombre limité de protocoles de purification de pleine longueur, l'isolement de la protéine CFTR fonctionnelle, à partir d'une variété de systèmes de surexpression cellulaire. Le procédé décrit ici est avantageuse car elle permet une purification rapide de WT-CFTR ou haute enrichissement de F508del- et G551D-CFTR dans des quantités modérées qui est très fonctionnel dans des dosages compris ATPase et des mesures directes de la fonction du canal, y compris les mesures de canal unique dans bicouche plane systèmes et mesures démontrés de la fonction du canal de la population de CFTR qui sont très pertinents à l'étude de petites molécules 19-21. Le procédé de purification est intégré dans un protocole rapide et efficace reconstitution, cependant protéine purifiée à partir d'autres méthodes peut être couplé à ce protocole de reconstitution et, à condition que le détergent de purification est similaire susceptibles d'être supprimés.

Par opposition à complexes et laborieuses expériences monocanal de excISED patches membranaires, les méthodes décrites ici permettent une évaluation robuste et simple de la fonction du canal CFTR, et uniquement cette mesure rapporte la fonction d'une population plus grande de canaux CFTR plutôt qu'un ou quelques molécules. Contrairement aux techniques impliquant des patches membranaires, cette méthode permet une évaluation directe des effets modulateurs de petites molécules sur le canal en l'absence quasi complète ou de protéines associées, en fonction de l'efficacité de la procédure de purification couplé.

Les étapes critiques dans le protocole

Bien qu'il existe plusieurs étapes critiques dans la reconstitution fonctionnelle de la protéine CFTR pour le dosage de flux d'anions, comme notes indiquées dans le Protocole, l'optimisation de la protéine: rapport lipides au cours CFTR reconstitution est la clé. Une telle optimisation est nécessaire pour chaque génotype CFTR.

Modifications et dépannage de la technique

Les res mV baseponse pour la sonde utilisée ici pendant l'essai d'efflux iodure avec des échantillons préparés comme décrit est généralement de -20 à -50 mV. Des écarts significatifs de cette gamme suggèrent qu'il peut y avoir des problèmes avec l'échantillon. D'autres sondes vendus par différents fabricants peuvent différer des lignes directrices fournies ici. Si une ligne de base stable ne peut être atteint, le détergent résiduel ou inactif, dénaturé, les protéines de mauvaise qualité peuvent être perméabilisation les vésicules à iodure.

Défaut de détecter un changement significatif dans le taux de valinomycine dépend iodure efflux de liposomes contenant CFTR phosphorylée en présence de MgATP peut refléter plusieurs questions, qui devraient tous être étudiés. Ces questions comprennent: mauvaise qualité, CFTR partiellement dénaturé ou CFTR impure; élimination incomplète de détergent lors de la reconstitution; protéine non-optimale: rapport lipides dans protéoliposomes; ou valinomycine insuffisante ajouté, rendant la dissipation de charge incomplète.

Le idosages efflux odide offre la possibilité d'utiliser la protéine CFTR pré-phosphorylée (tel que décrit dans le protocole), ou pour CFTR phosphorylée pendant l'essai. Si la protéine ne était pas phosphorylée reconstitué au cours de l'opération de purification, l'échantillon peut être phosphorylée lors de l'expérience de l'efflux d'iodure dans l'étape 3.2.7, par addition de PKA avec le MgATP. Dans ce cas veiller à ce que la ligne de base est enregistrée pendant au moins 5 min pour se assurer que la protéine phosphorylée a été suffisamment par l'enzyme avant PKA fonction de mesure avec addition de valinomycine. Des résultats similaires sont obtenus par les deux méthodes.

Au cours de ce protocole, la molécule de modulateur est autorisé à interagir avec la protéine CFTR pendant 5 minutes avant la mesure de l'activité par addition de MgATP puis valinomycine. Comme la plupart des modulateurs de CFTR sont très lipophile, il peut prendre du temps entre l'addition à l'association de bain et l'équilibre avec la protéine CFTR. Le test ne peut pas continuer sans èmee ajout de valinomycine, et donc aucune information ne est perdue en effectuant le test de cette manière. Dans les situations où l'utilisateur ne est pas concerné qu'il peut y avoir un temps de latence avant l'interaction de la petite molécule avec la protéine, le dosage pourrait être réalisée par l'addition aiguë du modulateur après l'addition de la valinomycine, tout en restant dans la phase initiale du taux la mesure.

Limites de la technique

Comme indiqué précédemment, ce dosage basé proteoliposomal de flux de l'activité du canal régulé par une population de molécules d'CFTR pleine longueur purifiées et reconstituées fournit une méthode unique pour interroger ligands qui modifient directement activité. Cependant, le procédé est limité en ce qu'il ne prévoit pas de comprendre le mécanisme par lequel des ligands changer la vitesse de flux à travers CFTR. Idéalement, le dosage de la protéine CFTR proteoliposomal flux purifié et reconstitué doit être utilisé en combinaison avec la lèvre planeétudes id bicouches d'activité de canal unique. Cette combinaison serait donner un aperçu de l'état de la protéine qui se lie les ligands, ce est à dire l'ouverture et / ou l'état fermé.

Importance par rapport aux méthodes existantes

Il existe actuellement un manque de méthodes d'évaluation de l'interaction directe de petites molécules avec le canal CFTR par rapport modulateurs à petites molécules qui interagissent avec un autre composant cellulaire de modifier indirectement l'activité du canal, par exemple, à travers un modulateur ou voie de signalisation ou une perturbation de la protéine-protéine importante interactions. Procédé d'efflux d'iodure démontre une interaction directe avec la protéine selon l'une quelconque petite molécule qui module l'activité des canaux de CFTR. Malgré le faible débit de manière mesures, il reste une valeur considérable dans ces procédés uniques pour l'étude de l'interaction directe de la protéine CFTR avec des petites molécules et des potentialisateurs correcteurs. Beaucoup de petites molecule modulateurs sont en cours de développement par les deux groupes universitaires et l'industrie pharmaceutique pour traiter les patients cliniquement FC, car ce est l'idée maîtresse de la recherche actuelle des FC. Il est prévu que les méthodes décrites ici vont aider à l'élaboration et la validation du mécanisme d'action des plus prometteuses de ces molécules.

Les applications futures de la technique

Les méthodes employées ici sont également très prêtent à l'adaptation aux autres protéines d'intérêt. En effet une modification des méthodes décrites a été utilisé pour étudier deux P. aeruginosa protéines membranaires impliquées dans le mouvement de substrats à travers la membrane anionique 26,27, ce qui démontre l'utilité et la polyvalence de ces méthodes. Leur utilisation dans l'étude des canaux et des transporteurs d'anions supplémentaires est prévu dans le futur.

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Disclosures

Les auteurs reconnaissent les conseils du Dr Mohabir Ramjeesingh au cours du développement des méthodes de purification décrites ici. Ces études ont été soutenus par des subventions de fonctionnement au CCS des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) et la fibrose kystique Canada (CFC) canadiennes. PDWE a été financé en partie par des bourses de recherche par les IRSC et CFC. Les auteurs reconnaissent la fourniture de correcteur, potentialisateur et composés inhibiteurs du Dr R. Bridges (Université Rosalind de médecine et des sciences) et la distribution par les Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT). Les auteurs reconnaissent également un service exceptionnel par le Baylor Culture Cellulaire Facility (NIH subvention P30 CA125123) dans l'expression et Poids protéine CFTR mutant en utilisant le système de baculovirus. Les inactifs VX-770 analogique, V-09 à 1188, était un don de Vertex Pharmaceuticals.

Acknowledgments

Les auteurs déclarent qu'ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fos-choline 14 detergent Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) F312 Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche (www.roche-applied-science.com) 04 693 132 001 EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack  Roche (www.roche-applied-science.com) 05 892 791 001
Ni-NTA Agarose Qaigen GmbH 1018240
Fisherbrand Screening columns Fisher Healthcare 11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K Millipore (www.millipore.com) UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840051C
POPC Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 850457C
PS, Porcine Brain Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840032C CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 841118C
Ergosterol Sigma (www.sigmaaldrich.com) 45480
Pierce Detergent removal spin column Thermo Scientific 87779 1 ml capacity columns
valinomycin Sigma (www.sigmaaldrich.com) V-0627
VX-770 (ivacaftor) Selleck Chemicals S1144
iodide selective microelectrode Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) LIS-146ICM  
 
 
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
Clampex 8.1 software Axon Instruments (www.axon.com) we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System  Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) LIS-146LICM-XS Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars Big Science Inc (www.stirbars.com) SBM-0502-CMB choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine GE Health Care (www.gelifesciences.com) 17-0042-01
Sonicator Laboratory Supplies Co, Inc. G112SP1G Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable

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References

  1. Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50, (1), 233-248 (2011).
  2. Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68, (4), 809-818 (1992).
  3. Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
  4. Genetic Analysis Consortium. http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
  5. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245, (4922), 1073-1080 (1989).
  6. Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2, (8), 1253-1261 (1993).
  7. Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148, (1-2), 164-274 (2012).
  8. Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148, (1-2), 150-163 (2012).
  9. Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419, (1-2), 41-60 (2012).
  10. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365, (18), 1663-1672 (2011).
  11. Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270, (28), 17033-17043 (1995).
  12. Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
  13. Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267, (36), 26142-26149 (1992).
  14. Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4, (2), 95-100 (1993).
  15. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327, (1), 17-21 (1997).
  16. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, (37), 39051-39057 (2004).
  17. Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
  18. Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
  19. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, (44), 36639-36649 (2012).
  20. Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54, (24), 8693-8701 (2011).
  21. Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21, (5), 666-678 (2014).
  22. Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78, (3), 411-418 (2010).
  23. Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8, (2), 153-171 (2009).
  24. Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418, (1), 185-190 (2009).
  25. Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3, (2), 119-121 (2004).
  26. Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (32), 13083-13088 (2011).
  27. Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4, (5), e00678-e00613 (2013).
  28. Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. Academic Press. 337-357 (2010).
  29. Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75, (6), 1430-1438 (2009).
  30. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387, (5), 1055-1060 (2009).
  31. Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268, (15), 11304-11311 (1993).
  32. Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
  33. Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271, (45), 28463-28468 (1996).
  34. Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110, (11), 1651-1658 (2002).
  35. Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136, (6), 659-671 (2010).
  36. Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89, (4), 417-425 (2004).
Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR
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Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).More

Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).

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