Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

doi: 10.3791/52427 Published: March 9, 2015

Summary

Beschrieben wird hier ein schnelles und wirksames Verfahren für die funktionelle Rekonstitution von gereinigten Wildtyp- und mutierten CFTR-Proteins, die die Aktivität für dieses Chloridkanal, der bei zystischer Fibrose fehlerhaft ist bewahrt. Iodid-Efflux aus rekonstituierter Proteo von CFTR vermittelten ermöglicht Untersuchungen der Kanalaktivität und die Auswirkungen von kleinen Molekülen.

Abstract

Die Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) ist eine eindeutige Kanal-Bildungselement von der ATP-Bindungskassette (ABC) -Superfamilie von Transportern. Die Phosphorylierung und Nucleotid-abhängigen Chlorid-Kanal-Aktivität von CFTR wurde häufig in Ganzzellsystemen und als einzelne Kanäle in abgetrennten Membranflecken untersucht. Viele Mukoviszidose verursachenden Mutationen wurde gezeigt, dass diese Aktivität ändern. Obwohl eine kleine Anzahl von Reinigungsprotokolle sind veröffentlicht worden, haben eine schnelle Rekonstitution Methode Kanalaktivität beibehält und ein geeignetes Verfahren zur Untersuchung Population Kanalaktivität in einem gereinigten System fehlte. Hier schnelle Methoden zur Reinigung und funktionelle Rekonstitution des Volllängen-CFTR-Protein in Proteoliposomen von definierten Lipid-Zusammensetzung, die eine Aktivität als geregelter Halogenid Kanal beibehält beschrieben. Diese Rekonstiutionsmethode zusammen mit einem neuen Fluß basierenden Assay Kanalaktivität ist ein geeignetes System zurStudium der Bevölkerung Kanaleigenschaften von Wildtyp-CFTR und die krankheitserregenden Mutanten F508del- und G551D-CFTR. Insbesondere weist das Verfahren die Anwendung in der Untersuchung der direkten Effekte der Phosphorylierung, Nukleotide und kleine Moleküle wie Potentiatoren und Inhibitoren auf die CFTR-Kanalaktivität. Die Verfahren sind sich auch zur Untersuchung anderer Membrankanäle / Transporter für anionische Substrate.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Chlorid-Transports durch die apikale Membran von Epithelzellen in Geweben wie der Lunge, des Darms, der Bauchspeicheldrüse und Schweißdrüsen wird primär von der Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), einem ATP- und Phosphorylierung reguliert Mitglied der ABC (ATP-vermittelten Binding Cassette) C-Unterfamilie von Membranproteinen (in 1 überprüft). Wie andere Mitglieder der ABCC Familie ist CFTR eine große, mehr Spanning integrales Membranprotein, das an zwei ATP-Nukleotid-Bindungsstellen an der Schnittstelle ihrer Nukleotid-(NBDs), wo es geringe ATPase-Aktivität besitzt, in einer einzigen gebildet bindet Website. Im Gegensatz zu anderen ABCC Familie Mitglieder CFTR wurde als einzigartiges geregelten Cl Kanal anstatt als aktiven gelösten Transporter entwickelt.

Mutationen im CFTR Ursache Mukoviszidose, einer Krankheit, die mehrere Organe wie die Lunge, Magen, Darm, Pankreas-und Fortpflanzungsorgane, was zu morbidity und Mortalität bei jungen Erwachsenen. Lungenerkrankungen nimmt normalerweise Frühletalität bei zystischer Fibrose und in den meisten Fällen wird durch den Verlust der CFTR-Funktion auf dem Oberflächenepithel der leitenden Atemwegen verursacht wird. Der Mangel an CFTR Chlorid-Kanal-Aktivität führt zu einer Verringerung sowohl der Cl - und Wasserbewegung über die Oberfläche Epithel, um die Fluidschicht auf der apikalen Oberfläche der Wimper Respirationsepithels modifizieren. Dies führt zu einem viskosen Atemwegsoberflächenflüssigkeit, die die Fähigkeit von Wimper respiratorischen Epithelzellen beeinträchtigt effektiv klare Pathogenen aus den Atemwegen. Als Folge sind die meisten CF-Patienten leiden unter wiederkehrenden Anfällen von Lungenentzündung und Lungenschäden aufgrund einer Entzündung.

Wie erwartet, Studien über den Wirkungsmechanismus des normalen CFTR-Protein konzentrierte sich hauptsächlich auf detaillierten elektrophysiologische Untersuchungen der Kanalöffnung Aktivität. Einkanal-Studien haben direkt, dass CFTR fungiert als PKA-abhängige Cl gezeigt- Kanal, der ein ATP-regulierten Tor 2 besitzt. Detaillierte elektrophysiologische Studien bieten eine Vielzahl von Informationen über einzelne CFTR-Kanäle 1,3, es kann jedoch Sorge, ob die Eigenschaften eines bestimmten einzelnen Kanal, der untersucht wurde, ist repräsentativ für die gesamte Bevölkerung von CFTR-Kanäle und damit die einzelnen Kanal Testergebnisse sollten stets zusammen mit Methoden, um die makroskopischen Bevölkerung studieren berücksichtigt werden. Direkter Assay der Bevölkerung Kanalaktivität von gereinigtem CFTR hat das Potential, um einen Einblick in die molekularen Defekts mit krankheitsverursachenden Mutation assoziiert ist und Entdeckung chemischer Modulatoren, die Reparatur mutierten CFTR-Proteine ​​zu treiben. Bis heute gibt es mehr als 1.900 verschiedene Mutationen im CFTR gedacht, um Mukoviszidose 4 verursachen. Der Haupt Mutation F508del-CFTR, auf mindestens einem Allel in etwa 90% der Patienten in Nordamerika und Europa führt zu Proteinfehlfaltung and Retention im endoplasmatischen Retikulum 5. F508del-CFTR hat auch andere Folgen, einschließlich defekte Kanalaktivität 6-9. Die sich ergebende Fehlen von CFTR von der Zelloberfläche ist mit einer schweren Erkrankung. G551D-CFTR, eine weniger häufige Mutation, wird angenommen, dass noch richtig gefaltet dysfunktional als Chlorid-Kanal an der Zelloberfläche 6 ist. Die Entwicklung niedermolekularer Korrektoren und Potentiatoren hat das Ziel, Korrektur Faltung und / oder Menschen von Mutanten, wie F508del-CFTR an der Zelloberfläche und potenzierende oder Erhöhung der Kanalaktivität von Mutationen wie G551D, wenn sie auf der Zelloberfläche vorhanden sind, jeweils . Während die Korrektoren VX-809 und VX-661 (noch nicht zur Anwendung bei Patienten zugelassen, die Potentiator Kalydeco (Ivacaftor, VX-770) wird auf 150 mg alle 12 h bei CF-Patienten> 6 Jahre mit mindestens einem G551D verwendet -CFTR Mutation, und in jüngerer Zeit für Patienten mit einem G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pund G1349D. Kalydeco sowohl sicher und führt zu einer Verbesserung der klinischen Maßnahmen CF Krankheit 10 ist jedoch der Mechanismus der Wirkung des kleinen Moleküls war schlecht bei der FDA-Zulassung für die Anwendung bei Patienten verstanden.

Eine Handvoll von CFTR Reinigungsverfahren wurden zuvor 2,11-18, von denen viele erfordern eine beträchtliche Zeitdauer in Anspruch beschrieben. In einer kürzlich erschienenen Publikation 19 wurde eine einzigartige schnelle Reinigung und Rekonstitution Verfahren zur CFTR in Sf 9-Zellen-Expressionssystem überexprimiert beschrieben, und das gereinigte Protein in definierten Lipidsystem wurde verwendet, um ein CFTR Halogenid Kanalaktivitätstest für eine Population von CFTR entwickeln Molekülen. Der Assay fasst die bekannten Wirkungen der Phosphorylierung, Nukleotide und Inhibitoren auf die CFTR-Funktion. Das System wurde verwendet, um die Wirkungen der Potentiator abzufragen VX-770 / Kalydeco auf Wt (Wildtyp), F508del- und G551D-CFTR und es wurde zum ersten Mal gezeigtZeit, die das Arzneimittel interagiert direkt mit dem CFTR-Protein, seine Kanalaktivität in einem ATP-unabhängigen Weise zu verstärken, was die Nützlichkeit und Anwendbarkeit dieser Verfahren auf die Untersuchung der Wechselwirkung von CFTR und Mutanten mit Nukleotiden und kleinen Molekülen aus einer Population Perspektive beantworten klinisch relevante Fragen zum Protein. Die Verfahren sind auch verwendet worden, um andere Potentiator Moleküle und deren Derivate 20, als auch die Auswirkungen eines kleinen Moleküls Korrektor auf die Aktivität des Proteins 21 zu studieren.

Efflux-Assays wurden in vielen Studien verwendet worden, die zuvor um die Aktivität des CFTR-Mutanten und die Wirkungen von CFTR-modulatorische Verbindungen auf ihre Aktivität, einschließlich der Gesamtzelltests unter Verwendung von Elektroden, radioaktiven Tracer und Fluorophore 22,23, Membranvesikel mit ionenselektiven Elektroden 24 zu untersuchen und gereinigt wieder hergestellt CFTR mit radioaktiver Tracer 25. Allerdings the Verwendung von ionenselektiven Elektroden zu reinig wiederhergestellt CFTR Studie wurde vor kurzem 19 ausgewiesen. Eine Anpassung der aktuellen Methode ist für die Rekonstitution und funktionelle Charakterisierung der beiden Membranproteine ​​von Pseudomonas aeruginosa, einem gemeinsamen CF Pathogen verwendet. Rekonstitution von gereinigten Alge Protein der äußeren Membran gekuppelt mit Jodid Efflux-Messungen wurden verwendet, um ein Modell für die anionische Alginat Sekretion durch diese Transporter 26 zu unterstützen. Rekonstitution und Iodid Auslauf Messungen wurden mit dem gereinigten WZX Protein, das ein Modell vorgeschlagen werden, die ein H + -abhängigen Antiport-Mechanismus für die Lipid-verknüpftes Oligosaccharid Translokation über die bakteriellen Innenmembran schlägt dieses Protein 27 dürfen angewandt. In beiden Fällen wurde Jodid als Surrogat für die anionische Substrat bei geringeren Durchsatz verwendet, wenn auch, als man für eine native Substrat erwarten. Das Verfahren kann für die Anpassung an andere Proteine, die mit c istationic Transport oder Leitungsbahnen für die anionische Substrate.

Hier wird eine schnelle Reinigungsverfahren ist für den CFTR-Proteins und seiner Rekonstitution in Proteoliposomen von definierten Lipid beschrieben. Die rasche Rekonstitution kann leicht zur Verwendung mit CFTR durch andere Verfahren gereinigt zugeschnitten werden, dass die Art des Detergens in der Reinigung verwendet zugänglich ist, um die Entfernung von den hier verwendeten Methoden oder nach einem geeigneten Detergens vor der Rekonstitution ausgetauscht werden. Das Iodid Efflux Verfahren zur Messung der Kanalaktivität der gereinigten und rekonstituierten CFTR-Protein ist im Detail beschrieben, und einige typische Ergebnisse, die durch dieses Verfahren erhalten werden können, sind dargestellt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Reinigung von CFTR

HINWEIS: Siehe Tabelle der Materialien und Geräte für eine Liste von Waren und Materialien in diesem Protokoll verwendet. Ein detailliertes Protokoll besteht für die Überexpression des menschlichen Wt-CFTR und Mutanten in der S f 9-Baculovirus-Expressionssystem 17,28. Überexprimieren CFTR und bereiten Pellets von Sf 9-Zellen gemäß diesem Protokoll.

  1. Crude Membranpräparation
    1. Beschaffen einer neuen oder Auftauen einer gefrorenen S f 9 Zellpellet aus einer 500 ml Zellkultur-Überexpression Wildtyp-, F508del- oder G551D-CFTR-Proteins mit einem C-terminalen His 10 -tag von Standardzellkulturverfahren gezüchtet, wie zuvor beschrieben 17,28. Zellpellets wird ein Volumen von etwa 5 ml und einem Feuchtgewicht von etwa 5 g.
    2. Resuspendieren Sf 9-Zellen in 20 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,4 mit Protease-Inhibitor-Cocktail (1 Tablette pro 50 ml) bei 4 ° C, bei denen dieProbe erscheint optisch homogen und keine Zellklumpen zu bleiben.
    3. Lyse Zellen unter Verwendung einer Hochdruckzelle Disruptor (Tabelle der Materialien und Geräte) und erreichte ein Minimum von 10.000 psi (vorzugsweise 15.000-20.000 psi) für 2 Minuten pro Durchgang. Halten Sie die Probe bei 4 ° C während der Lyse.
      1. Die Probe wird in einem Röhrchen auf Eis nach der Lyse Zeitraum dann sofort laden Sie die Probe in der Zelle Disruptor. Wiederholen Lyseverfahren 3 mal. Untersuchen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, kleiner als 10% erhalten bleibt.
        HINWEIS: andere Verfahren zur Lyse Zellen, wie Glasperlen, usw. sind nicht streng auf dieses System untersucht, jedoch kann ein Benutzer ein solches alternatives Verfahren geeignet finden.
    4. Zentrifuge Zelllyse Material bei 4 ° C in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 2.000 · g für 20 min. Die überstehende Flüssigkeit und entsorgen des Pellets. Teilen Sie den Überstand unter 20 Röhrchen und zentrifugieren Sie die Proben für 1 Stunde bei 4 ° C bei 125.000 · g in einer Tisch ultracenZentrifuge.
    5. Entfernen Sie den Überstand, darauf achten, daß das Pellet, und speichern Pellets in denselben Röhrchen bei -80 ° C für weniger als 2 Monate zu stören bis zur Verwendung oder zu halten auf dem Eis und fahren Sie mit der Reinigung sofort.
  2. CFTR Solubilisierung
    1. Erhalten 1-4 frische oder gefrorene Sf 9 rohe Membranpellets und Resuspendieren in je 1 ml Puffer 1 (2% fos Cholin; siehe Tabelle 1 für die vollständige Rezeptur) bei 4 ° C auf Eis, mit einer 25 G Nadel und 1 ml Spritze, bis die Lösung ohne sichtbare Zellmembran Klumpen mit dem Auge homogen. Wenn mehr als ein Pellet wird als solubilisierte, weiterhin jede Probe gemäß den Anweisungen für eine einzelne Pellet unten parallel zu behandeln, die Bündelung der Proben in Schritt 1.3.2.
    2. Lösen Sie 1 Mini-Protease-Inhibitor-Tablette in 1 ml Puffer 2 (10 mM Imidazol; siehe Tabelle 1), die fos Cholin 14 Reinigungsmittel fehlt (Protease-Inhibitoren sind 10x concentbewertet als die empfohlene Anwendungskonzentration an dieser Stelle) und fügen Sie 100 ul zu der resuspendierten rohe Membranpellet (Protease-Inhibitoren sind in der jeweils empfohlenen Verdünnung an dieser Stelle). Auf Eis für 45 bis 60 min unter Mischen durch Inversion 5 mal alle 5 min.
    3. Zentrifuge resuspendiert rohe Membranpellet in einer Tischultrazentrifuge für 25 Minuten bei 125.000 × g und 4 ° C. Behalten Sie den Überstand, der solubilisiertes CFTR enthält und entsorgen Sie die Pellets.
  3. Column verbindlich, Phosphorylierung und Elution
    1. Waschen 400 ul von Nickel-NTA (Nitrilotriessigsäure) Agarose-Aufschlämmung oder äquivalente Harz mit 1 ml Puffer 2 (10 mM Imidazol, siehe Tabelle 1), die Waschmittel fehlt, um Lösungsmittel zu entfernen und Puffer bei 4 ° C. Wiederholen Sie die Wäsche noch zweimal.
    2. Kombinieren solubilisierten CFTR verbleibende Proteaseinhibitor (900 ul) und Nickel-Harz (von 400 ul Aufschlämmung) zu insgesamt 10 ml mit Puffer 2 (10 mM Imidazol; siehe Tabelle 1) which fehlt jegliche hinzugefügt Reinigungsmittel. Fos- Cholin 14 Konzentration effektiv zu 0,2% (w / v) in diesem Schritt verdünnt. Wenn es mehrere Rohre, bündeln alle Proben, enthaltend solubilisiertes CFTR, Proteaseinhibitoren, Nickel-NTA-Harz und 0,2% (w / v) fos Cholin-14 an dieser Stelle. Inkubieren für 60 min bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
    3. Pass CFTR-Protease-Inhibitor-Nickel-NTA-Lösung auf ein kleines Screening Spalte (Tabelle 1) oder einen gleichwertigen, leere Spalte.
    4. Wasche die Nickel NTA-Harz, das in der Säule zurückgehalten wird, mit 4 ml pro anfängliche Pellet aus Puffer 3 (10 mM Imidazol + DDM, siehe Tabelle 1) fos Cholin 14, fehlen, die jedoch enthält 1 mM DDM (Dodecylmaltosid Waschmittel), bei 4 ° C. Zugabe von DDM Waschmittel nicht den pH dieses Puffers nicht signifikant.
    5. Bereiten PKA-MgATP Lösung durch Zugabe von 25 ul (5 mM, Endkonzentration) MgATP, 2.500 U des cAMP-abhängige Proteinkinase A, katalytische Untereinheit (PKA) auf 475 & mgr; l Puffer 3 (10 mM Imidazol + DDM, siehe Tabelle 1) in die Kolonne. Phosphorylieren Proteins durch Abdichten des unteren Endes der Säule mit einer Kappe oder einem Parafilm und der Zugabe von 500 ul der PKA-MgATP Lösung für jede anfängliche Pellet verwendet.
    6. Inkubieren bei Raumtemperatur (20 ° C) für 20 Minuten unter leichtem Mischen und Resuspendieren des Harzes unter Verwendung einer 1 ml Pipette alle 2 Minuten, um sicherzustellen, dass die PKA ist in Kontakt mit der gesamten Oberfläche der Nickel NTA Harz kommen.
    7. Entfernen Sie die Kappe und Elution der PKA / MgATP Lösung aus der Säule. Die Säule wird mit 2 ml Puffer 3 (10 mM Imidazol + DDM; siehe Tabelle 1) bei 4 ° C.
    8. Multiplizieren die Anzahl der Pellets, die in dem Experiment 4. Waschen der Säule mit dieser Anzahl von ml Puffer 4 verwendet (50 mM Imidazol + DDM, siehe Tabelle 1) bei 4 ° C, durch Zugabe von 4 ml Puffer auf die Säule, so dass er durch und unmittelbar zu fließen, indem sie das nächste 4 ml Aliquots auf die Säule.
    9. Tabelle 1) bei 4 ° C pro anfängliche Pellet durch die Säule bei einer Zeit verwendet wird, 1 ml ohne eine Pause, damit die Säule, um zu trocknen, und sammeln Sie das gesamte Eluat, das gereinigt CFTR in einer einzigen Röhre.
    10. Konzentrieren Proteinprobe auf Imidazol- und Molekulargewichtsabbau günstig Produkte zu entfernen unter Verwendung einer Zentrifuge Filtereinrichtung (100.000 Molekulargewicht cut-off), wie in der Tabelle von Materialien und Ausrüstung oder eine andere ähnliche Vorrichtung beschrieben, in einem Gesamtvolumen von 10 ml Puffer 6 (75 mM KI + DDM, siehe Tabelle 1) oder einem anderen Puffer der Wahl, das 1 mM DDM (wie Puffer 7 für nicht Iodid Efflux Experimenten 25 mM HEPES + DDM, siehe Tabelle 1), durch Zentrifugation bei 2.000 × g und 4 ° C für etwa 20 min, bis die Probe konzentriert, um 200 & mgr; l. Verdünnte Probe auf 10 ml und wiederholen Sie den Konzentrationsschritt.
      HINWEIS: Nach unserer Erfahrung (unveröffentlicht), Imidazol deutlich INHIbits der ATPase-Aktivität von CFTR und sollte in diesem Schritt durch Verdünnung und Konzentration mindestens zweimal zu entfernen, wenn die Probe für funktionelle Messungen verwendet werden.
    11. Sammeln Sie konzentrierten gereinigt CFTR. Halten bei 4 ° C in Gegenwart von DDM Puffer bis zur Verwendung innerhalb von 1-2 Tagen bzw. fortsetzen sofort dem Rekonstitution. Das gereinigte Protein Nicht einfrieren, wie in unserer Erfahrung, die wir beobachten, verminderte Aktivität.

2. Rekonstitution von CFTR

  1. Lipid Vorbereitung
    HINWEIS: CFTR wurde erfolgreich in Ei-PC, POPC, 2 rekonstituiert: 1 (w / w), Ei-PC: POPC (1: 1 w / w) Mischung, oder einer Mischung aus PE: PS: PC: Ergosterol, 5: 2, : 2: 1 (w / w).
    1. Für Iodid Auslaufversuche, trockenen 5 mg Ei-PC (200 ul von 25 mg / ml Stamm, siehe Tabelle der Materialien und Geräte) unter einem Strom von Argongas für 20 min bei Raumtemperatur in einem Pyrex oder andere feste (non-Borosilikat- ) Glasrohr.
    2. Verwendung der Absorption bei 280 nm, ein ELISA assay oder eine andere Methode, eine Schätzung der Konzentration der gereinigten Protein CFTR Probe. Für Jodid Efflux Experimente mit Wildtyp-CFTR, mit einem Protein: Lipid-Verhältnis von 1: 300-1: 3000 (w / w), um ein ausreichendes Signal zu erzeugen. Für G551D- und F508del-CFTR, mit einem Protein: Lipid-Verhältnis von ungefähr 1: 200-1: 1200 (w / w), um die Ausfluss Aktivität nachzuweisen.
    3. Optimieren Sie die Protein: Lipid-Verhältnis für jedes einzelne System. Berechnen des Volumens des gereinigten Proteins erforderlich. Berechnen des Volumens der Puffer mit 1 mM DDM benötigt, um ein Endvolumen von 1 ml, also 1 ml zu - (Volumen des erforderlichen Proteinlösung) = Volumen des Puffers.
      1. Die berechnete Volumen des gewünschten Puffersystem mit 1 mM DDM zu dem getrockneten Lipid (aber nicht das CFTR-Protein zu diesem Zeitpunkt hinzuzufügen) und bedecken die Glasröhre mit Parafilm. Für Jodid Efflux Experimenten resuspendieren Lipide in Puffer 6 (75 mM KI + DDM, siehe Tabelle 1). Für andere Experimente resuspendieren in Puffer 8 (25 mM HEPES + DDM findenTabelle 1) oder einer anderen gewünschten internen Puffer, der 1 mM DDM.
      2. Wirbel für 2 min bei Raumtemperatur in Suspension des Lipids im DDM Puffer unterstützen. Alternativ Erwärmung der Probe auf 37 ° C für 1-2 min, bevor Vortexen.
    4. Suspendiere das Lipid wiederholt bei Raumtemperatur mit einer 1 ml Spritze und 25 G-Nadel, bis keine Lipidfilms auf den Seiten der Röhre sichtbar ist. Vermeiden Einblasen von Luft in der Lösung, die feinen Blasen zu produzieren und zu unterstützen in Oxidation von Iodid und Lipide würden.
    5. Beschallen die suspendierte Lipid in der Parafilm abgedeckt Rohr für einen 20 s-Burst in einem Ultraschallbad Eis enthielt, und dann unverzüglich in Eis für 1 min. 3-mal wiederholen.
      HINWEIS: Intensive Ultraschall stellt sich Jodid-Lösungen gelb durch Oxidation. Übermäßigen Beschallung. Überwachen Sie die Probe für Farbwechsel. Wenn ein Farbwechsel festgestellt wird, entsorgen Sie die Probe und erneut vorzubereiten. Die Farbänderung infolge der Oxidation einigerdas Iodid würde Oxidation der Lipide unter den gleichen Bedingungen führen. Verdrängen der Luft aus dem Rohr mit Argongas zuvor Beschallen der Lösung wird verhindert, dass die Oxidation von Lipiden und Iodid. Intensive Ultraschall kann schlechte Qualität oder zerkratzte Glasröhren, was zum Verlust der Probe zu brechen.
    6. Hinzufügen des Volumens gereinigt CFTR in Schritt 2.1.3 beschallten Lipidprobe, um einen berechneten erreichen ein Endvolumen von 1 ml. Mischen das Protein mit dem Lipid und Detergenslösung durch Resuspension 10 mal mit einer 25 G Nadel und 1 ml Spritze.
    7. Eingestellt Lipid- und Proteinprobe auf Eis für 30 min unter Schwenken der Röhre zu 5 mal je 5 min mischen.
  2. Reinigungsmittel-bindenden Spalte Vorbereitung
    1. Besorgen Sie sich einen einmaligen Gebrauch kommerziellen Reinigungsmittel-bindenden Spin-Säule (siehe Tabelle der Materialien und Geräte) mit einer 1 ml Fassungsvermögen und brechen Sie auf die Registerkarte unten beginnen die Säule fließt.
    2. Zentrifugieren Sie die Spalte für 2 min bei 2000 x g, um das Speicher b entfernenuffer, und entsorgen Sie diesen Puffer.
    3. 5 ml Puffer 7 (75 mM KI, siehe Tabelle 1) auf die Säule, und dann bei 200 × g zentrifugieren für 4 Minuten, um den Waschpuffer eluieren. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male für insgesamt 3 Waschschritten, um alle Spuren der Speicherpuffer zu entfernen. Entsorgen Sie alle Durchfluss.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass der Puffer verwendet, um die Säule zu waschen NICHT DDM oder andere Reinigungsmittel enthalten. Die Säule hat eine begrenzte Bindekapazität für Reinigungsmittel und ein Puffer, wenn Waschmittel, das verwendet wird, wird die Säule unwirksam bei der Entfernung des Detergens aus der Protein-Lipid-Detergens-Probe sein.
    4. Sie 1 ml des Lipid-Detergens-Protein-Probe vorsichtig Aliquot auf die Oberseite des Säulenharz und inkubieren Probe an der Spitze der Säule für 2 min bei Raumtemperatur.
    5. Zentrifugieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 4 min bei 2000 xg und sammeln das trübe Proteoliposom Probe in ein sauberes 1,5 oder 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen oder ein Glasrohr und legen Sie das samweise auf Eis.
    6. Sammeln verbleibende Proteoliposomen in der Säule durch Zugabe von 200 ul Puffer 7 (75 mM KI, Tabelle 1) oder andere Puffer (ohne Detergens) zu dem oberen Ende der Säule und wiederholen den Zentrifugationsschritt für 2 min.
    7. Fügen Sie den zweiten Eluats auf die Proteoliposom Probe bei bewölktem Himmel sieht.
    8. Die Probe bei 4 ° C über Nacht oder sofort verwenden für Iodid Auslaufmessungen.

3. Iodid Efflux Messungen für gereinigtes, Rekonstituierte CFTR

  1. Erzeugung eines Iodid-Gradient über die Membran proteoliposomal
    1. Vorzuquellen Sephadex G50 Perlen in Puffer 9 (75 mM K-Glu, Kaliumglutamat, siehe Tabelle 1), (etwa 5 g trockene Kügelchen in 50 ml Puffer) oder gewünschte externe Puffer bei Raumtemperatur für mindestens 2 Stunden oder bei 4 ° C über Nacht.
    2. Herstellung von 4 Sephadex G50 Säulen in Puffer 9 gesättigt (75 mM K-Glu, siehe Tabelle 1) oder andererPuffer in kleinen Spalten Screening durch Laden Harz mindestens ¾ voll in der Säule.
    3. Zentrifugieren für 4 min bei 2000 × g, um überschüssige Puffer aus dem Harz zu entfernen. Es sollte etwa 2,25 ml gepackte hydratisierten Harzes in der Säule am Ende der Zentrifugation Schritt.
      HINWEIS: Resin sollten leicht hydratisiert werden, jedoch nicht in Flüssigkeit eingetaucht und einer anschließenden kurzen Spin nicht eluieren signifikante Volumina Puffer. Es ist kritisch für die erfolgreiche Elution des Proteoliposom Probe, die Säule Harz ist weder zu feucht noch zu trocken, und der Benutzer muss möglicherweise mit den Säulen, um sich mit den erfolgreichsten Pufferaustauschbedingungen vertraut experimentieren.
    4. 125-150 ul Proteoliposom Probe vorsichtig in den oberen Rand jeder Spalte und Zentrifuge 4 min bei 2000 x g.
    5. Pool Proteoliposom Eluaten zusammen für den sofortigen Einsatz in Iodid Efflux oder andere Experimente.
      HINWEIS: Die eluierte Volumen von jeder Säule sollte etwa sein150 ul und die Probe sollte etwas bewölkt, aber weniger trübe als die ursprüngliche Probe sein. Größere Mengen oder klar Eluate legen nahe, dass die Säulen zuvor nicht ausreichend getrocknet sind oder die durch Trocknen zu viel sind, und nicht in einem erfolgreichen Iodid Auslaufversuch führen.
  2. Iodid-Efflux-Assay
    1. Ein Iodid selektiven Mikroelektrode (Tabelle der Materialien und Geräte) ausgiebig mit entionisiertem Wasser gewaschen und dann für 20 min inkubiert, bevor das Experiment in Puffer 10 (15 & mgr; M KI, siehe Tabelle 1). Waschen Sie die Elektrode wieder ausgiebig mit deionisiertem Wasser.
    2. Jeweils 150 ul des Arzneimittels in Puffer 9 (20 uM typische Konzentration, um eine Endkonzentration von 10 & mgr; M in dem Test zu erzeugen) (75 mM K-Glu, siehe Tabelle 1), die bzw. das in Puffer 9 in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einem kleinen Floh Rührstab.
      1. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen vorhanden sind. Verwenden Sie eine Pipettenspitze entfernen StreuBlasen. Wenn eine Arzneimittellösung verwendet wird, sicherzustellen, dass die DMSO-Endkonzentration in der Vertiefung weniger als 1% (v / v) (typischerweise 0,1-0,2% (v / v)).
    3. Fügen Sie 150 ul des rekonstituierten CFTR-Protein, das in Abschnitt 3.1 in Puffer 9 hergestellt wurde (75 mM K-Glu, siehe Tabelle 1) in die gut mit Drogen-oder Puffer, um ein Gesamtvolumen von 300 ul in der Vertiefung der Platte zu produzieren.
    4. Platzieren Sie die Platten mit 96 Vertiefungen auf einer Rührplatte gegeben und bei 130 Umdrehungen pro Minute (oder bei mäßiger Geschwindigkeit von ca. ¼ der Maximalgeschwindigkeit).
    5. Führen Sie die Spitze des Iodid selektive Elektrode vorsichtig in die Vertiefung mit der Probe, so dass die Spitze der Boden des Bohrlochs nicht berühren oder durch den Rührstab zu schlagen. Sicherzustellen, daß die Referenzelektrode, wenn getrennte, ist auch in Kontakt mit der Lösung in den Brunnen.
    6. Nehmen Sie Kurven mit einem hausgemachten oder kommerzielle Computerprogramm, das mit der Elektrodenschnittstellen (siehe Tabelle der Materialien und Geräte für Details).Eine Abtastrate von 2 Hz, mit einer Filterung des Signals durch ein Tiefpassfilter.
    7. Die Probe wird für 5 Minuten ins Gleichgewicht kommen, um eine stabile flache oder fast flache Basislinie erzeugen während der Aufnahme.
    8. In 3 ul MgATP (100 mM Stamm in dH 2 O hergestellt und mit KOH auf pH 7 eingestellt; 1 mM Endkonzentration) auf die Probe, um das Protein zu aktivieren. Lassen Sie ca. 5 min, eine neue stabile Basislinie zu erreichen. Immer den pH-Wert der 100 mM MgATP Lager einzustellen, um neutral vor Gebrauch auf Änderungen des pH-Werts des externen Puffer vermeiden.
    9. In 3 ul Valinomycin Lager (2 uM; 20 nM Endkonzentration) auf die Probe, um Veränderungen in der Potentialdifferenz durch Jodid selektive Leitung durch CFTR erzeugt Shunt. Notieren Sie sich die abnehmende Steigung (Abnahme in mV) durch CFTR-vermittelten Efflux Iodid Aktivität für mindestens 5 min.
    10. Um sicherzustellen, dass das Einfangen von Iodid in den Proteoliposom Lumen ausreichend war, werden 3 ul 10% (v / v) Triton X-100 zu der Probe. Significant und sofortige Iodid Freisetzung zeigt an, dass ausreichend Iodid in den Vesikeln, daß war Einfangen nicht der limitierende Faktor für die Veränderungen in der Steigung in 3.2.9 festgelegt, sondern vielmehr der CFTR-vermittelte Aktivität gefangen.
    11. Gründlich waschen die Elektrode und Rührstab mit entionisiertem Wasser nach der Behandlung von Proben mit Drogen oder mit Triton X-100, um sicherzustellen, alle Spuren dieser Reagenzien wurden entfernt, um eine Verunreinigung der nächsten Probe zu vermeiden.
    12. Bereiten Sie eine Reihe von verdünnten KI-Konzentrationen im mikromolaren bis nanomolaren Bereich im Puffer 9 (K-Glu-Puffer, siehe Tabelle 1). Den mV-Reaktion der Elektrode auf jede Konzentration von 0 bis zur höchsten Konzentration. Eine Standardkurve, wo die Sonde Antwort (mV) wird gegen log der molaren Iodid-Konzentration aufgetragen. Verwenden Sie die Standardkurve, um die mV Reaktion der Sonde während der Auslauf Experiment Konzentration von Iodid frei konvertieren.
      HINWEIS: Eine Eich Aktuellhabe auf einer wöchentlichen Basis, bis ein Anwender sicher ist, wie schnell die Reaktion der Sonde ändert. Es wird eine Drift in der Antwort und Empfindlichkeit der Sonde über die Zeit sein. Da die Sonde im Alter wird die Reaktion beeinträchtigen. Dies kann teilweise durch eine Änderung der internen Lösungen periodisch und ausgiebigem Waschen der Sondenspitze in Wasser nach dem Gebrauch, was wahrscheinlich Grenzen Anhaften von Molekülen an der Sondenoberfläche aufzuheben.
    13. Bestimmen Sie die mittlere Neigung der Linie der Konzentration gegen die Zeit für jeden Proteoliposom Probe für die letzten 30 Sekunden vor der Zugabe von MgATP, und nach Zugabe von Valinomycin aber vor der Zugabe von Triton X-100. Subtrahieren Sie die Grundneigung vom Valinomycin, das CFTR-vermittelten Efflux Iodid Tätigkeit der Probe zu bestimmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In dieser Publikation geschrieben werden Verfahren zur Reinigung, zu rekonstruieren und zu messen geregelten Kanalaktivität des CFTR-Proteins. 1a zeigt den Arbeitsablauf für die Reinigung, Wiederherstellung und Iodid Auslaufverfahren. Verfahren zur Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen durch Jodid Fluss auch in weiteren Einzelheiten in der zugeordneten Video gezeigt.

Reinigung und Wiederherstellung der CFTR in Proteo

CFTR funktionell in hohen Mengen in Sf 9-Zellen exprimiert werden, unter Verwendung von rekombinantem Baculovirus, Wt oder mutierte CFTR cDNA 2. Während es kein Säugetierexpressionssystem wurde CFTR unter Verwendung des Baculovirus-System in Sf 9 Zellen, um eine hohe Expression gewährleisten ausgedrückt. CFTR Produktion kann so hoch wie 1% des gesamten zellulären Proteins 17,28 sein. Die S f 9- Baculovirus System hat den Vorteil, dass das Protein glycosyliert Kern und dasQualitätskontrollmaschinen in diesem System relativ permissive, daß CFTR und Mutanten können auf der Zelloberfläche erzeugt werden. Ein zehn Histidin-Tag wurde auf den Carboxyterminus entwickelt, um die Reinigung durch Affinität dieses Tags für Nickel-NTA zu ermöglichen. Die C-terminalen Tag hilft, Co-Reinigung von verkürztem CFTR-Proteine ​​und Ausbeuten funktionelle CFTR-Proteins in ATPase Einkanal und Iodid Efflux Experimenten 17,19,24,28,29 verhindern. Allerdings ist die hier beschriebene Reinigungsprotokoll sollte für N-terminal getaggte CFTR als gut.

Zuvor wurde gezeigt, daß CFTR-Protein kann effektiv von S f 9-Plasmamembranzubereitungen mit NaPFO (Natrium pentadecafluoro-octanoat) bei Raumtemperatur 15 extrahiert werden. Jedoch ist die Empfindlichkeit der NaPFO bei 4 ° C, einer Temperatur auszufällen förderlich für die Erhaltung richtig gefalteten Proteins und die langwierige Dialyse erforderlich PFO entfernen waren nicht zugänglich rapid Aufreinigung und Rekonstitution Methoden bestimmt, die Aktivität des Proteins in den nachfolgenden Assays der CFTR-Funktion zu optimieren. Eine Auswertung eines Panels von Detergentien (einschließlich Dodecyl-β-D-maltosid (DDM), 3 - [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS), fos Cholin 12 und fos Cholin 14, zeigte, daß fos Cholin 14 am wirksamsten bei der Solubilisierung menschliche CFTR-His 10 von S f 9-Membranen, und das DDM war wirksam bei der Aufrechterhaltung der ATPase-Aktivität von CFTR in Waschmittellösung (Daten nicht gezeigt). Somit wird ein fos Cholin 14 Waschmittelextraktionsschritt durchgeführt wird, durch Austausch gefolgt Waschmittel DDM, um die Aktivität des Proteins zu erhalten.

(; Silber Stain Figur 2) nach der Reinigung und Konzentration wird eine Proteinfraktion im DDM Waschmittel, das ein ~ 150 kDa-Bande als Hauptkomponente enthält, erhalten wird. Das Molekulargewicht entspricht menschlichen CFTR in S <exprimiertem> f 9cells und durch SDS-PAGE, wo es die Typen komplexer Glykosylierung Charakteristik des CFTR in Säugetierzellen fehlt analysiert. Die 150 kDa-Spezies zu sein scheint ungefähr 90% rein nach SDS-PAGE-Analyse und Silberfärbung. Western-Blotting unter Verwendung des M3A7 Anti CFTR-Antikörper bestätigt, dass diese monoklonalen Maus gegen NBD2 gerichtet mit der 150 kDa-Bande (2; Blot) reagiert. In bestimmten Studien, Spuren von Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht sind als kleinere Banden auf dem Gel sichtbar vorhanden, bei ~ 60 und ~ 80 kDa (Daten nicht gezeigt). Die M3A7 Anti CFTR-Antikörper reagiert mit den 60 und 80 kDa-Banden, aber nicht mit anderen nicht-CFTR-Proteinen reagieren (Daten nicht gezeigt). Dies legt nahe, daß die niedermolekularen Komponenten CFTR Abbauprodukten co-gereinigt mit CFTR über ihre C-terminalen His-Tag. Die Reinigung erfolgt in Gegenwart von Protease-Inhibitoren erfolgen, und es scheint, dass diese Komponenten in den Zellen vorhanden sind, bevor der Reinigungsprozedur is durchgeführt. Der Konzentrationsschritt des Verfahrens beseitigt nahezu alle der kontaminierenden niedrigerem Molekulargewicht Fragmente. CFTR kann an dieser Stelle aufgelöst werden, oder ein Protein von einem anderen Reinigungsverfahren können bei der Rekonstitution Protokoll verwendet werden.

Liposomale Fluss basierenden Assays berichtet die funktionelle Rekonstitution einer Population von gereinigten und rekonstituierten CFTR Molekülen reguliert, anionenselektive Kanäle

Um zu bestimmen, wenn ein erheblicher Anteil des gereinigten CFTR wurde als geregelter Chlorid-Kanal unter Verwendung der obigen Verfahren rekonstituiert wurde ein proteoliposomal Halogenid-Fließtest entwickelt, der die Aktivität von einer Population von rekonstituierten CFTR Moleküle (schematisch in 1B gezeigt) berichtet. Wenn im schlimmsten Fall die Mehrheit der wiederhergestellten CFTR Moleküle fehlgefaltetem, diese Moleküle nicht, eine Leitfähigkeit zu verleihen, nicht zwischen Kationen und Anionen diskriminierenund / oder das Tor Regulierung durch PKA-Phosphorylierung und Nukleotide fehlen. Lee et al. Sind Verfahren, die eine Schätzung der prozentualen funktionellen Rekonstituierung eines Membranproteins 30 ermöglichen veröffentlicht.

Leere Liposomen (ohne CFTR) oder Proteo (Lager wiederhergestellt CFTR) mit KI (75 mM) und außer liposomalen Iodid geladen Austausch mit Kaliumglutamat (75 mM), indem Liposomen durch eine Gelfiltrationssäule. Die KI geladen Proteo an eine Vertiefung, die K-Glu (Kaliumglutamat) hinzugefügt, um eine nach außen gerichtete Gradient für Iodid erstellen und Auslauf als Steigerungen extraliposomale Iodid im Laufe der Zeit mit einer Jodid empfindlichen Mikro 24 überwacht. Der Ausstrom von negativ geladenen Iodid zu einer Abnahme im pH-Signal (Signal negativer wird). Wenn die Konzentration an Iodid im Laufe der Zeit freigesetzt wird, aufgetragen wird, wird die Steigung (wie in Figur 3) umgedreht, um eine Erhöhung der Iodid im ex zeigenexterne Lösung im Laufe der Zeit.

K-Glu wurde als impermeant Gegenion gewählt, da es ein Beispiel für ein Anion, das nicht durch das CFTR-Protein bestanden hat, scheint keine signifikante Blockierung der Poren unter den verwendeten Bedingungen zu verursachen, und keine Interferenz mit dem Jodid selektiv verursachen Elektrode. Ein Assay könnte um ein anderes Anion optimiert werden, sofern sie diese Kriterien erfüllt. Fünfundsiebzig mM Anion-Konzentrationen wurden empirisch als Konzentrationen, gute Einfangen und ausreichende Signale in dem Test unter den beschriebenen Bedingungen ergab für die Messung ausgewählt. Es wird im Wesentlichen kein Iodid Freisetzung von Iodid-beladenen Liposomen fehlt funktionell rekonstituiert CFTR, bis die Vesikel mit Reinigungsmittel durchlässig gemacht (Abbildung 3, Steuerspuren), während CFTR-Rekonstitution Iodid belastete Proteo vermitteln Iodid Freisetzung in die externe Lösung nach Zugabe von MgATP (1 mM), um das CFTR-Kanal und Valinomycin öffnen(20 nM), um die Entwicklung eines Membranpotentials zu verhindern (3A, siehe Kurve für Protein-Lipid-Gewichtsverhältnis von 1: 3.000 (w / w)).

Valinomycin ist ein Ionophor, die Kalium Shuttles speziell durch die Membran hindurch, hinunter seine Konzentrationsgefälle und die Konzentration von 20 nM wurde empirisch als die höchste Konzentration, die Integrität der leeren Liposomen nicht stören, haben im vorliegenden System gewählt. Dies muss für jedes besondere System optimiert werden. Ohne Zusatz von Valinomycin, besteht eine abgekürzte Iodid Freisetzung von wenigen nm, die schnell ein Plateau erreicht (Daten nicht gezeigt). Diese Bedingungen sind bekannt, um das Anion Kanalaktivität CFTR sonst maximal aktiviert (wie in 3A), scheint es, dass das Fehlen einer signifikanten Reaktion spiegelt die momentane Erhöhung intraliposomale positive Ladung durch die anionenselektive Pore CFTR durch Jodid Leitungs vermittelte sofort Begrenzung continuschiedenen Iodid Auslauf wo Valinomycin ist nicht inbegriffen. Diese Valinomycin-vermittelten Reaktion bestätigt, dass Iodid Efflux wurde in den vorherigen Experimenten, da der Ladungsakkumulation begrenzt, die Unterstützung der Anionenselektivität rekonstituierter CFTR. Wenn CFTR fehlte diese Selektivität würde sowohl Kalium- und Iodid in der Lage, aus Proteoliposomen, wodurch die Notwendigkeit zur Fluss Valinomycin initiieren Aufhebung Efflux haben.

Die Iodid-Konzentrationen, die zu dieser ersten Zeitpunkten waren empirisch gewählt, um im optimalen Empfindlichkeitsbereich für das Iodid Messelektrode verwendet fallen. Verwendung anderer Iodid Elektroden Optimierung dieser Faktoren erfordern. Nach Erreichen eines Plateaus ist Triton X-100 zugegeben, um die Proteo permeabilisieren und Freigabe verbleibende eingeschlossene Iodid. Im Gegensatz zu den anfänglichen Iodid-Messungen (zwischen 1 und 2 Minuten nach Zugabe Valinomycin erhalten), wobei die Ablesungen bei diesen Endpunkten nicht in den linearen Bereich der Elektroden caliTion Kurve (Daten nicht gezeigt), um dadurch auszuschließen eine genaue Bewertung der Fraktion von Liposomen aus dem CFTR-Protein in der Lage ist Iodid Efflux relativ zu der Gesamtzahl der Liposomen in dem Assay oder der Prozentsatz das funktionelle Rekonstitution der Vermittlung ist.

Die Rate von Iodid Flusses gibt die Anzahl der CFTR-Protein-Moleküle, die Öffnungswahrscheinlichkeit und einheitliche Leitfähigkeit jedes CFTR-Kanal. Daher sollte die Rate der Iodid Efflux abhängig von der Anzahl und der Offenwahrscheinlichkeit jedes CFTR Molekül sein. Die Vorhersage war in diesem System durch die Erhöhung der Anzahl der CFTR-Moleküle pro Liposom getestet. Das Verhältnis des aktivierten (phosphorylierten und MgATP behandelt) CFTR-Protein zu Lipid wurde variiert, wobei die Verhältnisse im Bereich von 1: 300-1: 3000 (w / w) (3A). Je größer die Menge des rekonstituierten CFTR in Proteoliposomen vorhanden, desto größer ist die Rate der Efflux (gemessen zwischen 1-2 min nach Zugabe Valinomycin), unterstützt die Vorhersage tHut Ausflussraten sind abhängig von der Anzahl der Moleküle in jeder CFTR Liposom. Die Ausflussgeschwindigkeit unter Verwendung spezifischen Protein: Lipid-Verhältnissen reproduzierbar zwischen experimentellen Tagen und Protein-Aufreinigung und damit Hervorhebung der Strenge dieser Methode.

Die Rate von Iodid Efflux scheint mit der Öffnungswahrscheinlichkeit des CFTR-Kanals in dieser rekonstituierten System beziehen. Da Phosphorylierung durch PKA für CFTR-Aktivierung 31 (und Überprüfung von 32) erforderlich ist, wird erwartet, dass es eine niedrige Rate von Iodid-Efflux in Vesikeln CFTR enthalten, die nicht durch exogene PKA-Behandlung, wo die offenen Wahrscheinlichkeit gering phosphoryliert worden ist . In Proteo, die PKA behandelt haben, wird der Öffnungswahrscheinlichkeit viel höher sein, was zu einer viel größeren erwarteten Rate von Efflux. In der Praxis werden für PKA behandelt CFTR in Anwesenheit von 1 mM MgATP in diesem System die Rate der Iodid Efflux nach Zugabe valinomyc gemessen von ein bis zwei Minutenin etwa das Vierfache der Rate der CFTR-Protein zu MgATP aber nicht PKA (3B) unterzogen. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass die Ausflussgeschwindigkeit beziehen sich auf die Offenwahrscheinlichkeit kanalisieren. In der Praxis kann es schwierig sein, in diesem Test zu vergleichen direkt fort Wahrscheinlichkeit gegeben, dass auch andere Faktoren wie die zeitabhängigen Veränderungen in der elektrochemischen Antriebskraft wird die beobachtete Ausflussaktivität beeinflussen öffnen. Die Leser werden darauf hingewiesen, dass dieser Test ist kein Ersatz für eine detaillierte Einzelkanalaktivität Aufnahmen.

Interessanterweise wird in der Regel in Gegenwart von MgATP, die signifikant größer als Efflux von Liposomen ohne CFTR (3B, C) ​​eingehalten wird eine niedrige Rate von Iodid-Efflux durch "nicht-phosphoryliertes" Proteins. Dieser niedrige Wert kann basale Phosphorylierung von CFTR im Sf 9-Zellen-Expressionssystem vor der Reinigung 33 zu reflektieren. CFTR anderer Ausdruck syste gereinigtms können unterschiedliche Ebenen der basalen Phosphorylierung und damit unterschiedliche Restaktivität.

Diese schnelle Reinigungsprotokoll Ausbeuten Wt-CFTR von Sf 9-Zellen bei nahezu Homogenität jedoch für F508del- und G551D-CFTR wird das Verfahren besser als Anreicherungsverfahren beschrieben. Einige verunreinigende Bänder werden über SDS-PAGE 19, von denen viele während CFTR-Abbauprodukte, die CFTR-Antikörper reaktiv sind und erscheinen, bevor Zellaufschluss anwesend sein beobachtet. Die Rekonstitution und Iodid Flussverfahren sind für diesen angereicherten Proben von klinisch relevanten Mutanten. (: Lipid-Gewichtsverhältnis von etwa 1: 600-Protein) und G551D-CFTR (Protein: Lipid-Verhältnis von ungefähr 1: 300), wie in 3D gezeigt, wird eine signifikante Iodid Efflux sowohl F508del- gemessen. Während beide Mutanten eine geringere absolute Wirksamkeit als Wt-CFTR (Protein: Lipid-Gewichtsverhältnis von 1: 1.200), ist es schwierig, die Proben direkt nach der Quantifizierung zu vergleichenkönnen nicht so genau für die Mutanten, die mit CFTR-Abbauprodukte verunreinigt werden können. Doch sowohl F508del-CFTR und G551D mit diesen Verfahren gereinigt, wieder hergestellt und unterzogen, um Auslaufmessungen reagieren, um Kleinmoleküle Potentiatoren (Abbildung 4) zu erwarten, und zeigen ähnliche Kanalfunktion zu Protein durch die strengeren PFO Reinigungsverfahren 19 gereinigt.

Die Kanalaktivität gereinigt und wiederhergestellt CFTR kann mit niedermolekularen Inhibitoren und Potentiatoren moduliert werden

CFTR inh -172 34 ist die spezifische CFTR-Inhibitor zur Verfügung, die gezeigt wurde, um die Öffnungswahrscheinlichkeit des CFTR Chloridkanäle in einzelnen Kanal Leitwertmessungen 35 zu hemmen und CFTR-Aktivität in anderen Studien 22,36 hemmen. Wie in 3C gezeigt, wird die Rate der Efflux nach Valinomycin hinaus signifikant durch Vorbehandlung mit CFTR inh vermindertem ub> -172. Daher ist dieser Test von der Kanalaktivität einer Population von gereinigten und rekonstituierten CFTR Moleküle wirksam Berichts Aktivität von Modulatoren wie die hemmenden Liga CFTR inh -172.

Der Test ist empfindlich und hoch für Untersuchung der Wirkungen von kleinen Molekül-Potentiator Behandlung sowie. Wie in 4 gezeigt, alle drei CFTR Genotypen getestet signifikant durch aktive kleine Molekül Potentiatoren wie potenziert Kalydeco / VX-770 oder VRT-532 (4C; für G551D gezeigt), während ein inaktives Analogon keine Wirkung auf die Jodid-Efflux Aktivität von CFTR (für F508del-CFTR gezeigt; 4B). Der Test ist für die Prüfung der Potentiator Konzentrationsabhängigkeit, und die Rolle von ATP und Phosphorylierung an Potentiator vermittelte CFTR-Aktivität.

27fig1highres.jpg "Breite =" 700px "/>
Abb. 1: Assay Design und Workflow (A) Arbeitsablauf für die in dieser Veröffentlichung beschriebenen Arbeit (B) Schematische Darstellung des Iodid Auslaufversuch.. Eine modifizierte Version des Panel B wurde ursprünglich in The Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; und Bär, CE Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Potentiator VX-770 (Ivacaftor) Öffnet das defekte Kanal Gate of Mutant CFTR in einer Phosphorylierung abhängige aber ATP unabhängig. 2012; 287: 36.639 bis 36.649. © Die amerikanische Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie.

Abbildung 2
Abb. 2: Das CFTR schnelle Reinigungsprozedur Erträge gereinigt Wt-CFTR-Protein Silber gefärbten SDS-PAGE-Gel und Western-Blot mit dem M3A7 CFTR Antikörper für gereinigtes humanes Wt-CFTR-Protein in DDM Waschmittel (1 ug und 0,1 ug für das Gel und Blot, respectively), isoliert aus Sf 9-Zellen-Überexpression eine (His) 10 -markierte Version das Protein. Wt-CFTR (> 90% ig) bei 150 kDa nachgewiesen, das für dieses Protein fehlt komplexe Glycosylierung geeignet. Diese Forschung wurde ursprünglich in The Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; und Bär, CE Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Potentiator VX-770 (Ivacaftor) Öffnet das defekte Kanal Gate of Mutant CFTR in einer Phosphorylierung abhängige aber ATP unabhängig. 2012; 287: 36.639 bis 36.649. © Die amerikanische Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie.

Figur 3
Abbildung 3: Die iodide Efflux-Assay Berichte geregelt Kanalaktivität für die gereinigte und wiederhergestellten CFTR-Protein. (A) gereinigtes und phosphorylierte Wt-CFTR rekonstituiert an Protein: Lipid-Verhältnissen von 1: 300 (w / w), 1: 1.200 (w / w) und 1: 3.000 (w / w) vermittelt Iodid-Efflux aus den Bläschen Lumen die Schütt Bad im Laufe der Zeit nach der Zugabe von 1 mM MgATP und 20 nM Valinomycin. Die Zugabe von 0,1% (w / v) Triton X-100, um die Proteo Meldungen eingeschlossen Iodid in das Vesikel Lumen am Ende des Experiments zu permeabilisieren. (B) Anfängliche Iodid Ausflußzeit Kurs rekonstituiert Wt-CFTR-Protein, die nicht gewesen vorphosphoryliert. (C) Anfängliche Iodid Ausflussraten zeigen die Abhängigkeit der beobachteten Aktivität auf funktionelle CFTR-Proteins. PKA Phosphorylierung des Proteins signifikante Kanalaktivität, die durch Zugabe des CFTR-Inhibitor inhibiert wird inh -172 (20 uM), die erforderlich, cTTR. Daten sind Mittelwerte ± SEM; * P <0,05, *** p <0,0001. (D) Mehrere Genotypen herzustellen geregelten CFTR-Signale in der Iodid-Efflux-Assay, einschließlich Wt, F508del- und G551D-CFTR gegenüber der Kontrolle. Daten sind Mittelwerte ± SEM; * P <0,05; *** P <0,0004 vs. Kontrolle. Diese Forschung (Teile von Daten in den Feldern A, C und D) wurde ursprünglich in The Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; und Bär, CE Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Potentiator VX-770 (Ivacaftor) Öffnet das defekte Kanal Gate of Mutant CFTR in einer Phosphorylierung abhängige aber ATP unabhängig. 2012; 287: 36.639 bis 36.649. © Die amerikanische Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie.

4
Abbildung 4: Die Phosphorylierung abhängige Potenzierung der CFTR durch kleine Moleküle können mit der abgefragt werdenIodid Effluxsystem für Wt, F508del- und G551D-CFTR. (A) Gew-CFTR wird massgeblich von der Potentiator VX-770 (10 uM) potenziert, nur in der PKA-phosphoryliert. Daten sind Mittelwerte ± SEM * p <0,01 vs. + PKA-VX-770. (B) VX-770 (10 & mgr; M), aber nicht ein inaktiver analog, V-09 bis 1188 (10 & mgr; M), signifikant die Iodid Efflux potenziert Aktivität phosphoryliert F508del-CFTR. Daten sind Mittelwerte ± SEM, n = 3 *** p <0,001 vs. -VX-770 Kontrolle. (C) Potenzierung der G551D-CFTR durch 10 uM VRT-532 oder VX-770. Daten sind Mittelwerte ± SEM, n = 5, ** p <0.001 *** p <0.0001 vs. -VX-770 Kontrolle. Diese Forschung (Platten ac) wurde ursprünglich in The Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; und Bär, CE Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Potentiator VX-770 (Ivacaftor) Öffnet das defekte Kanal Gate of Mutant CFTR in einer Phosphorylierung abhängige aber ATP unabhängig. 2012; 287: 36.639 bis 36.649. © Die amerikanische Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie.

r> ight "> 7.4
Puffer Name Inhalt pH Einstellen des pH mit
Puffer 1 2% fos Cholin 2% (w / v) fos Cholin 14 Detergens in 10 mM Imidazol, 25 mM HEPES 7.4 Imidazol / HEPES
Puffer 2 10 mM Imidazol 10 mM Imidazol, 25 mM HEPES (ohne Reinigungsmittel) 7.4 Imidazol / HEPES
Puffer 3 10 mM Imidazol + DDM 10 mM Imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM Dodecyl-β-D-maltosid 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 4 50 mM Imidazol + DDM 50 mM Imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM Dodecyl-β-D-maltosid 7.4 Imidazol / HEPES
Puffer 5 600 mM Imidazol + DDM 600 mM Imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM Dodecyl-β-D-maltosid 7.4 Imidazol / HEPES
Puffer 6 75 mM KI + DDM 75 mM KI, 20 mM MOPS, 1 mM Dodecyl-β-D-maltosid 7.4 KOH
Puffer 7 75 mM KI 75 mM KI, 20 mM MOPS 7.4 KOH
Puffer 8 25 mM HEPES + DDM 25 mM HEPES, 25 mM NaCl, 1 mM Dodecyl-β-D-maltosid 7.4 HCl / NaOH
Puffer 9 75 mM K-Glu 75 mM K-Glutamat, 20 mM MOPS KOH / Glutaminsäure
Puffer 10 15 mM KI 15 mM KI, 20 mM MOPS 7.4 KOH

Tabelle 1: Übersicht über die Puffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Es gab eine beschränkte Anzahl von Reinigungsprotokolle für Volllängen-funktionelle CFTR Isolierung war, aus einer Vielzahl von Zellexpression Systemen. Das hier beschriebene Verfahren ist vorteilhaft, da sie ermöglicht eine schnelle Reinigung von Wt-CFTR oder hohe Anreicherung von F508del- und G551D-CFTR in moderaten Mengen, die hochfunktionell in Assays einschließlich ATPase und direkte Messungen der Kanalfunktion, einschließlich Einzelkanalmessungen in planaren Doppelschicht Systeme und zeigte Maßnahmen CFTR Population Kanalfunktion, die von großer Bedeutung für die Untersuchung von kleinen Molekülen, 19-21. Das Reinigungsverfahren wird in eine schnelle und wirksame Rekonstitutionsprotokoll integriert, kann jedoch gereinigtes Protein von anderen Methoden zu diesem Rekonstitutionsprotokoll sowie gekoppelt werden, vorausgesetzt, dass die Reinigung Waschmittel ist in ähnlicher Weise zugänglich Entfernung.

Was kompliziert und mühsam Einzelkanal-Experimente von exc gegensierten Membranflecken, die hier beschriebenen Verfahren ermöglichen eine robuste und dennoch einfache Beurteilung der CFTR-Kanal-Funktion und individuell durch diese Maßnahme, berichtet die Funktion einer größeren Population von CFTR-Kanäle statt einem oder wenigen Molekülen. Im Gegensatz zu Verfahren, bei denen Membranflecken ermöglicht dieses Verfahren die direkte Bewertung der Wirkungen von Kleinmolekül-Modulatoren auf dem Kanal in der Nähe oder vollständige Abwesenheit von assoziierten Proteinen, abhängig von der Wirksamkeit des Reinigungsverfahrens verbunden.

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls

Obwohl es mehrere kritische Schritte in der funktionellen Rekonstitution CFTR für das Anion Flussassay, wie angegeben Noten in dem Protokoll, die Optimierung der Protein: Lipid-Verhältnis während CFTR Rekonstitution ist der Schlüssel. Eine derartige Optimierung für jeden CFTR Genotyp erforderlich.

Änderungen und Fehlerbehebung der Technik

Die Baseline-mV response für die Sonde während der Jodid-Efflux-Test mit den Proben, wie beschrieben, hergestellt wurde, verwendet hier typischerweise -20 bis -50 mV. Wesentliche Abweichungen von diesem Bereich vorschlagen, kann es zu Problemen mit der Probe. Andere Sonden verschiedener Hersteller verkauft werden, können von den Richtlinien hier abweichen. Wenn eine stabile Basislinie nicht erreicht werden kann, kann Restreinigungsmittel oder inaktiv, vergällt, schlechte Qualität Protein werden Permeabilisieren der Vesikel zu Iodid.

Das Fehlen einer signifikanten Änderung in der Rate der Valinomycin abhängigen Iodid Efflux von Liposomen, die phosphorylierte CFTR in Anwesenheit von MgATP können verschiedene Probleme, die alle untersucht werden müssen reflektieren detektieren. Zu diesen Problemen zählen: schlechte Qualität teildenaturierte CFTR oder unrein CFTR; unvollständige Entfernung des Reinigungsmittels während der Rekonstitution; nicht optimale Protein: Lipid-Verhältnis in Proteo; oder unzureichende Valinomycin hinzugefügt, wodurch Ladungsableitung unvollständig.

Das iodide Efflux-Assays bietet die Flexibilität, vorphosphoryliert CFTR-Protein (wie in dem Protokoll beschrieben) oder phosphorylierte CFTR während des Assays verwendet werden. Wenn der rekonstituierte Protein wurde nicht während des Reinigungsverfahrens phosphoryliert kann die Probe während der Jodid-Efflux Experiment im Schritt 3.2.7 phosphoryliert werden, durch Zugabe von PKA mit MgATP. In diesem Fall ist sicherzustellen, dass die Basislinie für mindestens 5 min aufgezeichnet, um sicherzustellen, dass das Protein wurde ausreichend durch die PKA Enzyms vor Meßfunktion unter Zusatz von Valinomycin phosphoryliert. Ähnliche Ergebnisse werden von beiden Verfahren erhalten.

Während des Protokolls wird der Modulator Molekül ermöglicht, mit dem CFTR-Protein, für 5 min zusammenwirken, bevor die Messung der Aktivität durch Zugabe von MgATP und Valinomycin. Da die meisten CFTR-Modulatoren sind sehr lipophile, kann es Zeit zwischen der Zugabe in das Bad und das Gleichgewicht Verbindung mit dem CFTR-Protein zu nehmen. Der Assay kann nicht ohne th fortzufahrene Zugabe von Valinomycin und somit keine Information durch Durchführung des Assays auf diese Weise verloren. In Situationen, in denen der Benutzer nicht darum, dass es eine Verzögerung, bevor Wechselwirkung der kleinen Moleküle mit dem Protein, könnte der Assay durch die Zugabe von akuten Modulator nach Zugabe von Valinomycin durchgeführt werden, während sie noch in der Anfangsrate Phase die Messung.

Grenzen der Technik

Wie bereits erwähnt, diese proteoliposomal Fluss basierter Assay regulierter Kanalaktivität von Einwohnern gereinigt und wiederhergestellt voller Länge CFTR-Moleküle eine einzigartige Methode für die Abfrage von Liganden, die direkt ändern Aktivität. Jedoch ist das Verfahren begrenzt, dass es nicht einen Einblick in den Mechanismus, durch den Liganden verändern die Geschwindigkeit des Flusses durch CFTR. Idealerweise sollte die proteoliposomal Fluss Assay gereinigt und rekonstituiert CFTR in Kombination mit ebenen Lippen verwendet werdenid-Doppelschicht-Studien einzelner Kanalaktivität. Diese Kombination würde Einblick in den Zustand des Proteins, die die Liganden bindet, zu schaffen, das heißt der offenen und / oder geschlossenen Zustand.

Bedeutung in Bezug auf bestehenden Methoden

Es besteht derzeit ein Mangel an Methoden zur Bewertung der direkten Interaktion von kleinen Molekülen mit dem CFTR-Kanal im Vergleich zu niedermolekularer Modulatoren, die mit einem anderen Zellbestandteil interagieren, um indirekt zu verändern Kanalaktivität, zum Beispiel durch eine modulierende oder Signalwegs oder Unterbrechung der wichtigen Protein-Protein- Wechselwirkungen. Das Iodid Efflux Verfahren demonstriert die direkte Interaktion mit dem Protein nach kleinen Molekülen, die die Kanalaktivität CFTR moduliert. Trotz des geringen Durch Weise der Messungen bestehen noch beträchtliche Wert in dieser einzigartigen Methoden zur Untersuchung der direkten Interaktion von CFTR mit kleinen Molekülen Potentiatoren und Korrektoren. Viele kleine moleculE-Modulatoren sind in der Entwicklung sowohl von akademischen Gruppen und der pharmazeutischen Industrie zu CF-Patienten klinisch zu behandeln, da dies der Hauptschub aktuellen CF-Forschung. Es wird erwartet, dass die hier beschriebenen Verfahren wird bei der Entwicklung und Validierung des Wirkmechanismus der vielversprechendste dieser Moleküle erleichtern.

Zukünftige Anwendungen der Technik

Die hier verwendeten Methoden sind auch sehr gut für andere Proteine ​​von Interesse Anpassung ist. Tat eine Modifikation der beschriebenen Verfahren wurde verwendet, um zwei P. studieren aeruginosa Membranproteinen in der Bewegung der anionische Substrate über der Membran 26,27 gebracht, was die Nützlichkeit und Vielseitigkeit dieser Methoden. Ihre Verwendung in der Studie von zusätzlichen Anionen-Kanäle und Transporter ist in der Zukunft erwartet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren danken den Rat von Dr. Mohabir Ramjeesingh während der Entwicklung der hier beschriebenen Reinigungsverfahren. Diese Studien wurden durch Betriebskostenzuschüsse zur CEB von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) und Cystic Fibrosis Canada (CFC) unterstützt. PDWE wurde teilweise durch Fellowship Awards durch den CIHR und CFC unterstützt. Die Autoren danken der Bereitstellung von Korrektor Potentiator und Inhibitor-Verbindungen von Dr. R. Bridges (Rosalind Universität für Medizin und Wissenschaft) sowie den Vertrieb durch die Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT). Die Autoren hervorragenden Service zu bestätigen auch von der Baylor Cell Culture Facility (NIH P30 CA125123) auszudrücken Wt und mutierten CFTR-Proteins unter Verwendung des Baculovirus-System. Die inaktive VX-770 analog, V-09 bis 1188, war ein Geschenk von Vertex Pharmaceuticals.

Acknowledgments

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fos-choline 14 detergent Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) F312 Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche (www.roche-applied-science.com) 04 693 132 001 EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack  Roche (www.roche-applied-science.com) 05 892 791 001
Ni-NTA Agarose Qaigen GmbH 1018240
Fisherbrand Screening columns Fisher Healthcare 11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K Millipore (www.millipore.com) UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840051C
POPC Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 850457C
PS, Porcine Brain Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840032C CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 841118C
Ergosterol Sigma (www.sigmaaldrich.com) 45480
Pierce Detergent removal spin column Thermo Scientific 87779 1 ml capacity columns
valinomycin Sigma (www.sigmaaldrich.com) V-0627
VX-770 (ivacaftor) Selleck Chemicals S1144
iodide selective microelectrode Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) LIS-146ICM  
 
 
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
Clampex 8.1 software Axon Instruments (www.axon.com) we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System  Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) LIS-146LICM-XS Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars Big Science Inc (www.stirbars.com) SBM-0502-CMB choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine GE Health Care (www.gelifesciences.com) 17-0042-01
Sonicator Laboratory Supplies Co, Inc. G112SP1G Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50, (1), 233-248 (2011).
  2. Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68, (4), 809-818 (1992).
  3. Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
  4. Genetic Analysis Consortium. http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
  5. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245, (4922), 1073-1080 (1989).
  6. Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2, (8), 1253-1261 (1993).
  7. Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148, (1-2), 164-274 (2012).
  8. Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148, (1-2), 150-163 (2012).
  9. Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419, (1-2), 41-60 (2012).
  10. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365, (18), 1663-1672 (2011).
  11. Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270, (28), 17033-17043 (1995).
  12. Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
  13. Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267, (36), 26142-26149 (1992).
  14. Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4, (2), 95-100 (1993).
  15. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327, (1), 17-21 (1997).
  16. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, (37), 39051-39057 (2004).
  17. Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
  18. Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
  19. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, (44), 36639-36649 (2012).
  20. Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54, (24), 8693-8701 (2011).
  21. Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21, (5), 666-678 (2014).
  22. Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78, (3), 411-418 (2010).
  23. Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8, (2), 153-171 (2009).
  24. Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418, (1), 185-190 (2009).
  25. Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3, (2), 119-121 (2004).
  26. Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (32), 13083-13088 (2011).
  27. Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4, (5), e00678-e00613 (2013).
  28. Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. Academic Press. 337-357 (2010).
  29. Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75, (6), 1430-1438 (2009).
  30. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387, (5), 1055-1060 (2009).
  31. Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268, (15), 11304-11311 (1993).
  32. Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
  33. Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271, (45), 28463-28468 (1996).
  34. Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110, (11), 1651-1658 (2002).
  35. Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136, (6), 659-671 (2010).
  36. Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89, (4), 417-425 (2004).
Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).More

Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter