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Biology

शुद्ध wildtype और उत्परिवर्ती CFTR प्रोटीन के कार्यात्मक पुनर्गठन और चैनल गतिविधि माप

doi: 10.3791/52427 Published: March 9, 2015

Summary

यहाँ वर्णित सिस्टिक फाइब्रोसिस में दोषपूर्ण है जो इस क्लोराइड चैनल के लिए गतिविधि को बरकरार रखता है कि शुद्ध जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती CFTR प्रोटीन के कार्यात्मक पुनर्गठन के लिए एक तेजी से और प्रभावी प्रक्रिया है। CFTR द्वारा मध्यस्थता का पुनर्गठन proteoliposomes से आयोडाइड तपका चैनल गतिविधि का अध्ययन और छोटे अणुओं के प्रभाव की अनुमति देता है।

Abstract

सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) ट्रांसपोर्टरों की कैसेट (एबीसी) superfamily बंधन एटीपी की एक अद्वितीय चैनल बनाने सदस्य है। CFTR के फास्फारिलीकरण और न्यूक्लियोटाइड निर्भर क्लोराइड चैनल गतिविधि अक्सर पूरे सेल प्रणाली में और excised झिल्ली पैच में एक चैनल के रूप में अध्ययन किया गया है। कई सिस्टिक फाइब्रोसिस के कारण म्यूटेशन इस गतिविधि को बदलने के लिए दिखाया गया है। शुद्धि प्रोटोकॉल की एक छोटी संख्या में प्रकाशित किया गया है, वहीं चैनल गतिविधि को बरकरार रखे हुए है कि एक तेजी से पुनर्गठन विधि और एक शुद्ध प्रणाली में जनसंख्या चैनल गतिविधि के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त विधि की कमी की गई है। यहां तेजी से तरीकों का एक विनियमित halide चैनल के रूप में गतिविधि को बरकरार रखे हुए है कि परिभाषित लिपिड रचना की proteoliposomes में शुद्धि और पूर्ण लंबाई CFTR प्रोटीन के कार्यात्मक पुनर्गठन के लिए वर्णित हैं। एक साथ चैनल गतिविधि का एक उपन्यास प्रवाह आधारित परख के साथ इस पुनर्गठन विधि के लिए एक उपयुक्त प्रणाली हैजंगली प्रकार CFTR की आबादी चैनल गुण और रोग के कारण म्यूटेंट F508del- और G551D-CFTR का अध्ययन। विशेष रूप से, विधि फास्फारिलीकरण, न्यूक्लियोटाइड और ऐसे CFTR चैनल गतिविधि पर potentiators और inhibitors के रूप में छोटे अणुओं का प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन करने में उपयोगिता है। तरीकों में भी ऋणात्मक substrates के लिए अन्य झिल्ली चैनल / ट्रांसपोर्टरों का अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी हैं।

Introduction

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फेफड़े, आंत, अग्न्याशय और पसीने की ग्रंथियों के रूप में इस तरह के ऊतकों में उपकला कोशिकाओं के शिखर झिल्ली भर में क्लोराइड परिवहन मुख्य रूप से एबीसी की सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR), एक ATP- और फास्फारिलीकरण विनियमित सदस्य (ATP- द्वारा मध्यस्थता है 1 में समीक्षा की झिल्ली प्रोटीन की कैसेट) सी उपप्रजाति () बाइंडिंग। ABCC उपपरिवार के अन्य सदस्यों की तरह, CFTR अपने न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी डोमेन के यह एक एकल में मामूली ATPase गतिविधि के पास जहां (NBDs), के इंटरफेस पर गठित दो न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी साइटों पर एटीपी बांधता है कि एक बड़े, बहु फैले अभिन्न झिल्ली प्रोटीन है साइट। हालांकि, अन्य ABCC उपपरिवार सदस्यों के विपरीत, CFTR एक अद्वितीय विनियमित सीएल चैनल के रूप में नहीं बल्कि एक सक्रिय घुला हुआ पदार्थ ट्रांसपोर्टर के रूप में विकसित किया गया है।

मोरबी के लिए अग्रणी CFTR कारण सिस्टिक फाइब्रोसिस, फेफड़ों, जठरांत्र संबंधी मार्ग, अग्नाशय और प्रजनन पथ सहित कई अंगों को प्रभावित करने के लिए एक रोग में उत्परिवर्तन,युवा वयस्कों में dity और मृत्यु दर। फेफड़ों की बीमारी आम तौर पर आयोजित करने एयरवेज की सतह उपकला पर CFTR समारोह के नुकसान के कारण होता है सिस्टिक फाइब्रोसिस में मृत्यु दर और ज्यादातर मामलों में खातों। रोमक श्वसन उपकला के शिखर सतह पर तरल पदार्थ की परत को संशोधित करने के लिए सतह उपकला भर में और पानी के आंदोलन - CFTR क्लोराइड चैनल गतिविधि की कमी के कारण दोनों एक सीएल में कमी का कारण बनता है। इस रोमक श्वसन उपकला कोशिकाओं की क्षमता impairs कि एक चिपचिपा airway के सतह तरल में परिणाम वायुमार्ग से बाहर प्रभावी ढंग से स्पष्ट रोगजनकों के लिए। एक परिणाम के रूप में, सबसे सीएफ रोगियों फेफड़ों के संक्रमण और सूजन की वजह से फेफड़ों को नुकसान की आवर्तक मुकाबलों से ग्रस्त हैं।

जैसी कि उम्मीद थी, सामान्य CFTR प्रोटीन की कार्रवाई के तंत्र के अध्ययन मुख्य रूप से अपने चैनल gating गतिविधि का विस्तृत electrophysiological पढ़ाई पर ध्यान केंद्रित किया। एक चैनल के अध्ययन के एक PKA निर्भर सीएल के रूप में सीधे कि CFTR कार्यों से पता चला है- एक एटीपी विनियमित गेट दो के पास जो चैनल। अध्ययन किया गया है कि किसी विशेष एक चैनल की विशेषताओं इसलिए पूरे CFTR चैनलों की आबादी और एक चैनल को प्रतिबिंबित करता है कि क्या करने के रूप में विस्तृत electrophysiological पढ़ाई एकल CFTR चैनलों 1,3 के बारे में जानकारी का एक बड़ा सौदा प्रदान करते हैं, हालांकि चिंता का विषय हो सकता है परिणाम हमेशा स्थूल जनसंख्या का अध्ययन करने के तरीकों के साथ-साथ विचार किया जाना चाहिए। शुद्ध CFTR की आबादी चैनल गतिविधि के प्रत्यक्ष परख रोग के कारण परिवर्तन के साथ जुड़े आणविक दोष में अंतर्दृष्टि प्रदान करने और रासायनिक modulators के जो मरम्मत उत्परिवर्ती CFTR प्रोटीन की खोज के लिए ड्राइव करने की क्षमता है। तिथि करने के लिए, सिस्टिक फाइब्रोसिस चार पैदा करने के बारे में सोचा CFTR में 1900 विभिन्न म्यूटेशन से अधिक कर रहे हैं। उत्तरी अमेरिका और यूरोप में रोगियों के लगभग 90% में कम से कम एक एलील पर पाया प्रमुख उत्परिवर्तन, F508del-CFTR, प्रोटीन एक misfolding की ओर जाता हैendoplasmic जालिका 5 में एन डी प्रतिधारण। F508del-CFTR भी दोषपूर्ण चैनल गतिविधि 6-9 सहित अन्य परिणाम है। कोशिका की सतह से CFTR की परिणामी अभाव गंभीर बीमारी के साथ जुड़ा हुआ है। G551D-CFTR, एक कम आम उत्परिवर्तन, ठीक से अभी तक मुड़ा कोशिका की सतह 6 बजे एक क्लोराइड चैनल के रूप में बेकार है माना जाता है। छोटे अणु correctors और potentiators के विकास क्रमशः, कोशिका की सतह पर जब वर्तमान तह और / या ऐसी कोशिका की सतह को F508del-CFTR के रूप में म्यूटेंट की तस्करी, और potentiating को सही या ऐसे G551D के रूप में म्यूटेशन के चैनल गतिविधियों में वृद्धि का लक्ष्य है । 150 मिलीग्राम सीएफ रोगियों> 6 साल में कम से कम एक G551D साथ में हर 12 घंटे में इस्तेमाल किया जा रहा है vx-770); correctors vx-809 और vx-661 (अभी तक रोगियों में उपयोग के लिए, potentiator Kalydeco (ivacaftor अनुमोदित नहीं कर रहे हैं -CFTR उत्परिवर्तन, और अधिक हाल ही में रोगियों के लिए G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255P से एक के साथऔर G1349D। Kalydeco सीएफ बीमारी 10 के नैदानिक ​​उपायों, इस छोटे अणु की कार्रवाई की लेकिन तंत्र खराब रोगियों में उपयोग के लिए एफडीए अनुमोदन के समय में समझ में आ गया था के सुधार में सुरक्षित और परिणाम दोनों है।

CFTR शुद्धि तरीकों में से एक मुट्ठी भर पहले से पूरा करने के लिए समय के एक काफी लंबाई की आवश्यकता होती है, जिनमें से कई 2,11-18, वर्णित किया गया है। हाल ही में एक प्रकाशन 19 में, एक अद्वितीय तेजी से शुद्धि और पुनर्गठन विधि एस एफ 9 सेल अभिव्यक्ति प्रणाली में overexpressed CFTR के लिए वर्णित किया गया था, और परिभाषित लिपिड प्रणालियों में इस शुद्ध प्रोटीन CFTR की आबादी के लिए एक CFTR halide चैनल गतिविधि परख विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था अणुओं। परख CFTR समारोह पर फास्फारिलीकरण, न्यूक्लियोटाइड और अवरोधकों के ज्ञात प्रभाव का स्मरण दिलाता है। प्रणाली potentiator के प्रभाव से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया गया था vx-770 / Kalydeco Wt- (जंगली प्रकार) पर, F508del- और G551D-CFTR और यह पहली बार के लिए दिखाया गया थादवा के लिए एक बड़ी आबादी के नजरिए से CFTR और न्यूक्लियोटाइड और छोटे अणुओं के साथ म्यूटेंट की बातचीत का अध्ययन करने के लिए इन तरीकों की उपयोगिता और प्रयोज्यता का प्रदर्शन, एक एटीपी स्वतंत्र तरीके से अपने चैनल गतिविधि शक्ति प्रदान करने के लिए CFTR प्रोटीन के साथ सीधे संपर्क रखता है कि समय प्रोटीन के बारे में नैदानिक ​​प्रासंगिक सवालों के जवाब। तरीकों में भी अन्य potentiator अणु और उनके डेरिवेटिव 20, साथ ही प्रोटीन 21 की गतिविधि पर एक छोटा सा अणु पढ़नेवाला के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

तपका assays के पहले से इलेक्ट्रोड, रेडियोधर्मी tracers और fluorophores 22,23 का उपयोग करते हुए पूरे सेल assays के, आयन चयनात्मक इलेक्ट्रोड 24 के साथ झिल्ली पुटिकाओं सहित CFTR म्यूटेंट की गतिविधि और अपनी गतिविधि पर CFTR-modulatory यौगिकों के प्रभाव की जांच करने के लिए कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है , और रेडियोधर्मी tracers 25 के साथ पुनर्गठन CFTR शुद्ध। हालांकि वेंशुद्ध पुनर्गठन CFTR अध्ययन करने के लिए आयन चयनात्मक इलेक्ट्रोड के ई का प्रयोग पहली बार हाल ही में 19 की सूचना मिली थी। वर्तमान पद्धति का एक रूपांतर पुनर्गठन और Pseudomonas aeruginosa, एक आम सीएफ रोगज़नक़ में दो झिल्ली प्रोटीन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया गया है। आयोडाइड तपका माप के साथ युग्मित शुद्ध ALGE बाहरी झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन के इस ट्रांसपोर्टर 26 के माध्यम से ऋणात्मक alginate स्राव के लिए एक मॉडल का समर्थन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। पुनर्गठन और आयोडाइड तपका माप एक मॉडल के इस प्रोटीन 27 से बैक्टीरियल भीतरी झिल्ली में लिपिड से जुड़े oligosaccharide स्थानान्तरण के लिए एक एच + निर्भर antiport तंत्र से पता चलता है कि प्रस्तावित किए जाने की अनुमति दी है जो विशुद्ध Wzx प्रोटीन, के लिए लागू किया गया था। एक एक देशी सब्सट्रेट के लिए उम्मीद कर सकते हैं की तुलना में दोनों ही मामलों में आयोडाइड कम throughput पर यद्यपि, anionic सब्सट्रेट के लिए एक किराए के रूप में इस्तेमाल किया गया था। विधि ग के साथ अन्य प्रोटीन के लिए अनुकूलन के लिए उपयुक्त हो सकता हैऋणात्मक substrates के लिए ationic परिवहन या चालन रास्ते।

यहाँ एक तेजी से शुद्धिकरण प्रक्रिया CFTR प्रोटीन और परिभाषित लिपिड की proteoliposomes में इसके पुनर्गठन के लिए वर्णित है। तेजी से पुनर्गठन की प्रक्रिया को आसानी से शुद्धि में इस्तेमाल डिटर्जेंट के प्रकार यहां इस्तेमाल किया तरीकों से हटाने के लिए उत्तरदायी है या पुनर्गठन प्रक्रिया से पहले एक उपयुक्त डिटर्जेंट के लिए विमर्श किया जा सकता है, बशर्ते कि अन्य विधियों के द्वारा शुद्ध CFTR के साथ प्रयोग के लिए सिलवाया जा सकता है। शुद्ध और पुनर्गठन CFTR प्रोटीन का चैनल गतिविधि की माप के लिए आयोडाइड तपका विधि विस्तार से वर्णन किया गया है और इस विधि से प्राप्त किया जा सकता है कि कुछ खास परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं।

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Protocol

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CFTR 1. शुद्धीकरण

नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त उपकरण और सामग्री की एक सूची के लिए सामग्री की तालिका और उपकरण देखें। एक विस्तृत प्रोटोकॉल एस एफ 9-baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली 17,28 में मानव WT-CFTR की overexpression और म्यूटेंट के लिए मौजूद है। CFTR overexpress और इस प्रोटोकॉल के अनुसार एस एफ 9 कोशिकाओं के छर्रों तैयार करते हैं।

  1. क्रूड झिल्ली तैयारी
    1. एक ताजा प्राप्त या मानक सेल संस्कृति तरीकों से बड़े हो गए, पर व्यक्त एक सी टर्मिनल उनकी 10 -tag साथ wildtype-, F508del-, या G551D-CFTR प्रोटीन कोशिकाओं की एक 500 मिलीलीटर संस्कृति से एक जमे हुए एस एफ 9 सेल गोली पिघलना, के रूप में पहले 17,28 का वर्णन किया। सेल छर्रों लगभग 5 मिलीलीटर की मात्रा और लगभग 5 ग्राम की एक गीला वजन होगा।
    2. Resuspend एस एफ सुनिश्चित करने के 4 डिग्री सेल्सियस पर protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल के साथ फॉस्फेट बफर खारा के 20 मिलीलीटर (पीबीएस) 7.4 पीएच (1 गोली 50 प्रति मिलीलीटर) में 9 कोशिकाओं,नमूना नेत्रहीन सजातीय प्रतीत होता है और कोशिकाओं का कोई गुच्छों रहते हैं।
    3. पारित होने के प्रति दो मिनट के लिए 10,000 साई (अधिमानतः 15,000-20,000 साई) की एक न्यूनतम पहुँचने के बाद, उच्च दबाव सेल Disruptor (सामग्री और उपकरणों के टेबल) का उपयोग Lyse कोशिकाओं। सेल के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना रखें।
      1. फिर तुरंत सेल Disruptor में नमूना फिर से लोड सेल अवधि के बाद बर्फ पर एक ट्यूब में नमूना ले लीजिए। दोहराएँ सेल प्रक्रिया तीन बार। कम से कम 10% बरकरार रहेगा सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें।
        नोट: इस तरह के आदि कांच के मोती, के रूप में अन्य तरीकों lyse करने के लिए कोशिकाओं, कड़ाई से हालांकि एक उपयोगकर्ता एक ऐसी वैकल्पिक विधि उपयुक्त मिल सकता है, इस प्रणाली के लिए जांच नहीं की गई है।
    4. 20 मिनट के लिए 2000 XG पर एक उच्च गति अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र सेल सामग्री। सतह पर तैरनेवाला लीजिए और गोली के निपटान के। 20 ट्यूबों के बीच सतह पर तैरनेवाला फूट डालो और ultracen एक तालिका के शीर्ष में 125,000 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए नमूने अपकेंद्रित्रtrifuge।
    5. निकालें और उपयोग करें जब तक कम से कम दो महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एक ही ट्यूबों में गोली, और दुकान छर्रों परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, या बर्फ पर बनाए रखने और तुरंत शुद्धि के साथ जारी है।
  2. CFTR solubilization
    1. 1-4 ताजा या फ्रोजन एस एफ 9 कच्चे तेल की झिल्ली छर्रों प्राप्त करें और बफर 1 के 1 मिलीलीटर में प्रत्येक resuspend (2% FOS -choline; पूरा नुस्खा के लिए 1 टेबल देखें) बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर, एक 25 जी सुई और 1 का उपयोग समाधान जब तक मिलीलीटर सिरिंज दिखाई दे कोशिका झिल्ली गुच्छों के बिना आंखों से सजातीय है। एक से अधिक गोली solubilized किया जा रहा है, कदम 1.3.2 पर नमूने पूलिंग, समानांतर में नीचे एक भी गोली के लिए निर्देशों के अनुसार प्रत्येक नमूने का इलाज जारी है।
    2. एक बफर 2 मिलीलीटर में एक मिनी protease अवरोध करनेवाला गोली भंग (10 मिमी imidazole, 1 टेबल देखें) FOS -choline 14 डिटर्जेंट का अभाव है, जो (प्रोटीज इनहिबिटर्स 10x अधिक एकाग्रता हैंइस बिंदु पर उनकी सिफारिश कमजोर पड़ने से मूल्यांकन) और resuspended कच्चे तेल की झिल्ली गोली 100 μl (प्रोटीज इनहिबिटर्स इस बिंदु पर उनकी सिफारिश कमजोर पड़ने पर कर रहे हैं) जोड़ें। उलटा द्वारा 5 बार हर 5 मिनट के मिश्रण के साथ 45-60 मिनट के लिए बर्फ पर सेट करें।
    3. अपकेंद्रित्र 125,000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए एक तालिका के शीर्ष ultracentrifuge में कच्चे तेल की झिल्ली गोली resuspended। Solubilized CFTR शामिल है जो सतह पर तैरनेवाला बनाए रखने और गोली त्यागें।
  3. कॉलम बंधन, फास्फारिलीकरण और क्षालन
    1. निकल NTA (nitrilotriacetic एसिड) agarose घोल या बफर 2 में से 1 मिलीलीटर के साथ बराबर राल के 400 μl धो (10 मिमी imidazole, 1 टेबल देखें) डिटर्जेंट का अभाव है, जो विलायक हटाने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर करने के लिए। दोहराएँ धोने दो बार और अधिक।
    2. (10 मिमी imidazole, 1 टेबल देखें) बफर 2 के साथ 10 मिलीलीटर की कुल करने के solubilized CFTR, शेष protease अवरोध करनेवाला (900 μl) और निकल राल (400 μl घोल से) गठबंधन Which किसी भी जोड़ा डिटर्जेंट का अभाव है। FOS -choline 14 एकाग्रता को प्रभावी ढंग से (w / v) के इस कदम पर 0.2% करने के लिए पतला है। कई ट्यूबों कर रहे हैं, solubilized CFTR, प्रोटीज इनहिबिटर्स, निकल NTA राल और 0.2% से युक्त सभी नमूनों पूल (w / v) FOS -choline-14 में इस बिंदु पर। कोमल झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. एक छोटी सी स्क्रीनिंग स्तंभ (तालिका 1) या समकक्ष खाली कॉलम CFTR-protease अवरोध करनेवाला निकल NTA के समाधान के नीचे से गुजरती हैं।
    4. बफर 3 की प्रारंभिक गोली प्रति 4 मिलीलीटर के साथ, कॉलम में बनाए रखा है जो निकल NTA राल, धो (10 मिमी imidazole + DDM, 1 टेबल देखें) FOS -choline 14 का अभाव है, लेकिन 1 मिमी DDM (dodecyl maltoside डिटर्जेंट) शामिल है, जो 4 डिग्री सेल्सियस पर। DDM डिटर्जेंट के अलावा महत्वपूर्ण इस बफर का पीएच को बदल नहीं है।
    5. 2500 प्रोटीन काइनेज ए, उत्प्रेरक सबयूनिट शिविर निर्भर यू (पी 25 μl MgATP की (5 मिमी, अंतिम एकाग्रता), जोड़कर PKA-MgATP समाधान तैयारटेबल देखें 1) स्तंभ के लिए; बफर 3 (10 मिमी imidazole + DDM के 475 μl को के.ए.)। एक टोपी या Parafilm के साथ स्तंभ के नीचे अंत सील, और उपयोग प्रत्येक प्रारंभिक गोली के लिए PKA-MgATP समाधान के 500 μl जोड़कर प्रोटीन Phosphorylate।
    6. PKA निकल NTA राल की पूरी सतह के साथ संपर्क में आ गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए कोमल मिश्रण और 1 मिलीलीटर pipettor का हर 2 मिनट का उपयोग कर राल के मेजबान के साथ 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (20 डिग्री सेल्सियस) पर सेते हैं।
    7. टोपी निकालें और स्तंभ से PKA / MgATP समाधान elute। बफर 3 में से 2 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धो (10 मिमी imidazole + DDM, 1 टेबल देखें) 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    8. अनुमति देने के लिए, स्तंभ के लिए बफर के 4 मिलीलीटर जोड़कर, 4 डिग्री सेल्सियस पर, (देखें तालिका 1 50 मिमी imidazole + DDM) बफर 4 मिलीलीटर की इस संख्या के साथ 4. धो स्तंभ द्वारा प्रयोग में इस्तेमाल छर्रों की संख्या बढ़ यह स्तंभ के लिए अगले 4 मिलीलीटर विभाज्य जोड़ने के माध्यम से और तुरंत प्रवाह करने के लिए।
    9. तालिका 1) से गुजर रहा प्रोटीन स्तंभ शुष्क करने की अनुमति देने के लिए एक ठहराव के बिना एक समय में, स्तंभ के माध्यम से 1 मिलीलीटर इस्तेमाल किया प्रारंभिक गोली प्रति 4 डिग्री सेल्सियस पर, और एक एकल ट्यूब में शुद्ध CFTR युक्त पूरे eluate इकट्ठा।
    10. 10 एमएल बफर 6 के कुल में, इस तरह की सामग्री और उपकरण या अन्य इसी तरह के डिवाइस की तालिका में वर्णित के रूप में (100,000 आणविक वजन कट ऑफ) एक अपकेंद्रित्र फिल्टर डिवाइस का उपयोग imidazole और कम आणविक भार गिरावट उत्पादों को दूर करने के लिए प्रोटीन नमूना ध्यान लगाओ (75 मिमी केआई + DDM, 1 टेबल देखें 2000 XG पर centrifuging द्वारा,) और के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, (इस तरह के गैर-आयोडाइड तपका प्रयोगों के लिए बफर 7, 25 मिमी HEPES + DDM के रूप में 1 टेबल) या 1 मिमी DDM युक्त पसंद के अन्य बफर देखना नमूना तक के बारे में 20 मिनट के 200 μl के लिए केंद्रित है। 10 एमएल के लिए नमूना पतला और एकाग्रता कदम दोहराएँ।
      नोट: हमारे अनुभव में (अप्रकाशित), imidazole काफी inhiCFTR की ATPase गतिविधि बिट्स और नमूना कार्यात्मक मापन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा अगर कम से कम दो बार कमजोर पड़ने और एकाग्रता से इस कदम पर हटाया जाना चाहिए।
    11. केंद्रित शुद्ध CFTR लीजिए। 1-2 दिनों के भीतर उपयोग करें जब तक DDM बफर की उपस्थिति में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें या पुनर्गठन कदम को तुरंत पर जारी है। हम कम गतिविधि का निरीक्षण हमारे अनुभव के रूप में, शुद्ध प्रोटीन फ्रीज नहीं है।

CFTR 2. पुनर्गठन

  1. लिपिड तैयारी
    नोट: CFTR सफलतापूर्वक अंडा पीसी, POPC में दो पुनर्गठन किया गया है: 1 अंडा पीसी (डब्ल्यू / डब्ल्यू): POPC (1: 1 डब्ल्यू / डब्ल्यू) मिश्रण, या पीई का एक मिश्रण: पुनश्च: पीसी: ergosterol, 5: 2 : 2: 1 (डब्ल्यू / डब्ल्यू)।
    1. आयोडाइड तपका प्रयोगों, सूखी अंडा पीसी की 5 मिलीग्राम के लिए एक pyrex या अन्य मजबूत (गैर borosilicate में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए आर्गन गैस की एक धारा के तहत (25 मिलीग्राम / एमएल शेयर के 200 μl, सामग्री और उपकरण की तालिका देखें) ) ग्लास ट्यूब।
    2. 280 एनएम पर absorbance का उपयोग करना, एक एलिसा एकssay या अन्य विधि, शुद्ध CFTR प्रोटीन नमूना की एकाग्रता का अनुमान है। एक के लिपिड अनुपात: 300-1: 3000 एक पर्याप्त संकेत के उत्पादन के लिए (डब्ल्यू / डब्ल्यू) wildtype CFTR साथ आयोडाइड तपका प्रयोगों के लिए, एक प्रोटीन का उपयोग करें। तपका गतिविधि का पता लगाने के क्रम में 1200 (डब्ल्यू / डब्ल्यू): 200-1: लगभग 1 के लिपिड अनुपात: G551D- और F508del-CFTR के लिए, एक प्रोटीन का उपयोग करें।
    3. एक विशेष प्रणाली के लिए लिपिड अनुपात: प्रोटीन का अनुकूलन। आवश्यक शुद्ध प्रोटीन की मात्रा की गणना। = बफर की मात्रा (प्रोटीन की आवश्यकता समाधान की मात्रा) - 1 मिलीलीटर, यानी, 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा बनाने के लिए आवश्यक 1 मिमी DDM साथ बफर की मात्रा की गणना।
      1. सूखे लिपिड के लिए 1 मिमी DDM के साथ वांछित बफर सिस्टम की गणना की मात्रा में जोड़ें (लेकिन इस समय CFTR प्रोटीन जोड़ नहीं है) और Parafilm के साथ ग्लास ट्यूब को कवर किया। आयोडाइड तपका प्रयोगों के लिए, बफर 6 में लिपिड resuspend (75 मिमी केआई + DDM, 1 टेबल देखें)। अन्य प्रयोगों बफर 8 में resuspend के लिए (25 मिमी HEPES + DDM, देखेंतालिका 1) या 1 मिमी DDM युक्त एक और वांछित आंतरिक बफर।
      2. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए भंवर DDM बफर में लिपिड के निलंबन में सहायता करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, vortexing के पहले 1-2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए नमूना गर्मी।
    4. कोई लिपिड फिल्म ट्यूब के पक्षों पर दिखाई देता है जब तक एक 1 मिलीलीटर सिरिंज और 25 जी सुई के साथ कमरे के तापमान पर बार बार लिपिड निलंबित। ठीक बुलबुले का उत्पादन और आयोडाइड और लिपिड ऑक्सीकरण में सहायता करेगा जो समाधान में हवा इंजेक्शन लगाने से बचें।
    5. Parafilm में निलंबित कर दिया लिपिड एक स्नान sonicator युक्त बर्फ में एक 20 सेकंड फट के लिए ट्यूब कवर Sonicate, और फिर एक मिनट के लिए बर्फ को तुरंत हस्तांतरण। तीन बार दोहराएँ।
      नोट: तीव्र sonication के ऑक्सीकरण के कारण पीला आयोडाइड समाधान हो जाता है। इसलिए अत्यधिक sonication के बचने। रंग में परिवर्तन के लिए नमूना मॉनिटर। एक रंग परिवर्तन का उल्लेख किया जाता है, तो नमूना त्यागने और फिर से तैयार करते हैं। कारण से कुछ का ऑक्सीकरण के रंग में परिवर्तनआयोडाइड ही परिस्थितियों में लिपिड ऑक्सीकरण में नतीजा होगा। समाधान sonicating पहले आर्गन गैस के साथ ट्यूब से हवा विस्थापित लिपिड और आयोडाइड के ऑक्सीकरण रोकने में मदद मिलेगी। तीव्र sonication के खराब गुणवत्ता या नमूना के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप खरोंच ग्लास ट्यूब तोड़ सकते हैं।
    6. 1 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा को प्राप्त करने के लिए एक sonicated लिपिड नमूना करने के लिए कदम 2.1.3 में गणना की शुद्ध CFTR की मात्रा में शामिल करें। एक 25 जी सुई और 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ मेजबान द्वारा 10 बार लिपिड और डिटर्जेंट समाधान के साथ प्रोटीन मिलाएं।
    7. ट्यूब के घूमता के साथ 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेट लिपिड और प्रोटीन नमूना 5 बार हर 5 मिनट के मिश्रण करने के लिए।
  2. डिटर्जेंट बाध्यकारी स्तंभ तैयारी
    1. 1 मिलीलीटर मात्रा क्षमता के साथ एक एकल उपयोग वाणिज्यिक डिटर्जेंट बाध्यकारी स्पिन स्तंभ (सामग्री और उपकरण की तालिका देखें) प्राप्त करें और स्तंभ बह शुरू करने के लिए नीचे टैब को तोड़ने।
    2. भंडारण ख दूर करने के लिए 2000 XG पर 2 मिनट के लिए स्तंभ अपकेंद्रित्रuffer, और इस बफर त्यागें।
    3. बफर 7 में से 5 मिलीलीटर जोड़ें स्तंभ के लिए (75 मिमी केआई, 1 टेबल देखें) और फिर धो बफर elute करने के लिए 4 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र। भंडारण बफर के सभी निशान को हटाने के लिए तीन washes के एक कुल के लिए इस चरण दो से अधिक बार दोहराएँ। सभी प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
      नोट: यह स्तंभ धोने के लिए इस्तेमाल बफर DDM या किसी भी अन्य डिटर्जेंट शामिल नहीं है कि महत्वपूर्ण है। स्तंभ डिटर्जेंट के लिए एक परिमित बाध्यकारी क्षमता है और डिटर्जेंट युक्त एक बफर प्रयोग किया जाता है, तो स्तंभ प्रोटीन लिपिड डिटर्जेंट नमूना से डिटर्जेंट को दूर करने में अप्रभावी हो जाएगा।
    4. ध्यान स्तंभ राल के शीर्ष पर लिपिड डिटर्जेंट प्रोटीन नमूना के सभी एक एमएल विभाज्य और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए स्तंभ के शीर्ष पर नमूना सेते हैं।
    5. 2000 XG पर 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना अपकेंद्रित्र और एक साफ 1.5 या 2 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में बादल छाए रहेंगे proteoliposome नमूना या एक ग्लास ट्यूब इकट्ठा करने और सैम जगहबर्फ पर मिसाल।
    6. स्तंभ के ऊपर से 200 बफर 7 की μl (75 मिमी केआई, 1 टेबल) या (डिटर्जेंट के बिना) अन्य बफर जोड़कर कॉलम में शेष proteoliposomes लीजिए और 2 मिनट के लिए centrifugation कदम दोहराएँ।
    7. यह बादल लग रहा है अगर proteoliposome नमूना करने के लिए दूसरा eluate जोड़ें।
    8. रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना दुकान या आयोडाइड तपका मापन के लिए तुरंत उपयोग करें।

शुद्ध, पुनर्गठन CFTR के लिए 3. आयोडाइड तपका माप

  1. Proteoliposomal झिल्ली भर में एक आयोडाइड ढाल का सृजन
    1. बफर 9 में प्री-फूल Sephadex G50 के मोती, (लगभग 5 ग्राम सूखे मोती 50 मिलीलीटर बफर में) या वांछित बाहरी बफर कमरे के तापमान पर कम से कम दो घंटे के लिए या 4 में, (75 मिमी कश्मीर ग्लू पोटेशियम ग्लूटामेट, 1 टेबल देखें) रातोंरात सी °।
    2. बफर 9 में संतृप्त 4 Sephadex G50 के स्तंभों को तैयार है या अन्य (75 मिमी कश्मीर ग्लू, 1 टेबल देखें)¾ करने के लिए कम से कम कॉलम में पूर्ण राल लोड करके छोटे स्क्रीनिंग कॉलम में बफर।
    3. राल से अतिरिक्त बफर दूर करने के लिए 2000 XG पर 4 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। Centrifugation कदम के अंत में स्तंभ में पैक हाइड्रेटेड राल के लगभग 2.25 मिलीग्राम होना चाहिए।
      नोट: राल हल्के से हाइड्रेटेड लेकिन तरल में डूब और बाद में एक संक्षिप्त स्पिन बफर के महत्वपूर्ण संस्करणों elute नहीं करना चाहिए नहीं किया जाना चाहिए। यह स्तंभ राल न तो बहुत गीला और न ही बहुत शुष्क और उपयोगकर्ता सबसे सफल बफर विनिमय शर्तों के साथ परिचित बनने के लिए कॉलम के साथ प्रयोग करने के लिए आवश्यकता हो सकती है कि proteoliposome नमूना के सफल क्षालन के लिए महत्वपूर्ण है।
    4. ध्यान से 2000 x जी पर 4 मिनट के लिए प्रत्येक स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज के शीर्ष करने के proteoliposome नमूने के 125-150 μl जोड़ें।
    5. पूल proteoliposome आयोडाइड तपका या अन्य प्रयोगों में तत्काल उपयोग के लिए एक साथ eluates।
      नोट: प्रत्येक स्तंभ से eluted मात्रा मोटे तौर पर होना चाहिए150 μl और नमूना कुछ हद तक बादल छाए रहेंगे, लेकिन मूल नमूना की तुलना में कम से बादल छाए रहेंगे होना चाहिए। बड़ी मात्रा या स्पष्ट eluates कॉलम पर्याप्त सूख नहीं किया गया है, या बहुत ज्यादा क्रमश: सूख गया है, और एक सफल आयोडाइड तपका प्रयोग में परिणाम नहीं होगा कि सलाह देते हैं।
  2. आयोडाइड तपका परख
    1. बड़े पैमाने पर de-ionized पानी के साथ (सामग्री और उपकरणों के तालिका) एक आयोडाइड चयनात्मक सूक्ष्म इलेक्ट्रोड धो लें, और फिर बफर 10 में प्रयोग से पहले 20 मिनट के लिए सेते (15 माइक्रोन केआई, 1 टेबल देखें)। De-ionized पानी के साथ फिर से बड़े पैमाने पर इलेक्ट्रोड धो लें।
    2. बफर 9 में (परख में 10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता का उत्पादन करने के लिए 20 माइक्रोन ठेठ एकाग्रता) दवा के 150 μl जोड़ें एक 96 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से करने के लिए बफर 9 में या वाहन (75 मिमी कश्मीर ग्लू, 1 टेबल देखें) एक छोटे पिस्सू हलचल पट्टी के साथ।
      1. वर्तमान कोई बुलबुले हैं कि सुनिश्चित करें। आवारा दूर करने के लिए एक विंदुक टिप का उपयोग करेंबुलबुले। एक दवा समाधान किया जा रहा है, तो कुएं में अंतिम DMSO के एकाग्रता ((आम तौर पर 0.1-0.2% वी / वी)) 1% से कम (वी / वी) है कि सुनिश्चित करते हैं।
    3. बफर 9 में धारा 3.1 में निर्मित किया गया था कि पुनर्गठन CFTR प्रोटीन के 150 μl जोड़ें थाली के कुएं में 300 μl की कुल मात्रा का उत्पादन करने के लिए, दवा या बफर के साथ अच्छी तरह से करने के लिए (75 मिमी कश्मीर ग्लू, 1 टेबल देखें)।
    4. एक हलचल प्लेट पर 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और 130 rpm पर (या लगभग एक चौथाई अधिकतम गति के एक मध्यम गति पर) हलचल।
    5. ध्यान से टिप अच्छी तरह से नीचे छू नहीं है या हलचल पट्टी द्वारा मारा जा रहा है कि इस तरह के नमूने के साथ कुएं में आयोडाइड चयनात्मक इलेक्ट्रोड की नोक डालें। संदर्भ इलेक्ट्रोड, अलग हैं, तो अच्छी तरह से समाधान के साथ संपर्क में भी है कि सुनिश्चित करें।
    6. इलेक्ट्रोड के साथ इंटरफेस है कि एक घर बनाया या वाणिज्यिक कंप्यूटर प्रोग्राम का उपयोग कर रिकॉर्ड ट्रेसिंग (विवरण के लिए सामग्री की मेज और उपकरण देखें)।एक कम पास फिल्टर के माध्यम से संकेत के फिल्टर के साथ 2 हर्ट्ज का एक नमूना दर, का प्रयोग करें।
    7. नमूना जबकि रिकॉर्डिंग एक फ्लैट स्थिर, या निकट फ्लैट आधारभूत निर्माण करने के लिए 5 मिनट के लिए संतुलित करने की अनुमति दें।
    8. 3 μl MgATP (KOH के साथ DH 2 हे में तैयार किया और पीएच 7 के लिए समायोजित 100 मिमी स्टॉक, 1 मिमी अंतिम एकाग्रता) जोड़ें नमूना करने के लिए प्रोटीन सक्रिय करने के लिए। ~ 5 मिनट के लिए एक नया स्थिर आधारभूत तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं। हमेशा बाहरी बफर के पीएच में परिवर्तन से बचने के लिए उपयोग करने से पहले तटस्थ करने के लिए 100 मिमी MgATP स्टॉक का पीएच को समायोजित करें।
    9. CFTR के माध्यम से आयोडाइड चयनात्मक प्रवाहकत्त्व द्वारा उत्पन्न संभावित अंतर में बदलाव के अलग धकेलना करने के लिए नमूने के लिए, (20 एनएम अंतिम एकाग्रता 2 माइक्रोन) शेयर valinomycin के 3 μl जोड़ें। कम से कम 5 मिनट के लिए कारण CFTR की मध्यस्थता आयोडाइड तपका गतिविधि के घटते ढलान (एम वी में कमी) रिकॉर्ड।
    10. , Proteoliposome लुमेन में आयोडाइड का फँसाने के लिए पर्याप्त था कि यह सुनिश्चित 10% के 3 μl जोड़ने के लिए (वी / वी) ट्राइटन X-100 नमूने के लिए। Significanटी और तत्काल आयोडाइड रिहाई पर्याप्त आयोडाइड फँसाने 3.2.9 में निर्धारित ढलान में परिवर्तन बल्कि CFTR की मध्यस्थता गतिविधि के लिए सीमित कारक नहीं था कि इस तरह की पुटिकाओं में फंस गया है कि इंगित करता है।
    11. इन अभिकर्मकों के सभी निशान अगले नमूना के प्रदूषण से बचने के लिए हटा दिया गया है सुनिश्चित करने के लिए दवा के साथ या ट्राइटन X-100 के साथ नमूनों की उपचार के बाद de-ionized पानी के साथ अच्छी तरह से इलेक्ट्रोड और हलचल बार धोएं।
    12. बफर में nanomolar सीमा से 9 तक की micromolar में पतला केआई सांद्रता की एक श्रृंखला तैयार (कश्मीर ग्लू बफर, 1 टेबल देखें)। तैयार सर्वोच्च एकाग्रता के लिए 0 से प्रत्येक एकाग्रता के लिए इलेक्ट्रोड के एम वी प्रतिक्रिया रिकार्ड। जांच प्रतिक्रिया (एम वी) दाढ़ आयोडाइड एकाग्रता के प्रवेश बनाम साजिश रची है, जहां एक मानक वक्र का निर्माण। जारी की आयोडाइड की एकाग्रता के लिए तपका प्रयोग के दौरान जांच के एम वी प्रतिक्रिया कन्वर्ट करने के लिए मानक वक्र का प्रयोग करें।
      नोट: एक अंशांकन मौजूदा तैयार करेंएक उपयोगकर्ता के बारे में सुनिश्चित होने तक एक साप्ताहिक आधार पर किया है कि कैसे जल्दी से जांच परिवर्तन की प्रतिक्रिया। समय के साथ जांच की प्रतिक्रिया और संवेदनशीलता में एक बहाव हो जाएगा। जांच उम्र के रूप में, प्रतिक्रिया नीचा दिखाना होगा। यह आंशिक रूप से समय-समय पर आंतरिक समाधान बदल रहा है और उपयोग के बाद पानी में जांच टिप के व्यापक धोने, जांच की सतह के लिए अणुओं की जो संभावना सीमा पालन द्वारा निराकृत किया जा सकता है।
    13. MgATP के अलावा पहले पिछले 30 सेकंड के लिए प्रत्येक proteoliposome नमूने के लिए समय की साजिश बनाम एकाग्रता की लाइन की औसत ढलान का निर्धारण करते हैं, और valinomycin के अलावा के बाद लेकिन ट्राइटन X-100 के अलावा पहले। कि नमूने के लिए CFTR की मध्यस्थता आयोडाइड तपका गतिविधि का निर्धारण करने के लिए valinomycin से आधारभूत ढलान घटाना।

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इस प्रश्न के लिखित प्रकाशन में वर्णित है, शुद्ध पुनर्गठित और CFTR प्रोटीन की विनियमित चैनल गतिविधि को मापने के लिए तरीके हैं। 1A शुद्धि, पुनर्गठन और आयोडाइड तपका प्रक्रियाओं के लिए कार्यप्रवाह पता चलता है। आयोडाइड फ्लक्स द्वारा पुनर्गठन और चैनल गतिविधि माप के लिए तरीके भी जुड़े वीडियो में आगे विस्तार में दिखाए जाते हैं।

Proteoliposomes में CFTR की शुद्धि और पुनर्गठन

CFTR कार्यात्मक एस एफ में उच्च स्तर पर Wt या उत्परिवर्ती CFTR सीडीएनए दो युक्त पुनः संयोजक baculovirus का उपयोग करते हुए 9 कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है। नहीं एक स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली, वहीं CFTR अभिव्यक्ति का एक उच्च स्तर को सुनिश्चित करने के लिए एस एफ में 9 कोशिकाओं baculovirus प्रणाली का उपयोग करते हुए व्यक्त की गई थी। CFTR उत्पादन कुल सेलुलर प्रोटीन 17,28 के 1% के रूप में उच्च किया जा सकता है। 9- baculovirus प्रणाली एफ एस प्रोटीन कोर ग्लाइकोसिलेटेड और है कि लाभ दिया हैइस प्रणाली में गुणवत्ता नियंत्रण मशीनरी CFTR और म्यूटेंट कोशिका की सतह पर उत्पादन किया जा सकता है कि अपेक्षाकृत अनुमोदक ऐसी है। एक दस हिस्टडीन टैग निकल NTA के लिए इस टैग की आत्मीयता के आधार पर शुद्धि अनुमति देने के लिए carboxy टर्मिनस पर इंजीनियर था। सी टर्मिनल टैग काटा CFTR प्रोटीन और पैदावार ATPase में कार्यात्मक CFTR प्रोटीन, एकल चैनल और आयोडाइड तपका प्रयोगों 17,19,24,28,29 के सह-शुद्धि को रोकने के लिए मदद करता है। हालांकि यहां वर्णित शुद्धि प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से एन टर्मिनली टैग CFTR के लिए उपयुक्त होना चाहिए।

इससे पहले, यह CFTR प्रोटीन को प्रभावी ढंग से कमरे के तापमान 15 पर NaPFO (सोडियम pentadecafluoro-octanoate) का उपयोग एस एफ 9 प्लाज्मा झिल्ली की तैयारी से निकाला जा सकता है कि दिखाया गया है। हालांकि, NaPFO की संवेदनशीलता को ठीक से मुड़ा हुआ प्रोटीन, और पफो को दूर करने के लिए आवश्यक लंबा डायलिसिस के संरक्षण के लिए अनुकूल 4 डिग्री सेल्सियस, एक के तापमान पर वेग को रैप करने के लिए उत्तरदायी नहीं थेआईडी शुद्धि और पुनर्गठन के तरीकों CFTR समारोह के बाद assays में प्रोटीन की गतिविधि को अधिकतम करने का इरादा है। Dodecyl-β-डी-maltoside (DDM), 3 सहित डिटर्जेंट (के एक पैनल का मूल्यांकन - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), FOS -choline 12 और FOS -choline 14, पता चला है कि FOS -choline 14 एस एफ 9 झिल्ली से मानव CFTR-उसका 10 solubilizing में सबसे अधिक प्रभावी था, और कहा कि DDM (डेटा) नहीं दिखाया डिटर्जेंट समाधान में CFTR की ATPase गतिविधि को बनाए रखने में। इस प्रकार एक FOS -choline 14 डिटर्जेंट निष्कर्षण कदम प्रभावी था प्रोटीन की गतिविधि को बनाए रखने के लिए डिटर्जेंट DDM करने के लिए Exchange द्वारा पीछा किया जाता है।

(; रजत दाग चित्रा 2) शोधन और एकाग्रता के बाद, एक प्रोटीन अंश अपने प्रमुख घटक के रूप में एक ~ 150 केडीए बैंड में शामिल है कि DDM डिटर्जेंट में प्राप्त की है। इस आणविक वजन एस <में व्यक्त मानव CFTR से मेल खाती हैउन्हें> च 9cells और यह स्तनधारी कोशिकाओं में CFTR की जटिल ग्लाइकोसिलेशन विशेषता के प्रकार का अभाव है जहां एसडीएस पृष्ठ द्वारा विश्लेषण किया। 150 केडीए प्रजातियों एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण और चांदी धुंधला निम्नलिखित लगभग 90% शुद्ध प्रतीत होता है। M3A7 विरोधी CFTR एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी सोख्ता NBD2 के खिलाफ निर्देशित इस माउस मोनोक्लोनल 150 केडीए बैंड (; धब्बा चित्रा 2) के साथ प्रतिक्रिया करता है कि पुष्टि करता है। कुछ अध्ययनों में, कम वजन आणविक घटकों की मात्रा का पता लगाने ~ 60 पर, जेल पर दिखाई दे नाबालिग बैंड के रूप में मौजूद हैं और ~ 80 केडीए (डेटा) नहीं दिखाया। M3A7 विरोधी CFTR एंटीबॉडी 60 और 80 केडीए बैंड के साथ प्रतिक्रिया करता है, लेकिन अन्य गैर CFTR प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया नहीं करता है (डेटा) नहीं दिखाया। यह कम आणविक भार घटक CFTR गिरावट उत्पादों सह शुद्ध उनकी सी टर्मिनल उनकी टैग के माध्यम से CFTR साथ कर रहे हैं कि पता चलता है। शुद्धि प्रोटीज अवरोधकों की उपस्थिति में किया जाता है और यह इन घटकों शोधन प्रक्रिया में मैंने पहले कोशिकाओं में मौजूद हैं कि प्रतीत होता हैएस प्रदर्शन किया। प्रक्रिया की एकाग्रता कदम लगभग सभी contaminating कम आणविक वजन टुकड़े की हटाता है। CFTR इस बिंदु पर पुनर्गठन किया जा सकता है, या किसी अन्य शोधन प्रक्रिया से प्रोटीन पुनर्गठन प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है।

विनियमित के रूप में एक लिपोसोमल प्रवाह आधारित परख, आयनों चुनिंदा चैनलों शुद्ध और पुनर्गठन CFTR अणुओं की आबादी के कार्यात्मक पुनर्गठन की रिपोर्ट

शुद्ध CFTR का एक महत्वपूर्ण अनुपात से ऊपर तरीकों का उपयोग कर एक विनियमित क्लोराइड चैनल के रूप में पुनर्गठित किया गया था, तो यह निर्धारित करने के लिए, एक proteoliposomal halide प्रवाह परख (चित्रा 1 बी में रेखाचित्र के रूप में दिखाया गया है) का पुनर्गठन CFTR अणुओं की आबादी की गतिविधि रिपोर्टों जो विकसित किया गया था। सबसे खराब स्थिति में, पुनर्गठन CFTR अणुओं के बहुमत misfolded कर रहे हैं, इन अणुओं एक प्रवाहकत्त्व प्रदान करने के लिए असफल हो जायेगी, अगर, फैटायनों और anions के बीच भेदभाव करने में विफलऔर / या गेट PKA फास्फारिलीकरण और न्यूक्लियोटाइड द्वारा विनियमन की कमी होगी। ली एट अल। एक झिल्ली प्रोटीन 30 प्रतिशत के कार्यात्मक पुनर्गठन का आकलन है कि अनुमति देने के तरीकों को प्रकाशित किया है।

(पुनर्गठन CFTR असर) खाली liposomes (CFTR कमी) या proteoliposomes की (75 मिमी) और अतिरिक्त लिपोसोमल आयोडाइड के साथ लोड कर रहे हैं एक जेल निस्पंदन कॉलम के माध्यम से liposomes गुजर द्वारा पोटेशियम ग्लूटामेट (75 मिमी) के साथ विमर्श किया। केआई proteoliposomes आयोडाइड के लिए एक जावक ढाल बनाने के लिए एक अच्छी तरह से युक्त कश्मीर ग्लू (पोटेशियम ग्लूटामेट) करने के लिए जोड़ रहे हैं और तपका एक आयोडाइड संवेदनशील microelectrode 24 का उपयोग करते हुए समय के साथ extraliposomal आयोडाइड में वृद्धि के रूप में नजर रखी है भरा हुआ है। एम वी संकेत में कमी में नकारात्मक आरोप लगाया आयोडाइड परिणामों की तपका (संकेत और अधिक नकारात्मक हो जाता है)। समय के साथ जारी किया आयोडाइड की एकाग्रता साजिश रची है, जब ढलान पूर्व में आयोडाइड में वृद्धि दिखाने के लिए (चित्रा 3 के रूप में) उलटा हैसमय के साथ तेहरा समाधान।

कश्मीर ग्लू यह CFTR प्रोटीन के माध्यम से पारित नहीं होता है कि एक आयनों का एक उदाहरण है के रूप में इस्तेमाल की शर्तों के तहत ताकना की महत्वपूर्ण अवरुद्ध पैदा करने के लिए प्रकट नहीं होता है, impermeant counterion के रूप में चुना गया था, और आयोडाइड चयनात्मक साथ हस्तक्षेप का कारण नहीं है इलेक्ट्रोड। एक परख यह है कि इन मानदंडों को पूरा करती है, बशर्ते कि एक और आयनों के आसपास अनुकूलित किया जा सकता है। पचहत्तर मिमी आयनों की सांद्रता अनुभव से वर्णित शर्तों के तहत परख में माप के लिए अच्छा फँसाने और पर्याप्त संकेत दिया कि सांद्रता के रूप में चयन किया गया था। (; नियंत्रण निशान चित्रा 3) CFTR-पुनर्गठन किया है, जबकि आयोडाइड से भरी हुई proteoliposomes आयोडाइड के बाद इसके अलावा बाहरी समाधान में रिलीज मध्यस्थता, पुटिकाओं साबुन के साथ permeabilized कर रहे हैं जब तक अनिवार्य रूप से कार्यात्मक पुनर्गठन CFTR कमी आयोडाइड से भरी हुई liposomes से कोई आयोडाइड रिलीज नहीं होगी MgATP (1 मिमी) CFTR चैनल और valinomycin खोलने के लिए(20 एनएम) एक झिल्ली क्षमता के विकास को रोकने के लिए (चित्रा 3 ए, प्रोटीन के लिए ट्रेस देखें: एक के लिपिड बड़े पैमाने अनुपात: 3000 (डब्ल्यू / डब्ल्यू))।

Valinomycin वर्तमान प्रणाली में खाली liposome की अखंडता उपद्रव नहीं किया था, जो सर्वोच्च एकाग्रता के रूप में अनुभव से चुना गया था अपनी एकाग्रता ढाल और 20 एनएम की एकाग्रता नीचे, विशेष रूप से झिल्ली में पोटेशियम शटल कि एक ionophore है। यह एक विशेष प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है। Valinomycin के अलावा बिना, जल्दी से एक पठार तक पहुँच जाता है कि कुछ एनएम के एक संक्षिप्त आयोडाइड जारी है (डेटा) नहीं दिखाया। इन शर्तों अन्यथा ज़्यादा से ज़्यादा (चित्रा 3 ए के रूप में) CFTR के आयनों चैनल गतिविधि सक्रिय करने के लिए जाना जाता है, यह एक महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया की कमी CFTR के आयनों चयनात्मक ताकना के माध्यम से आयोडाइड चालन द्वारा मध्यस्थता intraliposomal सकारात्मक आरोप में तात्कालिक वृद्धि दर्शाता है कि प्रतीत होता है तुरंत सीमित continuvalinomycin शामिल नहीं है जहां ous आयोडाइड तपका। इस valinomycin की मध्यस्थता प्रतिक्रिया आयोडाइड तपका पुनर्गठन CFTR के आयनों चयनात्मकता का समर्थन है, क्योंकि आरोप संचय के पिछले प्रयोगों में सीमित कर दिया गया था कि पुष्टि करता है। CFTR इस चयनात्मकता कमी रह गई थी, तो पोटेशियम और आयोडाइड दोनों जिससे प्रवाह आरंभ करने के लिए valinomycin के लिए की जरूरत abrogating proteoliposomes से तपका करने में सक्षम हो गया होता।

इन प्रारंभिक समय बिंदुओं पर मापा आयोडाइड सांद्रता कार्यरत आयोडाइड संवेदन इलेक्ट्रोड के लिए इष्टतम संवेदनशीलता सीमा के भीतर गिर करने के अनुभव से चुने गए हैं। अन्य आयोडाइड इलेक्ट्रोड का उपयोग इन कारकों का अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। एक पठार तक पहुँचने के बाद, ट्राइटन X-100 proteoliposomes permeabilize और किसी भी शेष फंस आयोडाइड जारी करने के लिए जोड़ा गया है। (Valinomycin के बाद इसके अलावा मिनट 1 और 2 के बीच प्राप्त) प्रारंभिक आयोडाइड माप के विपरीत इन समापन पर रीडिंग इलेक्ट्रोड कैली के रैखिक सीमा में नहीं हैंbration वक्र (डेटा) नहीं दिखाया, जिससे CFTR प्रोटीन परख में liposomes की कुल संख्या, या इसकी प्रतिशत कार्यात्मक पुनर्गठन करने के लिए आयोडाइड तपका रिश्तेदार मध्यस्थता करने में सक्षम है, जिसमें से liposomes के अंश का सही मूल्यांकन precluding।

आयोडाइड प्रवाह की दर CFTR प्रोटीन अणुओं की संख्या, खुले संभाव्यता और प्रत्येक CFTR चैनल की एकात्मक प्रवाहकत्त्व को दर्शाता है। इसलिए, आयोडाइड तपका की दरों संख्या और प्रत्येक CFTR अणु के खुले संभावना पर निर्भर होना चाहिए। भविष्यवाणी liposome प्रति CFTR अणुओं की संख्या में वृद्धि से इस प्रणाली में परीक्षण किया गया था। लिपिड को सक्रिय (phosphorylated और MgATP इलाज) CFTR प्रोटीन का अनुपात 1 से लेकर अनुपात के साथ, विविध किया गया था: 300-1: 3000 (चित्रा 3 ए) (डब्ल्यू / डब्ल्यू)। proteoliposomes में मौजूद पुनर्गठन CFTR की अधिक से अधिक राशि, तपका की अधिक दर भविष्यवाणी टी का समर्थन है, (इसके अलावा valinomycin के बाद 1-2 मिनट के बीच मापा)टोपी तपका दरों प्रत्येक liposome में CFTR अणुओं की संख्या पर निर्भर हैं। इस प्रकार इस विधि की कठोरता पर प्रकाश डाला, लिपिड अनुपात प्रयोगात्मक दिन और प्रोटीन purifications के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं: तपका दर विशिष्ट प्रोटीन का उपयोग कर प्राप्त की।

आयोडाइड तपका की दर इस पुनर्गठन प्रणाली में CFTR चैनल के खुले संभावना से संबंधित हैं प्रतीत होता है। PKA से फास्फारिलीकरण (32 से और समीक्षा) CFTR सक्रियण 31 के लिए आवश्यक है, यह खुला संभावना कम है जहां बहिर्जात PKA उपचार, द्वारा phosphorylated नहीं किया गया है कि CFTR युक्त vesicles में आयोडाइड तपका की दर कम हो जाएगा उम्मीद है कि । PKA इलाज किया गया है कि proteoliposomes में, खुले संभावना तपका का एक बहुत बड़ा प्रत्याशित दर में जिसके परिणामस्वरूप बहुत अधिक हो जाएगा। इस प्रणाली में 1 मिमी MgATP की उपस्थिति में CFTR PKA इलाज के लिए अभ्यास में, आयोडाइड तपका की दर valinomyc के अलावा के बाद दो मिनट के लिए एक से मापा जाता हैलगभग चार CFTR प्रोटीन की दर MgATP लेकिन नहीं PKA (3B चित्रा) के अधीन गुना में। इन निष्कर्षों तपका दर खुला संभावना चैनल से संबंधित परिकल्पना का समर्थन है। व्यवहार में यह इस तरह के विद्युत ड्राइविंग बल में समय निर्भर परिवर्तन के रूप में अन्य कारकों मनाया तपका गतिविधि को प्रभावित करती है यह देखते हुए कि संभावना को खोलने के लिए सीधे इस परख में गतिविधि की तुलना करने के लिए मुश्किल हो सकता है। पाठक इस परख विस्तृत एक चैनल गतिविधि रिकॉर्डिंग के लिए एक प्रतिस्थापन नहीं है कि आगाह कर रहा है।

दिलचस्प है, आम तौर पर CFTR (चित्रा 3 बी, सी) की कमी liposomes से तपका की तुलना में काफी अधिक है जो MgATP की उपस्थिति में "unphosphorylated" प्रोटीन से आयोडाइड तपका की दर कम वहाँ मनाया जाता है। यह कम दर 33 शुद्धि करने से पहले एस एफ 9 सेल अभिव्यक्ति प्रणाली में CFTR के बेसल फास्फारिलीकरण प्रतिबिंबित कर सकते हैं। CFTR अन्य अभिव्यक्ति syste से शुद्धएमएस बेसल फास्फारिलीकरण के विभिन्न स्तरों और इसलिए अलग अवशिष्ट गतिविधि हो सकती है।

एस एफ हालांकि F508del- और G551D-CFTR के लिए पास एकरूपता पर 9 कोशिकाओं से यह तेजी से शुद्धि प्रोटोकॉल पैदावार WT-CFTR, विधि बेहतर एक संवर्धन प्रक्रिया के रूप में वर्णित किया गया है। कुछ contaminating बैंड CFTR एंटीबॉडी के लिए प्रतिक्रियाशील रहे हैं और सेल विघटन से पहले उपस्थित होने के लिए दिखाई देते हैं कि CFTR गिरावट उत्पादों को प्रतिबिंबित जिनमें से कई एसडीएस पृष्ठ 19 के माध्यम से मनाया जाता है। पुनर्गठन और आयोडाइड प्रवाह के तरीकों नैदानिक ​​प्रासंगिक म्यूटेंट के इन समृद्ध नमूने के लिए उपयुक्त हैं। (: लगभग 1 के लिपिड बड़े पैमाने अनुपात: 600 प्रोटीन) और G551D-CFTR (प्रोटीन: लगभग 1 के लिपिड अनुपात: 300) चित्रा 3 डी में दिखाया गया है, महत्वपूर्ण आयोडाइड तपका F508del- दोनों के लिए मापा जाता है। (: 1 के लिपिड बड़े पैमाने अनुपात: प्रोटीन 1200) दोनों म्यूटेंट WT-CFTR की तुलना में कम निरपेक्ष गतिविधि है, यह quantitation के रूप में सीधे नमूनों की तुलना करना मुश्किल हैCFTR गिरावट के उत्पादों के साथ दूषित कर रहे हैं कि म्यूटेंट के लिए के रूप में सही नहीं हो सकता। हालांकि F508del-CFTR और G551D दोनों, इन तरीकों से शुद्ध पुनर्गठन और तपका माप छोटे अणु potentiators (चित्रा 4) के रूप में की उम्मीद जवाब है, और अधिक कठोर पफो शोधन विधि 19 से शुद्ध प्रोटीन के समान चैनल समारोह को दिखाने के अधीन है।

शुद्ध और पुनर्गठन CFTR के चैनल गतिविधि छोटे अणु inhibitors और potentiators संग्राहक द्वारा किया जा सकता है

-172 34 INH CFTR एक चैनल प्रवाहकत्त्व माप 35 में CFTR क्लोराइड चैनलों के खुले संभावना को बाधित करने के लिए और अन्य अध्ययनों 22,36 में CFTR गतिविधि को बाधित करने के लिए दिखाया गया है कि सबसे विशिष्ट उपलब्ध CFTR अवरोध करनेवाला है। चित्रा -3 सी में दिखाया गया है, इसके अलावा valinomycin के बाद तपका की दर काफी CFTR INH साथ pretreatment से कम है यूबी> -172। इसलिए, शुद्ध और पुनर्गठन CFTR अणुओं की आबादी के चैनल गतिविधि के इस परख ऐसी -172 INH निरोधात्मक ligand के CFTR रूप modulators के रिपोर्टिंग गतिविधि में प्रभावी है।

परख के रूप में अच्छी तरह से छोटे अणु potentiator उपचार के प्रभाव की परीक्षा के प्रति संवेदनशील है और बहुत ही लागू है। चित्रा 4 में दिखाया गया है, का परीक्षण सभी तीन CFTR जीनोटाइप काफी ऐसे रूप में सक्रिय छोटे अणु potentiators द्वारा potentiated रहे हैं Kalydeco / vx-770 या VRT-532 (चित्रा 4C; G551D के लिए दिखाया गया है), एक निष्क्रिय अनुरूप आयोडाइड तपका पर कोई प्रभाव नहीं है, जबकि CFTR की गतिविधि (F508del-CFTR के लिए दिखाया गया है, 4B चित्रा)। परख potentiator एकाग्रता निर्भरता की परीक्षा, और potentiator की मध्यस्थता CFTR गतिविधि पर एटीपी की भूमिका और फास्फारिलीकरण के लिए लागू है।

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चित्रा 1:। इस प्रकाशन में वर्णित काम के लिए परख डिजाइन और कार्यप्रवाह (ए) कार्यप्रवाह (बी) आयोडाइड तपका प्रयोग के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।। पैनल बी के एक संशोधित संस्करण मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित किया गया था। Eckford, PDW; ली, सी .; Ramjeesingh, एम .; और भालू, सीई सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) potentiator vx-770 (Ivacaftor) एक फास्फारिलीकरण निर्भर लेकिन एटीपी स्वतंत्र ढंग से उत्परिवर्ती CFTR की दोषपूर्ण चैनल गेट खोलता है। 2012; 287: 36,639-36,649। © जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी।

चित्र 2
चित्रा 2:। CFTR तेजी शोधन प्रक्रिया पैदावार शुद्ध WT-CFTR प्रोटीन रजत एसडीएस पृष्ठ जेल और पश्चिम दागपर- व्यक्त करने का एक (उनकी) 10 -tagged संस्करण (क्रमशः एक माइक्रोग्राम प्रति और जेल और दाग के लिए 0.1 माइक्रोग्राम प्रति,) शुद्ध मानव WT-CFTR DDM डिटर्जेंट में प्रोटीन, के लिए एस एफ से पृथक 9 कोशिकाओं M3A7 CFTR एंटीबॉडी का उपयोग ERN धब्बा प्रोटीन। WT-CFTR (> 90% शुद्ध) जटिल ग्लाइकोसिलेशन कमी इस प्रोटीन के लिए उपयुक्त, 150 केडीए में पता चला है। इस शोध मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित किया गया था। Eckford, PDW; ली, सी .; Ramjeesingh, एम .; और भालू, सीई सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) potentiator vx-770 (Ivacaftor) एक फास्फारिलीकरण निर्भर लेकिन एटीपी स्वतंत्र ढंग से उत्परिवर्ती CFTR की दोषपूर्ण चैनल गेट खोलता है। 2012; 287: 36,639-36,649। © जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी।

चित्र तीन
चित्रा 3: मैंodide तपका परख रिपोर्ट शुद्ध और पुनर्गठन CFTR प्रोटीन के लिए चैनल गतिविधि विनियमित। (ए) और शुद्ध phosphorylated WT-CFTR प्रोटीन पर पुनर्गठित: लिपिड अनुपात 1: 300 (डब्ल्यू / डब्ल्यू): 1, 1200 (डब्ल्यू डब्ल्यू /) और 1: 3000 (डब्ल्यू डब्ल्यू /) के लिए पुटिका लुमेन से आयोडाइड तपका mediates 1 मिमी MgATP और 20 एनएम valinomycin के अलावा के बाद समय के साथ थोक स्नान। (w / v) ट्राइटन X-100 प्रयोग के अंत में पुटिका लुमेन में आयोडाइड फंस proteoliposomes विज्ञप्ति permeabilize के लिए 0.1% के अलावा। (बी) का पुनर्गठन WT-CFTR प्रोटीन के लिए प्रारंभिक आयोडाइड तपका समय कोर्स नहीं किया गया था कि पूर्व phosphorylated। (सी) प्रारंभिक आयोडाइड तपका दरों कार्यात्मक CFTR प्रोटीन पर मनाया गतिविधि की निर्भरता प्रदर्शित करता है। प्रोटीन की PKA फास्फारिलीकरण -172 (20 माइक्रोन) INH CTTR, CFTR अवरोध करनेवाला के अलावा द्वारा हिचकते हैं जो महत्वपूर्ण चैनल गतिविधि के लिए आवश्यक है। डाटा SEM के ± साधन हैं; * पी <0.05, *** पी <0.0001 (डी) एकाधिक जीनोटाइप Wt-, F508del- और नियंत्रण बनाम G551D-CFTR सहित आयोडाइड तपका परख में विनियमित CFTR का संकेत है, का उत्पादन। डाटा SEM के ± साधन हैं; * पी <0.05; *** पी <.0004 बनाम नियंत्रण। इस शोध (पैनल ए, सी और डी में डेटा के कुछ भागों) मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित किया गया था। Eckford, PDW; ली, सी .; Ramjeesingh, एम .; और भालू, सीई सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) potentiator vx-770 (Ivacaftor) एक फास्फारिलीकरण निर्भर लेकिन एटीपी स्वतंत्र ढंग से उत्परिवर्ती CFTR की दोषपूर्ण चैनल गेट खोलता है। 2012; 287: 36,639-36,649। © जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी।

चित्रा 4
चित्रा 4: छोटे अणुओं द्वारा CFTR के फास्फारिलीकरण निर्भर potentiation का उपयोग कर पूछताछ की जा सकती हैWt-, F508del- और G551D-CFTR के लिए आयोडाइड तपका प्रणाली। (क) WT-CFTR केवल PKA-phosphorylated राज्य में, potentiator vx-770 (10 माइक्रोन) से काफी potentiated है। डाटा * पी ​​<, SEM ± साधन हैं PKA-vx-770। (ख) vx-770 (10 माइक्रोन) नहीं बल्कि एक निष्क्रिय अनुरूप, वी-09-1188 (10 माइक्रोन), काफी आयोडाइड तपका potentiates + 0.01 बनाम phosphorylated F508del-CFTR की गतिविधि। डाटा, SEM ± साधन हैं, एन = 3 *** पी <0.001 बनाम -VX-770 नियंत्रण। 10 माइक्रोन VRT-532 या vx-770 से G551D-CFTR (ग) potentiation। डाटा SEM के ± साधन हैं, एन = 5, ** पी <0.001, *** पी <.0001 बनाम -VX-770 नियंत्रण। इस शोध (पैनल एसी) मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित किया गया था। Eckford, PDW; ली, सी .; Ramjeesingh, एम .; और भालू, सीई सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) potentiator vx-770 (Ivacaftor) एक में उत्परिवर्ती CFTR की दोषपूर्ण चैनल गेट खोलता है फास्फारिलीकरण निर्भर लेकिन एटीपी-स्वतंत्र ढंग से। 2012; 287: 36,639-36,649। © जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी।

R> ight "> 7.4
बफर नाम अंतर्वस्तु पीएच का उपयोग कर पीएच को समायोजित करें
बफर 1 2% FOS -choline 10 मिमी imidazole में 2% (डब्ल्यू / वी) FOS -choline 14 डिटर्जेंट, 25 मिमी HEPES 7.4 Imidazole / HEPES
बफर 2 10 मिमी imidazole 10 मिमी imidazole, 25 मिमी HEPES (कोई डिटर्जेंट) 7.4 Imidazole / HEPES
बफर 3 10 मिमी imidazole + DDM 10 मिमी imidazole, 25 मिमी HEPES, 1 मिमी dodecyl-β-डी-maltoside 7.4 Imidazole / HEPES
बफर 4 50 मिमी imidazole + DDM 50 मिमी imidazole, 25 मिमी HEPES, 1 मिमी dodecyl-β-डी-maltoside 7.4 Imidazole / HEPES
बफर 5 600 मिमी imidazole + DDM 600 मिमी imidazole, 25 मिमी HEPES, 1 मिमी dodecyl-β-डी-maltoside 7.4 Imidazole / HEPES
बफर 6 75 मिमी केआई + DDM 75 मिमी केआई, 20 मिमी mops, 1 मिमी dodecyl-β-डी-maltoside 7.4 KOH
बफर 7 75 मिमी केआई 75 मिमी केआई, 20 मिमी MOPS 7.4 KOH
बफर 8 25 मिमी HEPES + DDM 25 मिमी HEPES, 25 मिमी NaCl, 1 मिमी dodecyl-β-डी-maltoside 7.4 एचसीएल / NaOH के
बफर 9 75 मिमी कश्मीर ग्लू 75 मिमी कश्मीर ग्लूटामेट, 20 मिमी MOPS KOH / Glutamic एसिड
बफर 10 15 मिमी केआई 15 मिमी केआई, 20 मिमी MOPS 7.4 KOH

तालिका 1: बफ़र की तालिका।

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Discussion

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सेलुलर overexpression प्रणालियों की एक किस्म से, पूर्ण लंबाई, कार्यात्मक CFTR अलगाव के लिए शुद्धि प्रोटोकॉल की एक सीमित संख्या में किया गया है। यह ATPase और तलीय दोहरी परत में एक चैनल माप सहित चैनल समारोह के प्रत्यक्ष माप, सहित assays में अत्यधिक कार्यात्मक है कि WT-CFTR या मध्यम मात्रा में F508del- और G551D-CFTR की उच्च संवर्धन का तेजी से शुद्धि की अनुमति देता है के रूप में यहाँ वर्णित विधि फायदेमंद है छोटे अणुओं 19-21 के अध्ययन के लिए प्रासंगिक हैं कि सिस्टम और CFTR आबादी चैनल समारोह का प्रदर्शन किया उपाय। शोधन विधि एक तेजी से और प्रभावी पुनर्गठन प्रोटोकॉल में एकीकृत है, अन्य तरीकों से हालांकि शुद्ध प्रोटीन, के रूप में अच्छी तरह से इस पुनर्गठन के प्रोटोकॉल के लिए युग्मित शुद्धि डिटर्जेंट इसी तरह हटाने के लिए उत्तरदायी है कि उपलब्ध कराई जा सकती है।

Exc से जटिल और श्रमसाध्य एक चैनल प्रयोगों के लिए विरोध के रूप मेंised झिल्ली पैच, यहां वर्णित विधि CFTR चैनल समारोह के एक मजबूत अभी तक स्पष्ट आकलन की अनुमति है, और विशिष्ट इस उपाय CFTR चैनलों के बजाय एक या कुछ अणुओं की एक बड़ी आबादी के समारोह की रिपोर्ट। झिल्ली पैच शामिल तकनीकों के विपरीत, इस विधि युग्मित शोधन प्रक्रिया की प्रभावशीलता के आधार पर जुड़े प्रोटीन, के पास या पूर्ण अभाव में चैनल पर छोटे अणु modulators के प्रभाव का प्रत्यक्ष आकलन की अनुमति देता है।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

प्रोटोकॉल में संकेत नोटों के रूप में आयनों प्रवाह परख के लिए CFTR के कार्यात्मक पुनर्गठन में कई महत्वपूर्ण कदम है, वहाँ रहे हैं, प्रोटीन का अनुकूलन: CFTR पुनर्गठन के दौरान लिपिड अनुपात की कुंजी है। इस तरह के अनुकूलन प्रत्येक CFTR जीनोटाइप के लिए आवश्यक है।

तकनीक का संशोधन और समस्या निवारण

आधारभूत एम वी रिसवर्णित के रूप में तैयार नमूनों के साथ आयोडाइड तपका परख के दौरान यहां इस्तेमाल की जांच के लिए ponse आम तौर पर -20 एम वी -50 के लिए है। इस श्रृंखला से महत्वपूर्ण विचलन नमूने के साथ समस्या आ सकती है सुझाव देते हैं। विभिन्न निर्माताओं द्वारा बेचे अन्य जांच यहाँ प्रदान के दिशा निर्देशों से अलग हो सकता है। एक स्थिर आधारभूत हासिल नहीं किया जा सकता है, तो अवशिष्ट डिटर्जेंट या निष्क्रिय, विकृत, खराब गुणवत्ता वाले प्रोटीन आयोडाइड के लिए पुटिकाओं permeabilizing जा सकता है।

विफलता जांच की जानी चाहिए जो सभी के लिए कई मुद्दों, प्रतिबिंबित कर सकते हैं MgATP की उपस्थिति में phosphorylated CFTR युक्त liposomes से निर्भर आयोडाइड तपका valinomycin की दर में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन का पता लगाने के लिए। इन मुद्दों में शामिल हैं: खराब गुणवत्ता, आंशिक रूप से विकृत CFTR या अशुद्ध CFTR; पुनर्गठन के दौरान डिटर्जेंट का अधूरा हटाने; गैर-श्रेष्ठतम प्रोटीन: proteoliposomes में लिपिड अनुपात; या अपर्याप्त valinomycin अधूरा प्रभारी अपव्यय प्रतिपादन गयी।

मेँodide तपका assays के परख के दौरान पूर्व phosphorylated CFTR प्रोटीन (प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में), या phosphorylated CFTR करने के लिए उपयोग करने के लिए लचीलापन प्रदान करता है। पुनर्गठन प्रोटीन शोधन प्रक्रिया के दौरान phosphorylated नहीं किया गया था, तो नमूना MgATP साथ PKA के अलावा द्वारा, कदम 3.2.7 पर आयोडाइड तपका प्रयोग के दौरान phosphorylated किया जा सकता है। इस मामले में आधारभूत प्रोटीन पर्याप्त valinomycin के अलावा के साथ समारोह मापने के पहले PKA एंजाइम द्वारा phosphorylated किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए दर्ज की गई है कि सुनिश्चित करते हैं। इसी तरह के परिणाम या तो विधि द्वारा प्राप्त कर रहे हैं।

प्रोटोकॉल के दौरान, न्यूनाधिक अणु फिर MgATP के अलावा और Valinomycin द्वारा गतिविधि की माप से पहले 5 मिनट के लिए CFTR प्रोटीन के साथ बातचीत करने की अनुमति दी है। सबसे CFTR modulators के बहुत lipophilic हैं के रूप में, यह CFTR प्रोटीन के साथ स्नान और संतुलन एसोसिएशन के अलावा के बीच का समय लग सकता है। परख वें बिना आगे नहीं बढ़ सकताई valinomycin के अलावा, और इस तरह कोई जानकारी नहीं है इस तरह से परख प्रदर्शन से खो दिया है। उपयोगकर्ता प्रोटीन के साथ छोटे अणु की बातचीत से पहले एक समय अंतराल हो सकता है चिंतित नहीं है जहां स्थितियों में, परख, valinomycin के अलावा के बाद न्यूनाधिक की तीव्र अलावा द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है की प्रारंभिक दर चरण में अब भी है, जबकि माप।

तकनीक की सीमाएं

जैसा कि पहले कहा, शुद्ध और पुनर्गठन पूर्ण लंबाई CFTR अणुओं की आबादी द्वारा विनियमित चैनल गतिविधि के इस proteoliposomal प्रवाह आधारित परख सीधे गतिविधि को संशोधित कि ligands के पूछताछ के लिए एक अनूठा तरीका प्रदान करता है। हालांकि, विधि यह ligands के CFTR के माध्यम से प्रवाह की दर में परिवर्तन के माध्यम से जो तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करता है में सीमित है। आदर्श रूप में, शुद्ध और पुनर्गठन CFTR की proteoliposomal प्रवाह परख तलीय होंठ के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जाना चाहिएएक चैनल गतिविधि का आईडी bilayer अध्ययन करता है। इस संयोजन खुला और / या बंद राज्य यानी, ligands के बांधता है कि प्रोटीन के राज्य में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व

महत्वपूर्ण प्रोटीन, प्रोटीन का मार्ग या विघटन एक modulatory के माध्यम से, परोक्ष रूप से जैसे चैनल गतिविधि, परिवर्तन करने के लिए एक और सेलुलर घटक के साथ बातचीत कि छोटे अणु modulators बनाम CFTR चैनल के साथ छोटे अणुओं की सीधी बातचीत का आकलन करने या संकेत के लिए तरीकों की कमी वर्तमान में है बातचीत। आयोडाइड तपका विधि CFTR के चैनल गतिविधि modulates कि किसी भी छोटे अणु के प्रोटीन के साथ सीधे संपर्क को दर्शाता है। माप की कम throughput के तरीके के बावजूद, छोटे अणु potentiators और correctors साथ CFTR की सीधी बातचीत का अध्ययन करने के लिए इन अद्वितीय तरीकों में काफी मूल्य बनी हुई है। कई छोटे Moleculइस मौजूदा सीएफ अनुसंधान का मुख्य जोर है के रूप में ई modulators, शैक्षिक समूहों और नैदानिक ​​सीएफ रोगियों के इलाज के लिए दवा उद्योग दोनों के द्वारा विकास के तहत कर रहे हैं। यह यहाँ वर्णित विधियों इन अणुओं के सबसे होनहार की कार्रवाई के तंत्र के विकास और सत्यापन में सहायता करेगा कि पूर्वानुमानित है।

तकनीक का भविष्य अनुप्रयोगों

यहां नियोजित तरीके भी हित के अन्य प्रोटीन के लिए adaption के लिए अत्यधिक उत्तरदायी हैं। दरअसल वर्णित विधियों में से एक संशोधन दो पी अध्ययन करने के लिए नियुक्त किया गया था aeruginosa झिल्ली प्रोटीन इन तरीकों की उपयोगिता और बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन, झिल्ली 26,27 भर में ऋणात्मक substrates के आंदोलन में फंसा। अतिरिक्त आयनों चैनलों और ट्रांसपोर्टरों के अध्ययन में उनके उपयोग भविष्य में पूर्वानुमानित है।

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Disclosures

लेखकों यहाँ वर्णित शुद्धि विधियों के विकास के दौरान डॉ Mohabir Ramjeesingh की सलाह स्वीकार करते हैं। इन अध्ययनों के स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) और सिस्टिक फाइब्रोसिस कनाडा (सीएफसी) की कनाडा के संस्थानों से CEB के लिए ऑपरेटिंग अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। PDWE CIHR और सीएफसी के माध्यम से फैलोशिप पुरस्कार के हिस्से में समर्थित किया गया। लेखकों सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन चिकित्सा (CFFT) द्वारा पढ़नेवाला, potentiator और डॉ आर पुल (मेडिसिन के रॉसलिंड विश्वविद्यालय और विज्ञान) से अवरोध करनेवाला यौगिकों और वितरण के प्रावधान को स्वीकार करते हैं। लेखकों को भी baculovirus प्रणाली का उपयोग कर WT और उत्परिवर्ती CFTR प्रोटीन को व्यक्त करने में Baylor सेल संस्कृति सुविधा (एनआईएच अनुदान P30 CA125123) द्वारा उत्कृष्ट सेवा स्वीकार करते हैं। निष्क्रिय vx-770 अनुरूप, वी-09-1188, वर्टेक्स फार्मास्यूटिकल्स का एक उपहार था।

Acknowledgments

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fos-choline 14 detergent Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) F312 Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche (www.roche-applied-science.com) 04 693 132 001 EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack  Roche (www.roche-applied-science.com) 05 892 791 001
Ni-NTA Agarose Qaigen GmbH 1018240
Fisherbrand Screening columns Fisher Healthcare 11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K Millipore (www.millipore.com) UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840051C
POPC Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 850457C
PS, Porcine Brain Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840032C CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 841118C
Ergosterol Sigma (www.sigmaaldrich.com) 45480
Pierce Detergent removal spin column Thermo Scientific 87779 1 ml capacity columns
valinomycin Sigma (www.sigmaaldrich.com) V-0627
VX-770 (ivacaftor) Selleck Chemicals S1144
iodide selective microelectrode Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) LIS-146ICM  
 
 
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
Clampex 8.1 software Axon Instruments (www.axon.com) we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System  Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) LIS-146LICM-XS Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars Big Science Inc (www.stirbars.com) SBM-0502-CMB choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine GE Health Care (www.gelifesciences.com) 17-0042-01
Sonicator Laboratory Supplies Co, Inc. G112SP1G Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable

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References

  1. Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50, (1), 233-248 (2011).
  2. Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68, (4), 809-818 (1992).
  3. Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
  4. Genetic Analysis Consortium. http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
  5. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245, (4922), 1073-1080 (1989).
  6. Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2, (8), 1253-1261 (1993).
  7. Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148, (1-2), 164-274 (2012).
  8. Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148, (1-2), 150-163 (2012).
  9. Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419, (1-2), 41-60 (2012).
  10. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365, (18), 1663-1672 (2011).
  11. Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270, (28), 17033-17043 (1995).
  12. Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
  13. Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267, (36), 26142-26149 (1992).
  14. Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4, (2), 95-100 (1993).
  15. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327, (1), 17-21 (1997).
  16. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, (37), 39051-39057 (2004).
  17. Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
  18. Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
  19. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, (44), 36639-36649 (2012).
  20. Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54, (24), 8693-8701 (2011).
  21. Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21, (5), 666-678 (2014).
  22. Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78, (3), 411-418 (2010).
  23. Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8, (2), 153-171 (2009).
  24. Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418, (1), 185-190 (2009).
  25. Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3, (2), 119-121 (2004).
  26. Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (32), 13083-13088 (2011).
  27. Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4, (5), e00678-e00613 (2013).
  28. Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. Academic Press. 337-357 (2010).
  29. Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75, (6), 1430-1438 (2009).
  30. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387, (5), 1055-1060 (2009).
  31. Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268, (15), 11304-11311 (1993).
  32. Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
  33. Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271, (45), 28463-28468 (1996).
  34. Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110, (11), 1651-1658 (2002).
  35. Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136, (6), 659-671 (2010).
  36. Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89, (4), 417-425 (2004).
शुद्ध wildtype और उत्परिवर्ती CFTR प्रोटीन के कार्यात्मक पुनर्गठन और चैनल गतिविधि माप
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Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).More

Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).

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