Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

doi: 10.3791/52427 Published: March 9, 2015

Summary

Descritto qui è una procedura rapida ed efficace per la ricostituzione funzionale di purificato wild-type e proteina CFTR mutata che preserva l'attività per questo canale del cloro, che è difettoso in fibrosi cistica. Efflusso ioduro da proteoliposomi ricostituiti mediati da CFTR permette studi di attività di canale e gli effetti di piccole molecole.

Abstract

La fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR) è un membro di canali che formano unico della ATP Binding Cassette (ABC) superfamiglia dei trasportatori. L'attività del canale fosforilazione e nucleotide cloruro di dipendenti di CFTR è stato spesso studiato in sistemi cellulari interi e come singoli canali in patch di membrana escisse. Molte mutazioni-fibrosi cistica provocando hanno dimostrato di alterare questa attività. Mentre un piccolo numero di protocolli di purificazione sono stati pubblicati, un metodo ricostituzione veloce che mantiene l'attività del canale e un metodo adatto per studiare l'attività del canale popolazione in un sistema purificato sono stati carenti. Qui metodi rapidi sono descritti per la purificazione e la ricostituzione funzionale della proteina CFTR full-length in proteoliposomi di definita composizione lipidica che mantiene l'attività come canale alogenuro regolamentato. Questo metodo ricostituzione con un nuovo saggio basato flux-dell'attività del canale è un sistema adatto perlo studio delle proprietà del canale popolazione di selvatici tipo CFTR e causano malattie mutanti F508del- e G551D-CFTR. In particolare, il metodo ha utility a studiare gli effetti diretti di fosforilazione, nucleotidi e piccole molecole quali potenziatori e gli inibitori sull'attività del canale CFTR. I metodi sono anche suscettibili di studio di altri canali di membrana / trasportatori per substrati anionici.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trasporto di cloruro attraverso le membrane apicale delle cellule epiteliali in tali tessuti come le ghiandole polmone, intestino, pancreas e sudore è mediata principalmente dalla fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR), un ATP e membro fosforilazione regolamentato della ABC (ATP Binding Cassette) C sottofamiglia di proteine ​​di membrana (rivisto in 1). Come altri membri della sottofamiglia ABCC, CFTR è un grande, multi-spanning proteina integrale di membrana che lega l'ATP a due siti di legame di nucleotidi formate all'interfaccia dei suoi domini nucleotide binding (NBDS), dove possiede ATPasi modesta in un unico site. Tuttavia, a differenza di altri membri sottofamiglia ABCC, CFTR è evoluto come un canale unico regolamentato Cl, piuttosto che come un soluto transporter attiva.

Le mutazioni in CFTR causa la fibrosi cistica, una malattia che colpisce diversi organi tra cui i polmoni, tratto gastrointestinale, del pancreas e del tratto riproduttivo, portando a Morbidity e mortalità nei giovani adulti. Malattia polmonare solitamente rappresenta mortalità precoce nella fibrosi cistica e nella maggior parte dei casi è causata dalla perdita di funzione di CFTR sulla superficie dell'epitelio delle vie aeree di conduzione. La mancanza di CFTR canale attività cloruro provoca una riduzione sia Cl - e il movimento dell'acqua attraverso l'epitelio superficie per modificare lo strato di liquido sulla superficie apicale dell'epitelio respiratorio ciliato. Ciò si traduce in un liquido viscoso di superficie delle vie aeree che riducono la capacità di cellule epiteliali respiratorie ciliate a patogeni efficacemente sgombrare delle vie aeree. Di conseguenza, la maggior parte dei pazienti con fibrosi cistica soffrono di attacchi ricorrenti di infezione polmonare e danni ai polmoni a causa di infiammazione.

Come previsto, studi del meccanismo di azione della normale proteina CFTR è concentrata principalmente su studi elettrofisiologici modalità della sua attività gating canale. Studi di canale singolo hanno dimostrato direttamente che funziona CFTR come PKA-dipendente Cl- Canale che possiede un ATP cancello regolamentato 2. Dettagliati studi elettrofisiologici forniscono una grande quantità di informazioni sui canali CFTR singoli 1,3, ma ci possono essere preoccupazioni sul fatto che le caratteristiche di un particolare singolo canale che è stato studiato è riflettente di tutta la popolazione di canali CFTR e quindi il singolo canale risultati devono sempre essere considerati insieme con i metodi per studiare la popolazione macroscopico. Analisi diretta del canale attività popolazione di CFTR purificato ha il potenziale per fornire una conoscenza del difetto molecolare associata a mutazioni che causano malattie e per guidare la scoperta di modulatori chimici quali riparazione proteine ​​CFTR mutante. Ad oggi, ci sono in eccesso di 1.900 differenti mutazioni nel CFTR pensato per causare la fibrosi cistica 4. La mutazione importante, F508del-CFTR, che si trova in almeno un allele in circa il 90% dei pazienti in Nord America e in Europa conduce alle proteine ​​misfolding unritenzione nd nel reticolo endoplasmatico 5. F508del-CFTR ha anche altre conseguenze, tra cui l'attività del canale difettoso 6-9. La risultante assenza di CFTR dalla superficie cellulare è associata con la malattia grave. G551D-CFTR, una mutazione meno comune, è pensato per essere adeguatamente ancora piegato è disfunzionale come canale del cloro sulla superficie cellulare 6. Lo sviluppo di piccole molecole correttori e potenziatori ha rispettivamente lo scopo di correggere piegatura e / o traffico di mutanti, come F508del-CFTR alla superficie cellulare, e di potenziamento o aumentando l'attività del canale di mutazioni come G551D quando presenti sulla superficie cellulare, . Mentre i correttori VX-809 e VX-661 (non sono ancora approvati per l'uso nei pazienti, il potenziatore Kalydeco (ivacaftor, VX-770) viene utilizzata a 150 mg ogni 12 h nei pazienti con FC> 6 anni con almeno un G551D mutazione -CFTR, e più recentemente per i pazienti con uno dei G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pe G1349D. Kalydeco è sicuro e si traduce in un miglioramento delle misure cliniche della malattia CF 10, ma il meccanismo di azione di questo piccola molecola è stato poco compreso al momento della approvazione della FDA per l'uso in pazienti.

Una manciata di metodi di purificazione CFTR sono state descritte in precedenza 2,11-18, molti dei quali richiedono un considerevole periodo di tempo per completare. In una recente pubblicazione 19, un metodo di purificazione e ricostituzione rapida unico è stato descritto per CFTR sovraespresso in S f sistema di espressione 9 cellule, e questa proteina purificata in sistemi lipidici definiti stato usato per sviluppare un alogenuro CFTR determinazione dell'attività canale per una popolazione di CFTR molecole. Il test ricapitola i noti effetti di fosforilazione, nucleotidi e gli inibitori sulla funzione CFTR. Il sistema è stato utilizzato per interrogare gli effetti del potenziatore VX-770 / Kalydeco su WT- (wild-type), e F508del- G551D-CFTR ed è stato mostrato per la primatempo che il farmaco interagisce direttamente con la proteina CFTR potenziano l'attività del canale in maniera indipendente ATP, dimostrando l'utilità e l'applicabilità di questi metodi per lo studio dell'interazione di CFTR e mutanti con nucleotidi e piccole molecole da una prospettiva popolazione rispondere alle domande clinicamente rilevanti circa la proteina. I metodi sono stati utilizzati per studiare altre molecole potenziatore e loro derivati ​​20, nonché gli effetti di una piccola molecola di correttore sull'attività della proteina 21.

Saggi efflusso sono stati utilizzati in molti studi precedentemente per studiare l'attività di mutanti CFTR e gli effetti dei composti CFTR-modulatori sulla sua attività, compresi saggi cellulari totali utilizzando elettrodi, traccianti radioattivi e fluorofori 22,23, vescicole di membrana con elettrodi iono selettivi 24 , e purificato CFTR ricostituito con traccianti radioattivi 25. Tuttavia the l'uso di elettrodi iono selettivi per studiare purificato CFTR ricostituito è stato segnalato di recente 19. Un adattamento del metodo attuale è stata utilizzata per la ricostituzione e la caratterizzazione funzionale di due proteine ​​di membrana in Pseudomonas aeruginosa, un patogeno CF comune. Ricostituzione di purificato Alge proteina della membrana esterna insieme con misure di efflusso ioduro sono stati usati per sostenere un modello per la secrezione alginato anionici attraverso questo trasportatore 26. Ricostituzione e misurazioni efflusso ioduro stati applicati alla proteina Wzx purificata, che ha permesso un modello da proporre che suggerisce un meccanismo antiport -dipendente H + per lipidi-linked oligosaccaride traslocazione attraverso la membrana interna batterica da questa proteina 27. In entrambi i casi ioduro è stato usato come un surrogato per il substrato anionico, anche se a velocità inferiore a quanto ci si potrebbe aspettare per un substrato nativo. Il metodo può essere adatto per l'adattamento ad altre proteine ​​con cdi trasporto o di conduzione percorsi ationic per substrati anionici.

Qui una procedura di purificazione rapida è descritto per la proteina CFTR e la sua ricostituzione in proteoliposomi di lipidi definito. La procedura di ricostituzione rapida può essere facilmente adattato per l'uso con CFTR purificato con altri metodi, a condizione che il tipo di detersivo utilizzato nella purificazione è facile da eliminare con i metodi qui o può essere sostituito con un detergente adatto prima della procedura di ricostituzione. Il metodo efflusso ioduro di misurazione dell'attività di proteina canale CFTR purificata e ricostituito è descritta in dettaglio e alcuni risultati tipici che possono essere ottenuti da questo metodo sono rappresentati.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Purificazione di CFTR

NOTA: Si prega di vedere la tabella di materiali e attrezzature per un elenco delle attrezzature e dei materiali utilizzati in questo protocollo. Esiste un protocollo dettagliato per la sovraespressione di umano Wt-CFTR e mutanti in S f sistema di espressione 9-baculovirus 17,28. Iperespressione di CFTR e preparare pellets di S f 9 celle secondo questo protocollo.

  1. Preparazione membrana Crude
    1. Ottenere un fresco o scongelare congelato S f 9 pellet cellulare da una cultura da 500 ml di cellule over-esprimono wildtype-, proteine ​​F508del- o G551D-CFTR con un C-terminale suo 10 -tag, coltivato con metodi standard di coltura cellulare, come descritto in precedenza 17,28. Pellet cellulari saranno avere un volume di circa 5 ml e un peso umido di circa 5 g.
    2. Risospendere S f 9 cellule in 20 ml di tampone fosfato salino (PBS) pH 7,4 con inibitori delle proteasi cocktail (1 compressa per 50 ml) a 4 ° C, garantendo lacampione appare visivamente omogeneo e senza grumi di cellule rimangono.
    3. Cellule Lisare con un distruttore cellulare ad alta pressione (Tabella dei Materiali e attrezzature), raggiungendo un minimo di 10.000 psi (preferibilmente 15.000-20.000 psi) per 2 minuti per il passaggio. Mantenere il campione a 4 ° C durante la lisi.
      1. Raccogliere il campione in un tubo sul ghiaccio dopo il periodo di lisi quindi ricaricare immediatamente il campione nel distruttore cellulare. Ripetere procedura lisi 3 volte. Esaminare al microscopio per garantire meno del 10% rimasti intatti.
        NOTA: altri metodi per lisare cellule, come perline di vetro, ecc non sono stati rigorosamente esaminati per questo sistema, un utente può comunque trovare un simile metodo alternativo adatto.
    4. Centrifugare materiale lisi cellulare a 4 ° C in una centrifuga ad alta velocità a 2.000 xg per 20 min. Raccogliere il surnatante e smaltire il pellet. Dividere il surnatante tra 20 tubi e centrifugare i campioni per 1 ora a 4 ° C a 125.000 xg in un tavolo ultracentrifuge.
    5. Rimuovere e scartare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet, e conservare pellet negli stessi tubi a -80 ° C per meno di 2 mesi fino al momento dell'uso, o tenere a ghiaccio e continuare con la purificazione immediatamente.
  2. CFTR solubilizzazione
    1. Ottenere 1-4 S F 9 pellets membrana grezza freschi o surgelati e risospendere ciascuna in 1 ml di tampone 1 (2% fos -Colina; vedere la Tabella 1 per ricetta completa) a 4 ° C su ghiaccio, utilizzando un ago G 25 e 1 siringa ml fino a quando la soluzione è omogenea dall'occhio senza grumi visibili membrana cellulare. Se più pellet è essere solubilizzato, continuare a trattare ogni campione per le istruzioni per un singolo pellet sotto in parallelo, mettendo in comune i campioni al punto 1.3.2.
    2. Sciogliere 1 mini tablet inibitore della proteasi in 1 ml di tampone 2 (imidazolo 10 mm; vedi tabella 1), che manca di fos -Colina 14 detergente (inibitori della proteasi sono 10 volte più concentvalutazione della loro diluizione raccomandata a questo punto) e aggiungere 100 microlitri al pellet risospeso membrana grezza (inibitori delle proteasi sono al loro diluizione raccomandata a questo punto). Situato su ghiaccio per 45-60 minuti con miscelazione per inversione 5 volte ogni 5 min.
    3. Centrifugare risospeso pellet membrana greggio in una un'ultracentrifuga tavolo per 25 min a 125.000 xg e 4 ° C. Conservare il surnatante, che contiene CFTR solubilizzato e scartare il pellet.
  3. Colonna vincolante, fosforilazione e eluizione
    1. Lavare 400 microlitri di nichel-NTA (acido nitrilotriacetico) slurry agarosio o resina equivalente con 1 ml di tampone 2 (10 mM imidazolo, vedi Tabella 1) che manca di detersivo, per rimuovere il solvente e buffer a 4 ° C. Ripetere il lavaggio altre due volte.
    2. Combinare CFTR solubilizzato, rimanendo inibitore della proteasi (900 microlitri) e resina nichel (da 400 microlitri slurry) per un totale di 10 ml con tampone 2 (10 mM imidazolo, vedi Tabella 1) which manca qualsiasi detergente. I fos -Colina 14 concentrazione è efficace diluito allo 0,2% (w / v) in questa fase. Se ci sono più tubi, riunire tutti i campioni contenenti CFTR solubilizzato, inibitori della proteasi, resina nichel-NTA e 0,2% (w / v) fos -Colina-14, a questo punto. Incubare per 60 minuti a 4 ° C con delicata agitazione.
    3. Passare CFTR-proteasi inibitore-nichel soluzione NTA giù una piccola colonna di screening (tabella 1) o una colonna vuota equivalente.
    4. Lavare il nickel NTA resina, che viene mantenuto nella colonna, con 4 ml per pellet iniziale di Buffer 3 (imidazolo 10 mm + DDM, vedi tabella 1), che manca di fos -Colina 14, ma contiene 1 DDM mm (dodecil detersivo maltoside), a 4 ° C. Aggiunta di detersivo DDM non altera significativamente il pH di questo buffer.
    5. Preparare la soluzione PKA-MgATP aggiungendo 25 microlitri (5 mm, concentrazione finale) di MgATP, 2.500 U di cAMP-dipendente proteina chinasi A, subunità catalitica (PKA) a 475 ml di tampone 3 (10 imidazolo mM + DDM; vedi tabella 1) alla colonna. Fosforilare proteine ​​sigillando l'estremità inferiore della colonna con un tappo o Parafilm, e aggiungendo 500 ml di soluzione di PKA-MgATP per ciascun pellet iniziale utilizzato.
    6. Incubare a temperatura ambiente (20 ° C) per 20 min con miscelazione delicata e risospensione della resina usando una pipetta 1 ml ogni 2 min per assicurare che PKA è venuto a contatto con l'intera superficie del nickel resina NTA.
    7. Togliere il tappo ed eluire la soluzione PKA / MgATP dalla colonna. Lavare la colonna con 2 ml di tampone 3 (10 imidazolo mM + DDM, vedi tabella 1) a 4 ° C.
    8. Moltiplicare il numero di pellet usato nell'esperimento per 4. Lavare la colonna con questo numero di ml di tampone 4 (imidazolo 50 mM + DDM; vedere Tabella 1) a 4 ° C, aggiungendo 4 ml di tampone per colonna, permettendo di fluire attraverso e immediatamente aggiungere il successivo 4 ml un'aliquota alla colonna.
    9. Tabella 1) 1 ml di tampone 5 a 4 ° C per pastiglia iniziale utilizzato attraverso la colonna, 1 ml alla volta senza una pausa per consentire colonna asciugare, e raccogliere l'intero eluato contenente CFTR purificato in un unico tubo.
    10. Concentrato campione di proteine ​​per rimuovere imidazolici e basso peso molecolare di degradazione prodotti utilizzando un dispositivo di filtro centrifuga (100.000 peso molecolare di cut-off), come descritto nella tabella di materiali ed attrezzature o altro dispositivo simile, in un totale di 10 ml tampone 6 (75 mm KI + DDM; vedi Tabella 1) o altro buffer di scelta contenente 1 mM DDM (come Buffer 7 per esperimenti di efflusso non-ioduro, 25 mM HEPES + DDM; vedere Tabella 1), per centrifugazione a 2.000 xg e 4 ° C per circa 20 minuti fino a quando il campione si concentra a 200 microlitri. Diluire il campione di 10 ml e ripetere la fase di concentrazione.
      NOTA: Nella nostra esperienza (inedito), imidazolo significativamente INHIbit Il ATPasi attività di CFTR e deve essere rimosso in questa fase per diluizione e concentrazione almeno due volte se viene utilizzato il campione per misurazioni funzionali.
    11. Raccogliere CFTR purificato concentrato. Conservare a 4 ° C in presenza di tampone DDM fino all'uso entro 1-2 giorni o proseguire immediatamente alla fase ricostituzione. Non congelare la proteina purificata, come nella nostra esperienza osserviamo attività ridotta.

2. Ricostituzione di CFTR

  1. Preparazione Lipid
    NOTA: CFTR è stata ricostituita con successo in Egg PC, POPC, 2: 1 (w / w) Egg PC: POPC (1: 1 w / w) della miscela, o una miscela di PE: PS: PC: ergosterolo, 5: 2 : 2: 1 (w / w).
    1. Per gli esperimenti di efflusso ioduro, secco 5 mg di Egg PC (200 ml di 25 mg / ml magazzino, vedi Tabella dei Materiali e attrezzature) sotto un getto di gas argon per 20 minuti a temperatura ambiente in un pyrex o altro robusto (non-borosilicato ) tubo di vetro.
    2. Utilizzando assorbanza a 280 nm, un ELISA unssay o altro metodo, stimare la concentrazione del campione proteina CFTR purificata. Per gli esperimenti di efflusso con ioduro di tipo selvatico CFTR, utilizzare una proteina: rapporto lipidi di 1: 300-1: 3000 (w / w) per produrre un segnale sufficiente. Per G551D- e-F508del CFTR, utilizzare una proteina: rapporto lipidi di circa 1: 200-1: 1200 (w / w) per rilevare l'attività efflusso.
    3. Ottimizzare la proteina: rapporto di lipidi per ogni sistema particolare. Calcolare il volume di proteina purificata richiesto. Calcolare il volume di tampone con 1 mM DDM necessaria per produrre un volume finale di 1 ml, cioè, 1 ml - (volume della soluzione proteica richiesto) = volume di tampone.
      1. Aggiungere il volume calcolato del sistema tampone desiderato con 1 mM DDM al lipide essiccato (ma non aggiungere la proteina CFTR in questo momento) e coprire il tubo di vetro con Parafilm. Per gli esperimenti di efflusso ioduro, lipidi nel buffer 6 risospendere (75 mm KI + DDM, vedi tabella 1). Per altri esperimenti risospendere in Buffer 8 (25 HEPES mM + DDM, vediTabella 1) o un altro buffer interno desiderato contenente 1 mM DDM.
      2. Vortex per 2 minuti a temperatura ambiente per aiutare in sospensione del lipide nel buffer DDM. In alternativa, riscaldare il campione a 37 ° C per 1-2 minuti prima vortex.
    4. Sospendere il lipide ripetutamente a temperatura ambiente con una siringa da 1 ml e 25 G ago finché non film lipidico è visibile sui lati del tubo. Evitare di iniettare aria nella soluzione che produrrebbe bollicine e aiutare nella ossidazione di ioduro e lipidi.
    5. Sonicare i lipidi sospeso nel Parafilm coperto tubo per una raffica di 20 secondi in un bagno di sonicazione ghiaccio contenente, e poi trasferire immediatamente in ghiaccio per 1 min. Ripetere 3 volte.
      NOTA: sonicazione intenso trasforma soluzioni ioduro gialle a causa dell'ossidazione. Quindi evitare un'eccessiva ultrasuoni. Monitorare il campione per cambiamenti di colore. Se si nota una variazione di colore, scartare il campione e preparare nuovo. Il cambiamento di colore dovuto all'ossidazione di alcunilo ioduro comporterebbe l'ossidazione dei lipidi alle stesse condizioni. Spostare l'aria dal tubo con gas argon prima sonicating soluzione aiuta a prevenire l'ossidazione dei lipidi e ioduro. Sonicazione intenso può rompere di scarsa qualità o tubi di vetro graffiati con conseguente perdita del campione.
    6. Aggiungere il volume di CFTR purificato calcolata al punto 2.1.3 al campione lipidi sonicato per un ottenere un volume finale di 1 ml. Mescolare la proteina con la soluzione lipidica e detersivo risospensione 10 volte con una siringa 25 ago G e 1 ml.
    7. Impostare lipidi e proteine ​​del campione in ghiaccio per 30 min con vorticoso del tubo per mescolare 5 volte ogni 5 min.
  2. Detergente-binding preparazione colonna
    1. Ottenere uno spot Spin Column detergente vincolante uso singola (vedi Tabella dei Materiali e attrezzature), con una capacità di volume 1 ml e rompere la linguetta in basso per avviare la colonna di fluire.
    2. Centrifugare la colonna per 2 min a 2000 xg per rimuovere il deposito bUffer, e scartare questo buffer.
    3. Aggiungere 5 ml di tampone 7 (KI 75 mm, vedi tabella 1) alla colonna e centrifugare a 200 xg per 4 minuti per eluire il tampone di lavaggio. Ripetere questa operazione altre 2 volte per un totale di 3 lavaggi per eliminare tutte le tracce del tampone di conservazione. Gettare tutto flow-through.
      NOTA: E 'fondamentale che il buffer utilizzato per lavare la colonna NON contiene DDM o altro detergente. La colonna ha una capacità di legame finita per il detersivo e se si utilizza un tampone contenente detersivo, colonna sarà inefficace a rimuovere il detergente dal campione proteina-lipide detergente.
    4. Aliquotare attentamente tutte 1 ml del campione lipidi detergente-proteina sulla parte superiore della resina colonna e incubare campione nella parte superiore della colonna per 2 minuti a temperatura ambiente.
    5. Centrifugare il campione a temperatura ambiente per 4 min a 2.000 xg e raccogliere il campione proteoliposome nuvoloso in una provetta per microcentrifuga pulito da 1,5 o 2 ml o un tubo di vetro e posizionare il samPLe sul ghiaccio.
    6. Raccogliere rimanenti proteoliposomi nella colonna aggiungendo 200 microlitri di tampone 7 (KI 75 mM, Tabella 1) o altro buffer (senza detergente) alla sommità della colonna e ripetere la fase di centrifugazione per 2 min.
    7. Aggiungere il secondo eluato al campione proteoliposome se sembra nuvoloso.
    8. Conservare il campione a 4 ° C durante la notte o usare immediatamente per misurazioni efflusso ioduro.

3. ioduro efflusso Misure per purificata, CFTR ricostituita

  1. Generazione di un gradiente di ioduro attraverso la membrana proteoliposomal
    1. Perline Pre-swell Sephadex G50 a Buffer 9 (75 mm K-Glu, glutammato di potassio, vedi tabella 1), (circa 5 g di perle e asciutto in 50 ml di buffer) o cuscinetto esterno desiderato a temperatura ambiente per almeno 2 ore o al 4 ° C durante la notte.
    2. Preparare 4 colonne Sephadex G50 saturi a tampone 9 (75 mm K-Glu, vedi Tabella 1) o altrobuffer in colonnine di screening caricando resina ad almeno ¾ pieno nella colonna.
    3. Centrifugare per 4 min a 2.000 xg per rimuovere il tampone in eccesso dalla resina. Ci dovrebbe essere di circa 2,25 ml di resina idrata imballato nella colonna al termine della fase di centrifugazione.
      NOTA: resina deve essere idratata con leggerezza, ma non immerso in un liquido e un successivo breve giro non dovrebbe eluire volumi significativi di buffer. E 'fondamentale per il successo eluizione del campione proteoliposome che la resina colonna è né troppo bagnata né troppo secca e l'utente può avere bisogno di sperimentare con le colonne al fine di familiarizzare con le condizioni di scambio di buffer di maggior successo.
    4. Aggiungere con cautela 125-150 microlitri di proteoliposome campione all'inizio di ogni colonna e centrifugare per 4 min a 2000 x g.
    5. Pool proteoliposome eluati insieme per l'uso immediato in efflusso ioduro o altri esperimenti.
      NOTA: Il volume eluito dalla ciascuna colonna dovrebbe essere approssimativamente150 ml e il campione dovrebbe essere un po 'nuvoloso, ma meno torbida del campione originale. Volumi più grandi o eluati chiare suggeriscono che le colonne non sono state sufficientemente essiccato, o sono stati essiccati troppo rispettivamente, e non si tradurrà in un esperimento ioduro di efflusso successo.
  2. Iodide test efflusso
    1. Lavare un micro elettrodo selettivo ioduro (Tabella dei Materiali e attrezzature) ampiamente con acqua deionizzata, e poi incubare per 20 minuti prima dell'esperimento in Buffer 10 (15 micron KI, vedi tabella 1). Lavare l'elettrodo di nuovo a lungo con acqua deionizzata.
    2. Aggiungere 150 ml di farmaco (20 mM concentrazione tipica per produrre una concentrazione finale di 10 mM nel saggio) in tampone 9 (75 mM K-Glu, vedi Tabella 1) o il veicolo in tampone 9 ad un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con una piccola ancoretta pulci.
      1. Assicurarsi che non vi siano bolle presenti. Utilizzare un puntale per rimuovere randagiobolle. Se si utilizza una soluzione di droga, affinché la concentrazione finale di DMSO nel pozzo è inferiore all'1% (v / v) (tipicamente 0,1-0,2% (v / v)).
    3. Aggiungere 150 ml di proteina CFTR ricostituito che è stato prodotto nella sezione 3.1 in Buffer 9 (75 mM K-Glu, vedi Tabella 1) al pozzo con farmaco o tampone, per produrre un volume totale di 300 microlitri nel pozzetto della piastra.
    4. Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un piatto mescolare e mescolare a 130 rpm (o ad una velocità moderata di circa ¼ della velocità massima).
    5. Inserire la punta dell'elettrodo selettiva ioduro attenzione nel pozzetto con il campione in modo che la punta non tocchi il fondo del pozzo o di essere colpito dalla ancoretta. Assicurarsi che l'elettrodo di riferimento, se separati, è anche in contatto con la soluzione nel pozzo.
    6. Tracciati record utilizzando un programma per computer fatto in casa o commerciale che si interfaccia con l'elettrodo (vedi tabella di materiali e attrezzature per i dettagli).Utilizzare una frequenza di campionamento di 2 Hz, con filtraggio del segnale mediante un filtro passa basso.
    7. Lasciare che il campione si stabilizzi per 5 minuti per produrre una linea di base piatta piana e stabile, o in prossimità durante la registrazione.
    8. Aggiungere 3 ml (magazzino mm 100 preparata in dH 2 O e portata a pH 7 con KOH, 1 mM concentrazione finale) MgATP al campione per attivare la proteina. Lasciare ~ 5 minuti per raggiungere una nuova linea di base stabile. Regolare sempre il pH della MgATP mM magazzino 100 in folle prima dell'uso per evitare variazioni del pH del tampone esterna.
    9. Aggiungere 3 ml di valinomicina magazzino (2 micron; 20 nM concentrazione finale) per il campione per smistare cambiamenti nella differenza di potenziale generata da ioduro selettivo conduttanza attraverso CFTR. Registrare la pendenza diminuzione (diminuzione mV) a causa di attività di ioduro efflusso CFTR-mediata per almeno 5 minuti.
    10. Per garantire che la cattura di ioduro nel lume proteoliposome era sufficiente, aggiungere 3 ml di 10% (v / v) Triton X-100 al campione. RILIEVOt e rilascio immediato ioduro indica che ioduro sufficiente è stata intrappolata nelle vescicole tale che cattura non è stato il fattore limitante per le variazioni di pendenza determinate 3.2.9, ma piuttosto l'attività CFTR-mediata.
    11. Lavare la barra elettrodo e mescolare a fondo con acqua deionizzata dopo il trattamento dei campioni con farmaco o con Triton X-100 per garantire tutte le tracce di questi reagenti sono stati rimossi per evitare la contaminazione del campione successivo.
    12. Preparare una serie di concentrazioni diluite KI nel micromolare di gamma nanomolare a tampone 9 (tampone K-Glu, vedi Tabella 1). Registrare la risposta mV dell'elettrodo per ciascuna concentrazione da 0 alla massima concentrazione preparata. Costruire una curva standard in cui la risposta della sonda (mV) viene tracciato rispetto log della concentrazione di ioduro molare. Utilizzare la curva standard per convertire la risposta mV della sonda durante l'esperimento efflusso alla concentrazione di ioduro rilasciato.
      NOTA: Preparare una cur calibrazioneve su base settimanale finché un utente è sicuro della rapidità della risposta dei cambiamenti sonda. Ci sarà una deriva nella risposta e la sensibilità della sonda nel tempo. Con l'invecchiamento della sonda, la risposta si degrada. Questo può essere parzialmente abrogata cambiando le soluzioni interne periodicamente e vasta lavaggio della punta della sonda in acqua dopo l'uso, che limiti probabili aderenza molecole alla superficie della sonda.
    13. Determinare la pendenza media della linea della concentrazione rispetto plot tempo per ciascun campione proteoliposome per gli ultimi 30 secondi prima dell'aggiunta MgATP, e dopo l'aggiunta di valinomicina ma prima dell'aggiunta di Triton X-100. Sottrarre la pendenza della linea di base dalla valinomicina per determinare l'attività di ioduro efflusso CFTR-mediata per quel campione.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Descritto in questa pubblicazione scritta sono metodi per purificare, ricostituire e misurare l'attività dei canali regolamentata della proteina CFTR. Figura 1a mostra il flusso di lavoro per la purificazione, la ricostituzione e le procedure di efflusso ioduro. Metodi per la ricostituzione e l'attività dei canali misure di flusso ioduro sono anche indicati in dettaglio nel video associato.

Purificazione e ricostituzione di CFTR in proteoliposomi

CFTR può essere espressa in modo funzionale ad alti livelli in S f 9 celle con baculovirus ricombinanti contenenti Wt o mutante CFTR cDNA 2. Pur non essendo un sistema di espressione di mammifero, CFTR è stata espressa utilizzando il sistema di baculovirus in S f 9 cellule per garantire un alto livello di espressione. Produzione CFTR può essere alto come l'1% del totale di proteine ​​cellulari 17,28. La S f 9- sistema baculovirus ha il vantaggio che la proteina è glicosilata ed il nucleoMacchine di controllo qualità in questo sistema è relativamente permissiva tale che CFTR e mutanti possono essere prodotti sulla superficie cellulare. Un tag dieci istidina è stato progettato sul terminale carbossi per permettere la purificazione in virtù di affinità di questo tag per nickel-NTA. Il tag C-terminale aiuta a prevenire co-purificazione di proteine ​​CFTR troncati ei rendimenti proteina CFTR funzionale in ATPasi, singolo canale e ioduri esperimenti efflusso 17,19,24,28,29. Tuttavia, il protocollo di purificazione descritto deve essere adatto per CFTR N-terminale tag pure.

In precedenza, è stato dimostrato che la proteina CFTR può essere efficacemente estratta da preparazioni di membrane plasmatiche S f 9 utilizzando NaPFO (sodio pentadecafluoro-ottanoato) a temperatura ambiente 15. Tuttavia, la suscettibilità di NaPFO precipitazione a 4 ° C, una temperatura favorevole alla conservazione proteina correttamente ripiegata e dialisi lunga richiesta per rimuovere PFO non erano suscettibili di rapmetodi di purificazione id e ricostituzione scopo di aumentare l'attività della proteina nei successivi saggi di funzione CFTR. Una valutazione di un panel di detergenti (compresi dodecil-β-D-maltoside (DDM), 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), fos -Colina 12 e fos -Colina 14, ha dimostrato che fos -Colina 14 è stato più efficace in solubilizzazione CFTR-La sua umana 10 da S F 9 membrane, e che DDM è stato efficace nel mantenimento dell'attività ATPasi di CFTR in soluzione detergente (dati non riportati). Così un fos -Colina 14 detergente fase di estrazione viene eseguita, seguito da cambio DDM detersivo per mantenere l'attività della proteina.

Dopo la purificazione e concentrazione, una frazione proteica è ottenuta in detergente DDM che contiene una banda ~ 150 kDa come componente principale (Figura 2; argento Stain). Questo peso molecolare corrispondente al CFTR umana espressa in S <em> 9cells F e analizzati mediante SDS-PAGE, ove manchi il tipo di complesso glicosilazione caratteristica della CFTR in cellule di mammifero. Le 150 specie kDa sembra essere circa il 90% puro seguente analisi SDS-PAGE e colorazione argento. Western blotting utilizzando l'anticorpo anti-CFTR M3A7 conferma che questo monoclonale di topo diretto contro NBD2 reagisce con la banda di 150 kDa (Figura 2; blot). In alcuni studi, tracce di componenti di peso molecolare inferiore sono presenti come gruppi minori visibili sul gel, a ~ 60 ~ 80 kDa (dati non mostrati). L'anticorpo anti-CFTR M3A7 reagisce con i gruppi 60 e 80 kDa, ma non reagisce con altre proteine ​​non-CFTR (dati non mostrati). Questo suggerisce che i componenti di peso molecolare inferiore sono CFTR prodotti di degradazione co-purificato con CFTR tramite il loro C-terminale sua tag. La purificazione viene eseguita in presenza di inibitori della proteasi e sembra che questi componenti sono presenti nelle cellule prima della procedura di purificazione is eseguita. La fase di concentrazione del procedimento elimina virtualmente tutti i contaminanti frammenti peso molecolare inferiore. CFTR può essere ricostituito a questo punto, o proteine ​​da un'altra procedura di purificazione può essere utilizzato nel protocollo ricostituzione.

Un test basato flusso liposomiale riporta la ricostituzione funzionale di una popolazione di molecole CFTR purificati e ricostituiti come regolati, canali selettivi anione

Per determinare se una percentuale significativa di CFTR purificata è stata ricostituita come canale di cloruro regolato utilizzando i metodi di cui sopra, un saggio flusso alogenuro proteoliposomal stato sviluppato che riporta l'attività di una popolazione di molecole CFTR ricostituiti (illustrati schematicamente in figura 1B). Se, nel peggiore dei casi, la maggior parte delle molecole CFTR ricostituiti sono mal ripiegate, queste molecole non riuscirà a conferire una conduttanza, non riescono a discriminare tra cationi e anionie / o il cancello mancherà regolamentazione da PKA fosforilazione e nucleotidi. Lee et al. Hanno pubblicato metodi che permettono la stima della percentuale ricostituzione funzionale di una proteina di membrana 30.

Liposomi vuoti (manca CFTR) o proteoliposomi (recanti ricostituito CFTR) vengono caricati con KI (75 mm) e ioduro extra-liposomiale scambiati con glutammato di potassio (75 mm), passando liposomi attraverso una colonna di gel filtrazione. Il KI caricato proteoliposomi vengono aggiunti a un pozzo contenente K-Glu (glutammato di potassio) per creare un gradiente verso l'esterno per ioduro e l'efflusso è monitorato come aumenti di ioduro extraliposomal nel tempo utilizzando un microelettrodi sensibile ioduro 24. L'efflusso di risultati ioduro carica negativa in una diminuzione del segnale mV (segnale diventa più negativo). Quando la concentrazione di ioduro rilasciato nel tempo viene tracciato, la pendenza si inverte (come nella figura 3) per mostrare un aumento di ioduro nel francosoluzione Ternal nel corso del tempo.

K-Glu è stato scelto come controione impermeant in quanto è un esempio di un anione che non passa attraverso la proteina CFTR, non sembra provocare una significativa blocco del poro nelle condizioni utilizzate, e non causa interferenze con la selettiva ioduro dell'elettrodo. Un test può essere ottimizzato in giro un'altra anione, a condizione che soddisfi questi criteri. Settantacinque concentrazioni di anioni mM sono stati selezionati empiricamente come concentrazioni che hanno dato buona cattura e segnali sufficienti per la misura nel test nelle condizioni descritte. Non ci sarà essenzialmente senza rilascio di ioduro di liposomi ioduro-caricati privi CFTR funzionale ricostituito fino a quando le vescicole sono permeabilizzate con detergente (Figura 3; controllo tracce), mentre CFTR ricostituito, proteoliposomi ioduro-caricato mediano ioduro rilasciare nella soluzione esterna dopo l'aggiunta di MgATP (1 mm) per aprire il canale CFTR e valinomicina(20 nM) per prevenire lo sviluppo di un potenziale di membrana (Figura 3A; vedere tracce di proteine: lipidi rapporto massa di 1: 3000 (w / w)).

Valinomicina è uno ionoforo che navette potassio specificamente attraverso la membrana, giù il suo gradiente di concentrazione e la concentrazione di 20 nM è stato scelto empiricamente come la più alta concentrazione che non perturba l'integrità del liposoma vuoto nel sistema attuale. Ciò può avere bisogno di essere ottimizzato per ogni sistema particolare. Senza aggiunta di valinomicina, vi è un rilascio ioduro abbreviato di pochi nM che raggiunge rapidamente un plateau (dati non mostrati). Sebbene queste condizioni sono noti per attivare diversamente massimo l'attività del canale anionico CFTR (come nella Figura 3A), risulta che la mancanza di una risposta significativa riflette l'istantanea aumento carica positiva intraliposomal mediato per conduzione ioduro attraverso l'anione poro selettiva di CFTR , immediatamente limitando continuous efflusso ioduro dove valinomicina non è incluso. Questa risposta valinomicina mediata conferma che efflusso ioduro era limitata nei precedenti esperimenti a causa di accumulo di carica, sostenendo la selettività anione di CFTR ricostituito. Se CFTR mancava questa selettività, sia di potassio e ioduro sarebbero stati in grado di efflusso da proteoliposomi di annullamento delle così la necessità di valinomicina di avviare il flusso.

Le concentrazioni di ioduro misurata in questi punti temporali iniziali erano empiricamente prescelto per rientrare nel campo di sensibilità ottimale per l'elettrodo di rilevamento di ioduro impiegato. L'uso di altri elettrodi ioduro può richiedere l'ottimizzazione di questi fattori. Dopo aver raggiunto un plateau, Triton X-100 viene aggiunto permeabilize i proteoliposomi e rilasciare ogni residuo ioduro trappola. A differenza delle misurazioni iniziali ioduro (ottenuti tra 1 e 2 minuti dopo l'aggiunta valinomicina), le letture a tali parametri sono nel range lineare dei cali elettrodiCurva brazione (dati non mostrati), precludendo così una valutazione accurata della frazione di liposomi da cui proteina CFTR è capace di mediare ioduro di efflusso rispetto al numero totale dei liposomi nel saggio, o la sua ricostituzione funzionale cento.

Il tasso di flusso ioduro riflette il numero di molecole di proteine ​​CFTR, la probabilità di apertura e la conduttanza unitaria di ciascun canale CFTR. Quindi, i tassi di efflusso ioduro dovrebbero dipendere dal numero e probabilità di apertura di ogni molecola CFTR. La predizione è stato testato in questo sistema, aumentando il numero di molecole CFTR per liposoma. Il rapporto tra attivata (fosforilata e MgATP trattata) proteina CFTR lipidi era varia, con i rapporti che vanno da 1: 300-1: 3000 (w / w) (Figura 3A). Maggiore è la quantità di CFTR ricostituito presente nelle proteoliposomi, maggiore è la velocità di efflusso (misurata tra 1-2 minuti dopo l'aggiunta valinomicina), sostenendo il pronostico ttassi di efflusso cappello dipendono dal numero di molecole CFTR in ogni liposomi. Il tasso di efflusso ottenuto utilizzando proteina specifica: rapporti lipidici sono riproducibili tra i giorni sperimentali e purificazioni di proteine, evidenziando così il rigore di questo metodo.

La velocità di efflusso ioduro sembra riguardare la probabilità di apertura del canale CFTR in questo sistema ricostituito. Come è richiesta fosforilazione da PKA per CFTR attivazione 31 (e la revisione del 32), si prevede che ci sarà un basso tasso di efflusso ioduro in vescicole contenenti CFTR che non è stata fosforilata da PKA trattamento esogeno, dove la probabilità di apertura è bassa . In proteoliposomi che sono stati trattati PKA, la probabilità di apertura sarà molto più alto, con un conseguente maggiore tasso atteso di efflusso. In pratica, per PKA-trattati CFTR in presenza di 1 mM MgATP in questo sistema, il tasso di efflusso ioduro misurata da uno a due minuti dall'aggiunta valinomycin è di circa quattro volte il tasso di proteina CFTR sottoposto a MgATP ma non PKA (Figura 3B). Questi risultati supportano l'ipotesi che il tasso di efflusso si riferiscono al canale probabilità di apertura. In pratica, può essere difficile confrontare l'attività in questo test direttamente per aprire probabilità, dato che altri fattori come il tempo cambia dipendenti nella forza trainante elettrochimico influenzeranno l'attività efflusso osservata. Il lettore è avvisato che questo test non è un sostituto per dettagliate singole registrazioni di attività di canale.

È interessante notare, vi è di solito osservato un basso tasso di efflusso ioduro da proteine ​​"fosforilata" in presenza di MgATP che è significativamente maggiore di efflusso da liposomi privi CFTR (Figura 3B, C). Questo basso tasso può riflettere fosforilazione basale CFTR nel S f sistema di espressione 9 celle prima di purificazione 33. CFTR purificato da altra espressione systems possono avere diversi livelli di fosforilazione basale e quindi diversa attività residua.

Questo rapidi rendimenti protocollo di purificazione Wt-CFTR da S f 9 celle a quasi omogeneità, tuttavia per F508del- e G551D-CFTR, il metodo è meglio descritta come una procedura di arricchimento. Alcune band contaminanti sono osservate tramite SDS-PAGE 19, molti dei quali riflettono CFTR prodotti di degradazione che sono reattivi agli anticorpi CFTR e sembrano essere presenti prima rottura delle cellule. I metodi di ricostituzione e di flusso ioduro sono adatti per questi campioni arricchiti di mutanti clinicamente rilevanti. Come mostrato nella figura 3D, significativa efflusso ioduro viene misurato sia F508del- (proteina: lipidi rapporto di massa di circa 1: 600) e G551D-CFTR (proteina: rapporto lipidi di circa 1: 300). Mentre entrambi i mutanti hanno un'attività più bassa in assoluto rispetto Wt-CFTR (proteina: lipidi rapporto di massa di 1: 1.200), è difficile confrontare i campioni direttamente come quantificazionenon può essere più precisi per i mutanti che sono contaminati con prodotti di degradazione CFTR. Tuttavia sia F508del CFTR-G551D e purificati mediante questi metodi, ricostituite e sottoposti a misurazione efflusso rispondere come previsto a piccole molecole potenziatori (Figura 4), ​​e mostrano canale funzione simile alla proteina purificata dal più rigoroso metodo di purificazione 19 PFO.

L'attività del canale di CFTR purificata e ricostituito può essere modulata da piccoli inibitori molecolari e potenziatori

CFTR inh -172 34 è l'inibitore CFTR più specifica disponibile che ha dimostrato di inibire la probabilità di apertura dei canali del cloro CFTR in singole misure di conduttanza del canale 35 e di inibire l'attività CFTR in altri studi 22,36. Come mostrato in Figura 3C, il tasso di efflusso dopo valinomicina aggiunta è significativamente ridotta dal pretrattamento con inh CFTR ub> -172. Quindi, questo dosaggio del canale attività di una popolazione di molecole CFTR purificati e ricostituiti è efficace nell'attività segnalazione di modulatori come il ligando CFTR inibitorio inh -172.

Il test è altamente sensibile e applicabile all'esame degli effetti del trattamento piccola molecola potenziatore pure. Come mostrato in Figura 4, tutti e tre genotipi CFTR testati sono notevolmente potenziati da piccole molecole attive potenziatori come Kalydeco / VX-770 o VRT-532 (Figura 4C; mostrato per G551D), mentre un analogo inattivo non ha alcun effetto sul efflusso ioduro l'attività di CFTR (indicato per F508del-CFTR; Figura 4B). Il test è applicabile all'esame della concentrazione potenziatore dipendenza, e il ruolo di ATP e fosforilazione sull'attività CFTR potenziatore-mediata.

27fig1highres.jpg "width =" 700px "/>
Figura 1:. Design Assay e workflow (A) Flusso di lavoro per il lavoro descritto in questa pubblicazione (B) Rappresentazione schematica dell'esperimento efflusso ioduro.. Una versione modificata del pannello B è stato originariamente pubblicato su The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; and Bear, CE fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR) Potenziatore VX-770 (Ivacaftor) Apre il difettoso canale Porta di Mutant CFTR in maniera fosforilazione-dipendente ma ATP-indipendente. 2012; 287: 36.639-36.649. © L'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare.

Figura 2
Figura 2:. La proteina Argento Wt-CFTR CFTR rendimenti procedura rapida purificazione purificata macchiato SDS-PAGE gel e Occidentemacchia ERN usando l'anticorpo M3A7 CFTR per purificata umana proteina Wt-CFTR in detersivo DDM (1 mg e 0,1 mg per il gel e macchia, rispettivamente), isolati da S f 9 celle over-esprimono un (suo) 10 -tagged versione di la proteina. Wt-CFTR (> 90% puro) viene rilevata a 150 kDa, appropriato per questa proteina priva glicosilazione complessa. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato su The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; and Bear, CE fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR) Potenziatore VX-770 (Ivacaftor) Apre il difettoso canale Porta di Mutant CFTR in maniera fosforilazione-dipendente ma ATP-indipendente. 2012; 287: 36.639-36.649. © L'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare.

Figura 3
Figura 3: ireport di analisi efflusso odide regolati attività del canale per la proteina CFTR purificata e ricostituito. (A) depurato e fosforilato Wt-CFTR ricostituito a proteina: rapporti lipidici di 1: 300 (w / w), 1: 1200 (w / w) e 1: 3000 (w / w) media l'efflusso di ioduro dal lume vescicole a il bagno di massa nel tempo dopo l'aggiunta di 1 MgATP mM e 20 nM valinomicina. L'aggiunta dello 0,1% (w / v) Triton X-100 per permeabilize le proteoliposomi rilasci intrappolati ioduro nel lume vescicola alla fine dell'esperimento. (B) ioduro corso tempo di efflusso iniziale per ricostituita proteina WT-CFTR che non era stata . (C) tassi di efflusso ioduro iniziale pre-fosforilate dimostrano la dipendenza dell'attività osservata sulla proteina CFTR funzionale. È necessaria PKA fosforilazione della proteina per l'attività del canale significativo, che è inibita dall'aggiunta dell'inibitore CFTR, CTTR inh -172 (20 mM). I dati sono mezzi ± SEM; * P <0.05, *** p <0,0001. (D) genotipi multipli producono segnali CFTR regolamentati test efflusso ioduro, tra cui in peso, F508del- e G551D-CFTR rispetto ai controlli. I dati sono mezzi ± SEM; * P <0,05; *** P <0,0004 vs controllo. Questa ricerca (porzioni di dati in pannelli A, C e D) è stato originariamente pubblicato su The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; and Bear, CE fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR) Potenziatore VX-770 (Ivacaftor) Apre il difettoso canale Porta di Mutant CFTR in maniera fosforilazione-dipendente ma ATP-indipendente. 2012; 287: 36.639-36.649. © L'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare.

Figura 4
Figura 4: Il potenziamento fosforilazione-dipendente di CFTR da piccole molecole può essere interrogato utilizzando lasistema di efflusso ioduro per in peso, F508del- e G551D-CFTR. (A) Wt-CFTR è potenziato in modo significativo il potenziatore VX-770 (10 micron), solo nello stato di PKA-fosforilata. I dati sono medie ± SEM, * p <0,01 vs. + PKA-VX-770. (B) VX-770 (10 pM), ma non un analogo inattivo, V-09-1188 (10 pM), potenzia notevolmente l'efflusso ioduro l'attività di fosforilata F508del-CFTR. I dati sono mezzi ± SEM, n = 3, *** p <0.001 vs -VX-770 (c) Potenziamento della G551D-CFTR da 10 micron VRT-532 o VX-770 di controllo.. I dati sono medie ± SEM, n = 5, ** p <0,001, *** p <0,0001 vs -VX-770 di controllo. Questa ricerca (pannelli ac) è stato originariamente pubblicato su The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; and Bear, CE fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR) Potenziatore VX-770 (Ivacaftor) Apre il difettoso canale Porta di Mutant CFTR in una fosforilazione-dipendente, ma ATP-indipendente Manner. 2012; 287: 36.639-36.649. © L'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare.

r> ight "> 7.4
Buffer Nome Contenuto pH Regolare il pH utilizzando
Buffer 1 2% fos -Colina 2% (w / v) fos -Colina 14 detergente in imidazolo 10 mM, HEPES 25 mM 7.4 Imidazolo / HEPES
Buffer 2 Imidazolo 10 mM Imidazolo 10 mM, HEPES 25 mM (senza detergente) 7.4 Imidazolo / HEPES
Buffer 3 10 imidazolo mM + DDM Imidazolo 10 mM, HEPES 25 mM, 1 mM dodecil-β-D-maltoside 7.4 Imidazolo / HEPES
Buffer 4 Imidazolo + DDM 50 mM Imidazolo 50 mM, HEPES 25 mM, 1 mM dodecil-β-D-maltoside 7.4 Imidazolo / HEPES
Buffer 5 Imidazolo + DDM 600 mm Imidazolo 600 mm, 25 HEPES mm, 1 mm dodecil-β-D-maltoside 7.4 Imidazolo / HEPES
Buffer 6 75 mm KI + DDM KI 75 mm, MOPS 20 mm, 1 mm dodecil-β-D-maltoside 7.4 KOH
Buffer 7 KI 75 mm KI 75 mm, 20 MOPS mM 7.4 KOH
Buffer 8 25 mM HEPES + DDM 25 mM HEPES, 25 mM NaCl, 1 mM dodecil-β-D-maltoside 7.4 HCl / NaOH
Buffer 9 75 mm K-Glu 75 mm K-glutammato, 20 MOPS mM KOH / acido glutammico
Buffer 10 15 KI mM 15 KI mM, 20 MOPS mM 7.4 KOH

Tabella 1: Tabella di buffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ci sono stati un numero limitato di protocolli di purificazione per tutta lunghezza, isolamento CFTR funzionale, da una varietà di sistemi iperespressione cellulari. Il metodo qui descritto è vantaggioso in quanto consente una rapida purificazione di Wt-CFTR o alto arricchimento di F508del- e G551D-CFTR in quantità moderate, che è altamente funzionale in saggi, tra cui ATPasi e misure dirette di funzione del canale, tra cui le misure a canale singolo a doppio strato planare sistemi e le misure dimostrato di funzione CFTR canale popolazione che sono molto importanti per lo studio di piccole molecole 19-21. Il metodo di purificazione è integrato in un protocollo rapido ed efficace ricostituzione, proteine ​​però purificato da altri metodi può essere accoppiato a questo protocollo ricostituzione e, a condizione che il detergente purificazione è suscettibile di rimozione in modo simile.

Al contrario di esperimenti monocanale complicate e scrupoloso da excpatch di membrana mellati, i metodi descritti permettono una valutazione robusta ma semplice di funzione del canale CFTR, ed unicamente questa misura riporta la funzione di un numero maggiore di canali CFTR, piuttosto che una o poche molecole. A differenza delle tecniche che comportano patch di membrana, questo metodo consente la valutazione diretta degli effetti di piccole molecola modulatori sul canale nel prossimo o completa assenza di proteine ​​associate, secondo l'efficacia della procedura di purificazione accoppiato.

Passaggi critici all'interno del protocollo

Anche se ci sono diversi passaggi critici nella ricostituzione funzionale del CFTR per l'analisi del flusso di anioni, le note indicate nel protocollo, ottimizzazione della proteina: rapporto di lipidi durante CFTR ricostituzione è la chiave. È necessario Tale ottimizzazione per ogni genotipo CFTR.

Modifiche e risoluzione dei problemi della tecnica

Le res mV di baseponse per la sonda utilizzata qui durante il saggio efflusso ioduro con campioni preparati come descritto è tipicamente -20 a -50 mV. Scostamenti significativi di questa gamma suggeriscono che ci potrebbero essere problemi con il campione. Altre sonde venduti dai diversi produttori possono differire dai linee guida fornite qui. Se una linea di base stabile non può essere raggiunto, il detersivo residuo o inattivo, denaturati, proteine ​​di scarsa qualità possono essere permeabilizzante le vescicole di ioduro.

Il mancato di rilevare una variazione significativa del tasso di valinomicina dipendente ioduro efflusso da liposomi contenenti CFTR fosforilata in presenza di MgATP possono riflettere diverse questioni, le quali devono essere esaminati. Questi problemi includono: scarsa qualità, CFTR parzialmente denaturato o CFTR impura; rimozione incompleta del detersivo durante ricostituzione; proteine ​​non ottimale: rapporto lipidi in proteoliposomi; o valinomicina insufficiente aggiunto, rendendo carica dissipazione incomplete.

La isaggi efflusso odide offre la flessibilità di utilizzare proteine ​​CFTR pre-fosforilato (come descritto nel protocollo), oppure CFTR fosforilata durante il dosaggio. Se la proteina non è stata ricostituita fosforilata durante la procedura di purificazione, il campione può essere fosforilata durante l'esperimento efflusso ioduro al punto 3.2.7, mediante aggiunta di PKA con il MgATP. In questo caso assicurarsi che la linea di base viene registrato per almeno 5 minuti per assicurare che la proteina è stato sufficientemente fosforilato dall'enzima PKA prima funzione di misura con aggiunta di valinomicina. Risultati simili sono ottenuti con entrambi i metodi.

Durante il protocollo, la molecola modulatore è permesso di interagire con la proteina CFTR per 5 minuti prima della misurazione dell'attività mediante aggiunta di MgATP quindi Valinomicina. Come la maggior parte dei modulatori CFTR sono liposolubili, può richiedere tempo tra oltre al bagno e l'equilibrio di associazione con la proteina CFTR. Il test non può procedere senza the aggiunta di valinomicina, e quindi non perdere nessuna informazione eseguendo il test in questo modo. Nelle situazioni in cui l'utente non è preoccupato che ci può essere un ritardo prima interazione della piccola molecola con la proteina, il saggio può essere eseguito mediante l'aggiunta del modulatore acuta dopo l'aggiunta di valinomicina, mentre ancora nella fase iniziale del tasso la misurazione.

Limitazioni della tecnica

Come detto in precedenza, questo saggio basato flusso proteoliposomal di canale attività regolamentata da una popolazione di molecole CFTR full-length purificati e ricostituiti fornisce un metodo unico per interrogare ligandi che modificano direttamente l'attività. Tuttavia, il metodo è limitato in quanto non fornisce comprensione del meccanismo attraverso cui ligandi cambiare la velocità di flusso attraverso CFTR. Idealmente, il dosaggio proteoliposomal flusso di CFTR purificata e ricostituito deve essere usato in combinazione con il labbro planarestudi id doppio strato di attività singolo canale. Questa combinazione fornirebbe comprensione dello stato della proteina che lega i ligandi, cioè l'apertura e / o chiusura.

Significative in relazione a metodi esistenti

Attualmente vi è una carenza di metodi per valutare l'interazione diretta di piccole molecole con il canale CFTR contro piccole modulatori molecole che interagiscono con un altro componente cellulare di modificare indirettamente l'attività dei canali, ad esempio, attraverso una modulazione o via di segnalazione o interruzione di importanti proteina-proteina interazioni. Il metodo efflusso ioduro dimostra interazione diretta con la proteina di qualsiasi piccola molecola che modula l'attività del canale di CFTR. Nonostante la bassa velocità modalità delle misure, resta notevole valore in questi metodi unici per studiare l'interazione diretta di CFTR con piccole molecole potenziatori e correttori. Molti piccoli molecule modulatori sono in fase di sviluppo da entrambi i gruppi accademici e l'industria farmaceutica per il trattamento di pazienti affetti da FC clinico, in quanto questo è l'obiettivo principale della ricerca CF corrente. Si prevede che i metodi qui descritti aiuteranno nello sviluppo e convalida del meccanismo d'azione dei più promettenti di queste molecole.

Le future applicazioni della tecnica

I metodi impiegati qui sono anche molto suscettibili di adattamento al altre proteine ​​di interesse. Infatti una modifica dei metodi descritti è stato impiegato per studiare due P. proteine ​​di membrana aeruginosa implicati nel movimento di substrati anionici attraverso la membrana 26,27, dimostrando l'utilità e la versatilità di questi metodi. Il loro uso nello studio dei canali e trasportatori anionici aggiuntivi è previsto in futuro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori riconoscono i consigli del Dr. Mohabir Ramjeesingh durante lo sviluppo dei metodi di purificazione qui descritti. Questi studi sono stati supportati da sovvenzioni di funzionamento a CEB dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e fibrosi cistica Canada (CFC). PDWE è stato sostenuto in parte da premi Fellowship attraverso il CIHR e CFC. Gli autori riconoscono la fornitura di correttore, potenziatore e inibitori composti da Dr. R. Bridges (Rosalind Università di Medicina e Scienze) e distribuzione Fibrosi Cistica Therapeutics Fondazione (CFFT). Gli autori riconoscono anche un servizio eccezionale dalla coltura cellulare strumento Baylor (NIH concessione P30 CA125123) nell'esprimere Wt e proteina CFTR mutata con il sistema baculovirus. Il inattiva VX-770 analogico, V-09-1188, era un dono di Vertex Pharmaceuticals.

Acknowledgments

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fos-choline 14 detergent Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) F312 Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche (www.roche-applied-science.com) 04 693 132 001 EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack  Roche (www.roche-applied-science.com) 05 892 791 001
Ni-NTA Agarose Qaigen GmbH 1018240
Fisherbrand Screening columns Fisher Healthcare 11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K Millipore (www.millipore.com) UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840051C
POPC Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 850457C
PS, Porcine Brain Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840032C CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 841118C
Ergosterol Sigma (www.sigmaaldrich.com) 45480
Pierce Detergent removal spin column Thermo Scientific 87779 1 ml capacity columns
valinomycin Sigma (www.sigmaaldrich.com) V-0627
VX-770 (ivacaftor) Selleck Chemicals S1144
iodide selective microelectrode Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) LIS-146ICM  
 
 
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
Clampex 8.1 software Axon Instruments (www.axon.com) we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System  Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) LIS-146LICM-XS Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars Big Science Inc (www.stirbars.com) SBM-0502-CMB choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine GE Health Care (www.gelifesciences.com) 17-0042-01
Sonicator Laboratory Supplies Co, Inc. G112SP1G Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50, (1), 233-248 (2011).
  2. Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68, (4), 809-818 (1992).
  3. Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
  4. Genetic Analysis Consortium. http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
  5. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245, (4922), 1073-1080 (1989).
  6. Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2, (8), 1253-1261 (1993).
  7. Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148, (1-2), 164-274 (2012).
  8. Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148, (1-2), 150-163 (2012).
  9. Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419, (1-2), 41-60 (2012).
  10. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365, (18), 1663-1672 (2011).
  11. Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270, (28), 17033-17043 (1995).
  12. Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
  13. Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267, (36), 26142-26149 (1992).
  14. Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4, (2), 95-100 (1993).
  15. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327, (1), 17-21 (1997).
  16. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, (37), 39051-39057 (2004).
  17. Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
  18. Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
  19. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, (44), 36639-36649 (2012).
  20. Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54, (24), 8693-8701 (2011).
  21. Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21, (5), 666-678 (2014).
  22. Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78, (3), 411-418 (2010).
  23. Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8, (2), 153-171 (2009).
  24. Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418, (1), 185-190 (2009).
  25. Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3, (2), 119-121 (2004).
  26. Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (32), 13083-13088 (2011).
  27. Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4, (5), e00678-e00613 (2013).
  28. Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. Academic Press. 337-357 (2010).
  29. Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75, (6), 1430-1438 (2009).
  30. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387, (5), 1055-1060 (2009).
  31. Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268, (15), 11304-11311 (1993).
  32. Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
  33. Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271, (45), 28463-28468 (1996).
  34. Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110, (11), 1651-1658 (2002).
  35. Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136, (6), 659-671 (2010).
  36. Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89, (4), 417-425 (2004).
Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).More

Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter