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Biology

成长型测定和遗传需求生化确认的蛋白质降解 Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/52428
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital
* These authors contributed equally

Abstract

调节蛋白的降解是几乎每一个细胞功能的关键。大部分所了解的分子机制和真核细胞的蛋白质降解基因的要求，最初成立于酿酒酵母 。蛋白质降解的经典分析都依赖于生化脉冲追踪和放线菌酮追方法。尽管这些技术提供了敏感装置，用于观察蛋白降解，它们是费力，费时，并且低通量。这些方法不适合于快速或大规模筛选突变防止蛋白质降解。这里，酵母生长为基础的检测为浅显鉴定为蛋白降解基因的要求进行说明。在该测定中，需要对特定的选择条件下生长记者酶融合到一种不稳定的蛋白。细胞缺乏内源性报告酶，但表达该融合蛋白可以在塞莱生长只有当融合蛋白被稳定莫如条件下（ 即 ，当蛋白质的降解受到损害）。在这里所描述的生长测定，野生型和突变体的酵母细胞携带的质粒编码的融合蛋白的系列稀释液点样到选择性和非选择性培养基。选择条件下的生长是由给定的突变降解减值一致。增加蛋白质丰度应生化证实。一种酵母蛋白在适合电泳和免疫印迹形式的快速提取方法也证实。甲生长基于读出的蛋白质稳定性，并以简单的协议，用于蛋白提取用于生化分析，有利于快速鉴定对蛋白降解的基因的需求。这些技术可以适用于监视各种短命的蛋白质的降解。在呈现的例子中，HIS3酶，这是需要组氨酸的生物合成，融合到Deg1 -Sec62。Deg1 -Sec62是针对退化后异常从事内质网位子。细胞窝藏Deg1 -Sec62-HIS3能够选择性条件下生长时，蛋白质被稳定化。

Introduction

选择性蛋白质降解是对真核生命至关重要，并且改变的蛋白质降解有助于若干医疗条件，其中包括几种类型的癌症，神经变性疾病，心血管疾病，和囊性纤维化1-5。泛素-蛋白酶体系统（UPS），其催化选择性的蛋白质降解，是在这些条件6-10一个新兴的治疗靶点。泛素连接酶共价连接的76个氨基酸的泛素蛋白质11的聚合物。已标有泛素链蛋白识别并〜2.5 megadalton 26S蛋白酶体蛋白水解12。已经在模型真核生物酿酒酵母 （芽殖酵母）发起的研究已经基本在真核细胞中的蛋白质降解机理的阐明。 UPS的首次展示的生理基板是酵母转录抑制MATα213，UPS的14，和许多高度保守的成分被首次发现或特征酵母（ 如 15-26）。在这种多功能和基因听话的模式生物中发现的有可能继续提供重要见解泛素介导的降解机制保守。

识别大多数UPS基板和降解需要多种蛋白质的一致行动。因此，在表征一个给定的不稳定蛋白的调节的降解的一个重要目标是确定蛋白水解基因的需求。经典方法（ 例如脉冲追踪和放线菌酮追踪实验27），用于监测蛋白降解在哺乳动物或酵母细胞是费力和耗时的。虽然这些类型的方法中，用于检测蛋白质的降解提供高度敏感的装置，它们不适合用于蛋白降解或大规模screeni快速分析纳克的突变，防止蛋白质的降解。这里，酵母生长为基础的检测的快速鉴定为不稳定的蛋白质的降解的遗传要求提出。

在酵母生长系的分析方法，蛋白降解，感兴趣（或降解信号）不稳定的蛋白质融合，在帧中，对所需要的特定环境下酵母生长的蛋白质。其结果是一种人工基质，可作为一种强大的工具，以确定所关注的不稳定蛋白的蛋白质降解的遗传要求。便利地，最常用的实验室酵母菌株怀有突变的基因编码涉及的特定氨基酸或含氮碱（ 例如 20,28-30）的生物合成的代谢酶的小组。这些酶可用于在不存在在其合成中的酶参与外源提供的代谢物的细胞增殖至关重要。这样因而代谢酶可充当生长基记者不稳定蛋白质的降解与它们稠合。对蛋白降解的基因的需求可以容易地阐明，因为突变阻止蛋白水解将允许细胞窝藏降解记者选择条件下生长。

生长优势是一个间接指示特定的突变增加目的蛋白质的丰度。然而，直接生化分析，以确认突变允许的增长，通过增加蛋白质的水平，而不是通过间接的或人为的原因。在蛋白丰度突变的作用可能是通过稳态蛋白水平的细胞和不怀有特定突变蛋白质印迹分析来确定。一种酵母蛋白的快速高效提取（酵母细胞用氢氧化钠和样品缓冲的顺序孵化）在适当的形式方法通过免疫印迹分析也提出了31。总之，这些实验有助于快速识别蛋白质降解的候选人监管机构。

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Protocol

1.酵母生长试验，以确定候选人突变体有缺陷的蛋白质降解

  1. 变换的野生型和突变体的酵母细胞用质粒编码融合不稳定蛋白质，在帧中，记者代谢酶。
  2. 接种在5ml合成的定义（SD）的基本培养基中是选择性的细胞窝藏质粒分子的转化体。孵育过夜，在30℃，旋转。
  3. 测量在每个过夜培养物在600nm（OD 600）的光密度。
    注：按照过夜温育后，细胞在培养中可在任一对数或稳定生长期，但应已达到一个最小的OD 600为0.2。非常缓慢生长的酵母菌株，可能需要的孵育时间长于一晚，或接种的更大数目的细胞，如根据经验确定。
  4. 制备转化的酵母细胞的6倍连续稀释在无菌96孔板，与细胞稀释至开始ñOD 600为0.2。将每个酵母转化体中，在96孔板不同行待测定。
    1. 对于每一个转化体，计算稀释细胞至0.2的OD 600在200微升最终体积所需过夜培养物的体积。过夜培养这个体积添加到相应井柱1.添加无菌水适量使体积为200微升。
    2. 用于酵母中的每一行，在列2，3和4中添加125微升无菌水到孔中。
      注：独立包装的无菌96孔板可与无菌盖包装。盖子可以用作藏为分布在这个步骤中的无菌水。这允许无菌水同时传输到所有孔中一个给定列用多通道移液器。
    3. 通过上下吹打用多通道移液器混合的第一列（酵母稀释至OD 600为0.2）的内容。
    4. TRANSF呃25微升酵母从第1列至第2列，采用了多通道移液器。通过上下吹打混匀。转移25微升从第2列到第3列，以及25微升从第3列到第4列（混合以及在每一个步骤）。
  5. 混合用多通道移液器各样品。从最稀进行到至少稀酵母，吸管4微升各样品的柱到含有适当的选择培养基两个板。使用一个板中维持质粒的选择（这个板块作为酵母斑点和生长控制）。使用第二板介质，其选择用于融合到报道酶不稳定蛋白的质粒保持和表达。因为酵母沉降快速，通过上下抽吸混合细胞定期。
    注：干燥机板会更容易吸收液体比新制备的板，因此推荐用于这些实验。湿板可以通过在室温下孵育在LO被干燥瓦特湿度下1 - 2天或更短的孵育在层流罩。板可干不均匀，如果空气层流平行于板凳。使用模板可以更容易地发现酵母细胞在固定距离。两个样品模板在图1中提供的，这些可以被印刷，切出，并固定在培养皿盖的内侧。
  6. 允许板晾干在板凳上面。
  7. 孵育板在30℃下进行2 - 6天。
  8. 拍摄培养后各板。

图1
图1.模板为察觉酵母细胞到100毫米的琼脂平板上。这些模板可以用来促进在与多通道移液器规则距离斑点酵母。模板可以被打印，切出，并固定在培养皿盖的内侧。将培养皿中生长中内盖与模板贴。模板都标有一个缺口，以追踪定位。因此建议在生长测定中使用板可以同样标有一个缺口以跟踪方向。模板察觉四（A）或五个（B）提供了酵母细胞的连续稀释， 请点击这里查看这个数字与100毫米的模板的打印版本。

酵母生长试验2.生化确认

  1. 酵母细胞和后碱性蛋白抽提增长（从31修改）
    1. 变换的野生型和突变体的酵母细胞用质粒编码不稳定的蛋白质。
    2. 在5毫升的SD培养基是选择性的细胞窝藏质粒分子的接种转化体。孵育过夜，在30℃，旋转。
    3. 测量每个隔夜立方米的OD 600lture。
      注：培养过夜后，细胞可在任一对数或稳定生长期，但应已达到的OD 600，其将允许稀释至0.2在10毫升新鲜的选择性培养基（步骤2.1.4）的外径600。非常缓慢生长的酵母菌株，可能需要的孵育时间长于一晚，或接种的更大数目的细胞，如根据经验确定。
    4. 稀释的酵母细胞，以0.2的10ml新鲜的选择性培养基的OD 600。
    5. 继续孵育细胞在30℃，旋转或摇动，直到培养物达到OD 600 0.8和1.2之间（ 即在中期对数生长）。
      注意：如果感兴趣的不稳定的蛋白质是一个可调节的启动子的控制下，诱导蛋白表达和细胞收获的最佳时机可以根据以往的研究或经验观察不一。
    6. 收集2.5 OD 600单位文化在一个15毫升的锥形人管离心5000 xg离心5分钟，在室温下进行。吹打或抽吸去除上清液。
      注：600单元被以1.0的OD 600定义为酵母的存在量在1ml培养的一个外径。 V = 2.5的OD 600单位/测量的OD 600：培养（以毫升）收获2.5的OD 600单位（Ⅴ）所需的体积可以使用以下等式来确定
    7. 重悬的细胞在1ml蒸馏水中。转移的悬浮细胞至微量离心管。
    8. 通过离心沉淀细胞在6500×g离心30秒，在室温下进行。吹打或抽吸去除上清液。
    9. 重悬的细胞在100μl蒸馏水通过上下抽吸或涡旋，并加入100微升的0.2M NaOH中。通过上下吹打混匀。孵育样品5分钟，在室温下进行。
    10. 丸细胞（其中大部分尚未释放的蛋白质和仍然存活）离心18000×克5分钟。吹打或抽吸去除上清液。
    11. 重悬沉淀在50 - 100微升1×Laemmli样品缓冲液，将细胞裂解，通过上下吹打或涡旋。
      注意：使用Tris-甘氨酸电泳缓冲液系统和免疫印迹在pH用十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）兼容除去碱性上清液以下离心并将细胞在Laemmli样品缓冲液的后续再悬浮的提取物的蛋白质。
    12. 要充分使蛋白质变性，孵育裂解物在95℃下5分钟。
      注意：当在95℃下温育聚集倾向的蛋白（ 例如，蛋白的几个跨膜片段）可能成为不溶性的。因此，裂解物应在较低温度下孵育（ 例如 37℃ - 70℃）10 - 30分钟，因为经验确定，这样的蛋白质的分析。
    13. 凉爽裂解物通过放置在冰上5分钟。
    14. 离心裂解物在18000×g离心，在室温下1分钟以沉淀不溶物质。取上清液（溶解提取的蛋白质）通过SDS-PAGE之前，随后的免疫印迹分析（2.2节）分开。可替代地，存储裂解物在-20℃。
  2. 代表西方的印迹协议
    1. 加载裂解物的经验确定的体积的SDS-PAGE凝胶。
    2. 运行凝胶在200V直到染料前沿到达凝胶的底部。
    3. 在4℃下90分钟 - 从凝胶到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜通过湿转印转移蛋白在20 V 60。
    4. 块膜孵育在5％脱脂乳的Tris缓冲盐水（TBS）中，摇摆，进行1小时，在室温下过夜或在4℃下。
    5. 倒出封闭溶液。
    6. 孵育膜用1％脱脂乳的TBS特异于感兴趣蛋白质一级抗体（或表位标签体）用0.1％吐温20（TBS / T）1小时，在室温德mperature，摇摆。
    7. 滗抗体溶液，并用TBS / T洗膜3×5分钟，在室温下，摇摆。
    8. 孵育膜用适当的荧光团共轭的二级抗体在1％脱脂乳的TBS / T为1小时，在室温下，摇摆。
      注意：由于荧光团是光敏感，荧光团共轭抗体的稀释度应在黑暗中来制备。另外，在荧光团共轭抗体的存在膜的孵化应发生在遮光容器中。这可以通过包装孵育塔板在铝箔来完成。
    9. 滗抗体溶液，并用TBS / T洗膜3×5分钟，在室温下，摇摆。
    10. 收购膜采用LI-COR奥德赛CLX和图像Studio软件（或类似的影像设备和软件）的图像，根据制造商的建议。
    11. 成像膜后，孵育该膜与特异于负载的第一抗体在室温下1小时，以1％脱脂牛奶的TBS / T控制时蛋白质，摇摆。
    12. 滗抗体溶液，并用TBS / T洗膜3×5分钟，在室温下，摇摆。
    13. 孵育膜用适当的荧光团共轭的二级抗体在1％脱脂乳的TBS / T为1小时，在室温下，摇摆。
    14. 滗抗体溶液，并用TBS / T洗膜3×5分钟，在室温下，摇摆。
    15. 收购膜采用LI-COR奥德赛CLX和图像Studio软件（或类似的影像设备和软件）的图像，根据制造商的建议。

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Representative Results

为了说明这种方法，在HIS3酶已被稠合到模型内质网（ER）相关退化的羧基末端（ERAD）基板，Deg1 -Sec62（ 图2A）来创建Deg1 -Sec62-HIS3（ 图3） 。Deg1 -Sec62代表在与位子持续，异常协会有针对性一类新的ERAD基板的创始成员之一，该通道主要负责跨ER膜32-34动蛋白。此类不稳定蛋白已经暂时被称为ERAD-T（对于易位子相关）衬底。以往的研究表明，当异常位子接合，Deg1 -Sec62由Hrd1泛素连接酶（ 图2B-D）32，34，35针对降解。需要其他Hrd1基材的降解的因素似乎是可有可无的<EM> Deg1 -Sec62降解，这表明了一种新的降解机构32。下受损脂质结合和延长位子关联，载脂蛋白B的条件下，哺乳动物的低密度脂蛋白的蛋白质成分，似乎是由一个相关的机制36-38劣化。因此，Deg1 -Sec62可用于医学相关位子相关蛋白的降解提供了有用的模型。

野生型和hrd1Δ酵母细胞缺乏染色体HIS3基因转化用空载体39或质粒编码Deg1 -Sec62-HIS3和点样到选择性生长培养基（ 图4）。以确认转化的酵母细胞的数目相等转移至板，将细胞样到培养基缺乏色氨酸（其选择用于细胞窝藏质粒），但含组氨酸。观察到所有转化的酵母细胞相似的生长。表达Deg1 -Sec62-HIS3细胞预期在不存在组氨酸的只有当融合蛋白被稳定增长 ​​（即当ERAD-T被损害）。的确，hrd1Δ酵母表达Deg1 -Sec62-HIS3呈现增长相对于上介质缺乏色氨酸和组氨酸的表达Deg1 -Sec62-HIS3的野生型细胞中的优势。然而，标记的融合蛋白依赖性生长中观察到，即使在Hrd1存在缺乏组氨酸。为了提高测定的严格性，介质缺乏组氨酸补充有3-氨基-1H-1,2,3-三唑（3-AT）的HIS3酶40的竞争性抑制剂。酵母表达Hrd1增长非常糟糕的补充1中缺乏组氨酸 - 2毫米3-AT;当HRD1被删除，细胞生长恢复。 3-AT的夹杂物以3毫明显抑制所有细胞的生长，而不管Hrd1的存在或不存在的浓度。这些水库 ULTS与Hrd1依赖的基质降解是一致的。

接着，Deg1 -Sec62-HIS3蛋白的稳态丰度在酵母表达或缺乏Hrd1酶直接测试。 Western印迹分析表明在Deg1 -Sec62-HIS3和Deg1 -Sec62蛋白在酵母hrd1Δ相对于野生型细胞（ 图5）可比较的增加。这证实了对于Hrd1中两种蛋白质的水平的调节作用。 Deg1 -Sec62的Hrd1依赖降解后进行蛋白质异常接合ER位子32。重要的是，Deg1 -Sec62-HIS3异常啮合以类似的方式（未公布的数据）的易位子，进一步证实使用Deg1 -Sec62-HIS3的作为生长基记者Deg1 -Sec62降解特异性和位子相关通 ​​常蛋白质。

的“> 图2
图2：模型Deg1 -Sec62之后异常位子参与退化（A）Deg1 -Sec62 Deg1（从MATα2氨基端67个氨基酸）的示意图描述之后，顺序，由旗（F）表位，2-跨膜质网（ER）的蛋白质Sec62和S的两个副本金黄色葡萄球菌蛋白A（PRA）。为清楚起见，该融合蛋白被称为Deg1 -Sec62。（B）按照它的两个跨膜片段的正常插入ER膜，Deg1 -Sec62与易位子持久相互作用触发异常，Deg1依赖性位子接合。的最初胞质氨基末端尾部的一部分异常入射-并有可能保持在-的位子。（℃）按照异常位子engagemenT，Hrd1承认和泛素Deg1 -Sec62。红色圆圈表示泛素分子。（D）的 Deg1 -Sec62然后从ER膜中提取和降解的蛋白酶，有可能减轻位子阻塞。

图3
图3：Deg1 -Sec62-HIS3的下列异常位子接合示意性描绘 Deg1之后，按顺序，由标志（F）的表位，2-ER跨膜蛋白Sec62中，S的两个副本金黄色葡萄球菌蛋白A（PRA），和酵母HIS3酶。为清楚起见，该融合蛋白被称为Deg1 -Sec62-HIS3。

图4
图4：熔合HIS3到Deg1 （HRD1）和hrd1Δ酵母转化用空载体或质粒编码Deg1 -Sec62-HIS3的连续稀释液点样到介质缺乏色氨酸，介质缺乏色氨酸和组氨酸和中缺乏色氨酸和组氨酸辅以3-氨基1H-1,2,3-三唑（3-AT），HIS3的竞争性抑制剂，在指定的浓度。 请点击此处查看该图的放大版本。 。

图5
图5：Deg1 -Sec62和Deg1 -Sec62-HIS3的细胞缺乏Hrd1增加丰度蛋白质提取物来自野生型（+）和hrd1Δ制备（Δ）的酵母表达Deg1 -Sec62或Deg1 -Sec62-HIS3。蛋白质（相当于0.125的OD 600单位）通过SDS-PAGE分离，随后通过Western印迹用兔抗小鼠次级抗体，其直接结合的融合蛋白的蛋白A的表位。随后印迹与特异性抗体Pgk1基因提供了一个装载控制。

表1：本研究中使用的解决方案和缓冲器。

解组件评论
合成定义（SD）最小酵母中 2％葡萄糖，无氨基酸的0.67％酵母氮​​碱，0.002％腺嘌呤，0.004％尿嘧啶，0.002％精氨酸，0.001％组氨酸，0.006％异亮氨酸，0.006％亮氨酸，0.004％的赖氨酸，0.001％的蛋氨酸，0.006％苯丙氨酸，0.005 ％苏氨酸，0.004％色氨酸。为固体（片）介质，包括2％琼脂。 1.选择性培养基制备通过省略APpropriate氨基酸（S）或含氮碱。
为方便起见，这些成分可以被保持为浓储备溶液如下。氨基酸可以被保持为包含所有所需的氨基酸100X原液。酵母氮基可被保持在一个20X原液（13.4％）。葡萄糖可以保持在40％的储液。腺嘌呤和尿嘧啶可被维持为1％的储备溶液在0.1M NaOH中。
3.高压灭菌介质。
1X Laemmli样品缓冲液 2％SDS，10％甘油，5％β巯基乙醇，60毫摩尔Tris盐酸pH值为6.8，0.008％溴酚蓝 1. 1X样品缓冲液通常是通过稀释更浓缩的（例如，5X）库存制备。
2.染料溴酚蓝可加入到所希望的强度。 A“捏”（从刮刀的边缘抽头很小量）通常是足够的。
0.2M的氢氧化钠制备在水中。氢氧化钠反应玻璃。因此，对于长期储存，0.2M氢氧化钠应保持在塑料容器中。
的Laemmli电泳缓冲液（5X） 125毫摩尔Tris，960 mM的甘氨酸，0.5％SDS中为了准备1升1X的Laemmli的电泳缓冲液，稀释1：5的dh 2 O
三醋酸-SDS传输缓冲区（5X） 125毫摩尔Tris醋酸盐（pH 8.8），960毫甘氨酸，0.05％SDS的为了准备20升1X Tris乙酸盐，SDS的转移缓冲液，结合4升5倍的股票，4升甲醇和12升的dh 2 O
10X Tris缓冲盐水（TBS）中 500毫米的Tris，1.5 M氯化钠;调节pH至7.5 为了准备1升1X TBS，淡化1:10在卫生署2 O. 1X TBS可以补充与洗涤剂吐温-20和脱脂奶粉，作为合适的。
<TD> leu2-3,112
菌株名称别号相关基因型图来源
VJY6 MHY500 的MATa 图4和5 Chen等人，1993年
HIS3，Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
GAL2
VJY10 的MATa 图4和5 这项研究
his3-Δ200
ura3-52
lys2-801
trp1-1
GAL2
hrd1 :: kanMX4

可应要求提供本研究中所用的酵母菌株的建设细节：表2。

质粒号码全质粒名称人物来源
pVJ30 pRS414-P MET25 -Deg1 -flag，Sec62-2xProtA 五鲁宾斯坦等人，2012
pVJ121 pRS414-P MET25（与MET25子空载体） 4 Mumberg等，1994年
pVJ467 pRS414-P MET25 -Deg1 -flag，Sec62-2xProtA，HIS3 五这项研究
pVJ477 pRS414-P GAL4 -Deg1 -flag-Sec62-2xProtA，HIS3 4 这项研究

表3：在本研究中使用的质粒注意，所有质粒含有酵母着丝粒，以允许在酵母细胞中的复制，所述TRP1基因用于选择在酵母细胞中，并且是AmpR基因在细菌细胞中维持。质粒图谱，序列和结构的细节可根据要求提供。

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Discussion

这里介绍的方法允许快速测定和蛋白质降解酵母细胞中的遗传要求生物化学确认。这些实验中突出酵母的效用和权力作为一种模式真核生物（协议的处理，存储和操纵酵母细胞（ 如酵母41-44生物学的几个优秀的审查和汇编），可用于调查新的生物体）。的技术可以很容易地被应用到调查的各种类的蛋白质的降解和丰富。例如，其他人已采用这种策略来表征不稳定胞质，细胞核和ER腔和跨膜蛋白45-49的降解机制。

几个因素，必须在代谢酶的选择考虑到熔合到一种不稳定的蛋白。首先，这是至关重要的，该基因的功能性版本编码酶不存在于宿主基因组中。以最小化假阳性结果（选择条件下生长，即 ，当不稳定的蛋白质实际上是退化）时，建议用窝藏不可回复的报告基因（优选完整基因缺失）50的突变体等位基因的菌株工作。对于报告酶选择另一个考虑是竞争性抑制剂，其可以包括在选择性生长培养基中，以减少背景生长，提高测定严紧的可用性。这甚至可以在全功能退化机制的存在是蛋白质案件相对较低的周转率是有用的。在这里介绍的代表性实验，包括3-AT，其竞争性地抑制了HIS3酶，可使背景增长40。类似地，化合物6-氮尿嘧啶抑制的Ura3，需要尿嘧啶生物合成51的酶。该抑制剂浓度而增长发生在退化-Defective，但不是野生型，细胞必须根据经验来确定。某些代谢酶也可反选对。下计数器选择性的条件下，细胞可以生长仅在不稳定的蛋白质被降解（与熔融代谢酶是不存在的）。例如，转换的Ura3化合物5-氟乳清酸（5-FOA）的有毒化合物，5-氟尿嘧啶52。细胞表达的Ura3融合蛋白仅将在5-FOA存在下生长，如果的Ura3融合蛋白被降解。类似地，化合物5-氟邻氨基苯甲酸（5- FAA）是有毒的细胞具有功能性的色氨酸生物合成途径。 5-联邦航空局因此可用于反选择细胞表达TRP1融合蛋白53。反选择策略可以是用于降解-损害突变抑制器的识别是有用的。

用于驱动降解记者的表达的启动子也必须仔细地选择。 biosynth的最低水平客位酶可以是足以支持生长在不存在外源提供的代谢物，一个弱启动子，推荐54。在这里提出的有代表性的实验中，GAL4启动子，其被压制在葡萄糖55的存在下，用于促进Deg1 -Sec62-HIS3的转录。压制条件下（ 即 2％葡萄糖）根据该融合蛋白的基础表达足以支持选择性条件下生长（ 即不存在组氨酸和1的存在- 2mM的3-AT）时的降解机制被禁用。然而，蛋白水平足以支持生长下选择条件都可能是低于检测通过蛋白质印迹的阈值。因此，可能有必要驱动表达用弱启动子的生长实验和用于生化确认更强的启动子。在Deg1 -Sec62（带或不带HIS3融合），更ROBUS的情况下吨启动子（这里，MET25启动子39）所需的蛋白可视化通过western分析。

如这里所描述的，基于酵母的生长测定，可于一个小规模的，候选为基础的方法来进行。酵母细胞的系列稀释液制备的96孔板，并通过移液以固体生长培养基转移;用于稀释的酵母细胞悬浮液的效率和可重复性转印到固体介质的另一种方法是使用一个多针复制器，通常被称为一个“青蛙”56。理想的时间来拍摄板将随酵母菌株和条件。建议拍摄时从增长最快的培养菌落以最稀点首先成为可见的给定板。这通常是在该点在样本中的生长速率的差异是最明显的。它可能是可取的拍照上多天，尤其是在酵母的情况下表现出广泛的增长率。

生长基于报告基因分析，也可以适用于大规模的分析。例如，劣化报告可以被引入一市售的采用合成遗传阵列（SGA）技术46,57〜5000可行单倍体酵母基因缺失株文库。在该技术中，单倍体酵母菌株与染色体整合的代谢报道融合蛋白配合到基因缺失文库的每个应变。得到的二倍体细胞被诱导形成孢子（经过减数分裂），进行选择的单倍体减数分裂后代窝藏无论是代谢记者与个人基因缺失。这些菌株，然后转移集体到中等选择性的细胞，其中所述蛋白质已经稳定。作为用于小规模分析，如果与在蛋白质降解作用的基因被删除，融合蛋白将被稳定化，和细胞生长将得到加强。一个可比pproaches已经制定，允许大量收集菌株染色体外维持质粒的同时改造;这个策略避免了染色体融合，交配，产孢和减数分裂选择54。

当一个突变被发现以赋予生长优势的细胞窝藏代谢记者，有必要生物化学确认突变增加目的蛋白质的丰度。一种快速，可靠的酵母溶解过程中，密切改编自Kuhsnirov 31的方法，提出了。该协议允许蛋白的直接适用于由印迹分析的形式提取。对于给定的蛋白质的分析，溶胞产物的量，以每孔，丙烯酰胺凝胶性质，选择的膜，其使用的抗体和稀释液，和检测方法的必须凭经验确定被加载。代表印迹协议描述UTilizes共轭荧光染料的二抗;其它常用协议依赖于化学发光依赖于抗体结合的酶58。如这里描述的，用于检测所关注的蛋白质的膜可以直接再次探测与抗体为加载的对照蛋白质。如果用来检测感兴趣和装载对照蛋白的蛋白质的初级抗体已经提出来自相同物种，再杂交膜是可能的，只要从这些蛋白质所产生的条带不共迁移。然而，如果用来检测感兴趣和装载对照蛋白的蛋白质的初级抗体已经提出来自不同物种的相同的膜可以依次探测，即使带共迁移，如果二次抗体已经缀合至荧光基团与不同的发射波长。在的情况下的利益和装载对照蛋白共迁移和各自的初级抗体的蛋白质已RAISED来自相同物种，样品可以在两个SDS-PAGE凝胶，转移到PVDF膜上解决，并用特异于兴趣和装载对照蛋白的蛋白的抗体分别探测。可替换地，加载一致性可通过温育的膜与非特异性蛋白质污渍（ 例如考马斯或丽春红）来判断。此外，代表印迹协议假定由初级和次级抗体孵育顺序检测的蛋白质或表位，因为是典型的。在代表性的结果进行分析的融合蛋白包含来自金黄色葡萄球菌的蛋白A衍生的两个表位（PRA在图2和3）。 A蛋白直接结合到哺乳动物的免疫球蛋白，因此可以单独（ 即无一抗孵育步骤是必需的）59采用二次抗体检测。这是可能的融合记者酶的可能影响蛋白丰度或退化。因此，建议以生化确认使用版本基板支配由报告蛋白的结果。最后，这里描述的两个测定依赖于作为用于在蛋白质稳定性差的代理在稳态蛋白质水平的差异。因为蛋白质丰度反映了蛋白质的合成和降解，进一步的生化分析（ 例如放线菌酮追或脉冲追踪实验）的速率的整合必须采用直接分析的蛋白质的动态降解轮廓。

代表结果建立了一种新的这个协议的应用程序的蛋白质降解基因要求的确定是异常啮合ER位子。Deg1 -Sec62，HIS3赋予的选择条件下的酵母生长优势时，降解途径被灭活（ 即缺席Hrd1泛素连接酶的）。一种快速，可靠的蛋白质前牵引法，随后通过Western印迹法确认在没有Hrd1的增加丰Deg1 -Sec62（有或没有HIS3）的。以往的研究表明，易位子相关蛋白的Hrd1依赖性降解机制不同于那些其他Hrd1 ER腔或跨膜基板32。今后的工作将采用大规模的遗传屏幕Deg1 -Sec62，HIS3融合蛋白，以确定需要这种独特的降解机理的新基因。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

我们感谢鲁宾斯坦实验室的现任和前任成员提供支持和热情的科研环境。我们感谢瑞安T.吉布森在协议优化的援助。我们感谢马克Hochstrasser（耶鲁大学）和迪特·沃尔夫（斯图加特大学）的酵母菌株和质粒。我们感谢我们的匿名审稿人对他们在改善这个手稿的清晰度和实用的帮助。这项工作是由希格玛西的州立巴尔大学章SGW研究奖的支持，卫生授予国家研究院​​（R15 GM111713）为EMR，一个州立巴尔大学向往研究奖，以EMR，资金从波尔州立大学教务办公室和生物学系。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole Fisher Scientific AC264571000 Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) Roche 11088726001 May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped Sarstedt 82.1581.001 Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl Gilson F14401 Available from a variety of manufacturers
 
 
 

 
Name Company Catalog Number Comments
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl Gilson F14403 Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216 Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.
Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) Bio-Rad 170-8195 A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater Fisher Scientific 1172011AQ Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

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分子生物学，第96，泛素 - 蛋白酶体系统，
成长型测定和遗传需求生化确认的蛋白质降解<em&gt;酿酒酵母</em
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Watts, S. G., Crowder, J. J.,… More

Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (96), e52428, doi:10.3791/52428 (2015).

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