Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vækst-baserede Bestemmelse og biokemisk Bekræftelse af genetiske Krav til proteinnedbrydning i Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/52428
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital
* These authors contributed equally

Abstract

Reguleret proteinnedbrydning er afgørende for stort set alle cellulære funktion. Meget af det, man ved om de molekylære mekanismer og genetiske krav til eukaryot protein nedbrydning blev oprindeligt etableret i Saccharomyces cerevisiae. Klassiske analyser af proteinnedbrydning har påberåbt sig biokemiske puls-chase og cycloheximid-chase metoder. Selv om disse teknikker giver følsomme midler til observation proteinnedbrydning, er de besværlige, tidskrævende, og lav-throughput. Disse metoder er ikke egnede til hurtig eller storstilet screening for mutationer, der forhindrer proteinnedbrydning. Her er en gær vækst-assay for facile identifikation af genetiske krav til proteinnedbrydning beskrevet. I dette assay er en reporter enzym, der kræves for vækst under specifikke selektive betingelser fusioneret til et ustabilt protein. Celler, som mangler det endogene reporterenzym men udtrykker fusionsproteinet kan vokse under Selective betingelser, når fusionsproteinet er stabiliseret (dvs. når proteinnedbrydning er kompromitteret). I vækstassay beskrevet her, er seriefortyndinger af vildtype og mutant gærceller indeholdende et plasmid, der koder for et fusionsprotein plettet på selektive og ikke-selektive medium. Vækst under selektive betingelser er i overensstemmelse med nedbrydning forringelse ved en given mutation. Øget protein overflod bør biokemisk bekræftes. En fremgangsmåde til hurtig ekstraktion af gærproteiner i en form egnet til elektroforese og Western blotting er også vist. En vækst-baseret udlæsning for proteinstabilitet, kombineret med en enkel protokol til proteinekstraktion til biokemisk analyse, muliggør hurtig identifikation af genetiske krav til proteinnedbrydning. Disse teknikker kan tilpasses til at overvåge nedbrydningen af ​​en række af kortlivede proteiner. I det præsenterede eksempel HIS3 enzym, som er nødvendig for histidin-biosyntese, blev fusionerettil Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 er målrettet til nedbrydning efter det afvigende indgreb det endoplasmatiske reticulum translocon. Celler, der huser Deg1 -Sec62-His3 var i stand til at vokse under selektive betingelser, når proteinet var stabiliseret.

Introduction

Selektiv proteinnedbrydning er afgørende for eukaryot liv og ændret proteinnedbrydning bidrager til en række medicinske tilstande, herunder adskillige former for kræft, neurodegenerativ sygdom, cardiovaskulær sygdom og cystisk fibrose 1-5. Ubiquitin-proteasom-system (UPS), der katalyserer selektiv proteinnedbrydning, er en ny terapeutisk mål for disse betingelser 6-10. Ubiquitin-ligaser covalent vedhæfte polymerer af 76-aminosyre ubiquitin til proteiner 11. Proteiner, der er markeret med multiubiquitinkæder anerkendes og proteolyseret af ~ 2,5 megadalton 26S proteasom 12. Undersøgelser indledt i modellen eukaryote organisme Saccharomyces cerevisiae (spirende gær) har været grundlæggende i opklaringen af protein nedbrydningsmekanismer i eukaryote celler. Den første demonstreret fysiologiske substrat af UPS var gæren transskriptionsrepressor MATα2 13Blev 14, og mange højt konserverede dele af UPS først identificeret eller kendetegnet ved gær (fx 15-26). Opdagelser gjort i denne alsidige og genetisk medgørlig model organisme vil sandsynligvis fortsætte med at give vigtige indsigter i konserverede mekanismer ubiquitinmedieret nedbrydning.

Anerkendelse og nedbrydning af de fleste UPS substrater kræver samordnet indsats af flere proteiner. Derfor er et vigtigt mål i karakterisere det regulerede nedbrydning af en given ustabilt protein er at bestemme de genetiske krav til proteolyse. Klassiske tilgange (f.eks puls-chase og cycloheximid-chase eksperimenter 27) til overvågning proteinnedbrydning i mammale eller gærceller er besværlige og tidskrævende. Selv om disse typer af metode giver meget følsomme midler til detektering af proteinnedbrydning, er de ikke egnet til hurtig analyse af proteinnedbrydning eller storstilet flotationng for mutationer, der forhindrer proteinnedbrydning. Her er en gær vækst-assay for hurtig identifikation af genetiske krav til nedbrydning af ustabile proteiner præsenteres.

I gærvækst-baserede metode til analyse af proteinnedbrydning, en ustabil protein af interesse (eller nedbrydning signal) er fusioneret i ramme til et protein, der er nødvendig for gær vækst under særlige omstændigheder. Resultatet er et kunstigt substrat, der kan tjene som et effektivt værktøj til at bestemme de genetiske krav proteinnedbrydning af den ustabile protein af interesse. Hensigtsmæssigt mest almindeligt anvendte laboratorium gærstammer huser et panel af mutationer i gener, der koder metaboliske enzymer involveret i biosyntesen af særlige aminosyrer eller nitrogenholdige baser (f.eks 20,28-30). Disse enzymer er essentielle for cellulær proliferation i fravær af eksogent leveret metabolitter i hvis syntese enzymerne deltage. Sådanmetaboliske enzymer kan således fungere som vækst-baserede reportere til nedbrydning af ustabile proteiner, hvortil de er fusioneret. De genetiske krav til proteinnedbrydning let kan belyses, da mutationer, der forhindrer proteolyse vil tillade celler, der huser nedbrydningen reporter til at vokse under selektive betingelser.

En vækst fordel er en indirekte indikation af, at en bestemt mutation øger overflod af proteinet af interesse. Dog er direkte biokemisk analyse forpligtet til at bekræfte, at en mutation tillader vækst gennem øget protein niveauer i stedet for via indirekte eller artefakt årsager. Effekten af ​​en mutation på protein overflod kan bekræftes ved Western blot analyse af steady-state proteinniveauer i celler, og andre ikke gør havn særlig mutation. En fremgangsmåde til hurtig og effektiv ekstraktion af gærproteiner (sekventiel inkubering af gærceller med natriumhydroxid og prøvepuffer) i en form egnettil analyse ved Western blotting præsenteres også 31. Tilsammen udgør disse eksperimenter lette en hurtig identifikation af kandidat regulatorer af protein nedbrydning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Gær Vækst Assay at identificere kandidatlandene Mutanter Defekte i proteinnedbrydning

  1. Omdan vildtype og mutante gærceller med et plasmid, der koder for et ustabilt protein fusioneret i ramme til en reporter metabolisk enzym.
  2. Podes transformanter i 5 ml syntetisk defineret (SD) minimalmedium, der er selektiv for celler, der huser plasmidmolekyler. Inkuber natten over ved 30 ° C, roterer.
  3. Mål den optiske densitet ved 600 nm (OD 600) for hver kultur dyrket natten over.
    BEMÆRK: Efter inkubering natten over, kan celler i kultur være i enten logaritmisk eller stationære vækstfase, men skal have nået en minimal OD 600 på 0,2. Meget langsomtvoksende gærstammer kan kræve inkuberingstider længere end en nat, eller podning af et større antal celler, som bestemt empirisk.
  4. Forbered seks-fold seriefortyndinger af transformerede gærceller i en steril 96-brønds plade, der begynder med celler fortyndet til enn OD 600 på 0,2. Placer hver gærtransformant der skal analyseres i en anden række i 96-brønds plade.
    1. For hver transformant, beregne mængden af overnight kultur nødvendig for at fortynde celler til en OD600 på 0,2 i et slutvolumen på 200 ul. Tilføj denne mængde af natten over kultur til det tilsvarende godt i kolonne 1. Derpå tilsættes en passende mængde sterilt vand for at bringe volumen til 200 pi.
    2. For hver række af gær tilsættes 125 pi sterilt vand til brøndene i kolonne 2, 3 og 4.
      BEMÆRK: Individuelt indpakkede sterile plader med 96 brønde kan være pakket med sterile låg. Lågene kan anvendes som reservoirer for sterilt vand, der er fordelt i dette trin. Dette muliggør samtidig overførsel af sterilt vand til alle brønde i en given søjle med en multikanalpipette.
    3. Bland indholdet af den første søjle (gær fortyndet til en OD600 på 0,2) ved at pipettere op og ned med en multikanalpipette.
    4. TransfER 25 pi gær fra kolonne 1 til kolonne 2, ved hjælp af en multikanal pipette. Bland ved at pipettere op og ned. Overfør 25 pi fra kolonne 2 til kolonne 3, og 25 pi fra kolonne 3 til kolonne 4 (blande godt på hvert trin).
  5. Bland hver prøve med en multikanal pipette. Proceeding fra de fleste fortyndet til mindst fortynde søjler af gær, pipette 4 pi af hver prøve på to plader indeholdende det passende selektive medie. Brug en plade med medium, der opretholder plasmidet markering (denne plade tjener som en gær spotting og vækst kontrol). Brug en anden plade med medium, der selekterer for plasmid vedligeholdelse og ekspression af den ustabile fusioneret til reporterenzymet. Fordi gær afregne hurtigt blandes celler ved at pipettere op og ned med regelmæssige mellemrum.
    BEMÆRK: Tørretumbler plader vil lettere absorbere væske end frisklavet plader og er derfor anbefales til disse forsøg. Damp plader kan tørres ved inkubation ved stuetemperatur i low fugtighed i 1 - 2 dage eller kortere inkubationer i en laminar flow hætte. Pladerne kan tørre ujævnt hvis laminar luftstrøm er parallel til bænken. Anvendelse af en skabelon gør det lettere at få øje på gærceller med regelmæssige afstande. To skabeloneksemplerne er tilvejebragt i figur 1. Disse kan udskrives, skåret ud og fastgjort til indersiden af en petriskål låg.
  6. Lad pladerne tørre på bænken toppen.
  7. Pladerne inkuberes ved 30 ° C i 2 - 6 dage.
  8. Fotografere hver plade efter inkubation.

Figur 1
Figur 1. Skabeloner til spotting gærceller på 100 mm agarplader. Disse skabeloner kan anvendes til at lette spotting gær med regelmæssige afstande med en multikanalpipette. Skabeloner kan udskrives, skåret ud og fastgjort til indersiden af ​​en petriskål låg. Placer petriskål med vækstmediet inden låg med skabelon anbragt. Skabeloner er markeret med et hak til at spore orientering. Det anbefales, at pladerne anvendes i vækstassays lignende måde mærket med et hak til at spore orientering. Skabeloner til at spotte fire (A) eller fem (B) serielle fortyndinger af gærceller leveres. Klik her for at se en version af dette tal med 100 mm skabeloner.

2. Biokemisk Bekræftelse af gærvækst Assay

  1. Vækst af gærceller og Post-Alkaline Protein Extraction (modificeret fra 31)
    1. Omdan vildtype og mutante gærceller med et plasmid, der koder for den ustabile protein.
    2. Podes transformanter i 5 ml SD medium, der er selektiv for celler, der huser plasmidmolekyler. Inkuber natten over ved 30 ° C, roterer.
    3. Mål OD 600 af hver overnight culture.
      BEMÆRK: Efter inkubering natten over, kan celler i enten logaritmisk eller stationære vækstfase, men skal have nået en OD600, der medfører fortynding til en OD600 på 0,2 i 10 ml frisk selektivt medium (trin 2.1.4). Meget langsomtvoksende gærstammer kan kræve inkuberingstider længere end en nat, eller podning af et større antal celler, som bestemt empirisk.
    4. Fortynd gærceller til en OD 600 på 0,2 i 10 ml frisk selektivt medium.
    5. Fortsæt med at inkubere celler ved 30 ° C, drejes eller rystning, indtil kulturerne nå en OD600 mellem 0,8 og 1,2 (dvs. er i midten af logaritmisk vækst).
      BEMÆRK: Hvis den ustabile proteinet af interesse er under kontrol af en regulerbar promotor, kan den optimale timing af induktion af proteinekspression og cellehøst variere ifølge de foregående undersøgelser eller empiriske observationer.
    6. Saml 2,5 OD 600 enheder af kultur i en 15-ml keglesnital rør ved centrifugering ved 5000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten ved pipettering eller aspiration.
      BEMÆRK: En OD600 enhed defineres som den mængde af gær til stede i 1 ml kultur ved OD 600 på 1,0. Mængden af kultur (i ml), der kræves for at høste 2,5 OD 600 enheder (V) kan bestemmes ved hjælp af følgende ligning: V = 2,5 OD 600 enheder / Målt OD 600
    7. Resuspender celler i 1 ml destilleret vand. Overførsel suspenderede celler til et mikrocentrifugerør.
    8. Pelletere cellerne ved centrifugering ved 6.500 x g i 30 sekunder ved stuetemperatur. Fjern supernatanten ved pipettering eller aspiration.
    9. Resuspender celler i 100 pi destilleret vand ved pipettering op og ned eller hvirvelbehandling, og tilsæt 100 ul 0,2 M NaOH. Bland ved at pipettere op og ned. Inkuber prøver i 5 minutter ved stuetemperatur.
    10. Pellet-celler (hvoraf de fleste har endnu ikke frigivet proteiner, og som stadig levedygtige) ved centrifugering ved 18.000 xg i 5 minutter. Fjern supernatanten ved pipettering eller aspiration.
    11. Resuspender pellet i 50 til 100 pi 1x Laemmli-prøvebuffer, som vil lysere celler, ved at pipettere op og ned eller vortexing.
      BEMÆRK: Fjernelse af alkalisk supernatant efter centrifugering og efterfølgende resuspension af celler i Laemmli prøvepuffer ekstrakter proteiner ved en pH-værdi kompatibel med natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under anvendelse af en Tris-glycin drift puffersystem og western blotting.
    12. For fuldt ud at denaturere proteiner, inkuberes lysater ved 95 ° C i 5 min.
      BEMÆRK: Aggregering-tilbøjelige proteiner (f.eks proteiner med flere transmembrane segmenter) kan blive uopløselige, når de inkuberes ved 95 ° C. Derfor bør lysater inkuberes ved lavere temperaturer (f.eks 37 ° C - 70 ° C) i 10 - 30 min, som bestemmes empirisk, til analyse af sådanne proteiner.
    13. Cool lysater ved at placere på is i 5 minutter.
    14. Centrifugér lysater ved 18.000 xg i 1 min ved stuetemperatur for at pelletere uopløseligt materiale. Adskil supernatant (solubiliseret ekstraheret protein) ved SDS-PAGE før efterfølgende Western blot-analyse (afsnit 2.2). Alternativt gemme lysater ved -20 ° C.
  2. Repræsentant Western Blotting protokol
    1. Load empirisk mængde af lysater i en SDS-PAGE-gel.
    2. Kør gel ved 200 V, indtil farvefronten har nået bunden af ​​gelen.
    3. Overfør proteiner fra gel til polyvinylidenfluorid (PVDF) membran ved våd overførsel ved 20 V for 60-90 min ved 4 ° C.
    4. Block membran ved inkubation i 5% skummetmælk i Tris-saltvand (TBS), rocking, i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
    5. Dekanteres blokerende opløsning.
    6. Inkuber membranen med primært antistof specifikt for proteinet af interesse (eller epitopmærke deraf) i 1% skummetmælk i TBS med 0,1% Tween-20 (TBS / T) i 1 time ved stuetemperatur temperature, vuggende.
    7. Antistof opløsning dekanteres og vaskes membranen 3 x 5 min med TBS / T ved stuetemperatur rocking.
    8. Inkuber membranen med passende fluorofor-konjugeret sekundært antistof i 1% skummetmælk i TBS / T i 1 time ved stuetemperatur, rocking.
      BEMÆRK: Da fluoroforer er lysfølsom, skal fortyndinger af fluoroforen-konjugerede antistoffer fremstilles i mørke. Derudover bør inkubering af membraner i nærvær af fluoroforen-konjugerede antistoffer forekommer i lystætte beholdere. Dette kan opnås ved at vikle inkubationsbetingelser bakker i aluminiumsfolie.
    9. Antistof opløsning dekanteres og vaskes membranen 3 x 5 min med TBS / T ved stuetemperatur rocking.
    10. Hent billede af membran under anvendelse Li-Cor Odyssey CLX og Billede Studio software (eller sammenlignelig imaging udstyr og software), i overensstemmelse med producentens anbefalinger.
    11. Efter billeddannelse membran inkuberes membranen med et primært antistof specifikt for en belastninging kontrol protein i 1% skummetmælk i TBS / T i 1 time ved stuetemperatur, rocking.
    12. Antistof opløsning dekanteres og vaskes membranen 3 x 5 min med TBS / T ved stuetemperatur rocking.
    13. Inkuber membranen med passende fluorofor-konjugeret sekundært antistof i 1% skummetmælk i TBS / T i 1 time ved stuetemperatur, rocking.
    14. Antistof opløsning dekanteres og vaskes membranen 3 x 5 min med TBS / T ved stuetemperatur rocking.
    15. Hent billede af membran under anvendelse Li-Cor Odyssey CLX og Billede Studio software (eller sammenlignelig imaging udstyr og software), i overensstemmelse med producentens anbefalinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at illustrere denne metode har HIS3 enzymet er fusioneret til carboxyterminalen af modellen endoplasmatiske reticulum (ER) -associeret nedbrydning (ERAD) substrat Deg1 -Sec62 (figur 2A) for at skabe Deg1 -Sec62-His3 (figur 3) . Deg1 -Sec62 repræsenterer en af grundlæggerne af en ny klasse af ERAD substrater, der er målrettet efter vedvarende, afvigende tilknytning til translocon, kanalen har hovedansvaret for at flytte proteiner over ER membranen 32-34. Sådanne ustabile proteiner er foreløbigt blevet kaldt ERAD-T (for translocon-associeret) substrater. Tidligere undersøgelser viser, at ved afvigende translocon indgreb er Deg1 -Sec62 målrettet til nedbrydning af Hrd1 ubiquitin ligase (figur 2B-D) 32, 34, 35. Faktorer, der kræves til nedbrydning af andre Hrd1 substrater synes at være undværlige for <em> Deg1 -Sec62 nedbrydning, hvilket tyder på en ny forringelse mekanisme 32. Under tilstande med nedsat lipid bindende og langvarig translocon forening, apolipoprotein B, proteinkomponenten af pattedyr low-density lipoprotein, ser ud til at blive nedbrudt af et beslægtet mekanisme 36-38. Derfor kan Deg1 -Sec62 en nyttig model for nedbrydning af medicinsk relevante translocon-associerede proteiner.

Vildtype- og hrd1Δ gærceller, der mangler det kromosomale HIS3-genet, blev transformeret med en tom vektor 39 eller et plasmid, der koder Deg1 -Sec62-His3 og spottet på selektivt vækstmedium (figur 4). At bekræfte, at lige mange transformerede gærceller blev overført til plader blev celler plettet på medium, der mangler tryptophan (som selekterer for celler, der huser plasmid), men indeholdende histidin. Tilsvarende vækst blev observeret for alle transformerede gærceller.Celler, som udtrykker Deg1 -Sec62-His3 forventedes at vokse i fravær af histidin, når fusionsproteinet er stabiliseret (dvs. når ERAD-T er kompromitteret). Faktisk hrd1Δ gær udtrykker Deg1 -Sec62-His3 udviste en vækstfordel forhold til vild-type celler, der udtrykker Deg1 -Sec62-His3 på medium uden tryptophan og histidin. Imidlertid mærket fusion-protein-afhængig vækst i fravær af histidin blev observeret selv i nærværelse af Hrd1. For at øge stringensen af assayet blev medium, der manglede histidin suppleret med 3-amino-1H-1,2,3-triazol (3-AT), en kompetitiv inhibitor af HIS3 enzymet 40. Gær udtrykker Hrd1 voksede meget dårligt på medium, der mangler histidin suppleret med 1 - 2 mm 3-AT; da HRD1 blev slettet, var cellevækst genoprettet. Optagelse af 3-AT i en koncentration på 3 mM dramatisk inhiberede vækst af alle celler, uanset nærvær eller fravær af Hrd1. Disse res ÜLTS er i overensstemmelse med Hrd1-afhængig substrat nedbrydning.

Dernæst blev steady-state overflod af Deg1 -Sec62-His3 protein i gær udtrykker eller mangler Hrd1 enzym direkte afprøvet. Western blotting-analyse viste en tilsvarende stigning i Deg1 -Sec62-His3 og Deg1 -Sec62 protein i hrd1Δ gær i forhold til vildtypeceller (figur 5). Dette bekræfter en rolle for Hrd1 i reguleringen af ​​niveauer af begge proteiner. Hrd1-afhængig nedbrydning af Deg1 -Sec62 provenu efter proteinet afvigende indgreb ER translocon 32. Vigtigere er det, Deg1 -Sec62-His3 aberrerende tilkobler translocon på en lignende måde (upublicerede data), hvilket yderligere validering af anvendelsen af Deg1 -Sec62-His3 som en vækst-baserede reporter for nedbrydning af Deg1 -Sec62 specifikt og translocon-associerede proteiner generelt.

s "> Figur 2
Figur 2:.. Model for nedbrydning af Deg1 -Sec62 efter afvigende translocon engagement (A) Skematisk visning af Deg1 -Sec62 Deg1 (de aminoterminale 67 aminosyrer fra MATα2) følges, i rækkefølge, ved Flag (F) epitop Den 2-transmembrane endoplasmatiske reticulum (ER) protein sec62, og to kopier af S. aureus Protein A (PRA). For klarhedens skyld er fusionsproteinet benævnt Deg1 -Sec62. (B) Efter normal indsættelse af sine to transmembrane segmenter i ER-membranen, vedvarende interaktion Deg1 -Sec62 med translocon udløser unormal, Deg1 -afhængig translocon engagement. En del af den oprindeligt cytosole aminoterminale hale afvigende træder-og sandsynligvis forbliver inden-for translocon. (C) Efter unormale translocon engagement, Hrd1 anerkender og ubiquitylates Deg1 -Sec62. Røde cirkler angiver ubiquitin-molekyler. (D) Deg1 -Sec62 ekstraheres derefter fra ER-membranen og nedbrydes af proteasomet, sandsynligvis lindre translocon obstruktion.

Figur 3
Figur 3:. Skematisk visning af Deg1 -Sec62-His3 efter afvigende translocon engagement Deg1 følges i rækkefølge af Flag (F) epitop, 2-transmembrane ER protein sec62, to kopier af S. aureus Protein A (PRA), og gær His3 enzym. For klarhedens skyld er fusionsproteinet benævnt Deg1 -Sec62-His3.

Figur 4
Figur 4: Fusing His3 til Deg1 (HRD1) og hrd1Δ gær transformeret med en tom vektor eller et plasmid, der koder Deg1 -Sec62-His3 blev spottet på medium, der mangler tryptophan, medium uden tryptophan og histidin og medium uden tryptophan og histidin suppleret med 3-amino-1H-1,2,3-triazol (3-AT), en kompetitiv inhibitor af His3, ved de angivne koncentrationer. Klik her for at se en større udgave af dette tal .

Figur 5
Figur 5:. Øget overflod af Deg1 -Sec62 og Deg1 -Sec62-His3 i celler, der mangler Hrd1 Proteinekstrakter blev fremstillet fra vild type (+) og hrd1Δ(Δ) gær udtrykker Deg1 -Sec62 eller Deg1 -Sec62-His3. Proteiner (svarende til 0,125 OD600-enheder) blev separeret ved SDS-PAGE, efterfulgt af Western blotting med kanin-anti-muse-sekundære antistoffer, der direkte binder protein A epitoper af fusionsproteinerne. Efterfølgende western blotting med antistoffer specifikke for PGK1 giver en belastning kontrol.

Tabel 1: Løsninger og buffere anvendt i denne undersøgelse.

Opløsning Komponenter Kommentarer
Syntetisk Defineret (SD) Minimal Gær Medium 2% dextrose, 0,67% gærnitrogenbase uden aminosyrer, 0,002% adenin, 0,004% uracil, 0,002% arginin, 0,001% histidin, 0,006% isoleucin, 0,006% leucin, 0,004% lysin, 0,001% methionin, 0,006% phenylalanin, 0,005 % threonin, 0,004% tryptophan. For faststof (plade) medium, indbefatter 2% agar. 1. Selektiv medium fremstilles ved at udelade apmæssig aminosyre (r) eller nitrogenholdige baser.
2. For nemheds skyld kan disse ingredienser opretholdes som koncentrerede stamopløsninger som følger. Aminosyrer kan opretholdes som 100X stamopløsning indeholdende alle de ønskede aminosyrer. Gærnitrogenbase kan opretholdes i en 20X stamopløsning (13,4%). Dextrose kan opretholdes i en 40% stamopløsning. Adenin og uracil kan opretholdes som 1% stamopløsninger i 0,1 M NaOH.
3. steriliseres mediet ved autoklavering.
1X Laemmli prøvebuffer 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-mercaptoethanol, 60 mM Tris-HCI pH 6,8, 0,008% bromphenolblåt 1. 1X prøvepuffer ofte fremstillet ved fortynding af en mere koncentreret (f.eks 5X) lager.
2. Farvestoffet bromphenolblåt kan tilsættes til den ønskede intensitet. A "pinch" (meget lille mængde tappet fra kanten af ​​en spatel) er typisk tilstrækkelig.
0,2 M natriumhydroxid Forbered i vand. Natriumhydroxid reagerer med glas. Derfor, for langtidsopbevaring, 0,2 M natriumhydroxid bør opretholdes i plastbeholdere.
Laemmli Running Buffer (5x) 125 mM Tris, 960 mM glycin, 0,5% SDS At forberede 1 L 1X Laemmli løbebuffer, fortyndes 1: 5 i dH2O
Tris Acetate-SDS Transfer Buffer (5x) 125 mM Tris-acetat (pH 8,8), 960 mM glycin, 0,05% SDS Til fremstilling 20 L 1X Tris-acetat-SDS overførselsbuffer, kombinere 4 L 5X stock, 4 L af methanol, og 12 L af dH 2 O
10X Tris-bufret saltvand (TBS) 500 mM Tris, 1,5 M NaCl; pH justeret til 7,5 For at forberede 1 L 1X TBS, fortyndes 1:10 i dH 2 O. 1X TBS kan suppleres med detergent Tween-20 og skummetmælkspulver, som er relevant.
<td> leu2-3,112
Strain Navn Alias Relevant Genotype Tal Kilde
VJY6 MHY500 MATa 4 og 5 Chen et al., 1993
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
GAL2-
VJY10 MATa 4 og 5 Denne undersøgelse
his3- Δ 200
ura3-52
lys2-801
trp1-1
GAL2-
hrd1 :: KanMX4

Tabel 2:. Gærstammer anvendt i denne undersøgelse Konstruktionsdetaljer er tilgængelige efter anmodning.

Plasmid Number Fuld Plasmid navn Figur Kilde
pVJ30 pRS414-P MET25 -Deg1 -flag-Sec62-2xProtA 5 Rubenstein et al. 2012
pVJ121 pRS414-P MET25 (tom vektor med MET25 promoter) 4 Mumberg et al., 1994
pVJ467 pRS414-P MET25 -Deg1 -flag-Sec62-2xProtA-His3 5 Denne undersøgelse
pVJ477 pRS414-P GAL4 -Deg1 -flag-Sec62-2xProtA-His3 4 Denne undersøgelse

Bemærk plasmider, der anvendes i denne undersøgelse, at alle plasmider indeholder en gær centromer at tillade replikation i gærceller, TRP1-genet til selektion i gærceller, og AmpR genet for vedligeholdelse i bakterieceller: tabel 3.. Plasmid kort, sekvenser og konstruktionsdetaljer er tilgængelige efter anmodning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metode, der præsenteres her giver mulighed for hurtig bestemmelse og biokemisk bekræftelse af genetiske krav til proteinnedbrydning i gærceller. Disse eksperimenter fremhæve nytte og magt gær som en model eukaryot organisme (flere fremragende anmeldelser af gær biologi og opsamlinger af protokoller for håndtering, opbevaring og manipulere gærceller (f.eks 41-44) er tilgængelige for efterforskerne nye for organismen). De teknikker kan let anvendes til at undersøge nedbrydning og overflod af en række klasser af proteiner. For eksempel har andre anvendt denne strategi til at karakterisere nedbrydningsmekanismer af ustabil cytosoliske, nukleare, og ER luminale og transmembrane proteiner 45-49.

Et par faktorer skal tages i betragtning ved valget af metaboliske enzym til at smelte på et ustabilt protein. Først er det vigtigt, at en funktionel version af genet, der koder for enzymet ikkevære til stede i værtsgenomet. For at minimere falske positive resultater (dvs. vækst under selektive betingelser, når den ustabile protein er faktisk nedbrudt), anbefales det at arbejde med stammer, der huser ikke-reverterende mutant alleler af reportergenet (fortrinsvis komplette gen deletioner) 50. En anden overvejelse for reporterenzym udvælgelse er tilgængeligheden af ​​kompetitive inhibitorer, der kan indgå i det selektive vækstmedium at reducere væksten baggrund og forbedre assay stringens. Dette kan være nyttigt i tilfælde af proteiner med relativt lave omsætningshastigheder selv i nærvær af fuldt funktionelle nedbrydningsmekanismer. I de repræsentative eksperimenter præsenteres her, optagelse af 3-AT, som kompetitivt hæmmer His3 enzym reducerer væksten baggrund 40. Tilsvarende forbindelsen 6-azauracil inhiberer Ura3 et enzym, der kræves for uracil biosyntese 51. Koncentrationen inhibitor ved hvilken vækst forekommer i nedbrydning-defective, men ikke vildtype, celler bestemmes empirisk. Nogle metaboliske enzymer kan også være modsat valgt imod. Under counter-selektive betingelser kan celler vokser, når den ustabile protein nedbrydes (og fusioneret metaboliske enzym ikke er til stede). For eksempel Ura3 omdanner forbindelsen 5-fluororotsyre (5-FOA) til toksiske forbindelse 5-fluoruracil 52. Celler, der udtrykker en Ura3-fusionsprotein vil kun vokse i nærvær af 5-FOA, hvis Ura3 fusionsproteinet nedbrydes. Tilsvarende forbindelsen 5-fluoroanthranilic acid (5-FAA) er toksisk for celler med en funktionel tryptophan biosyntesevejen. 5-FAA kan således anvendes til counter-selektere for celler, der udtrykker TRP1-fusionsproteiner 53. Counter-selektionsstrategier kan være nyttige til identifikation af undertrykkere for nedbrydning-forringe mutationer.

Promotoren anvendes til at drive ekspression af et nedbrydningsprodukt reporter skal også nøje udvalgt. Som lave biosynthETIC enzymer kan være tilstrækkeligt til at understøtte væksten i fravær af eksogent leveret metabolit, anbefales en svag promotor 54. I repræsentative forsøg er præsenteret her, GAL4-promotor, som undertrykkes i nærvær af glucose 55, anvendes til at fremme transkription af Deg1 -Sec62-His3. Basal ekspression af dette fusionsprotein under represserende betingelser (dvs. 2% glucose) er tilstrækkelig til at understøtte vækst under selektive betingelser (dvs. fravær af histidin og tilstedeværelse af 1 - 2 mM 3-AT), når nedbrydningen mekanisme er deaktiveret. Imidlertid proteinniveauer tilstrækkelig støtte vækst under selektive betingelser vil sandsynligvis være under grænsen på detektering ved Western blotting. Derfor kan det være nødvendigt at drive ekspression med en svag promotor for væksten assay og en stærkere promotor til biokemisk bekræftelse. I tilfælde af Deg1 -Sec62 (med eller uden HIS3 fusion), en mere Robust-promotoren (her MET25 promoter 39) er påkrævet for protein visualisering ved western-analyse.

Som beskrevet her, kan gær-baserede vækst assay udføres på en lille skala, kandidat tilgang. Serielle fortyndinger af gærceller fremstilles i en 96-brønds plade og overføres ved pipettering til fast vækstmedium; en alternativ fremgangsmåde til effektiv og reproducerbar overførsel af fortyndet gær cellesuspensioner på fast medium er anvendelsen af et multi-pin replikator, der almindeligvis omtales som en "frogger" 56. Det ideelle tidspunkt at fotografere plader vil variere med gærstammer og betingelser. Det anbefales at fotografere en given plade når kolonier fra den hurtigst voksende kultur først bliver synlige på det mest fortyndede stedet. Dette er typisk det sted, hvor forskelle i vækstrater blandt prøverne er mest indlysende. Det kan være tilrådeligt at tage fotografier på flere dage, især i tilfælde af gærudviser en bred vifte af vækstrater.

Væksten-baserede reporter assay kan også tilpasses til produktion i stor skala analyser. For eksempel kan en forringelse reporter indføres i en kommercielt tilgængelig bibliotek af ~ 5.000 levedygtige haploide sletning gærgen stammer under anvendelse af syntetiske genetiske Array (SGA) teknologi 46,57. I denne teknik er en haploid gærstamme med en kromosomalt integreret metabolisk reporter fusionsprotein parret med hver stamme af gendeletion biblioteket. De resulterende diploide celler induceres til at danne sporer (undergår meiose) og underkastet selektion for haploid meiotiske afkom huser både metaboliske reporter og individuelle gendeletioner. Disse stammer overføres derefter massevis til medium selektive for celler, hvori proteinet er blevet stabiliseret. Som for mindre målestok analyser, hvis et gen med en rolle i proteinnedbrydning slettes, fusionsproteinet vil stabiliseres, og cellevækst vil blive styrket. Sammenlignelige enpproaches er blevet udtænkt, der giver mulighed for samtidig omdannelse af en stor samling af stammer med ekstra-kromosomalt vedligeholdt plasmider; denne strategi undgår kromosomal integration, parring, sporulation og meiotisk udvælgelse 54.

Når en mutation er fundet at give en vækstfordel til celler, der huser et metabolisk reporter, er det nødvendigt at biokemisk bekræfte, at mutationen forøger overflod af proteinet af interesse. En hurtig og pålidelig gær lysis procedure, nøje tilpasset fra metoden til Kuhsnirov 31, præsenteres. Denne protokol giver mulighed for udvinding af proteiner i en form direkte egnet til analyse ved Western blotting. Til analyse af et givet protein til mængden af ​​lysatet blive indlæst per brønd, acrylamidgel egenskaber, valg af membranen anvendte antistoffer og fortyndinger deraf, og en fremgangsmåde til påvisning skal bestemmes empirisk. Den repræsentative Western blotting beskrevne protokol utilizes sekundære antistoffer konjugeret til fluorescerende farvestoffer; andre almindeligt anvendte protokoller afhængige kemiluminescens afhængig af antistof-konjugerede enzymer 58. Som beskrevet her, kan anvendes til at detektere proteinet af interesse membranen direkte genprobet med et antistof for et loading kontrol protein. Hvis de primære antistoffer anvendes til at påvise proteinet af interesse og lastning kontrol protein er blevet rejst fra den samme art, Fornyet probing membranen er mulig, så længe båndene følger af disse proteiner ikke co-migrate. Hvis imidlertid de primære antistoffer anvendes til at påvise proteinet af interesse og lastning kontrol protein er blevet rejst fra forskellige arter, kan den samme membran sekventielt probes, selvom bands co-migrate, hvis de sekundære antistoffer er blevet konjugeret til fluoroforer med forskellige emissionsbølgelængder. I tilfælde af at proteinet af interesse og lastning kontrol protein co-migrerer og de respektive primære antistoffer har været raised fra samme art kan prøver løses på to SDS-PAGE-geler, overført til PVDF-membran og probet separat med antistoffer specifikke for proteinet af interesse og lastning kontrol protein. Alternativt kan lastning konsistens bedømmes ved at inkubere membraner med uspecifikke protein pletter (f.eks Coomassie eller Ponceau S). Endvidere repræsenterer western blotting Protokollen antager et protein eller en epitop, der er detekteret ved sekventiel inkubering af primære og sekundære antistoffer, som er typisk. Fusionsproteinerne analyseret i de repræsentative resultater indeholder to epitoper afledt fra Staphylococcus aureus Protein A (PRA i figur 2 og 3). Protein A binder direkte til pattedyr immunoglobuliner og kan derfor detekteres ved anvendelse af sekundært antistof alene (dvs. ingen primære antistof inkubationstrin er påkrævet) 59. Det er muligt, at fusion af et reporter-enzym kan påvirke protein overflod ellernedbrydning. Det er derfor tilrådeligt at biokemisk bekræfte resultaterne ved hjælp af en version af substratet er behæftet med reporterproteinet. Endelig begge analyser er beskrevet her stole på forskelle i steady-state protein niveauer som en proxy for forskelle i protein stabilitet. Fordi protein overflod afspejler integrationen af satserne for proteinsyntese og nedbrydning, yderligere biokemiske analyser (f.eks cycloheximid chase eller puls chase eksperimenter), skal anvendes til direkte at analysere et protein dynamiske nedbrydning profil.

De repræsentative resultater etablere en ny anvendelse af denne protokol til bestemmelse af genetiske krav til nedbrydning af et protein, som afvigende tilkobler ER translocon. Deg1 -Sec62-His3 tillagt en gær vækstfordel under selektive betingelser, når den nedbrydningsvej blev inaktiveret (dvs. fravær af Hrd1 ubiquitinligase). En hurtig og pålidelig protein extrækkraft metode efterfulgt af western blotting bekræftede en stigning i overflod af Deg1 -Sec62 (med eller uden His3) i fravær af Hrd1. Tidligere undersøgelser viser, at mekanismen for Hrd1-afhængige nedbrydning af translocon-associerede proteiner adskiller sig fra de andre Hrd1 ER luminale eller transmembrane substrater 32. Det fremtidige arbejde vil ansætte Deg1 -Sec62-His3 fusionsprotein i genetiske skærme store til at identificere nye gener, der er nødvendige for denne unikke nedbrydning mekanisme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker nuværende og tidligere medlemmer af Rubenstein laboratorium for at give en støttende og entusiastisk forskningsmiljø. Vi takker Ryan T. Gibson om bistand i protokol optimering. Vi takker Mark Hochstrasser (Yale University) og Dieter Wolf (Universität Stuttgart) for gærstammer og plasmider. Vi takker vores anonyme korrekturlæsere for deres hjælp til at forbedre klarhed og nytten af ​​dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af en forskningspris fra Ball State University kapitel i Sigma Xi til SGW, en National Institutes of Health tilskud (R15 GM111713) til EMR, en Ball State University aspire forskningspris til EMR, og midler fra Ball State University Provost kontor og Biologisk Institut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole Fisher Scientific AC264571000 Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) Roche 11088726001 May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped Sarstedt 82.1581.001 Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl Gilson F14401 Available from a variety of manufacturers
 
 
 

 
Name Company Catalog Number Comments
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl Gilson F14403 Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216 Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.
Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) Bio-Rad 170-8195 A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater Fisher Scientific 1172011AQ Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  2. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
  3. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
  4. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
  5. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1. S11 (2007).
  6. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  7. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
  8. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
  9. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
  12. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
  13. Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
  14. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  15. Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
  16. Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
  17. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
  18. Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
  19. Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
  20. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
  21. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
  22. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
  23. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
  24. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
  25. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
  26. Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
  27. Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
  28. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  29. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  30. Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093 (2012).
  31. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
  32. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
  33. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
  34. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
  35. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
  36. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
  37. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
  38. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
  39. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
  40. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
  41. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
  42. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
  43. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , Elsevier. San Diego. (2004).
  44. Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
  45. Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
  46. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
  47. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
  48. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
  49. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
  50. Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
  51. Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
  52. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
  53. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
  54. Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
  55. Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
  56. Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791 (2012).
  57. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
  58. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
  59. Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).

Tags

Molekylærbiologi Ubiquitin-proteasom-system, vækst assay proteinekstrakter western blotting gærgenetik mutanter endoplasmatisk reticulum-associeret nedbrydning proteinnedbrydning
Vækst-baserede Bestemmelse og biokemisk Bekræftelse af genetiske Krav til proteinnedbrydning i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Watts, S. G., Crowder, J. J.,… More

Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (96), e52428, doi:10.3791/52428 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter