Abstract
Regolamentato degradazione delle proteine è fondamentale per praticamente ogni funzione cellulare. Inizialmente Molto di ciò che è noto circa i meccanismi molecolari e requisiti genetici per eucariotica degradazione delle proteine è stato fondato nel Saccharomyces cerevisiae. Analisi classici di degradazione delle proteine hanno fatto affidamento su metodologie pulse-chase e cicloeximide-chase biochimici. Mentre queste tecniche prevedono mezzi sensibili per osservare la degradazione delle proteine, sono complessi, in termini di tempo, e bassa produttività. Questi approcci non sono suscettibili di screening rapido o su larga scala per le mutazioni che impediscono la degradazione delle proteine. Qui, un test basato su una crescita del lievito per l'identificazione facile dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine è descritto. In questo saggio, un enzima giornalista necessari per la crescita in condizioni selettive specifiche è fuso ad una proteina instabile. Le cellule privi del giornalista enzima endogeno, ma che esprimono la proteina di fusione può crescere sotto selecondizioni ctive solo quando la proteina di fusione è stabilizzato (cioè quando la degradazione delle proteine è compromessa). Nel saggio di crescita qui descritto, diluizioni seriali di wild-type e le cellule di lievito mutanti che ospitano un plasmide codificante una proteina di fusione sono macchiati su terreno selettivo e non selettivo. Crescita in condizioni selettive è coerente con la degradazione compromissione da una determinata mutazione. Una maggiore abbondanza di proteine deve essere confermata biochimicamente. Un metodo per la rapida estrazione di proteine di lievito in una forma adatta per elettroforesi e western blotting è anche dimostrato. Una lettura di crescita a base per la stabilità proteica, combinato con un semplice protocollo per l'estrazione di proteine per l'analisi biochimica, facilita la rapida identificazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine. Queste tecniche possono essere adattate per monitorare la degradazione di una varietà di proteine di breve durata. Nell'esempio presentato, l'enzima HIS3, che è richiesto per la biosintesi istidina, è stata fusaa Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 è mirato per la degradazione dopo si innesta aberrante reticolo endoplasmatico translocon. Le cellule che ospitano Deg1 -Sec62-HIS3 sono stati in grado di crescere in condizioni selettive quando la proteina è stato stabilizzato.
Introduction
Degradazione delle proteine selettiva è essenziale per la vita eucariotica, e alterata degradazione delle proteine contribuisce ad una serie di condizioni mediche, tra cui diversi tipi di cancro, malattie neurodegenerative, le malattie cardiovascolari, e la fibrosi cistica 1-5. Il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), che catalizza la degradazione delle proteine selettivo, è un obiettivo terapeutico emergente per queste condizioni 6-10. Ubiquitina ligases covalente attribuiscono polimeri dell'acido ubiquitina 76-amino alle proteine 11. Le proteine che sono stati marcati con catene polyubiquitin sono riconosciuti e proteolyzed dai ~ 2,5 megadalton proteasoma 26S 12. Gli studi avviati nel organismo modello eucarioti Saccharomyces cerevisiae (lievito in erba) sono fondamentale nella spiegazione dei meccanismi di degradazione delle proteine nelle cellule eucariotiche. Il primo substrato fisiologico dimostrato dell'UPS era il lievito repressore trascrizionale MATα2 13, 14, e molti componenti altamente conservati dell'UPS stati identificate o caratterizzate dal lievito (es 15-26). Scoperte fatte in questo versatile e geneticamente trattabili organismo modello è probabile che continueranno a fornire importanti informazioni sui meccanismi conservati di degradazione ubiquitina-mediata.
Il riconoscimento e la degradazione della maggior parte dei substrati UPS richiedono l'azione concertata di diverse proteine. Pertanto, un obiettivo importante nel caratterizzare il degrado regolamentato di una data proteina instabile è quello di determinare i requisiti genetici per proteolisi. Approcci classici (ad esempio impulso-chase e esperimenti cicloeximide-chase 27) per il monitoraggio degradazione delle proteine in cellule di mammifero o di lievito sono laborioso e richiede molto tempo. Mentre questi tipi di metodi forniscono mezzi altamente sensibili per la rilevazione degradazione delle proteine, non sono adatti per l'analisi rapida di degradazione delle proteine o screeni larga scalang per le mutazioni che impediscono la degradazione delle proteine. Qui, un test basato su una crescita del lievito per la rapida identificazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine instabili è presentato.
Nel metodo basato su crescita del lievito per analizzare degradazione delle proteine, una proteina instabile di interesse (o segnale di degradazione) è fusa, in cornice, per una proteina che è necessario per la crescita del lievito in circostanze specifiche. Il risultato è un substrato artificiale che può servire come un potente strumento per determinare i requisiti genetici di proteine degradazione della proteina instabile di interesse. Convenientemente, ceppi di lievito laboratorio più comunemente utilizzati ospitano un pannello di mutazioni nei geni che codificano enzimi metabolici coinvolti nella biosintesi di particolari amminoacidi o basi azotate (ad es 20,28-30). Questi enzimi sono essenziali per la proliferazione cellulare in assenza di metaboliti esogenamente fornite in cui sintesi enzimi partecipano. Taleenzimi metabolici possono quindi funzionare come reporter di crescita a base per la degradazione delle proteine instabili a cui sono fusi. I requisiti genetici per la degradazione delle proteine possono essere facilmente chiarita, in quanto le mutazioni che impediscono proteolisi permetteranno cellule che ospitano il giornalista degrado di crescere in condizioni selettive.
Un vantaggio di crescita è un'indicazione indiretta che una particolare mutazione aumenta l'abbondanza della proteina di interesse. Tuttavia, l'analisi biochimica diretta è necessario per confermare che una mutazione permette di crescita attraverso l'aumento dei livelli di proteine, piuttosto che tramite cause indirette o artefatti. L'effetto di una mutazione della proteina abbondanza può essere confermata da analisi Western Blot dei livelli di proteine steady-state in cellule che fanno e non ospitano la particolare mutazione. Un metodo per l'estrazione rapida ed efficace delle proteine di lievito (incubazione sequenziale di cellule di lievito con idrossido di sodio e tampone) in una forma adattaper l'analisi mediante western blotting è presentato anche il 31. Insieme, questi esperimenti facilitare la rapida identificazione dei regolatori candidati di degradazione delle proteine.
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Protocol
1. Lievito crescita Assay identificare Mutanti candidati difettosi in Protein Degradation
- Transform wild-type e mutanti cellule di lievito con un plasmide codificante una proteina fusa instabili, in cornice, per un enzima giornalista metabolica.
- Seminare trasformanti in 5 ml di sintetico definito (SD) terreno minimo che è selettiva per le cellule che ospitano le molecole plasmidi. Incubare per una notte a 30 ° C, rotante.
- Misurare la densità ottica a 600 nm (OD 600) di ciascuna coltura durante la notte.
NOTA: Dopo una notte di incubazione, le cellule in coltura può essere sia in fase di crescita logaritmica o stazionaria, ma dovrebbe aver raggiunto un diametro minimo di 600 di 0,2. Molto crescita lenta lieviti possono richiedere tempi di incubazione più di una notte, o inoculazione di un maggior numero di cellule, come determinato empiricamente. - Preparare sei diluizioni seriali di cellule di lievito trasformate in una piastra a 96 pozzetti sterili, a cominciare con le cellule diluite in unn OD 600 di 0,2. Posizionare ogni trasformante lievito per essere analizzati in una riga differente nella piastra a 96 pozzetti.
- Per ciascun trasformante, calcolare il volume di coltura overnight necessaria per diluire le cellule ad una OD 600 di 0,2 in un volume finale di 200 microlitri. Aggiungere questo volume di coltura durante la notte per pozzetto corrispondente nella colonna 1. Aggiungere la quantità appropriata di acqua sterile per portare il volume a 200 ml.
- Per ciascuna fila di lievito, aggiungere 125 ml di acqua sterile ai pozzetti nelle colonne 2, 3, e 4.
NOTA: piastre a 96 pozzetti sterili confezionati singolarmente possono essere forniti con coperchi sterili. I coperchi possono essere utilizzati come serbatoi per l'acqua sterile che viene distribuito in questa fase. Questo consente il trasferimento simultaneo di acqua sterile a tutti i pozzetti in una data colonna con una pipetta multicanale. - Mescolare il contenuto della prima colonna (lievito diluito ad una OD 600 di 0,2) pipettando su e giù con una pipetta multicanale.
- Trasfer 25 ml di lievito dalla colonna 1 alla colonna 2, utilizzando una pipetta multicanale. Mescolare pipettando su e giù. Trasferire 25 ml da Colonna 2 a colonna 3, e 25 ml di Colonna 3 Colonna 4 (mescolando bene ad ogni passo).
- Mescolare ogni campione con una pipetta multicanale. Procedendo da più diluito per almeno diluire colonne di lievito, pipetta 4 microlitri di ciascun campione su due piastre contenenti il terreno selettivo appropriato. Utilizzare una piastra con mezzo che mantiene selezione plasmide (questo piatto serve come un avvistamento lievito e controllo della crescita). Utilizzare una seconda piastra con mezzo che seleziona per plasmide manutenzione e l'espressione della proteina fusa instabile all'enzima giornalista. Perché lievito risolvere rapidamente, mescolare le cellule pipettando su e giù a intervalli regolari.
NOTA: Drier piatti saranno più facilmente assorbire il liquido di piatti preparati al momento e quindi sono consigliati per questi esperimenti. Piatti umidi possono essere essiccati per incubazione a temperatura ambiente in loumidità w per 1 - 2 giorni o incubazione più brevi in una cappa a flusso laminare. Le piastre possono asciugare in modo non uniforme se il flusso d'aria laminare è parallelo al banco. L'uso di un modello rende più facile individuare cellule di lievito a distanze regolari. Due modelli di esempio sono forniti in Figura 1. Questi possono essere stampati, tagliati, e incollate all'interno di un coperchio piatto Petri. - Lasciare le piastre ad asciugare sul banco.
- Incubare le piastre a 30 ° C per 2 - 6 giorni.
- Fotografa ogni piatto dopo l'incubazione.
Figura 1. Modelli per individuare le cellule di lievito su 100 mm piastre di agar. Questi modelli possono essere utilizzati per facilitare individuare lievito a distanze regolari con una pipetta multicanale. I modelli possono essere stampati, tagliati, e incollate all'interno di un coperchio piatto Petri. Posizionare piastra Petri con la crescitaCoperchio all'interno media con template apposto. I modelli sono contrassegnati da una tacca per monitorare l'orientamento. Si raccomanda che le piastre utilizzate in saggi di crescita sono parimenti segnalate con una tacca per monitorare l'orientamento. Modelli per individuare quattro (A) o cinque (B) sono previsti diluizioni seriali di cellule di lievito. Cliccate qui per vedere una versione stampabile di questa figura con i modelli da 100 mm.
2. Conferma biochimica di Assay Crescita Lievito
- La crescita di cellule di lievito e di post-alcalino di estrazione di proteine (modificato da 31)
- Transform wild-type e mutanti cellule di lievito con un plasmide codificante la proteina instabile.
- Seminare trasformanti in 5 ml di terreno SD che è selettiva per le cellule che ospitano le molecole plasmidi. Incubare per una notte a 30 ° C, rotante.
- Misurare la OD 600 di ogni cu nottelture.
NOTA: Dopo una notte di incubazione, le cellule possono essere sia in fase di crescita logaritmica o stazionaria, ma dovrebbe aver raggiunto un OD 600 che permetterà di diluizione per una OD 600 di 0,2 in 10 ml di terreno selettivo fresco (punto 2.1.4). Molto crescita lenta lieviti possono richiedere tempi di incubazione più di una notte, o inoculazione di un maggior numero di cellule, come determinato empiricamente. - Diluire le cellule di lievito ad una OD 600 di 0,2 in 10 ml di mezzo fresco selettiva.
- Continuare a incubare cellule a 30 ° C, la rotazione o agitazione, fino a quando le culture raggiungere un diametro esterno di 600 tra 0,8 e 1,2 (cioè sono in crescita mid-logaritmica).
NOTA: Se la proteina instabile di interesse sotto il controllo di un promotore regulatable, tempi ottimali per l'induzione dell'espressione della proteina e la raccolta delle cellule può variare secondo studi precedenti o osservazioni empiriche. - Raccogliere 2,5 OD 600 unità di cultura in 15 ml conicaal tubo mediante centrifugazione a 5000 xg per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione.
NOTA: Un OD 600 unità è definita come la quantità di lievito presente in 1 ml di coltura a OD 600 di 1,0. Il volume di coltura (in ml) necessario per raccogliere 2,5 OD 600 unità (V) può essere calcolata utilizzando la seguente equazione: V = 2,5 OD 600 unità / OD 600 misurato - Risospendere le cellule in 1 ml di acqua distillata. Trasferire le cellule in sospensione in una provetta.
- Agglomerare cellule per centrifugazione a 6.500 xg per 30 secondi a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione.
- Risospendere le cellule in 100 ml di acqua distillata pipettando su e giù o vortex, e aggiungere 100 ml 0.2 M NaOH. Mescolare pipettando su e giù. Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente.
- Cellule pellet (la maggior parte dei quali non hanno ancora rilasciato proteine e sono ancora vitali) per centrifugazione a 18.000 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione.
- Risospendere pellet in 50 - 100 microlitri tampone 1x Laemmli, che la lisi delle cellule, pipettando su e giù o vortex.
NOTA: La rimozione del surnatante dopo la centrifugazione alcalina e successiva risospensione delle cellule in tampone campione Laemmli estrae proteine a pH compatibile con sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) utilizzando un sistema tampone Tris-glicina esecuzione e western blotting. - Per denaturare completamente proteine, lisati incubare a 95 ° C per 5 min.
NOTA: proteine di aggregazione-inclini (ad esempio proteine con diversi segmenti transmembrana) possono diventare insolubili quando incubato a 95 ° C. Pertanto, lisati devono essere incubate a temperature più basse (ad esempio 37 ° C - 70 ° C) per 10 - 30 min, come determinato empiricamente, per l'analisi di tali proteine. - Lisati fresco mettendo in ghiaccio per 5 min.
- Lisati centrifugare a 18.000 g per 1 minuto a temperatura ambiente a pellet materiale insolubile. Separare il surnatante (proteina estratta solubilizzato) per SDS-PAGE prima successiva analisi Western Blot (punto 2.2). In alternativa, negozio lisati a -20 ° C.
- Rappresentante Protocollo Blotting occidentale
- Caricare empiricamente determinato volume di lisati in un gel SDS-PAGE.
- Eseguire gel a 200 V fino colorante anteriore ha raggiunto il fondo del gel.
- Trasferire proteine dai gel di fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrana mediante trasferimento bagnato a 20 V 60 - 90 min a 4 ° C.
- Block membrana incubando nel latte scremato 5% in Tris-Buffered Saline (TBS), dondolo, per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
- Decantare soluzione bloccante.
- Incubare membrana con un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse (o epitopo della stessa) in 1% di latte scremato in TBS con 0.1% Tween-20 (TBS / T) per 1 ora a camera temperature, dondolo.
- Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo.
- Incubare a membrana con appropriate anticorpo secondario coniugato fluoroforo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo.
NOTA: Perché fluorofori sono sensibili alla luce, diluizioni di anticorpi fluoroforo coniugati devono essere preparati al buio. Inoltre, l'incubazione delle membrane in presenza di anticorpi coniugati fluoroforo deve avvenire in contenitori lightproof. Questo può essere realizzato avvolgendo vassoi di incubazione in un foglio di alluminio. - Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo.
- Acquisire immagine di membrana utilizzando Li-Cor Odyssey CLx e software Immagine Studio (o apparecchiature di imaging comparabili e software), secondo le indicazioni del produttore.
- Dopo l'imaging membrana, incubare la membrana con un anticorpo primario specifico per un caricoing proteina di controllo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo.
- Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo.
- Incubare a membrana con appropriate anticorpo secondario coniugato fluoroforo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo.
- Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo.
- Acquisire immagine di membrana utilizzando Li-Cor Odyssey CLx e software Immagine Studio (o apparecchiature di imaging comparabili e software), secondo le indicazioni del produttore.
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Representative Results
Per illustrare questa metodologia, l'enzima HIS3 è stato fuso al carbossi-terminale del modello reticolo endoplasmatico (ER) di degradazione associata (ERAD) substrato, Deg1 -Sec62 (Figura 2A) per creare Deg1 -Sec62-HIS3 (Figura 3) . Deg1 -Sec62 rappresenta uno dei membri fondatori di una nuova classe di substrati ERAD che sono indirizzate a seguito persistente, associazione aberranti con il translocon, il canale principale responsabile per lo spostamento di proteine attraverso la membrana ER 32-34. Tali proteine instabili sono stati provvisoriamente chiamato ERAD-T (per translocon-associato) substrati. Precedenti studi indicano che, su aberranti impegno translocon, Deg1 -Sec62 è mirato per degradazione da parte Hrd1 ligasi ubiquitina (Figura 2B-D) 32, 34, 35. Fattori necessari per la degradazione di altri substrati Hrd1 sembrano essere superflua per <em> Deg1 -Sec62 degrado, suggerendo un nuovo meccanismo di degradazione 32. In condizioni di alterata vincolanti lipidico e associazione translocon prolungata, apolipoproteina B, la componente proteica delle lipoproteine a bassa densità di mammiferi, sembra essere degradato da un meccanismo correlato 36-38. Pertanto, Deg1 -Sec62 può fornire un utile modello per la degradazione di rilevanza medica proteine translocon associate.
Wild-type e lievito hrd1Δ cellule che mancano del gene cromosomico HIS3 sono state trasformate con un vettore vuoto 39 o un plasmide codificante Deg1 -Sec62-HIS3 e macchiati su mezzo di crescita selettiva (Figura 4). Per confermare che i numeri uguali di cellule di lievito trasformate sono stati trasferiti alle lastre, le cellule sono stati avvistati su terreno privo di triptofano (che seleziona per le cellule che ospitano il plasmide) ma contenenti istidina. Crescita simile è stata osservata per tutte le cellule di lievito trasformate.Le cellule che esprimono Deg1 -Sec62-HIS3 dovevano crescere in assenza di istidina solo quando la proteina di fusione è stabilizzato (cioè quando ERAD-T è compromessa). Infatti, hrd1Δ lievito esprimendo Deg1 -Sec62-HIS3 mostrato una crescita del vantaggio relativo alle cellule wild-type che esprimono Deg1 -Sec62-HIS3 su supporto triptofano carente e istidina. Tuttavia, marcata crescita fusion-proteina-dipendente in assenza di istidina è stata osservata anche in presenza di Hrd1. Al fine di aumentare la severità del dosaggio, medio privo istidina è stato integrato con il 3-ammino-1H-1,2,3-triazolo (3-AT), un inibitore competitivo dell'enzima HIS3 40. Lievito esprimendo Hrd1 cresciuto molto male a medio istidina carente integrato con 1 - 2 mm 3-AT; quando HRD1 è stato eliminato, la crescita cellulare è stata restaurata. L'inclusione di 3-AT ad una concentrazione di 3 mM crescita drasticamente inibita di tutte le cellule, indipendentemente dalla presenza o assenza di Hrd1. Questi res ULT sono coerenti con la degradazione del substrato Hrd1-dipendente.
Avanti, l'abbondanza di stato stazionario della proteina Deg1 -Sec62-HIS3 in lievito che esprime o manca l'enzima Hrd1 era direttamente testato. Analisi Western blotting ha indicato un aumento paragonabile Deg1 -Sec62-HIS3 e proteine Deg1 -Sec62 in hrd1Δ lievito rispetto alle cellule wild-type (Figura 5). Questo conferma un ruolo per Hrd1 nella regolazione dei livelli di entrambe le proteine. Degrado Hrd1-dipendente di Deg1 -Sec62 procede dopo la proteina impegna aberrante ER translocon 32. È importante sottolineare che, Deg1 -Sec62-HIS3 impegna aberrante la translocon in maniera analoga (dati non pubblicati), convalidando ulteriormente l'uso di Deg1 -Sec62-HIS3 come reporter di crescita a base per la degradazione di Deg1 -Sec62 specificamente e proteine translocon associate in generale.
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Figura 2:.. Modello per la degradazione di Deg1 -Sec62 seguente aberrante impegno translocon (A) Rappresentazione schematica del Deg1 -Sec62 Deg1 (le amino-terminale di 67 amminoacidi da MATα2) è seguita, in sequenza, dalla Bandiera (F) epitope , il 2-transmembrana reticolo endoplasmatico (ER) proteine Sec62, e due copie del S. aureus Proteina A (PRA). Per chiarezza, la proteina di fusione viene indicata come Deg1 -Sec62. (B) Dopo normale inserimento dei suoi due segmenti transmembrana nella membrana ER, interazione persistente Deg1 -Sec62 con il translocon innesca anormale, Deg1 -dipendente translocon impegno. Una parte della coda amino-terminale inizialmente citosolica-entra e aberrante probabile rimane all'interno the translocon. (C) A seguito engagemen translocon anormalit, Hrd1 riconosce e ubiquitylates Deg1 -Sec62. Cerchi rossi indicano molecole ubiquitina. (D) Deg1 -Sec62 viene poi estratto dalla membrana ER e degradata dal proteasoma, probabilmente alleviare translocon ostruzione.
Figura 3:. Rappresentazione schematica del Deg1 -Sec62-HIS3 seguente aberrante impegno translocon Deg1 è seguito, in sequenza, dalla Bandiera (F) epitopi, il 2-ER transmembrana proteine Sec62, due copie del S. aureus Proteina A (PrA), e l'enzima lieviti HIS3. Per chiarezza, la proteina di fusione viene indicata come Deg1 -Sec62-HIS3.
Figura 4: fusione HIS3 a Deg1 (HRD1) e lievito hrd1Δ trasformato con un vettore vuoto o un plasmide codifica Deg1 -Sec62-HIS3 sono stati avvistati su terreno privo di triptofano, medium privo triptofano e istidina , e medio privo triptofano e istidina integrato con 3-ammino-1H-1,2,3-triazolo (3-AT), un inibitore competitivo di HIS3, alle concentrazioni indicate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .
Figura 5:. Aumento abbondanza di Deg1 -Sec62 e Deg1 -Sec62-HIS3 in cellule prive Hrd1 estratti proteici sono stati preparati da wild-type (+) e hrd1Δ(Δ) lievito esprime Deg1 -Sec62 o Deg1 -Sec62-HIS3. Proteine (equivalenti a 0,125 OD 600 unità) sono stati separati da SDS-PAGE, seguita da Western blotting con anticorpi secondari di coniglio anti-topo, che si legano direttamente la proteina A epitopi delle proteine di fusione. Successivamente western blotting con anticorpi specifici per PGK1 fornisce un controllo di carico.
| Soluzione | Componenti | Commenti | ||
| Synthetic Definito (SD) Minimal lievito Mezzo | 2% di destrosio, 0,67% di base di azoto lievito senza aminoacidi, 0,002% adenina, 0,004% uracile, 0,002% arginina, 0,001% istidina, 0,006% isoleucina, leucina 0,006%, 0,004% lisina, metionina 0,001%, 0,006% fenilalanina, 0.005 % treonina, triptofano 0,004%. Per solido (piatto) di media, includono 2% agar. | 1. Terreno selettivo è preparato omettendo apAcido propriate amino (s) o basi azotate. | ||
| 2. Per comodità, questi ingredienti possono essere mantenuti come soluzioni di riserva concentrate come segue. Gli aminoacidi possono essere mantenute come soluzione madre 100X contenente tutti gli aminoacidi desiderati. Lievito base di azoto può essere mantenuto in una soluzione di 20X magazzino (13,4%). Destrosio può essere mantenuto in una soluzione madre 40%. Adenina e uracile possono essere mantenute come 1% soluzioni madre a 0.1 M NaOH. | ||||
| 3. Sterilizzare media in autoclave. | ||||
| 1X Laemmli Sample Buffer | 2% SDS, 10% glicerolo, 5% β-mercaptoetanolo, 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,008% blu di bromofenolo | 1. 1X tampone campione viene spesso preparata diluendo un (es 5X) stock più concentrato. | ||
| 2. Il blu di bromofenolo colorante può essere aggiunto a intensità desiderata. A "pizzicare" (piccola quantità sfruttato dal bordo di una spatola) è tipicamente sufficiente. | ||||
| 0,2 M di idrossido di sodio | Preparare in acqua. Sodio idrossido reagisce con vetro. Pertanto, per la conservazione a lungo termine, 0,2 M di idrossido di sodio deve essere mantenuto in contenitori di plastica. | |||
| Laemmli tampone di corsa (5X) | 125 mM Tris, glicina 960 mM, 0,5% SDS | Per preparare 1 L di 1X Laemmli Correre Buffer, diluire 1: 5 in dH 2 O | ||
| Tris-Acetato SDS Transfer Buffer (5X) | 125 Tris mM acetato (pH 8,8), glicina 960 mM, 0,05% SDS | Per preparare 20 L di 1X Tris acetato-SDS Transfer Buffer, unire 4 L di 5X magazzino, 4 L di metanolo, e 12 L di dH 2 O | ||
| 10X Tris-Buffered Saline (TBS) | Tris 500 mm, 1,5 M NaCl; pH regolato a 7,5 | Per preparare 1 L di 1X TBS, diluire 1:10 in dH 2 O. 1X TBS può essere completata con il detergente Tween-20 e il latte scremato in polvere, a seconda dei casi. |
| Strain Nome | Alias | Genotype Rilevante | Cifre | Fonte |
| VJY6 | MHY500 | MATA | 4 e 5 | Chen et al., 1993 |
| his3-Δ200 | ||||
| leu2-3,112 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| GAL2 | ||||
| VJY10 | MATA | 4 e 5 | Questo studio | |
| his3- Δ 200 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| GAL2 | ||||
| hrd1 :: kanMX4 |
Tabella 2:. Lieviti ceppi utilizzati in questo studio i dettagli di costruzione sono disponibili su richiesta.
| Plasmidi Number | Nome completo plasmidi | Figura | Fonte |
| pVJ30 | pRS414-P MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA | 5 | Rubenstein et al., 2012 |
| pVJ121 | pRS414-P MET25 (vuoto vettore con promoter MET25) | 4 | Mumberg et al., 1994 |
| pVJ467 | pRS414-P MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-HIS3 | 5 | Questo studio |
| pVJ477 | pRS414-P GAL4 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-HIS3 | 4 | Questo studio |
Tabella 3:. I plasmidi utilizzati in questo studio Notare che tutti i plasmidi contengono un centromero lievito per consentire la replicazione in cellule di lievito, il gene TRP1 per la selezione in cellule di lievito, e il gene per la manutenzione AMPR in cellule batteriche. Mappe plasmidi, sequenze e dettagli di costruzione sono disponibili su richiesta.
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Discussion
La metodologia qui presentata consente la rapida determinazione e la conferma biochimica dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine nelle cellule di lievito. Questi esperimenti sottolineano l'utilità e la potenza di lievito come organismo modello eucariote (diverse ottime recensioni di lievito biologia e compilazioni di protocolli per la gestione, la conservazione e la manipolazione cellule di lievito (ad esempio 41-44) sono disponibili per gli investigatori nuovi per l'organismo). Le tecniche possono essere prontamente applicate per indagare la degradazione e l'abbondanza di una varietà di classi di proteine. Ad esempio, gli altri hanno utilizzato questa strategia per caratterizzare i meccanismi di degradazione di citosolico instabile, nucleare, e ER luminale e proteine transmembrana 45-49.
Alcuni fattori devono essere considerati nella scelta di enzima metabolico di fondere ad una proteina instabile. In primo luogo, è essenziale che una versione funzionale del gene codificante l'enzima nonessere presenti nel genoma ospite. Per ridurre al minimo risultati falsi positivi (cioè la crescita in condizioni selettive quando la proteina instabile è in realtà degradata), si consiglia di lavorare con ceppi che ospitano non ritornare alleli mutanti del gene reporter (delezioni geniche preferibilmente complete) 50. Un'altra considerazione per la selezione giornalista enzima è la disponibilità di inibitori competitivi, che possono essere incluse nel terreno di coltura selettivo per ridurre la crescita di fondo e migliorare dosaggio rigore. Questo può essere utile nei casi di proteine con tassi di rotazione relativamente basse anche in presenza di meccanismi di degradazione completamente funzionale. Negli esperimenti di rappresentanza qui presentati, l'inserimento di 3-AT, che inibisce competitivamente l'enzima HIS3, riduce la crescita di fondo 40. Analogamente, il composto 6-azauracil inibisce URA3, un enzima necessario per uracile biosintesi 51. La concentrazione inibitore in cui la crescita si verifica in degrado-defective, ma non wild-type, cellule deve essere determinata empiricamente. Alcuni enzimi metabolici potrebbero anche essere contro-selezionati contro. In condizioni controrotanti selettiva, le cellule possono crescere solo quando la proteina instabile è degradato (e l'enzima metabolico fusa non è presente). Ad esempio, URA3 converte il composto acido 5-fluoroorotic (5-FOA) al composto tossico, 5-fluorouracile 52. Le cellule che esprimono una proteina di fusione URA3-cresceranno solo in presenza di 5-FOA se la proteina di fusione URA3 è degradata. Allo stesso modo, il composto acido 5-fluoroanthranilic (5-FAA) è tossico per le cellule con un funzionale biosintesi del triptofano. 5-FAA può quindi essere utilizzato per contro-selezionare per le cellule che esprimono proteine Trp1-fusione 53. Strategie anti-selezione possono essere utili per l'identificazione dei soppressori di mutazioni-degrado compromettere.
Il promotore usato per guidare l'espressione di un giornalista degrado deve essere attentamente selezionati. Come bassi livelli di Biosynthenzimi etic possono essere sufficienti per sostenere la crescita in assenza di metabolita esogeno fornito, un promotore debole, si consiglia di 54. Negli esperimenti rappresentativi qui presentati, il promotore GAL4, che è represso in presenza di glucosio 55, è utilizzato per promuovere la trascrizione di Deg1 -Sec62-HIS3. Espressione basale di questa proteina di fusione in condizioni di reprimere (cioè il 2% di glucosio) è sufficiente a sostenere la crescita in condizioni selettive (cioè assenza di istidina e presenza di 1 - 2 mm 3-AT) quando il meccanismo di degradazione è disabilitato. Tuttavia, i livelli di proteina sufficienti per sostenere la crescita in condizioni selettive sono suscettibili di essere al di sotto della soglia di rilevamento mediante western blotting. Pertanto, potrebbe essere necessario per guidare l'espressione con un promotore debole per il saggio di crescita e un promotore forte per conferma biochimica. Nel caso di Deg1 -Sec62 (con o senza la fusione HIS3), più robust promotore (qui, il promotore MET25 39) è richiesto per la visualizzazione di proteine mediante analisi occidentale.
Come descritto qui, il saggio di crescita a base di lievito, può essere eseguita su un approccio basato candidato-piccole dimensioni. Diluizioni seriali di cellule di lievito vengono preparati in una piastra da 96 pozzetti e trasferiti pipettando per mezzo di crescita solido; un metodo alternativo per il trasferimento efficiente e riproducibile di diluiti sospensioni cellulari di lievito su terreno solido è l'uso di un replicatore multipolare, comunemente indicato come "frogger" 56. Il momento ideale per fotografare piatti variano con ceppi e condizioni di lievito. Si consiglia di fotografare un dato piatto quando le colonie dalla cultura in più rapida crescita in primo luogo diventano visibili nel luogo più diluita. Questo è in genere il punto in cui le differenze nei tassi di crescita tra i campioni sono più evidenti. Può essere opportuno prendere fotografie su più giorni, in particolare nel caso di lievitopresentante una vasta gamma di tassi di crescita.
Il reporter assay di crescita a base può anche essere adattato per l'analisi su larga scala. Ad esempio, un giornalista di degradazione può essere introdotto in una libreria disponibile in commercio di ~ 5.000 vitali ceppi aploidi delezione genetica del lievito che utilizzano la tecnologia sintetica Array genetica (SGA) 46,57. In questa tecnica, un ceppo di lievito aploide con una proteina di fusione giornalista metabolica cromosomicamente integrato è accoppiato ad ogni ceppo della biblioteca delezione del gene. Le cellule diploidi risultanti sono indotte a sporulare (sottoporsi meiosi) e sottoposti alla selezione per aploidi progenie meiotic ospitare sia il giornalista metabolico e singoli delezioni geniche. Questi ceppi sono poi trasferiti in massa di terreno selettivo per cellule in cui la proteina è stato stabilizzato. Per quanto riguarda le analisi su piccola scala, se un gene con un ruolo nella degradazione delle proteine viene eliminato, la proteina di fusione sarà stabilizzato, e la crescita delle cellule sarà rafforzata. Paragonabile approaches sono stati ideati, che consente la trasformazione simultanea di una grande collezione di ceppi con extra-cromosomicamente plasmidi mantenute; questa strategia ovvia integrazione cromosomica, accoppiamento, sporulazione, e la selezione meiotic 54.
Se una mutazione si trova a conferire un vantaggio di crescita per cellule ospitare un reporter metabolica, è necessario confermare biochimicamente la mutazione che aumenta l'abbondanza della proteina di interesse. Una procedura di lievito lisi rapida e affidabile, strettamente adattato dal metodo di Kuhsnirov 31, viene presentato. Questo protocollo consente l'estrazione di proteine in forma direttamente per l'analisi mediante western blotting. Per l'analisi di una data proteina, la quantità di lisato da caricare per pozzetto, proprietà gel acrilamide, scelta di membrana, anticorpi utilizzati e diluizioni loro, e il metodo di rilevamento deve essere determinato empiricamente. Il protocollo rappresentante occidentale blotting descritto utilizes anticorpi secondari coniugati con coloranti fluorescenti; altri protocolli comunemente utilizzati si basano su chemiluminescence dipende da enzimi anticorpi coniugati 58. Come descritto qui, la membrana utilizzata per rilevare la proteina di interesse può essere reprobed direttamente con un anticorpo per una proteina di controllo di carico. Se gli anticorpi primari utilizzati per rilevare la proteina di interesse e proteine di controllo di carico sono stati sollevati dalla stessa specie, reprobing la membrana è possibile finché le bande derivanti da tali proteine non fanno co-migrate. Se, tuttavia, gli anticorpi primari utilizzati per rilevare la proteina di interesse e proteine di controllo di carico sono stati sollevati da specie diverse, la stessa membrana può essere sondato sequenzialmente, anche se le bande co-migrate, se gli anticorpi secondari sono stati coniugati a fluorofori con diverse lunghezze d'onda di emissione. Nel caso in cui la proteina di interesse e controllo loading proteina co-migrate e rispettivi anticorpi primari sono stati raised dalla stessa specie, i campioni possono essere risolti in due gel SDS-PAGE, trasferiti su una membrana PVDF, e sondati separatamente con anticorpi specifici per la proteina di interesse e controllo carico proteine. In alternativa, caricare la coerenza può essere giudicato incubando membrane con macchie di proteine non specifici (ad esempio, Coomassie o Ponceau S). Inoltre, il protocollo rappresentante Western Blotting assume una proteina o epitopo che viene rilevato da incubazione sequenziale di anticorpi primari e secondari, come è tipico. Le proteine di fusione analizzati i risultati rappresentativi contengono due epitopi derivati da Staphylococcus aureus Proteina A (pra in figure 2 e 3). Proteina A lega direttamente alle immunoglobuline mammiferi e quindi può essere rilevato usando anticorpo secondario alone (cioè non è richiesta alcuna incubazione anticorpo primario passo) 59. E 'possibile che la fusione di un enzima giornalista può influenzare proteine abbondanza odegrado. È pertanto consigliabile confermare biochimicamente i risultati utilizzando una versione del substrato svincolato dalla proteina reporter. Infine, entrambi i saggi qui descritte affidano a differenze nei livelli di proteina steady-state come proxy per le differenze di stabilità proteica. Poiché le proteine abbondanza riflette l'integrazione dei tassi di sintesi proteica e la degradazione, ulteriori analisi biochimiche (quali cicloesimide inseguimento o pulse chase esperimenti) deve essere impiegato per analizzare direttamente il profilo degrado dinamica di una proteina.
I risultati rappresentativi stabiliscono una nuova applicazione di questo protocollo per la determinazione dei requisiti genetici per la degradazione di una proteina che impegna aberrante la translocon ER. Deg1 -Sec62-HIS3 conferito un vantaggio di crescita del lievito in condizioni selettive quando la via di degradazione è stato inattivato (cioè in l'assenza della ubiquitina ligasi Hrd1). Un veloce e affidabile di proteine exMetodo trazione seguita da Western blotting confermato un aumento in abbondanza di Deg1 -Sec62 (con o senza HIS3) in assenza di Hrd1. Precedenti studi indicano che il meccanismo di degradazione Hrd1-dipendente delle proteine translocon associate differisce da quelli di altre Hrd1 ER luminali o transmembrana substrati 32. Il lavoro futuro impiegherà la proteina di fusione Deg1 -Sec62-HIS3 schermi genetici su larga scala per identificare nuovi geni necessari per questo meccanismo di degradazione unico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri attuali e precedenti del laboratorio Rubenstein per fornire un ambiente di ricerca e entusiasta. Ringraziamo Ryan T. Gibson per l'assistenza nella ottimizzazione dei protocolli. Ringraziamo Mark Hochstrasser (Yale University) e Dieter Wolf (Universität Stuttgart) per i ceppi di lievito e plasmidi. Ringraziamo i nostri revisori anonimi per il loro aiuto nel migliorare la chiarezza e l'utilità di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un premio di ricerca del capitolo Ball State University di Sigma Xi a SGW, un National Institutes of Health sovvenzione (R15 GM111713) per EMR, un premio di ricerca Ball State University aspirano ad EMR, e fondi dalla Ball State University Ufficio di Provost e Dipartimento di Biologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
| 3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs. |
| Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer. |
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers. |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes. |
| Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) | Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
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Tags
Biologia Molecolare sistema ubiquitina-proteasoma,
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