Abstract
Reglerad proteinnedbrytning är avgörande för praktiskt taget varje cellulär funktion. Mycket av vad som är känt om de molekylära mekanismer och genetiska krav för eukaryot proteinnedbrytning ursprungligen inrättades i Saccharomyces cerevisiae. Klassiska analyser av proteinnedbrytning har förlitat sig på biokemiska puls chase och cykloheximid-chase metoder. Medan dessa tekniker ger känsligt medel för observation proteinnedbrytning, de är arbetskrävande, tidskrävande, och låg genomströmning. Dessa metoder är inte mottagliga för snabb eller storskalig screening för mutationer som förhindrar proteinnedbrytning. Här används en jästtillväxt-baserad analys för enkel identifiering av genetiska krav för proteinnedbrytning beskrivits. I denna analys är en reporterenzym som krävs för tillväxt under specifika selektiva betingelser fuserad till en instabil protein. Celler som saknar den endogena reporterenzymet men uttrycker fusionsproteinet kan växa under selective förhållanden endast när fusionsproteinet är stabiliserade (dvs. när proteinnedbrytning äventyras). I tillväxtanalysen beskriven här, är serieutspädningar av vildtyp och mutanta jästceller som hyste en plasmid som kodar för ett fusionsprotein i fläckar på selektiva och icke-selektivt medium. Tillväxten under selektiva betingelser är förenlig med nedskrivnings nedbrytning av en given mutation. Ökad protein överflöd bör biokemiskt bekräftas. Ett förfarande för snabb extraktion av jästproteiner i en form lämplig för elektrofores och western blotting demonstreras också. En tillväxtbaserad utläsning för proteinstabilitet, kombinerat med ett enkelt protokoll för proteinutvinning för biokemisk analys, underlättar snabb identifiering av genetiska krav för proteinnedbrytning. Dessa tekniker kan anpassas för att övervaka nedbrytningen av en mångfald av kortlivade proteiner. I exemplet som presenteras, HIS3 enzymet, vilket krävs för histidin-biosyntes, fuseradestill Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 är riktad till nedbrytning efter det avvikande griper endoplasmanätet translocon. Celler som härbärgerar Deg1 -Sec62-His3 kunde växa under selektiva betingelser när proteinet stabiliserades.
Introduction
Selektiv proteinnedbrytning är viktigt för eukaryot liv, och förändrad proteinnedbrytning bidrar till ett antal medicinska tillstånd, inklusive flera typer av cancer, neurodegenerativa sjukdomar, hjärt- och kärlsjukdomar, och cystisk fibros 1-5. Ubiquitin-proteasomsystemet (UPS), som katalyserar selektiv proteinnedbrytning, är en framväxande terapeutiskt mål för dessa förhållanden 6-10. Ubikitin ligaser kovalent fästa polymerer av den 76-aminosyran ubiquitin till proteiner 11. Proteiner som har markerats med polyubiquitin kedjor erkänns och proteolyseras av ~ 2,5 megadalton 26S proteasom 12. Studier som inletts i modellen eukaryot organism Saccharomyces cerevisiae (spirande jäst) har varit grundläggande i belysning av proteinnedbrytningsmekanismer i eukaryota celler. Den första visade fysiologiska substrat av UPS var jästen transkriptionsrepressor MATα2 13, 14, och många högkonserverade komponenter i UPS först identifierades eller kännetecknas av jäst (t.ex. 15-26). Upptäckter som gjorts i denna mångsidiga och genetiskt foglig modellorganism kommer sannolikt att fortsätta att ge viktiga insikter i bevarade mekanismer ubiquitinmedierad nedbrytning.
Erkännande och nedbrytning av de flesta UPS substrat kräver gemensamma åtgärder av flera proteiner. Därför är ett viktigt mål vid karakterisering av reglerad nedbrytning av en given instabilt protein för att bestämma de genetiska kraven för proteolys. Klassiska metoder (t.ex. puls chase och cykloheximid-chase experiment 27) för övervakning proteinnedbrytning i däggdjurs eller jästceller är arbetskrävande och tidsödande. Medan dessa typer av metodik ger höggradigt känsliga medel för att detektera proteinnedbrytning, är de inte lämpliga för snabb analys av proteinnedbrytning eller storskalig screening för mutationer som förhindrar proteinnedbrytning. Här är en jästtillväxt baserad analys för snabb identifiering av genetiska krav för nedbrytning av instabila proteiner presenteras.
I jästtillväxt-baserad metod för att analysera proteinnedbrytning, ett instabilt protein av intresse (eller signalförsämring) är sammansmält i ram, till ett protein som erfordras för jästtillväxt under särskilda omständigheter. Resultatet är ett artificiellt substrat, som kan fungera som ett kraftfullt verktyg för att bestämma de genetiska kraven för proteinnedbrytning av den instabila proteinet av intresse. Lämpligen mest vanligen använda stammar laboratoriejäst hyser en panel av mutationer i gener som kodar metaboliska enzymer involverade i biosyntesen av särskilda aminosyror eller kvävehaltiga baser (t.ex. 20,28-30). Dessa enzymer är väsentliga för cellproliferation i frånvaro av exogent tillhandahålls metaboliter i vilkas syntes enzymerna deltar. Sådanmetaboliska enzymer kan därmed fungera som tillväxtbaserade reportrar för nedbrytning av instabila proteiner som de är smält. De genetiska kraven för proteinnedbrytning lätt kan belysas, eftersom mutationer som förhindrar proteolys tillåter celler hyser reportern nedbrytningen att växa under selektiva betingelser.
En tillväxtfördel är en indirekt indikation på att en särskild mutation ökar överflödet av proteinet av intresse. Dock är direkt biokemisk analys krävs för att bekräfta att en mutation tillåter tillväxt genom ökade proteinnivåer snarare än via indirekta eller artefaktuella orsaker. Effekten av en mutation på protein överflöd kan bekräftas genom western blot-analys av steady-state proteinnivåer i celler som gör och inte hyser den speciella mutationen. Ett förfarande för snabb och effektiv extraktion av jästproteiner (sekventiell inkubering av jästceller med natriumhydroxid och provbuffert) i en form som är lämpligför analys med western blotting presenteras också 31. Tillsammans utgör dessa experiment underlättar snabb identifiering av kandidat regulatorer av proteinnedbrytning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Jäst Tillväxtanalys att identifiera kandidat Mutants Defekta i proteinnedbrytning
- Omvandla vildtyp och mutanta jästceller med en plasmid som kodar ett instabilt protein fuserat, i ram, till en reporter metabolisk enzym.
- Inokulera transformanter i 5 ml syntetisk definierats (SD) minimalt medium som är selektiv för celler som härbärgerar plasmidmolekyler. Inkubera över natten vid 30 ° C, att rotera.
- Mät den optiska tätheten vid 600 nm (OD 600) hos varje övernattskultur.
OBS: Efter inkubation över natten, kan celler i kultur vara i antingen logaritmisk eller stationär tillväxtfas men bör ha nått en minimal OD 600 på 0,2. Mycket långsamt växande jäststammar kan kräva inkubationstider längre än en natt, eller inokulering av ett större antal celler, såsom bestäms empiriskt. - Förbered sex-faldiga seriespädningar av transformerade jästceller i en steril 96-brunnars platta, som börjar med celler utspädda till enn OD 600 av 0,2. Placera varje jästtransformanten som skall analyseras i en annan rad i 96-brunnar.
- För varje transformant, beräkna volymen av övernattskultur som krävs för att späda cellerna till en OD 600 av 0,2 i en slutlig volym av 200 | il. Lägg denna volym över natten kultur till motsvarande brunn i kolumn 1. Tillsätt en lämplig mängd sterilt vatten för att bringa volymen till 200 l.
- För varje rad av jäst, tillsätt 125 | il sterilt vatten till brunnarna i kolumn 2, 3, och 4.
OBS: Individuellt inslagna sterila 96-hålsplattor kan förpackas med sterila lock. Locken kan användas som behållare för det sterila vatten som distribueras i detta steg. Detta möjliggör samtidig överföring av sterilt vatten till alla brunnar i en given kolumn med en flerkanalspipett. - Blanda innehållet i den första kolumnen (jäst utspädd till en OD 600 av 0,2) genom att pipettera upp och ned med en flerkanalspipett.
- Överfer 25 pl jäst från kolumn 1 till kolumn 2, med hjälp av en flerkanalspipett. Blanda genom att pipettera upp och ned. Överför 25 ^ från kolumn 2 till kolumn 3, och 25 ^ från kolumn 3 till kolumn 4 (blanda väl vid varje steg).
- Blanda varje prov med en flerkanalspipett. Med utgångspunkt från de flesta utspädd till minst späda kolumner av jäst, pipett 4 il av varje prov på två plattor innehållande lämplig selektivt medium. Använd en tallrik med medium som bibehåller plasmiden val (denna platta tjänar som en jäst spotting och tillväxtkontroll). Använd en andra platta med medium som selekterar för plasmiden underhåll och expression av den instabila proteinet sammansmält med reporterenzym. Eftersom jäst sedimentera snabbt, blanda cellerna genom pipettering upp och ned med regelbundna intervall.
OBS: Torktumlare plåtar kommer lättare absorberar vätska än nylagade plattor och rekommenderas därför för dessa experiment. Fuktiga plattor kan torkas genom inkubering vid rumstemperatur i low luftfuktighet för 1 - 2 dagar eller kortare inkubationer i ett laminärt flöde huva. Plattorna kan torka ojämnt om laminärt luftflöde är parallell till bänken. Användning av en mall gör det lättare att upptäcka jästceller på regelbundna avstånd. Två exempelmallar tillhandahålls i figur 1. Dessa kan skrivas ut, skära ut och fästas på insidan av en petriskål lock. - Låt plattorna torka på bänken toppen.
- Inkubera plattorna vid 30 ° C under 2-6 dagar.
- Bild varje platta efter inkubering.
Figur 1. Mallar för spotting jästceller på 100-mm-agarplattor. Får Mallarna användas för att underlätta observation jäst med jämna avstånd med en flerkanalspipett. Mallar kan tryckas, skäras ut, och som fästs på insidan av en petriskål lock. Placera petriskål med tillväxtmedel insida lock med mall anbringas. Mallar är markerade med en skåra för att spåra orientering. Det rekommenderas att plattor som används i tillväxtanalyser på liknande sätt märkas med en skåra för att spåra orientering. Mallar för observation fyra (A) eller fem (B) serieutspädningar av jästceller finns. Klicka här för att se en utskriftsvänlig version av denna siffra med 100-mm-mallar.
2. Biokemiska Bekräftelse av jäst tillväxt Assay
- Tillväxt av jästceller och Post-Alkaline Protein Extraction (modifierad från 31)
- Omvandla vildtyp och mutanta jästceller med en plasmid som kodar för det instabila proteinet.
- Inokulera transformanter i 5 ml SD-medium som är selektiv för celler som härbärgerar plasmidmolekyler. Inkubera över natten vid 30 ° C, att rotera.
- Mät OD 600 av varje natt culture.
OBS: Efter inkubation över natten, kan celler vara i antingen logaritmisk eller stationär tillväxtfas men bör ha nått en OD 600 som kommer att tillåta spädning till en OD 600 av 0,2 i 10 ml färskt selektivt medium (steg 2.1.4). Mycket långsamt växande jäststammar kan kräva inkubationstider längre än en natt, eller inokulering av ett större antal celler, såsom bestäms empiriskt. - Späd jästceller till en OD 600 av 0,2 i 10 ml färskt selektivt medium.
- Fortsätt att inkubera cellerna vid 30 ° C, vridning eller skakning, tills kulturerna når ett OD 600 mellan 0,8 och 1,2 (dvs är i mitten av logaritmisk tillväxt).
OBS: Om den instabila proteinet av intresse är under kontroll av en reglerbar promotor, kan den optimala tidpunkten för induktion av proteinuttryck och cellskörd varierar beroende på tidigare studier eller empiriska observationer. - Samla 2.5 OD 600 enheter av kultur i en 15-ml koniskal röret genom centrifugering vid 5000 xg under 5 min vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten genom pipettering eller aspiration.
OBS: Ett OD 600 enhet definieras som mängden jäst närvarande i en ml odlings vid OD 600 av 1,0. Volymen av kulturen (i ml) som krävs för att skörda 2.5 OD 600 enheter (V) kan bestämmas med följande formel: V = 2,5 OD 600 enheter / Uppmätt OD 600 - Resuspendera cellerna i 1 ml destillerat vatten. Överför suspenderade celler till ett mikrocentrifugrör.
- Pelletera celler genom centrifugering vid 6500 xg under 30 sek vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten genom pipettering eller aspiration.
- Resuspendera cellerna i 100 | il destillerat vatten genom att pipettera upp och ned eller virvling, och tillsätt 100 | il 0,2 M NaOH. Blanda genom att pipettera upp och ned. Inkubera proverna under 5 min vid rumstemperatur.
- Pellets celler (av vilka de flesta ännu inte släppt proteiner och fortfarande livskraftiga) genom centrifugering vid 18.000 xg under 5 min. Avlägsna supernatanten genom pipettering eller aspiration.
- Resuspendera pelleten i 50 till 100 | il 1 x Laemmli provbuffert, vilket kommer att lysera celler, genom att pipettera upp och ner eller virvling.
OBS: Avlägsnande av den alkaliska supernatanten efter centrifugering och efterföljande återsuspension av celler i Laemmli-provbuffert extraherar proteiner vid ett pH kompatibelt med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) med användning av en Tris-glycin löpande buffertsystem och western blotting. - För att till fullo denaturera proteiner, inkubera lysat vid 95 ° C i 5 min.
OBS: Sammanläggning benägna proteiner (t.ex. proteiner med flera transmembransegment) kan bli olösliga vid inkubation vid 95 ° C. Därför bör lysat inkuberas vid lägre temperaturer (t.ex. 37 ° C - 70 ° C) under 10 till 30 min, såsom bestäms empiriskt, för analys av sådana proteiner. - Cool lysat genom att placera på is i 5 min.
- Centrifugera lysat vid 18.000 xg i 1 min vid rumstemperatur för pelletering av olösligt material. Separera supernatanten (solubiliserades herat protein) genom SDS-PAGE före efterföljande western blot-analys (avsnitt 2.2). Alternativt, lagra lysat vid -20 ° C.
- Representant Western blotting protokoll
- Load empiriskt bestämd volym av lysat i en SDS-PAGE-gel.
- Kör gelén vid 200 V tills färgfronten har nått botten av gelén.
- Överför proteiner från gel till polyvinylidenfluorid (PVDF) membran genom våt överföring vid 20 V under 60-90 min vid 4 ° C.
- Block membran genom inkubering i 5% skummjölk i Tris-buffrad saltlösning (TBS), gungande, under 1 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- Dekantera blockerande lösningen.
- Inkubera membran med primär antikropp som är specifik för proteinet av intresse (eller epitopmärkning därav) i en% skummjölk i TBS med 0,1% Tween-20 (TBS / T) under 1 h vid rums- temperature, gunga.
- Dekantera antikropplösning, och tvätta membranet 3 x 5 min med TBS / T vid rumstemperatur, gunga.
- Inkubera membran med lämplig fluorofor-konjugerad sekundär antikropp i 1% skummjölk i TBS / T under 1 timme vid rumstemperatur, gunga.
OBS: Eftersom fluoroforer är ljuskänslig, bör spädningar av fluoroforenheter-konjugerade antikroppar beredas i mörkret. Dessutom bör inkubation av membran i närvaro av fluoroforen-konjugerade antikroppar förekommer i lightproof behållare. Detta kan åstadkommas genom att linda inkubation brickor i aluminiumfolie. - Dekantera antikropplösning, och tvätta membranet 3 x 5 min med TBS / T vid rumstemperatur, gunga.
- Förvärva bild av membran använder Li-Cor Odyssey CLX och Bild Studio (eller motsvarande bildutrustning och programvara), enligt tillverkarens rekommendationer.
- Efter avbildning membran, inkubera membranet med en primär antikropp som är specifik för en lasting kontrollprotein i 1% skummjölk i TBS / T under 1 timme vid rumstemperatur, gunga.
- Dekantera antikropplösning, och tvätta membranet 3 x 5 min med TBS / T vid rumstemperatur, gunga.
- Inkubera membran med lämplig fluorofor-konjugerad sekundär antikropp i 1% skummjölk i TBS / T under 1 timme vid rumstemperatur, gunga.
- Dekantera antikropplösning, och tvätta membranet 3 x 5 min med TBS / T vid rumstemperatur, gunga.
- Förvärva bild av membran använder Li-Cor Odyssey CLX och Bild Studio (eller motsvarande bildutrustning och programvara), enligt tillverkarens rekommendationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att illustrera denna metod, har HIS3 enzymet smälts till karboxiänden av modellen endoplasmatiska retiklet (ER) -associated nedbrytning (ERAD) substrat, Deg1 -Sec62 (figur 2A) för att skapa Deg1 -Sec62-His3 (Figur 3) . Deg1 -Sec62 representerar en av grundarna av en ny klass av ERAD substrat som är riktade efter ihållande, avvikande association med translocon, kanalen i första hand ansvarar för att flytta proteiner över ER membranet 32-34. Sådana instabila proteiner har preliminärt kallats ERAD-T (för translocon associerade) substrat. Tidigare studier indikerar att, vid avvikande translocon ingrepp, är Deg1 -Sec62 riktat för nedbrytning genom Hrd1 ubiquitin ligas (Figur 2B-D) 32, 34, 35. Faktorer som krävs för nedbrytning av andra Hrd1 substrat verkar vara umbärliga för <em> Deg1 -Sec62 nedbrytning, vilket tyder på en mekanism roman nedbrytnings 32. Under förhållanden med störd fett bindande och långvarig translocon förening, apolipoprotein B, proteinkomponenten i däggdjurs low-density lipoprotein, verkar vara ned av en närstående mekanism 36-38. Därför kan Deg1 -Sec62 tillhandahålla en användbar modell för nedbrytning av medicinskt relevanta translocon associerade proteiner.
Vildtyp och hrd1Δ jästceller som saknar den kromosomala HIS3-genen transformerades med en tom vektor 39 eller en plasmid som kodar Deg1 -Sec62-His3 och fläckvis på selektiv tillväxtmedium (Figur 4). För att bekräfta att lika antal av transformerade jästceller överfördes till plattor, cellerna i fläckar på medium som saknade tryptofan (som selekterar för celler, som hyser plasmiden) men innehållande histidin. Liknande tillväxt observerades för alla transformerade jästceller.Celler som uttrycker Deg1 -Sec62-His3 förväntades växa i frånvaro av histidin endast när fusionsproteinet stabiliseras (dvs när ERAD-T äventyras). Faktum hrd1Δ jäst som uttrycker Deg1 -Sec62-His3 uppvisade en tillväxtfördel i förhållande till vildtyp celler som uttrycker Deg1 -Sec62-His3 på medium utan tryptofan och histidin. Emellertid märkt fusionsprotein-beroende tillväxt i frånvaro av histidin observerades även i närvaro av Hrd1. För att öka stringensen hos analysen, var medium som saknar histidin kompletterat med 3-amino-1H-1,2,3-triazol (3-AT), en kompetitiv inhibitor av HIS3-enzym 40. Jäst uttrycker Hrd1 växte mycket dåligt på medium som saknar histidin kompletterat med 1 - 2 mM 3-AT; när HRD1 togs bort, var celltillväxten återställd. Införande av 3-AT i en koncentration av 3 mM dramatiskt hämmad tillväxt av alla celler, oavsett närvaron eller frånvaron av Hrd1. Dessa res ÜLTS är förenliga med Hrd1 beroende substrat nedbrytning.
Nästa, steady-state överflöd av Deg1 -Sec62-His3 protein i jäst som uttrycker eller saknar Hrd1 enzymet direkt testat. Western blotting analys visade en jämförbar ökning Deg1 -Sec62-His3 och Deg1 -Sec62 protein i hrd1Δ jäst i förhållande till vildtypceller (Figur 5). Detta bekräftar en roll för Hrd1 i regleringen av nivåerna av båda proteinerna. Hrd1 Beroende nedbrytning av Deg1 -Sec62 fortsätter efter proteinet griper abnormt ER translocon 32. Viktigt Deg1 -Sec62-His3 ingriper abnormt den translocon på ett liknande sätt (opublicerade data), vilket ytterligare validerar användningen av Deg1 -Sec62-His3 som ett tillväxtbaserade reporter för nedbrytning av Deg1 -Sec62 specifikt och translocon associerade proteiner i allmänhet.
s ">
Figur 2:.. Modell för nedbrytningen av Deg1 -Sec62 följande avvikande translocon ingrepp (A) Schematisk återgivning av Deg1 -Sec62 Deg1 (de aminoterminala 67 aminosyrorna från MATα2) följs, i sekvens, av flagg (F) epitop , den 2-trans endoplasmatiska retiklet (ER) protein Sec62, och två kopior av S. aureus protein A (PRA). För tydlighetens skull är det fusionsprotein kallas Deg1 -Sec62. (B) Efter normal insättning av sina två transmembransegment i ER-membranet, ihållande interaktion mellan Deg1 -Sec62 med translocon utlöser onormal, Deg1 -beroende translocon engagemang. En portion av det inledningsvis cytosolisk aminoterminala svansen inträder-och abnormt sannolikt förblir inom-the translocon. (C) Efter onormala translocon engagement, erkänner Hrd1 och ubiquitylates Deg1 -Sec62. Röda cirklar indikerar ubiquitin molekyler. (D) Deg1 -Sec62 heras sedan från ER membranet och bryts ned av proteasomen, sannolikt lindra translocon obstruktion.
Figur 3:. Schematisk skildring av Deg1 -Sec62-His3 efter avvikande translocon engagemang Deg1 följs, i sekvens, av flagg (F) epitop, den 2-trans ER protein Sec62, två kopior av S. aureus protein A (PRA), och den jäst His3-enzymet. För tydlighets skull är fusionsproteinet kallas Deg1 -Sec62-His3.
Figur 4: Fixerings His3 till Deg1 (HRD1) och hrd1Δ jäst transformerad med en tom vektor eller en plasmid som kodar Deg1 -Sec62-His3 fläckades på medium som saknar tryptofan, medium som saknar tryptofan och histidin och medium som saknar tryptofan och histidin kompletterat med 3-amino-1 H-1,2,3-triazol (3-AT), en kompetitiv hämmare av His3, vid de angivna koncentrationerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra .
Figur 5:. Ökad överflöd av Deg1 -Sec62 och Deg1 -Sec62-His3 i celler som saknar Hrd1 Proteinextrakt bereddes från vildtyp (+) och hrd1Δ(Δ) jäst som uttrycker Deg1 -Sec62 eller Deg1 -Sec62-His3. Proteiner (motsvarande 0,125 OD 600 enheter) separerades genom SDS-PAGE, följt av Western-blotting med kanin-anti-mus-sekundära antikroppar, som direkt binder protein A epitoper av fusionsproteinerna. Efterföljande western blotting med antikroppar som är specifika till Pgk1 tillhandahåller en laddningskontroll.
| Lösning | Komponenter | Kommentarer | ||
| Syntetiskt Defined (SD) Minimal Jäst Medium | 2% dextros, 0,67% jästkvävebas utan aminosyror, 0,002% adenin, 0,004% uracil, 0,002% arginin, 0,001% histidin, 0,006% isoleucin, 0,006% leucin, 0,004% lysin, 0,001% metionin, 0,006% fenylalanin, 0,005 % treonin, 0,004% tryptofan. För fast (platta) medium, inkluderar 2% agar. | 1. Selektiv Mediet bereds genom att utelämna aplig aminosyra (er) eller kvävehaltiga baser. | ||
| 2. För enkelhets skull kan dessa ingredienser bibehållas som koncentrerade stamlösningar enligt följande. Aminosyror kan bibehållas som 100X stamlösning innehållande alla önskade aminosyror. Jästkvävebas kan bibehållas i en 20X stamlösning (13,4%). Dextros kan bibehållas i en 40% stamlösning. Adenin och uracil kan bibehållas som en% förrådslösningar i 0,1 M NaOH. | ||||
| 3. Sterilisera medium genom autoklavering. | ||||
| 1X Laemmli provbuffert | 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-merkaptoetanol, 60 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,008% bromfenolblått | 1. 1X Sample buffert ofta beredd genom utspädning en mer koncentrerad (t.ex. 5X) lager. | ||
| 2. Färgämnes bromofenolblått kan sättas till önskad intensitet. En "nypa" (mycket liten mängd knackade från kanten av en spatel) är typiskt tillräckligt. | ||||
| 0,2 M natriumhydroxidlösning | Förbered i vatten. Natriumhydroxid reagerar med glas. Därför, för långtidslagring, 0,2 M natriumhydroxid bör bibehållas i plastbehållare. | |||
| Laemmli Running Buffer (5X) | 125 mM Tris, 960 mM glycin, 0,5% SDS | För att framställa ett L 1X Laemmli löpbufferten, utspädd 1: 5 i dH 2 O | ||
| Tris acetat-SDS Transfer Buffer (5X) | 125 mM Tris-acetat (pH 8,8), 960 mM glycin, 0,05% SDS | För att framställa 20 L 1X Tris Acetat-SDS överföringsbuffert, kombinera 4 L av 5X lager, 4 liter metanol, och 12 L av dH 2 O | ||
| 10X Tris-buffrad saltlösning (TBS) | 500 mM Tris, 1,5 M NaCl; pH justerat till 7,5 | För att förbereda 1 L 1X TBS, späd 1:10 i dH 2 O. 1X TBS kan kompletteras med detergenten Tween-20 och skummjölkspulver, som är lämpligt. |
| Stam Namn | Alias | Relevant Genotyp | Siffror | Källa |
| VJY6 | MHY500 | MATa | 4 och 5 | Chen et al., 1993 |
| his3-Δ200 | ||||
| leu2-3,112 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| gal2 | ||||
| VJY10 | MATa | 4 och 5 | Denna studie | |
| his3- Δ 200 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| gal2 | ||||
| hrd1 :: kanMX4 |
Tabell 2:. Jäststammar som användes i denna studie Byggnadsdetaljer finns på begäran.
| Plasmid Antal | Fullständigt Plasmid Namn | Figur | Källa |
| pVJ30 | pRS414-P MET25 -Deg1 -FLAG-Sec62-2xProtA | 5 | Rubenstein et al., 2012 |
| pVJ121 | pRS414-P MET25 (tom vektor med MET25 promotor) | 4 | Mumberg et al., 1994 |
| pVJ467 | pRS414-P MET25 -Deg1 -FLAG-Sec62-2xProtA-His3 | 5 | Denna studie |
| pVJ477 | pRS414-P GAL4 -Deg1 -FLAG-Sec62-2xProtA-His3 | 4 | Denna studie |
Tabell 3:. Plasmider som användes i denna studie Observera att alla plasmider innehåller en jästcentromer för att tillåta replikation i jästceller, TRP1-genen för selektion i jästceller, och amprgen för underhåll i bakterieceller. Plasmid kartor, sekvenser och konstruktionsdetaljer är tillgängliga på begäran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som presenteras här möjliggör snabb bestämning och biokemisk bekräftelse av genetiska krav för proteinnedbrytning i jästceller. Dessa experiment belysa nyttan och kraften av jäst som modell eukaryot organism (flera utmärkta recensioner av jästbiologi och sammanställningar av protokoll för hantering, lagring och manipulera jästceller (t.ex. 41-44) är tillgängliga för utredarna nya för organismen). Teknikerna kan utan vidare tillämpas för att undersöka nedbrytningen och förekomst av en mängd olika klasser av proteiner. Till exempel, har andra anställda denna strategi för att karakterisera nedbrytningsmekanismer instabil cytosoliskt, kärnkraft, och ER luminala och transmembranproteiner 45-49.
Några faktorer måste beaktas i valet av metabola enzym att smälta till en instabil protein. För det första är det viktigt att en funktionell version av den gen som kodar för enzymet intevara närvarande i värdgenomet. För att minimera falska positiva resultat (dvs tillväxt under selektiva betingelser när den instabila proteinet är faktiskt nedbruten), rekommenderas att arbeta med stammar som hyser icke-åter muterade alleler av reportergenen (helst kompletta gen strykningar) 50. En annan faktor för rapportenzym val är tillgången på konkurrerande hämmare, som kan ingå i det selektiva tillväxtmediet för att minska bakgrunds tillväxten och öka analys stringens. Detta kan vara användbart i fall av proteiner med relativt låga omsättningshastigheter även i närvaro av fullständigt funktionella nedbrytningsmekanismer. I de representativa experiment som presenteras här, införandet av 3-AT, som kompetitivt hämmar His3 enzymet minskar bakgrundstillväxten 40. Likaså föreningen 6-azauracil inhiberar Ura3, ett enzym som krävs för uracil biosyntes 51. Inhibitorkoncentrationen vid vilken tillväxt sker i degradering-defective, men inte vildtypen, måste celler bestämmas empiriskt. Vissa metabola enzymer kan också vara kontraproduktivt valts mot. Under kontra selektiva förhållanden, får cellerna växa endast när den instabila proteinet bryts ned (och smält metaboliska enzymet saknas). Exempelvis Ura3 omvandlar föreningen 5-fluororotsyra (5-FOA) mot den toxiska föreningen, 5-fluorouracil 52. Celler som uttrycker en Ura3-fusionsprotein kommer bara att växa i närvaro av 5-FOA om URA3-fusionsprotein omvandlas. Likaså är föreningen 5-fluoroanthranilic syra (5-FAA) giftigt för celler med en funktionell tryptofan biosyntesvägen. 5-FAA kan således användas för att motverka att välja för celler som uttrycker TRP1-fusionsproteiner 53. Counter-selektionsstrategier kan vara användbara för att identifiera dämpare av nedbrytnings-försämra mutationer.
Den promotor som används för att driva expression av en reportergen nedbrytning måste också väljas noggrant. Så låga nivåer av BiosynthEtic enzymer kan vara tillräcklig för att stödja tillväxten i frånvaro av exogent medföljande metabolit, är en svag promotor rekommenderas 54. I de representativa experimenten som presenteras här, GAL4-promotorn, vilken är undertryckt i närvaro av glukos 55, används för att främja transkription av Deg1 -Sec62-His3. Basal expression av detta fusionsprotein enligt undertryckande betingelser (dvs 2% glukos) är tillräcklig för att stödja tillväxt under selektiva betingelser (dvs. frånvaro av histidin och närvaro av 1 - 2 mM 3-AT) när mekanismen nedbrytningen är inaktiverad. Men för att proteinnivåer tillräckliga stödja tillväxten under selektiva betingelser kommer sannolikt att vara under tröskelvärdet för upptäckt genom western blotting. Därför kan det vara nödvändigt att driva uttryck med en svag promotor för tillväxtanalys och en starkare promotor för biokemisk bekräftelse. I fallet med Deg1 -Sec62 (med eller utan HIS3 fusion), en mer Robust-promotorn (här, MET25 promotorn 39) krävs för proteinvisualisering med western-analys.
Som beskrivs här, kan jästen baserade tillväxtanalys utföras på en småskalig, kandidat baserad metod. Serieutspädningar av jästceller bereds i en 96-brunnar och överförs genom pipettering till fast odlingsmedium; en alternativ metod för effektiv och reproducerbar överföring av utspädda jästcellsuspensionerna på fast medium är användningen av en flerstifts replikator, som vanligtvis kallas en "Frogger" 56. Den perfekta tiden att fotografera plattor varierar med jäststammar och villkor. Det rekommenderas att fotografera en given platta när kolonier från den snabbast växande kulturen först blir synliga på den mest utspädda plats. Detta är vanligtvis den punkt där skillnader i tillväxttakten bland proverna är mest uppenbara. Det kan vara tillrådligt att ta fotografier på flera dagar, i synnerhet i fallet med jästuppvisar ett brett spektrum av tillväxttakter.
Tillväxten baserade reporteranalysen kan också anpassas för storskalig analyser. Till exempel kan en reporter nedbrytnings införas i en kommersiellt tillgänglig bibliotek av ~ 5000 bärkraftiga haploid jäst gendeletion stammar använder Syntetisk Genetisk Array (SGA) teknik 46,57. I denna teknik, är en haploid jäststam med en kromosomalt integrerad metabolisk reporterfusionsprotein paras till varje stam av gendeletion biblioteket. De resulterande diploida celler induceras sporulera (genomgå meios) och utsattes för selektion för haploid meiotisk Avkomma som härbärgerar både den metaboliska reporter och individuella genprodukter deletioner. Dessa stammar överförs sedan en masse till medium selektivt för celler i vilka proteinet har stabiliserats. När det gäller småskalig analyser, om en gen med en roll i proteinnedbrytning raderas, fusionsproteinet kommer att stabiliseras, och celltillväxt kommer att stärkas. Jämförbar enpproaches har tagits fram som möjliggör samtidig omvandling av en stor samling av stammar med extra-kromosomalt hållna plasmider; denna strategi undanröjer kromosomal integrering, parning, sporulering och meiotisk val 54.
När en mutation har befunnits ge en tillväxtfördel till celler som härbärgerar en metabolisk reporter, är det nödvändigt att biokemiskt bekräfta att mutationen ökar överflödet av proteinet av intresse. En snabb och tillförlitlig jäst lys förfarande, tätt anpassat från metoden enligt Kuhsnirov 31, presenteras. Detta protokoll möjliggör för utvinning av proteiner i en form direkt lämpliga för analys med Western blotting. För analys av ett givet protein, till mängden av lysatet laddades per brunn, akrylamid gelegenskaperna, måste valet av membran, antikroppar som används och spädningar därav, och detekteringsmetod bestämmas empiriskt. Den representativa western blotting protokoll som beskrivs utilizes sekundära antikroppar konjugerade till fluorescerande färgämnen; andra vanliga protokoll beroende kemiluminescens beroende antikropps konjugerade enzymer 58. Såsom beskrivs här, kan membranet användas för att detektera proteinet av intresse direkt reprobed med en antikropp för en laddningskontrollprotein. Om de primära antikroppar som används för att detektera proteinet av intresse och lastning kontrollprotein har höjts från samma art, reprobing membranet är möjligt så länge som de band som följer av dessa proteiner inte samar migrera. Om emellertid de primära antikropparna används för att detektera proteinet av intresse och lastningskontrollprotein har höjts från olika arter, kan samma membran sekventiellt sonde, även om band co-migrate, om de sekundära antikropparna har konjugerats till fluoroforer med olika emissionsvåglängder. I det fall att proteinet av intresse och lastningskontrollprotein co-migrate och de respektive primära antikroppar har varit raised från samma art, får prover lösas på två SDS-PAGE geler, överfördes till PVDF-membran och sonde separat med antikroppar specifika för proteinet av intresse och lastning kontrollprotein. Alternativt kan lastning konsekvens bedömas genom inkubation membran med ospecifika proteinfläckar (t.ex. Coomassie eller Ponceau S). Vidare förutsätts det representativa western blotting protokoll ett protein eller epitop som detekteras genom sekventiell inkubering av primära och sekundära antikroppar, som är typiskt. Fusionsproteinerna analyseras i de representativa resultat innehåller två epitoper härledda från Staphylococcus aureus protein A (PRA i figurerna 2 och 3). Protein A binder direkt till däggdjurs immunoglobuliner och kan därför upptäckas med hjälp av sekundär antikropp ensam (dvs. ingen primär antikropp inkubation steg krävs) 59. Det är möjligt att fusion av en reporter enzym kan påverka protein överflöd ellernedbrytning. Det är därför lämpligt att biokemiskt bekräfta resultaten med en version av underlaget inte kompliceras av reportern proteinet. Slutligen båda analyserna beskrivs här förlitar sig på skillnader i steady state proteinnivåer som en proxy för skillnader i proteinstabilitet. Eftersom protein överflöd återspeglar integrationen av hastigheter av proteinsyntes och nedbrytning, ytterligare biokemisk analys (t ex cykloheximid chase eller puls chase experiment) måste användas för att direkt analysera ett proteins dynamisk nedbrytningsprofil.
De representativa resultat etablera en ny tillämpning av detta protokoll för bestämning av genetiska krav för nedbrytning av ett protein som avvikande engagerar ER translocon. Deg1 -Sec62-His3 ges en jästtillväxtfördel under selektiva betingelser när nedbrytningsvägen inaktiverades (dvs. frånvaron av Hrd1 ubiquitin ligas). En snabb och tillförlitlig protein exdragkraft metod som western blotting bekräftade en ökad förekomst av Deg1 -Sec62 (med eller utan His3) i avsaknad av Hrd1. Tidigare studier indikerar att mekanismen för Hrd1-beroende nedbrytning av translocon associerade proteiner skiljer sig från de hos andra Hrd1 ER luminala eller transmembransubstrat 32. Framtida arbete kommer att sysselsätta den Deg1 -Sec62-His3 fusionsprotein i storskaliga genetiska skärmar för att identifiera nya gener som krävs för denna unika mekanism nedbrytning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Acknowledgments
Vi tackar nuvarande och tidigare medlemmar av Rubenstein labbet för att tillhandahålla en stödjande och entusiastisk forskningsmiljö. Vi tackar Ryan T. Gibson för hjälp i protokolloptimering. Vi tackar Mark Hochstrasser (Yale University) och Dieter Wolf (Universität Stuttgart) för jäststammar och plasmider. Vi tackar våra anonyma granskare för deras hjälp med att förbättra tydligheten och nyttan av detta manuskript. Detta arbete stöddes av ett forsknings utmärkelse från kapitlet Ball State University of Sigma Xi till SGW, en National Institutes of Health bidrag (K15 GM111713) till EMR, en Ball State University ASPIRE forsknings utmärkelse till EMR, och medel från statliga universitet Ball Provost kansli och Biologiska institutionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
| 3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs. |
| Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer. |
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers. |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes. |
| Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) | Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
References
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
- Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
- Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1. S11 (2007).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
- Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
- Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
- Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
- Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
- Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
- Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
- Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
- Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
- Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
- Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
- Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
- Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
- Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
- Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
- Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
- Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093 (2012).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
- Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
- Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
- Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
- Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
- Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
- Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
- Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
- Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
- Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
- Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , Elsevier. San Diego. (2004).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
- Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
- Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
- Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
- Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
- Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
- Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
- Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
- Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791 (2012).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
- Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
- Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).
Tags
Molecular Biology Ubiquitin-proteasomsystemet,
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
