Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vekst-baserte Fastsettelse og Biokjemisk Bekreftelse av Genetiske Krav for proteinnedbrytning i Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/52428
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital
* These authors contributed equally

Abstract

Regulert protein degradering er avgjørende for nesten alle cellulære funksjon. Mye av det som er kjent om de molekylære mekanismer og genetiske krav til eukaryote protein degradering ble opprinnelig etablert i Saccharomyces cerevisiae. Klassiske analyser av protein degradering har stolt på biokjemiske puls-jage og cykloheksimid-chase metoder. Mens disse teknikkene gir følsomme midler for å observere proteinnedbrytning, de er arbeidskrevende, tidkrevende, og lav gjennomstrømning. Disse metodene er ikke mottagelig for rask eller storskala screening for mutasjoner som hindrer protein degradering. Her er en gjærvekst-basert assay for den lette identifisering av genetiske krav til proteinnedbrytingen er beskrevet. I denne analysen blir en reporter-enzym som er nødvendig for vekst under bestemte selektive betingelser kondensert til et ustabilt protein. Celler som mangler endogen reporter-enzym, men som uttrykker fusjonsproteinet kan vokse under selective tilstander bare når fusjonsproteinet blir stabilisert (dvs. når proteinnedbrytingen er kompromittert). I veksten analysen beskrevet her, blir seriefortynninger av villtype og mutante gjærceller som inneholder et plasmid som koder for et fusjonsprotein flekket ut på selektive og ikke-selektive medium. Vekst under selektive betingelser er forenlig med nedbrytning funksjon av en gitt mutasjon. Økt protein overflod bør biokjemisk bekreftet. Fremgangsmåte for rask ekstraksjon av gjærproteiner i en form egnet for elektroforese og Western blotting er også demonstrert. En vekstbasert avlesning for proteinstabilitet, kombinert med en enkel protokoll for proteinekstraksjon for biokjemisk analyse, muliggjør hurtig identifisering av genetiske krav for proteinnedbrytning. Disse teknikkene kan bli tilpasset for å overvåke nedbrytningen av en rekke kortvarige proteiner. I det eksempel som presentert, HIS3 enzym, som er nødvendig for biosyntese histidin, ble smeltettil Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 er målrettet for degradering etter det abnormt engasjerer endoplasmatiske retikulum translocon. Celler som inneholder Deg1 -Sec62-HIS3 var i stand til å vokse under selektive betingelser når proteinet ble stabilisert.

Introduction

Selektiv protein degradering er avgjørende for eukaryote liv, og endret protein degradering bidrar til en rekke medisinske tilstander, inkludert flere typer kreft, nevrodegenerativ sykdom, hjerte- og karsykdommer, og cystisk fibrose 1-5. Ubiquitin-proteasom system (UPS), som katalyserer selektiv protein nedbrytning, er en voksende terapeutisk mål for disse forholdene 6-10. Ubiquitin ligaser kovalent feste polymerer av den 76-amino-syre ubiquitin til proteiner 11. Proteiner som er merket med polyubiquitin kjedene er anerkjent og proteolyserte av ~ 2,5 megadalton 26S proteasomet 12. Studier initiert i modellen eukaryot organisme Saccharomyces cerevisiae (spirende gjær) har vært grunnlegg i klarlegging av protein degraderingsmekanismer i eukaryote celler. Den første gang påvist fysiologiske substrat av UPS var gjær transkripsjonen repressor MATα2 13, 14, og mange høyt konserverte delene av UPS ble først identifisert og karakterisert i gjær (for eksempel 15 til 26). Funnene som er gjort i denne allsidige og genetisk medgjørlig modellorganisme vil trolig fortsette å gi viktig innsikt i konserverte mekanismer for ubiquitin-mediert degradering.

Anerkjennelse og degradering av de fleste UPS underlag krever felles handling av flere proteiner. Derfor er et viktig mål for å karakterisere den regulerte nedbrytning av en gitt ustabilt protein er å bestemme den genetiske krav for proteolyse. Klassiske metoder (f.eks puls-chase og cykloheksimid-chase eksperimenter 27) for overvåking av proteindegradering i pattedyr eller gjærceller er arbeidskrevende og tidkrevende. Mens disse typer av metodikk gir meget følsomme midler for påvisning av proteindegradering, er de ikke egnet til hurtig analyse av proteindegradering eller store maskeringsng for mutasjoner som hindrer protein degradering. Her er en gjærvekst-basert assay for rask identifisering av genetiske krav til nedbrytning av ustabile proteiner presentert.

I gjærvekst-basert metode for analyse av proteindegradering, et ustabilt protein av interesse (eller degradering signal) er sammensmeltet, i rammen, til et protein som er nødvendig for gjærvekst under visse omstendigheter. Resultatet er et kunstig substrat som kan tjene som et kraftig verktøy for å bestemme den genetiske krav protein nedbrytning av den ustabile proteinet av interesse. Hensiktsmessig mest brukte laboratoriegjærstammer huse et panel av mutasjoner i gener som koder for metabolske enzymer som er involvert i biosyntesen av bestemte aminosyrer eller nitrogenholdige baser (f.eks 20,28-30). Disse enzymene er viktig for cellulær proliferasjon i fravær av eksogent tilgjengelig metabolitter i hvis syntese enzymer deltar. Slikmetabolske enzymer kan således virke som vekstbaserte reportere for nedbrytning av ustabile proteiner til hvilke de er sammensmeltet. De genetiske krav for proteinnedbrytning lett kan belyst, siden mutasjoner som hindrer proteolyse vil tillate celler som inneholder nedbrytning reporter til å vokse under selektive betingelser.

En vekstfordel er en indirekte indikasjon på at en bestemt mutasjon øker overflod av proteinet av interesse. Imidlertid kreves direkte biokjemisk analyse for å bekrefte at en mutasjon tillater vekst gjennom økt proteinnivå heller enn via indirekte eller kunstig årsaker. Effekten av en mutasjon på protein overflod kan bli bekreftet ved western blot-analyse av steady-state-proteinnivåer i celler som ikke gjør det havnen den spesielle mutasjon. En fremgangsmåte for hurtig og effektiv ekstraksjon av gjærproteiner (sekvensiell inkubasjon av gjærceller med natriumhydroksyd og prøvebuffer) i en form som egner segfor analyse av western blotting er også presentert 31. Sammen utgjør disse eksperimentene lette rask identifisering av kandidat regulatorer av protein degradering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Gjær Vekst analysen å identifisere Kandidat Mutants Defekte i protein degradering

  1. Transform vill-type og mutante gjærceller med et plasmid som koder for et ustabilt protein fusjonert i ramme til en reporter metabolsk enzym.
  2. Inokulere transformanter i 5 ml syntetisk definert (SD) minimalt medium som er selektivt for celler som inneholder plasmid-molekyler. Inkuber over natten ved 30 ° C, roterer.
  3. Måle den optiske tettheten ved 600 nm (OD 600) av hver kultur natten over.
    MERK: Etter inkubering over natten, kan celler i kultur være i enten logaritmisk eller stasjonær vekstfase, men bør ha nådd en minimal OD 600 på 0,2. Meget langsom voksende gjærstammer kan kreve inkubasjonstider lengre enn en natt, eller inokulering av et større antall celler, som bestemt empirisk.
  4. Forbered seks gangers seriefortynninger av transformerte gjærceller i en steril 96-brønns plate, som begynner med celler fortynnet til enn OD 600 på 0,2. Plassere hver gjærtransformanten som skal analyseres i en annen rad i 96-brønns plate.
    1. For hver transformant, beregner volumet av natten kultur som kreves for å fortynne cellene til en OD 600 på 0,2 i et sluttvolum på 200 ul. Legge dette volum av natten kultur til den tilsvarende brønn i kolonne 1. Tilsett passende mengde sterilt vann for å bringe volumet til 200 pl.
    2. For hver rad av gjær, tilsett 125 ul sterilt vann til brønnene i kolonne 2, 3 og 4.
      MERK: Individuelt innpakket sterile 96-brønners plater kan være pakket med sterile lokk. Lokkene kan bli anvendt som reservoarer for sterilt vann som er fordelt i dette trinnet. Dette tillater samtidig overføring av sterilt vann til alle brønner i et gitt kolonne med en multikanalpipette.
    3. Bland innholdet i den første kolonnen (gjær fortynnet til en OD 600 på 0,2) ved å pipettere opp og ned med en multikanal pipette.
    4. TRANSFer 25 ul av gjær fra kolonne 1 til kolonne 2, ved hjelp av en multikanalpipette. Bland ved å pipettere opp og ned. Overføring 25 ul fra kolonne 2 til kolonne 3, og 25 ul fra kolonne 3 og kolonne 4 (blandebrønn i hvert trinn).
  5. Bland hver prøve med en multikanalpipette. Fortsetter fra mest til minst fortynnet fortynne kolonner av gjær, pipette 4 pl av hver prøve på to plater inneholdende det passende selektivt medium. Bruk en plate med medium som opprettholder plasmid utvalg (denne platen fungerer som en gjær spotting og vekstkontroll). Bruke en andre plate med medium som selekterer for plasmid vedlikehold og ekspresjon av det ustabile protein fusjonert til reporter-enzym. Ettersom gjær avgjøre raskt, bland celler ved å pipettere opp og ned med jevne mellomrom.
    MERK: Tørrere plater vil lettere absorbere væske enn ferske plater og er derfor anbefalt for disse eksperimentene. Fuktige plater kan tørkes ved inkubasjon ved romtemperatur i low fuktighet for 1 - 2 dager eller kortere inkubasjonene i en laminær hette. Platene kan tørke ujevnt hvis den laminære luftstrømmen er parallell med benken. Bruk av en mal som gjør det lettere å oppdage gjærceller med jevne avstander. To eksempelmaler er gitt i figur 1. Disse kan skrives ut, kuttet ut, og festet på innsiden av en petriskål lokk.
  6. Tillate platene til tørk på benken toppen.
  7. Inkuber platene ved 30 ° C i 2 - 6 dager.
  8. Fotografere hver plate etter inkubasjon.

Figur 1
Figur 1. Maler for spotting gjærceller på 100 mm-agar plater. Disse malene kan brukes til å lette småblødninger gjær med jevne avstander med en multikanalpipette. Maler kan skrives ut, kuttet ut, og festet på innsiden av en petriskål lokk. Plasser petriskål med vekstmedium inne lokket med mal festet. Maler er merket med et hakk for å spore orientering. Det anbefales at platene som brukes i vekstmålinger bli tilsvarende merket med et hakk for å spore orientering. Maler for spotting fire (A) eller fem (B) serielle fortynninger av gjærceller er gitt. Klikk her for å se en utskriftsvennlig versjon av dette tallet med 100 mm-maler.

2. Biokjemisk Bekreftelse av gjær Vekst analysen

  1. Vekst av gjærceller og Post-Alkaline Protein Extraction (modifisert fra 31)
    1. Transform vill-type og mutante gjærceller med et plasmid som koder for den ustabile protein.
    2. Inokulere transformanter i 5 ml SD-medium som er selektivt for celler som inneholder plasmid-molekyler. Inkuber over natten ved 30 ° C, roterer.
    3. Mål OD 600 av hver overnatting cuLTURE.
      MERK: Etter inkubering over natten, kan celler være i enten logaritmisk eller stasjonær vekstfase, men bør ha nådd en OD 600 som vil tillate fortynning til en OD 600 på 0,2 i 10 ml friskt selektivt medium (trinn 2.1.4). Meget langsom voksende gjærstammer kan kreve inkubasjonstider lengre enn en natt, eller inokulering av et større antall celler, som bestemt empirisk.
    4. Fortynn gjærceller til en OD 600 på 0,2 i 10 ml friskt selektivt medium.
    5. Fortsett å inkubere cellene ved 30 ° C, roterende eller risting, inntil kulturene komme frem til en OD 600 mellom 0,8 og 1,2 (dvs. er i midt-logaritmisk vekst).
      MERK: Hvis den ustabile protein av interesse er under kontroll av en regulerbar promoter, kan det optimale tidspunktet for induksjon av proteinuttrykk og celleinnhøstningsutstyr variere i henhold til tidligere studier eller empiriske observasjoner.
    6. Samle 2,5 OD 600 enheter av kultur i en 15-ml koniskal røret ved sentrifugering ved 5000 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Fjern supernatanten ved pipettering eller aspirasjon.
      MERK: En OD 600 enhet er definert som mengden av gjær er tilstede i en ml av kulturen ved OD 600 på 1,0. Volumet av kultur (i ml) som kreves for å høste 2,5 OD 600 enheter (V) kan bestemmes ved hjelp av følgende ligning: V = 2,5 OD 600 enheter / OD 600 Målt
    7. Resuspender celler i 1 ml destillert vann. Overfør suspenderte celler i et mikrosentrifugerør.
    8. Pelletere cellene ved sentrifugering ved 6500 x g i 30 sekunder ved romtemperatur. Fjern supernatanten ved pipettering eller aspirasjon.
    9. Resuspender celler i 100 mL destillert vann ved å pipettere opp og ned eller virvling, og tilsett 100 ul 0,2 M NaOH. Bland ved å pipettere opp og ned. Inkuber prøvene i 5 min ved romtemperatur.
    10. Pellets celler (hvorav de fleste har ennå ikke utgitt proteiner og er fortsatt levedyktig) ved sentrifugering ved 18.000 xg i 5 min. Fjern supernatanten ved pipettering eller aspirasjon.
    11. Resuspender pellet i 50-100 pl 1 x Laemmli-prøvebuffer, som vil lysere cellene, ved å pipettere opp og ned eller virvling.
      MERK: Fjerning av den alkaliske supernatanten etter sentrifugering og etterfølgende resuspensjon av cellene i Laemmli prøvebuffer ekstrakter proteiner ved en pH kompatibel med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under anvendelse av en Tris-glycin-buffer-systemet og western-blotting.
    12. For å fullt ut denaturere proteiner, inkuber lysater ved 95 ° C i 5 min.
      MERK: Aggregation-utsatt proteiner (f.eks proteiner med flere trans segmenter) kan bli uløselig når inkuberes ved 95 ° C. Derfor bør lysater inkuberes ved lavere temperaturer (for eksempel 37 ° C - 70 ° C) i 10 - 30 min, som bestemt empirisk, for analyse av slike proteiner.
    13. Kule lysater ved å plassere på is i 5 min.
    14. Sentrifuger lysater ved 18.000 x g i 1 min ved romtemperatur for å pelletere uoppløselig materiale. Separere supernatanten (solubilisert ekstrahert protein) ved hjelp av SDS-PAGE før etterfølgende western blot analyse (avsnitt 2.2). Alternativt butikklysatene ved -20 ° C.
  2. Representant Western Blotting Protocol
    1. Laste empirisk bestemt volum av lysater i en SDS-PAGE-gel.
    2. Kjør gelen ved 200 V til fargestoff fronten har nådd bunnen av gelen.
    3. Overfør proteinene fra gelen til polyvinylidenfluorid (PVDF) membran ved våt- overføring ved 20 V i 60-90 minutter ved 4 ° C.
    4. Blokk membranen ved inkubering i 5% skummet melk i Tris-buffret saltvann (TBS), gynge, i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
    5. Dekanter blokkering løsning.
    6. Inkuber membran med primært antistoff som er spesifikt for proteinet av interesse (eller epitop tag derav) i 1% skummet melk i TBS med 0,1% Tween-20 (TBS / T) i 1 time ved værelsemperature, rocking.
    7. Dekanter antistoffløsning, og vaske membranen 3 x 5 min med TBS / t ved romtemperatur, gynge.
    8. Inkuber membran med passende fluorofor-konjugert sekundært antistoff i 1% skummet melk i TBS / T i 1 time ved romtemperatur, gynge.
      MERK: Fordi fluoroforene er følsom for lys, bør fortynninger av fluoroforpar konjugerte antistoffer være forberedt i mørket. I tillegg bør inkubering av membraner i nærvær av fluoroforen-konjugerte antistoffer som forekommer i lystette beholdere. Dette kan oppnås ved å pakke inkubasjonsskåler i aluminiumsfolie.
    9. Dekanter antistoffløsning, og vaske membranen 3 x 5 min med TBS / t ved romtemperatur, gynge.
    10. Erverve bilde av membran ved hjelp av Li-Cor Odyssey CLX og Image Studio programvare (eller tilsvar tenkelig utstyr og programvare), i henhold til produsentens anbefalinger.
    11. Etter avbilding av membranen, inkubere membranen med et primært antistoff som er spesifikt for en lasting styre protein i 1% skummet melk i TBS / T i 1 time ved romtemperatur, gynge.
    12. Dekanter antistoffløsning, og vaske membranen 3 x 5 min med TBS / t ved romtemperatur, gynge.
    13. Inkuber membran med passende fluorofor-konjugert sekundært antistoff i 1% skummet melk i TBS / T i 1 time ved romtemperatur, gynge.
    14. Dekanter antistoffløsning, og vaske membranen 3 x 5 min med TBS / t ved romtemperatur, gynge.
    15. Erverve bilde av membran ved hjelp av Li-Cor Odyssey CLX og Image Studio programvare (eller tilsvar tenkelig utstyr og programvare), i henhold til produsentens anbefalinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å illustrere denne metodikk, har HIS3 enzymet blitt smeltet til karboksy-terminus av modellen endoplasmatiske retikulum (ER) -associated nedbrytning (erad) substrat, Deg1 -Sec62 (figur 2A) til å lage Deg1 -Sec62-HIS3 (Figur 3) . Deg1 -Sec62 representerer en av grunnleggerne av en ny klasse av erad underlag som er målrettet etter vedvarende, avvikende tilknytning til translocon, kanalen primært ansvarlig for flytting av proteiner over ER membranen 32-34. Slike ustabile proteiner har foreløpig blitt kalt erad-T (for translocon-forbundet) underlag. Tidligere studier tyder på at, ved avvik translocon engasjement, er Deg1 -Sec62 målrettet for degradering av Hrd1 ubiquitin ligase (figur 2B-D) 32, 34, 35. Faktorer som kreves for nedbrytning av andre Hrd1 substrater synes å være unnværlig for <em> Deg1 -Sec62 nedbrytning, noe som tyder på en roman degradering mekanisme 32. Under forhold med svekket lipidbindende og langvarig translocon forening, apolipoprotein B, proteinkomponenten i pattedyr low-density lipoproteiner, ser ut til å bli degradert av en beslektet mekanisme 36-38. Derfor kan Deg1 -Sec62 gi en nyttig modell for nedbrytning av medisinsk relevante translocon-assosierte proteiner.

Vill-type og hrd1Δ gjærceller som mangler kromosomalt HIS3-genet ble transformert med en tom vektor 39 eller et plasmid som koder for Deg1 -Sec62-HIS3 og flekket ut på selektivt vekstmedium (figur 4). For å bekrefte at like mange transformerte gjærceller ble overført til plater, ble cellene prikket inn medium mangler tryptofan (som velger for celler som inneholder plasmidet), men inneholder histidin. Lignende vekst ble observert for alle transformerte gjærceller.Celler som uttrykker Deg1 -Sec62-HIS3 var forventet å vokse i fravær av histidin bare når fusjonsproteinet er stabilisert (dvs. når erad-T er kompromittert). Faktisk hrd1Δ gjær som uttrykker Deg1 -Sec62-HIS3 oppviste en vekstfordel i forhold til villtype-celler som uttrykker Deg1 -Sec62-HIS3 på medium som manglet tryptofan og histidin. Imidlertid merket fusjonsprotein-avhengig vekst i fravær av histidin ble observert selv i nærvær av Hrd1. For å øke stringensen av analysen, ble medium som mangler histidin supplert med 3-amino-1H-1,2,3-triazol (3-AT), en kompetitiv inhibitor av enzymet HIS3 40. Gjær uttrykker Hrd1 vokste veldig dårlig på medium mangler histidin supplert med 1 - 2 mm 3-AT; når HRD1 ble slettet, ble cellevekst restaurert. Inkludering av 3-AT i en konsentrasjon på 3 mM dramatisk inhiberte veksten av alle celler, uavhengig av nærvær eller fravær av Hrd1. Disse res ults er konsistente med Hrd1 avhengig underlaget degradering.

Neste, steady-state overflod av Deg1 -Sec62-HIS3 protein i gjær uttrykker eller mangler Hrd1 enzymet ble direkte testet. Western blotting analyse indikerte en tilsvarende økning i Deg1 -Sec62-HIS3 og Deg1 -Sec62 protein i hrd1Δ gjær i forhold til villtype celler (Figur 5). Dette bekrefter en rolle for Hrd1 ved regulering av nivåer av begge proteiner. Hrd1 avhengig nedbrytning av Deg1 -Sec62 fortsetter etter proteinet abnormt engasjerer ER translocon 32. Viktigere, Deg1 -Sec62-HIS3 abnormt griper translocon på lignende måte (upubliserte data), videre å validere bruks av Deg1 -Sec62-HIS3 som et vekstbasert reporter for nedbrytning av Deg1 -Sec62 spesifikt og translocon-assosierte proteiner generelt.

s "> Figur 2
Fig. 2:. Modell for nedbrytning av Deg1 -Sec62 følgende avvik translocon inngrep (A) Skjematisk fremstilling av Deg1 -Sec62 Deg1 (amino-terminale 67 aminosyrer fra MATα2) etterfølges, i rekkefølge, av flagg (F) epitop , 2-transmembrane endoplasmatiske retikulum (ER) protein Sec62, og to kopier av S. aureus Protein A (PRA). For tydelighets skyld er fusjonsprotein referert til som Deg1 -Sec62. (B) Ved å følge vanlig innsetting av sine to transmembrane segmenter inn i ER-membranen, vedvarende interaksjon av Deg1 -Sec62 med translocon utløser unormal, Deg1 -avhengig translocon inngrep. En porsjon av den innledningsvis cytosoliske amino-terminale halen abnormt går inn-og sannsynligvis forblir innenfor-det translocon. (C) Ved å følge unormale translocon engagement, gjenkjenner Hrd1 og ubiquitylates Deg1 -Sec62. Røde sirkler indikerer ubiquitin-molekyler. (D) Deg1 -Sec62 blir deretter ekstrahert fra ER membranen og degradert av proteasomet, sannsynligvis lindre translocon obstruksjon.

Figur 3
Fig. 3: Skjematisk fremstilling av Deg1 -Sec62-HIS3 følgende avvik translocon inngrep Deg1 er fulgt i sekvens ved Flag (F) epitop, 2-transmembranprotein ER Sec62, to kopier av S. aureus protein A (PRA), og gjær-HIS3-enzymet. For tydelighets skyld er fusjonsprotein referert til som Deg1 -Sec62-HIS3.

Figur 4
Figur 4: Fusing HIS3 til Deg1 (HRD1) og hrd1Δ gjær transformert med en tom vektor eller et plasmid som koder Deg1 -Sec62-HIS3 ble oppdaget på medium mangler tryptofan, medium mangler tryptofan og histidin og medium mangler tryptofan og histidin supplert med 3-amino-1H-1,2,3-(3-AT), en kompetitiv hemmer av HIS3, på de angitte konsentrasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .

Figur 5
Fig. 5: Økt overflod av Deg1 -Sec62 og Deg1 -Sec62-HIS3 i celler som mangler Hrd1 Proteinekstrakter ble fremstilt fra villtype (+) og hrd1Δ(Δ) gjær uttrykker Deg1 -Sec62 eller Deg1 -Sec62-HIS3. Proteiner (tilsvarende 0,125 OD600 enheter) ble separert ved SDS-PAGE, fulgt av Western blotting med kanin anti-mus sekundære antistoffer, som direkte binder protein A epitoper av fusjonsproteinene. Påfølgende western blotting med antistoffer spesifikke for Pgk1 gir en lastekontroll.

Tabell 1: Løsninger og buffere som brukes i denne undersøkelsen.

Oppløsning Komponenter Kommentarer
Syntetisk Definert (SD) Minimal Gjær Medium 2% dekstrose, 0,67% gjærnitrogenbase uten aminosyrer, 0,002% adenin, uracil 0,004%, 0,002% arginin, histidin 0,001%, 0,006% isoleucin, leucin 0,006%, 0,004% lysin, metionin 0,001%, 0,006% fenylalanin, 0,005 % treonin, 0,004% tryptofan. For solid (plate) medium, inkluderer 2% agar. 1. Selektivt medium fremstilles ved å utelate apsikts aminosyre (r), eller nitrogenholdige baser.
2. For enkelhets skyld kan disse ingrediensene bli opprettholdt som konsentrerte stamløsninger som følger. Aminosyrer kan bli opprettholdt som 100X stamløsning inneholdende alle de ønskede aminosyrer. Gjærnitrogenbase kan opprettholdes i en 20X lagerløsning (13,4%). Dekstrose kan bli opprettholdt i en 40% lagerløsning. Adenin og uracil kan bli opprettholdt som en% stamløsninger i 0,1 M NaOH.
3. Steril medium ved autoklave.
1X Laemmli Sample Buffer 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-merkaptoetanol, 60 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,008% bromfenolblått 1. 1X Sample buffer er ofte forberedt ved å fortynne en mer konsentrert (f.eks 5X) lager.
2. Fargestoffet bromfenolblått kan tilsettes til ønsket intensitet. En "klype" (veldig liten mengde tappet fra kanten av en slikkepott) er vanligvis tilstrekkelig.
0,2 M natriumhydroksyd Forberede i vann. Natriumhydroksyd reagerer med glasset. Derfor, for langtidslagring, 0,2 M natriumhydroksyd bør opprettholdes i plastbeholdere.
Laemmli Running Buffer (5X) 125 mM Tris, 960 mM glysin, 0,5% SDS For å forberede en L 1X Laemmli Running Buffer, fortynne 1: 5 i dH 2 O
Tris Acetat-SDS Transfer Buffer (5X) 125 mM Tris acetat (pH 8,8), 960 mM glysin, 0,05% SDS For å fremstille 20 ml Tris-acetat-1X SDS overføringsbuffer, kombiner 4 liter av 5X lager, 4 l metanol og 12 l av dH 2 O
10X Tris-bufret saltvann (TBS) 500 mM Tris, 1,5 M NaCl; pH justeres til 7,5 For å forberede en L av 1X TBS, fortynne 01:10 i dH 2 O. 1X TBS kan suppleres med detergent Tween-20 og pulverisert skummet melk, som hensiktsmessig.
<td> leu2-3,112
Strain Name Alias Relevant Genotype Tallene Kilde
VJY6 MHY500 Mata 4 og 5 Chen et al., 1993
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
VJY10 Mata 4 og 5 Denne studien
his3- Δ 200
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
hrd1 :: kanMX4

Tabell 2:. Gjær stammer brukt i denne studien Detaljer om bygging er tilgjengelig på forespørsel.

Plasmid Antall Full Plasmid navn Figur Kilde
pVJ30 pRS414-P MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA 5 Rubenstein et al., 2012
pVJ121 pRS414-P MET25 (tom vektor med MET25 promoter) 4 Mumberg et al., 1994
pVJ467 pRS414-P MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-HIS3 5 Denne studien
pVJ477 pRS414-P GAL4 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-HIS3 4 Denne studien

Tabell 3:. Plasmider anvendt i denne studien Merk at alle plasmidene inneholder en gjær-cent for å tillate replikasjon i gjærceller, TRP1 genet for seleksjon i gjærcellene, og ampR-genet for vedlikehold i bakterieceller. Plasmidkartene, sekvenser, og detaljer av konstruksjonen er tilgjengelig på forespørsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metodikken som presenteres her muliggjør rask bestemmelse og biokjemiske bekreftelse av genetiske krav for proteindegradering i gjærceller. Disse eksperimentene markere nytten og kraft gjær som modell eukaryot organisme (flere gode anmeldelser av gjær biologi og samlinger av protokoller for håndtering, oppbevaring og manipulerer gjærceller (f.eks 41-44) er tilgjengelig for etterforskerne nye til organismen). Teknikkene kan lett bli anvendt for å undersøke nedbrytning og overflod av en rekke forskjellige klasser av proteiner. For eksempel, andre har brukt denne strategien for å karakterisere degraderingsmekanismer av ustabil cytosolisk, kjernekraft, og ER luminal og transmembrane proteiner 45-49.

Noen faktorer må vurderes i valg av metabolske enzym å fusjonere til en ustabil protein. For det første er det vesentlig at en funksjonell versjon av genet som koder for enzymet ikkevære tilstede i vertsgenomet. For å minimalisere falske positive resultater (dvs. vekst under selektive betingelser når den ustabile protein er faktisk degradert), anbefales det å arbeide med stammer som bærer på ikke-rever mutante alleler av reportergenet (fortrinnsvis komp gendelesjoner) 50. En annen vurdering for reporter enzym utvalget er tilgjengeligheten av konkurrerende hemmere, som kan inngå i den selektive vekstmedium for å redusere bakgrunns vekst og forbedre analysen stringens. Dette kan være nyttig i tilfeller av proteiner med relativt lave omsetning priser selv i nærvær av fullt funksjonelle degraderingsmekanismer. I de representative eksperimenter som presenteres her, inkludering av 3-AT, som kompetitivt hemmer HIS3 enzymet, reduserer bakgrunns vekst 40. Likeledes hemmer forbindelsen 6-azauracil URA3, et enzym som er nødvendig for biosyntese 51 uracil. Inhibitor-konsentrasjon ved hvilken vekst forekommer i degradering-defective, men ikke vill-type, må cellene bestemmes empirisk. Noen metabolske enzymer kan også virke mot sin hensikt valgt mot. Under betingelser kontra selektiv, kan cellene vokser bare når den ustabile proteinet blir degradert (og det smeltede metabolsk enzym som ikke er tilstede). For eksempel URA3 omdanner forbindelsen 5-fluororotinsyre (5-FOA) til den giftige forbindelse, 5-fluoruracil 52. Celler som uttrykker en URA3-fusjonsprotein vil bare vokse i nærvær av 5-FOA hvis URA3-fusjonsprotein blir degradert. Likeledes er forbindelsen 5-fluoroanthranilic syre (5-FAA) giftig for celler med en funksjonell tryptofan biosyntesebanen. 5-FAA, kan således brukes til å kontra selektere for celler som uttrykker TRP1-fusjonsproteiner 53. Counter-seleksjonsstrategier kan være nyttig for identifisering av undertrykkere av nedbrytnings-svekke mutasjoner.

Arrangøren brukes til å drive uttrykk for en degradering reporter må også velges med omhu. Som lave nivåer av BIOSYNTHmagnetiske enzymer kan være tilstrekkelig til å understøtte vekst i fravær av eksogent tilført metabolitt, er en svak promoter anbefales 54. I representative eksperimenter er presentert her, GAL4 promoteren, som er fortrengt, i nærvær av glukose 55, blir brukt til å fremme transkripsjon av Deg1 -Sec62-HIS3. Basal uttrykk for denne fusjonsprotein i henhold repressing forhold (dvs. 2% glukose) er tilstrekkelig til å støtte vekst under selektive betingelser (dvs. fravær av histidin og tilstedeværelse av 1 - 2 mm 3-AT) når degradering mekanismen er deaktivert. Imidlertid, for å proteinnivåer tilstrekkelig støtte vekst under selektive betingelser vil sannsynligvis være under grensen for deteksjon ved western blotting. Derfor kan det være nødvendig å drive ekspresjon med en svak promoter for vekstanalyse og en sterkere promoter for biokjemisk bekreftelse. I tilfelle av Deg1 -Sec62 (med eller uten HIS3 fusjon), en mer Robust-promoteren (her, den MET25 promoter 39) er nødvendig for protein visualisering ved Western analyse.

Som beskrevet her, kan gjær baserte vekstanalyse utføres på en liten skala, kandidat basert tilnærming. Serielle fortynninger av gjærceller blir fremstilt i en 96-brønns plate og overføres ved pipettering til fast vekstmedium; en alternativ fremgangsmåte for effektiv og reproduserbar overføring av fortynnet gjærcellesuspensjoner på fast medium er bruken av en flerpolet replikator, ofte referert til som en "frogger" 56. Den ideelle tiden å fotografere plater vil variere med gjærstammer og forhold. Det anbefales å fotografere en gitt plate når kolonier fra den raskest voksende kultur først bli synlig på det mest fortynnet spot. Dette er vanligvis det punktet hvor forskjeller i vekstrater blant prøver er mest åpenbare. Det kan være tilrådelig å ta bilder på flere dager, spesielt i tilfellet av gjærsom oppviser et bredt spekter av vekstrater.

Veksten baserte reporter analysen kan også bli tilpasset for storskala-analyser. For eksempel kan en nedbrytning reporter innføres i en kommersielt tilgjengelig bibliotek av ~ 5000 levedyktige haploide gjærgen delesjonsstammer ved anvendelse av syntetiske Genetisk Array (SGA) teknologi 46,57. I denne teknikken blir en haploid gjærstamme med en kromosomalt integrert metabolsk reporter fusjonsprotein parret med hver stamme av genet delesjon biblioteket. De resulterende diploide celler blir overtalt til å sporulere (gjennomgå meiose) og utsatt for utvalg for haploid meiotisk avkom huse både den metabolske reporter og individuelle gendelesjoner. Disse stammene blir deretter overført en masse til selektivt medium for celler hvor proteinet er stabilisert. Som for småskala-analyser, hvis et gen med en rolle i proteinnedbrytning slettes, fusjonsproteinet vil bli stabilisert, og cellevekst vil være forbedret. Sammenlign enpproaches har blitt utviklet som gir mulighet for samtidig transformasjon av en stor samling av stammer med ekstra-kromosomer vedlikeholdt plasmider; denne strategien unngår kromosom integrasjon, parring, sporulering, og meiotisk utvalg 54.

Når en mutasjon er funnet å gi en vekstfordel til celler som inneholder et metabolsk reporter, er det nødvendig å biokjemisk bekrefte at mutasjonen øker overflod av proteinet av interesse. En hurtig og pålitelig gjær lyseprosedyren, tett tilpasset fra metoden ifølge Kuhsnirov 31, er presentert. Denne protokollen tillater utvinning av proteiner i en form som direkte er egnet for analyse ved western blotting. For analyse av et gitt protein, mengden av lysat som skal lastes per brønn, akrylamid gelegenskaper, valg av membran, antistoffer som brukes og fortynninger derav, og metode for påvisning må bestemmes empirisk. Representanten western blotting protokoll beskrevet utilizes sekundære antistoffer konjugert til fluorescerende fargestoffer; andre vanlige protokoller er avhengige av kjemiluminescens avhengig av antistoff-konjugert 58 enzymer. Som beskrevet her, kan membranen anvendes for å påvise proteinet av interesse bli direkte reprobed med et antistoff for en lastekontrollprotein. Dersom de primære antistoffer som brukes for å påvise proteinet av interesse og lastekontroll protein har blitt hevet fra den samme art, reprobing membranen er mulig så lenge som de bånd som kommer fra disse proteinene ikke ko-migrerer. Hvis imidlertid de primære antistoffer som brukes for å påvise proteinet av interesse og lastekontroll protein har blitt hevet fra forskjellige arter, kan den samme membranen probet sekvensielt, selv om bånd ko-migrerer, hvis de sekundære antistoff er konjugert til fluoroforer med ulike utslippsbølgelengder. I det tilfelle at proteinet av interesse, og lastekontroll protein ko-migrerer og de respektive primære antistoffer har vært raised fra den samme art, kan prøvene bli løst på to SDS-PAGE-geler, overført til PVDF-membran, og probet separat med antistoffer som er spesifikke for proteinet av interesse lastekontroll og protein. Alternativt kan laste konsistens bli dømt ved inkubasjon membraner med uspesifikke proteinflekker (f.eks Coomassie eller Ponceau S). Videre, påtar representativ Western blotting-protokoll et protein eller epitop som blir detektert ved sekvensiell inkubasjon av primære og sekundære antistoffer, som er typisk. Fusjonsproteiner ble analysert i de representative resultater inneholde to epitoper avledet fra Staphylococcus aureus protein A (PRA i figurene 2 og 3). Protein A binder direkte til pattedyr immunoglobuliner, og derfor kan påvises ved hjelp av sekundære antistoff alene (dvs. uten primært antistoff inkubering trinnet er nødvendig) 59. Det er mulig at fusjon av et reporter-enzym kan påvirke protein eller overfloddegradering. Det er derfor lurt å biokjemisk bekrefte resultatene med en versjon av underlaget uhemmet av reporter protein. Til slutt, begge analysene beskrevet her stole på forskjeller i steady-state protein nivåer som en proxy for forskjeller i proteinstabilitet. Fordi proteinet overflod reflekterer integrering av forekomst av proteinsyntese og nedbrytning, ytterligere biokjemiske analyser (f.eks cykloheksimid jage eller puls chase eksperimenter) skal anvendes til direkte å analysere et protein dynamiske nedbrytningsprofil.

De representative resultater etablere en ny anvendelse av denne protokollen for bestemmelse av genetisk krav til nedbrytning av et protein som abnormt inngrep med ER translocon. Deg1 -Sec62-HIS3 dratt en gjærvekstfordel under selektive betingelser ved nedbrytning pathway ble inaktivert (dvs. fravær av Hrd1 ubiquitin ligase). En rask og pålitelig protein extraksjonsmetode etterfulgt av western-blotting bekreftet en økning i mengde av Deg1 -Sec62 (med eller uten HIS3) i fravær av Hrd1. Tidligere studier tyder på at mekanismen for Hrd1-avhengig nedbrytning av translocon-assosierte proteiner som skiller seg fra de andre Hrd1 ER luminal eller transmembrane substrater 32. Fremtidig arbeid vil ansette Deg1 -Sec62-HIS3 fusjonsprotein i store genetiske skjermer for å identifisere nye gener som kreves for denne unike degradering mekanisme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker nåværende og tidligere medlemmer av Rubenstein lab for å gi en støttende og entusiastisk forskningsmiljø. Vi takker Ryan T. Gibson for å få hjelp i protokollen optimalisering. Vi takker Mark Hochstrasser (Yale University) og Dieter Wolf (Universität Stuttgart) for gjærstammer og plasmider. Vi takker våre anonyme lesere for deres hjelp i å forbedre klarhet og nytten av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en forskningspris fra Ball State University kapittel av Sigma Xi til SGW, en National Institutes of Health stipend (R15 GM111713) til EPJ, en Ball State University Aspire forskningspris til EPJ, og midler fra Ball State University Provost kontor og Institutt for biologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole Fisher Scientific AC264571000 Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) Roche 11088726001 May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped Sarstedt 82.1581.001 Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl Gilson F14401 Available from a variety of manufacturers
 
 
 

 
Name Company Catalog Number Comments
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl Gilson F14403 Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216 Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.
Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) Bio-Rad 170-8195 A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater Fisher Scientific 1172011AQ Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  2. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
  3. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
  4. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
  5. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1. S11 (2007).
  6. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  7. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
  8. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
  9. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
  12. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
  13. Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
  14. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  15. Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
  16. Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
  17. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
  18. Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
  19. Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
  20. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
  21. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
  22. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
  23. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
  24. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
  25. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
  26. Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
  27. Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
  28. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  29. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  30. Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093 (2012).
  31. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
  32. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
  33. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
  34. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
  35. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
  36. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
  37. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
  38. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
  39. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
  40. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
  41. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
  42. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
  43. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , Elsevier. San Diego. (2004).
  44. Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
  45. Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
  46. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
  47. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
  48. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
  49. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
  50. Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
  51. Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
  52. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
  53. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
  54. Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
  55. Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
  56. Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791 (2012).
  57. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
  58. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
  59. Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).

Tags

Molecular Biology Ubiquitin-proteasom system, Spirende gjær vekstanalyse proteinekstrakter western blotting gjær genetikk mutanter endoplasmatisk retikulum-assosiert degradering protein degradering
Vekst-baserte Fastsettelse og Biokjemisk Bekreftelse av Genetiske Krav for proteinnedbrytning i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Watts, S. G., Crowder, J. J.,… More

Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (96), e52428, doi:10.3791/52428 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter