Abstract
Gereguleerde eiwitafbraak is cruciaal voor vrijwel elke cellulaire functie. Veel van wat bekend is over de moleculaire mechanismen en genetische eisen voor eukaryotische eiwitafbraak werd aanvankelijk opgericht in Saccharomyces cerevisiae. Klassieke analyses van eiwitafbraak hebben vertrouwd op biochemische pulse-chase en cycloheximide-chase methodieken. Hoewel deze technieken gevoelige middelen voor het observeren van afbraak van eiwitten, ze zijn omslachtig, tijdrovend, en een laag-throughput. Deze benaderingen zijn niet vatbaar voor snelle en grootschalige screening van mutaties die eiwitafbraak voorkomen. Hier wordt een gistgroei gebaseerde bepaling voor gemakkelijke identificatie van genetische eisen eiwitafbraak beschreven. In deze bepaling wordt een reporterenzym vereist groei onder bepaalde selectieve omstandigheden gefuseerd aan een instabiele eiwit. Cellen ontbreekt het endogene reporter enzym, maar de uiting van de fusie-eiwit kan groeien onder selective omstandigheden wanneer het fusie-eiwit wordt gestabiliseerd (bijvoorbeeld bij eiwitafbraak gecompromitteerd). In de groei assay beschreven, worden seriële verdunningen van wildtype en mutante gist cellen die een plasmide dat codeert voor een fusie-eiwit gespot op selectieve en niet-selectieve medium. Groei onder selectieve omstandigheden, verenigbaar is met de afbraak bijzondere waardevermindering door een bepaalde mutatie. Verhoogde eiwit overvloed moet biochemisch worden bevestigd. Een werkwijze voor snelle extractie van gisteiwitten in een vorm geschikt voor elektroforese en Western blotting is eveneens aangetoond. Een groei gebaseerde uitlezing voor eiwitstabiliteit, gecombineerd met een eenvoudig protocol voor eiwitextractie voor biochemische analyse, maakt snelle identificatie van genetische eisen eiwitafbraak. Deze technieken kunnen worden aangepast om afbraak van verschillende kortstondige eiwitten volgen. In de gepresenteerde voorbeeld, het HIS3 enzym dat nodig is voor histidine biosynthese werd gefuseerdnaar ° 1 -Sec62. ° 1 -Sec62 is bedoeld voor degradatie na het afwijkend grijpt het endoplasmatisch reticulum translocon. Cellen die ° 1 -Sec62-his3 konden groeien onder selectieve omstandigheden wanneer het eiwit werd gestabiliseerd.
Introduction
Selectieve eiwitafbraak essentieel voor eukaryotische leven en veranderde eiwitafbraak bij tot een aantal medische aandoeningen, waaronder verschillende vormen van kanker, neurodegeneratieve ziekte, cardiovasculaire ziekte, en cystische fibrose 1-5. De ubiquitine-proteasoom-systeem (UPS) die selectieve afbraak van eiwitten katalyseert, is een opkomende therapeutisch doelwit voor deze omstandigheden 6-10. Ubiquitine ligasen covalent polymeren van de 76-aminozuur ubiquitine eiwitten 11. Eiwitten die zijn gemarkeerd met polyubiquitine ketens worden erkend en geproteolyseerd door de ~ 2,5 megadalton 26S-proteasoom 12. Studies gestart in het model eukaryoot organisme Saccharomyces cerevisiae (gist) zijn fundamenteel in de ontrafeling van de mechanismen afbraak van eiwitten in eukaryote cellen geweest. De eerste toonde fysiologische substraat van de UPS is de gist transcriptionele repressor MATα2 1314, en vele sterk geconserveerde delen van de UPS werden eerst geïdentificeerd of gekenmerkt in gist (bijvoorbeeld 15-26). Ontdekkingen gedaan in deze veelzijdige en genetisch handelbaar modelorganisme zijn waarschijnlijk blijven belangrijke inzichten verschaffen in geconserveerde mechanismen van ubiquitine gemedieerde afbraak.
Erkenning en degradatie van de meeste UPS ondergronden vereisen een gecoördineerde actie van meerdere eiwitten. Daarom is een belangrijk doel bij het karakteriseren van de geregelde afbraak van een bepaalde instabiele eiwit de genetische vereisten voor proteolyse bepalen. Klassieke benaderingen (bijv pulse-chase en cycloheximide-chase experimenten 27) voor het controleren eiwitafbraak bij zoogdier- of gistcellen zijn omslachtig en tijdrovend. Hoewel deze soorten methodologie gevoelige middelen voor het detecteren van eiwitafbraak, ze zijn niet geschikt voor snelle analyse van eiwitafbraak of grootschalige screening voor mutaties die eiwitafbraak voorkomen. Hier wordt een gistgroei-gebaseerde assay voor de snelle identificatie van genetische eisen voor de afbraak van instabiele eiwitten gepresenteerd.
In de gistgroei-methode voor het analyseren van eiwitafbraak, een instabiel eiwit van belang (of afbraak signaal) gefuseerd in frame, een eiwit dat nodig is voor groei van gist onder bepaalde omstandigheden. Het resultaat is een kunstmatig substraat dat als een krachtig instrument voor de genetische eisen van eiwitafbraak van het instabiele eiwit van belang te bepalen kan dienen. Gunstig, meest gebruikte laboratorium giststammen bevatten een paneel van mutaties in genen die coderen voor metabole enzymen betrokken bij de biosynthese van bepaalde aminozuren of stikstofhoudende basen (bv 20,28-30). Deze enzymen zijn essentieel voor cellulaire proliferatie in afwezigheid van exogeen geleverd metabolieten in de synthese waarvan de enzymen deelnemen. Zodanigmetabolische enzymen kunnen derhalve fungeren als groei gebaseerde reporters voor de afbraak van onstabiele eiwitten waaraan zij gefuseerd. De genetische eisen voor eiwitafbraak kunnen gemakkelijk worden toegelicht, aangezien mutaties die proteolyse voorkomen zal cellen die de afbraak reporter groeien onder selectieve omstandigheden.
Een groei voordeel is een indirecte indicatie dat een bepaalde mutatie verhoogt de overvloed van het eiwit van interesse. Echter, wordt direct biochemische analyse vereist om te bevestigen dat een mutatie maakt groei door verhoogde eiwitgehaltes in plaats van via indirecte of artefactuele oorzaken. Het effect van een mutatie op proteïne overvloed kan worden bevestigd door western blot analyse van steady-state eiwit niveaus in cellen die wel en niet haven de specifieke mutatie. Een werkwijze voor snelle en efficiënte extractie van gisteiwitten (sequentiële incubatie van gistcellen met natriumhydroxide en monsterbuffer) in een vorm geschiktvoor analyse door western blotting wordt ook gepresenteerd 31. Samen vormen deze experimenten te vergemakkelijken de snelle identificatie van kandidaat-regulatoren van eiwitafbraak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gist Groei Assay om Kandidaat Mutants Defecte in eiwitafbraak Identificeer
- Transformeer wild-type en mutant gistcellen met een plasmide dat codeert voor een instabiel eiwit gefuseerd in frame aan een reporter metabole enzym.
- Inoculeer transformanten in 5 ml synthetische gedefinieerd (SD) minimaal medium dat selectief is voor cellen die plasmide moleculen. Incubeer overnacht bij 30 ° C, roteren.
- Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van elke overnacht kweek.
OPMERKING: Na overnacht incubatie, kunnen cellen in kweek in logaritmisch of stationaire groeifase maar moeten tot een minimum OD600 van 0,2. Zeer traag groeiende giststammen kunnen incubatietijden vereisen meer dan een nacht of inoculatie van een groter aantal cellen, zoals empirisch. - Neem zes-voudige seriële verdunningen van de getransformeerde gistcellen in een steriele 96-well plaat, beginnend met cellen verdund tot eenn OD600 van 0,2. Plaats elke gist transformant wordt geanalyseerd in een andere rij in de 96-well plaat.
- Voor elke transformant Bereken het volume overnachtkweek nodig om cellen te verdunnen tot een OD600 van 0,2 in een eindvolume van 200 ul. Voeg dit volume van overnachtcultuur de overeenkomstige put in kolom 1. Voeg de juiste hoeveelheid steriel water om het volume op 200 ui te brengen.
- Voor elke rij van gist, voeg 125 ul steriel water aan de putjes in kolommen 2, 3 en 4.
OPMERKING: Individueel verpakte steriele 96-putjesplaten worden verpakt met steriele deksels. Het deksel kan worden gebruikt als reservoirs voor het steriele water wordt via deze stap. Dit maakt gelijktijdige overdracht steriel water aan alle putjes in een bepaalde kolom een multichannel pipet. - Meng de inhoud van de eerste kolom (gist verdund tot een OD600 van 0,2) door op en neer pipetteren met een multichannel pipet.
- Transfer 25 pl gist van kolom 1 tot kolom 2, met een multichannel pipet. Meng door en neer te pipetteren. Breng 25 ul van kolom 2 naar kolom 3 en 25 ul van kolom 3 kolom 4 (goed mengen bij elke stap).
- Meng elk monster met een multichannel pipet. Vanuit meeste verdund tot minst kolommen gist, pipet 4 pl van elk monster verdund op twee platen met het geschikte selectieve medium. Gebruik een plaat met medium dat plasmide selectie (deze plaat dient als een gist spotten en groei controle) onderhoudt. Gebruik een tweede plaat met medium dat selecteert voor plasmide onderhoud en expressie van het instabiele eiwit gefuseerd aan het reporterenzym. Omdat gist vestigen zich snel, meng cellen door en neer te pipetteren op regelmatige tijdstippen.
OPMERKING: Droger platen zullen gemakkelijker absorberen vloeistof dan vers bereide schotels en worden daarom aanbevolen voor deze experimenten. Damp plaatjes worden gedroogd door incubatie bij kamertemperatuur in low vochtigheid gedurende 1-2 dagen of korter incubaties in een laminaire stroming kap. Platen kunnen ongelijkmatig drogen wanneer de laminaire luchtstroom parallel aan de bank. Toepassing van een sjabloon vergemakkelijkt gistcellen plek op regelmatige afstanden. Twee voorbeeldsjablonen worden verschaft in Figuur 1. Deze kunnen worden afgedrukt, uitgesneden en aangebracht op de binnenkant van een petrischaal deksel. - Laat platen te drogen op de bank top.
- Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2-6 dagen.
- Fotografeer elke plaat na incubatie.
Figuur 1. Templates voor het spotten gistcellen op 100 mm agarplaten. Deze sjablonen kunnen worden gebruikt voor het vergemakkelijken spotten gist op regelmatige afstanden een multichannel pipet. Sjablonen worden afgedrukt, uitgesneden en aangebracht op de binnenkant van een petrischaal deksel. Plaats petrischaal met groeimedium binnenkant deksel met sjabloon aangebracht. Sjablonen worden gemarkeerd met een inkeping oriëntatie volgen. Aanbevolen wordt platen in groei assays eveneens worden voorzien van een inkeping oriëntatie volgen. Sjablonen voor het spotten van vier (A) of vijf (B) seriële verdunningen van gistcellen zijn aanwezig. Klik hier om een printbare versie van deze figuur met 100-mm templates te bekijken.
2. Biochemische Bevestiging van Gist Groei Assay
- De groei van gistcellen en na Alkaline Eiwitextractie (gewijzigd van 31)
- Transformeer wild-type en mutant gistcellen met een plasmide dat codeert voor het eiwit instabiel.
- Inoculeer transformanten in 5 ml SD medium dat selectief is voor cellen die plasmide moleculen. Incubeer overnacht bij 30 ° C, roteren.
- Meet de OD 600 van elke overnachting culture.
OPMERKING: Na incubatie overnacht, kunnen cellen worden in ofwel logaritmische of stationaire groeifase, maar moet een OD 600 dat verwatering zal toelaten om een OD 600 van 0,2 in 10 ml vers selectief medium (stap 2.1.4) hebben bereikt. Zeer traag groeiende giststammen kunnen incubatietijden vereisen meer dan een nacht of inoculatie van een groter aantal cellen, zoals empirisch. - Verdun gistcellen tot een OD600 van 0,2 in 10 ml vers selectief medium.
- Blijf cellen geïncubeerd bij 30 ° C, het roteren of schudden totdat kweken bereiken een OD600 van 0,8 en 1,2 (oftewel in mid-logaritmische groei).
Opmerking: Als het instabiele eiwit van belang onder controle van een reguleerbare promotor, kan de optimale tijdstip van inductie van eiwitexpressie en celoogst afhankelijk eerdere studies of empirische observaties. - Verzamel 2,5 OD 600 eenheden van cultuur in een 15-ml conischeal buis door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie.
OPMERKING: Een OD600 eenheid wordt gedefinieerd als de hoeveelheid gist aanwezig in 1 ml kweek bij OD600 van 1,0. Het volume van de kweek (in ml) nodig om oogsten 2,5 OD 600 eenheden (V) kan worden bepaald met de volgende vergelijking: V = 2,5 OD 600 eenheden / Gemeten OD600 - Resuspendeer cellen in 1 ml gedestilleerd water. Overdracht gesuspendeerde cellen een microcentrifugebuis.
- Pellet cellen door centrifugeren bij 6500 xg gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie.
- Resuspendeer cellen in 100 pl gedestilleerd water door en neer te pipetteren of vortexen, en voeg 100 ul 0,2 M NaOH. Meng door en neer te pipetteren. Incubeer de monsters gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Pellet cellen (waarvan de meeste zijn nog niet vrijgegeven eiwitten en zijn nog steeds levensvatbaar) door centrifugeren bij 18.000 xg gedurende 5 min. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie.
- Resuspendeer pellet in 50 - 100 gl 1 x Laemmli-monsterbuffer, die lyseren cellen, door op en neer pipetteren of vortexen.
OPMERKING: Verwijdering van de alkalische supernatant na centrifugeren en vervolgens opnieuw suspenderen van cellen in Laemmli monsterbuffer onttrekt eiwitten bij een pH compatibel met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) met een Tris-glycine-loopbuffer systeem en western blotting. - Om volledig denatureren eiwitten, incubeer lysaten bij 95 ° C gedurende 5 min.
OPMERKING: Aggregation-gevoelig eiwitten (bijvoorbeeld eiwitten met meerdere transmembraansegmenten) kan onoplosbaar worden wanneer geïncubeerd bij 95 ° C. Daarom moet lysaten worden geïncubeerd bij lagere temperaturen (bijvoorbeeld 37 ° C - 70 ° C) gedurende 10 - 30 minuten, zoals empirisch bepaald voor de analyse van dergelijke eiwitten. - Cool lysaten door het op ijs gedurende 5 minuten.
- Centrifugeer lysaten bij 18.000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur onoplosbaar materiaal te pelletiseren. Scheid de supernatant (oplosbaar geëxtraheerd eiwit) door SDS-PAGE vóór verder western blot analyse (paragraaf 2.2). Alternatief opslag lysaten bij -20 ° C.
- Representatieve Western Blotting Protocol
- Laad empirisch bepaalde hoeveelheid lysaten in een SDS-PAGE gel.
- Run gel bij 200 V tot kleurstoffront heeft de onderkant van de gel bereikte.
- Transfer eiwitten van gel tot polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan door natte overdracht bij 20 V gedurende 60-90 min bij 4 ° C.
- Blok membraan door incuberen in 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), schommelen, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Decanteren blokkeren oplossing.
- Incubeer membraan met primair antilichaam specifiek voor eiwit van belang (of epitoop tag daarvan) in 1% afgeroomde melk in TBS met 0,1% Tween-20 (TBS / T) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur temperature, schommelen.
- Decanteer antilichaamoplossing en wassen membraan 3 x 5 min met TBS / T bij kamertemperatuur schommelen.
- Incubeer het membraan met geschikte fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam in 1% afgeroomde melk in TBS / T gedurende 1 uur bij kamertemperatuur schommelen.
OPMERKING: Omdat fluoroforen zijn lichtgevoelig, moet verdunningen van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen worden voorbereid in het donker. Bovendien moet incubatie van membranen in aanwezigheid van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen voorkomen in lichtdichte verpakking. Dit kan worden bewerkstelligd door het wikkelen incubatie trays aluminiumfolie. - Decanteer antilichaamoplossing en wassen membraan 3 x 5 min met TBS / T bij kamertemperatuur schommelen.
- Verwerven beeld van membraan met behulp van Li-Cor Odyssey CLX en Image Studio-software (of vergelijkbare imaging apparatuur en software), volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Na beeldvorming membraan, incubeer de membraan met een primair antilichaam specifiek voor een lasting controle-eiwit in 1% afgeroomde melk in TBS / T gedurende 1 uur bij kamertemperatuur schommelen.
- Decanteer antilichaamoplossing en wassen membraan 3 x 5 min met TBS / T bij kamertemperatuur schommelen.
- Incubeer het membraan met geschikte fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam in 1% afgeroomde melk in TBS / T gedurende 1 uur bij kamertemperatuur schommelen.
- Decanteer antilichaamoplossing en wassen membraan 3 x 5 min met TBS / T bij kamertemperatuur schommelen.
- Verwerven beeld van membraan met behulp van Li-Cor Odyssey CLX en Image Studio-software (of vergelijkbare imaging apparatuur en software), volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om deze methode te illustreren, is het HIS3 enzym werd gefuseerd aan het carboxy-uiteinde van het model endoplasmatisch reticulum (ER) geassocieerde afbraak (ERAD) substraat ° 1 -Sec62 (Figuur 2A) om ° 1 -Sec62-HIS3 is (Figuur 3) . ° 1 -Sec62 vertegenwoordigt een van de oprichters van een nieuwe klasse van ERAD substraten die zijn gericht volgende persistent, afwijkende associatie met de translocatie, het kanaal primair verantwoordelijk voor het verplaatsen van eiwitten over het ER membraan 32-34. Dergelijke onstabiele eiwitten voorlopig zijn genoemd ERAD-T (voor-translocatie geassocieerd) substraten. Er werd vastgesteld dat bij afwijkende translocatie overeenkomst, ° 1 -Sec62 is bedoeld voor afbraak door de Hrd1 ubiquitine ligase (Figuur 2B-D) 32, 34, 35. Factoren die voor de afbraak van andere Hrd1 substraten lijkt overbodig om te zijn <em> ° 1 -Sec62 degradatie, hetgeen duidt op een nieuw degradatiemechanisme 32. Onder omstandigheden van verminderde lipide bindende en langdurige translocatie vereniging, apolipoproteïne B, de eiwitcomponent van zoogdieren low-density lipoproteïnen, lijkt te worden afgebroken door een verwant mechanisme 36-38. Daarom kan ° 1 -Sec62 een bruikbaar model voor afbraak van medisch relevante translocon geassocieerde eiwitten.
Wildtype en hrd1Δ gistcellen die het chromosomale HIS3-gen missen zijn getransformeerd met een lege vector 39 of een plasmide dat codeert ° 1 -Sec62-HIS3 en gespot op selectief groeimedium (figuur 4). Om te bevestigen dat gelijke aantallen van getransformeerde gistcellen werden overgebracht naar platen werden cellen gespot op medium zonder tryptofaan (die kiest voor cellen die het plasmide), maar met histidine. Soortgelijke groei werd waargenomen voor alle getransformeerde gistcellen.Cellen die ° 1 -Sec62-HIS3 expressie werd verwacht te groeien in de afwezigheid van histidine wanneer het fusie-eiwit wordt gestabiliseerd (dwz wanneer ERAD-T wordt aangetast). Inderdaad, hrd1Δ gist expressie ° 1 -Sec62-HIS3 vertoonden een groei voordeel ten opzichte van wild-type cellen die ° 1 -Sec62-HIS3 op medium zonder tryptofaan en histidine. Echter, gemerkt fusie-eiwit afhankelijke groei in de afwezigheid van histidine werd waargenomen, zelfs in aanwezigheid van Hrd1. Om de stringentie van de assay te verhogen, werd medium zonder histidine aangevuld met 3-amino-1H-1,2,3-triazool (3-AT), een competitieve remmer van het enzym his3 40. Gist uiten Hrd1 groeide zeer slecht op medium zonder histidine aangevuld met 1-2 mM 3-AT; toen HRD1 werd verwijderd, werd de celgroei hersteld. Opneming van 3-AT in een concentratie van 3 mM aanzienlijk remde groei van alle cellen, ongeacht de aanwezigheid of afwezigheid van Hrd1. Deze res ULT's zijn consistent met Hrd1-afhankelijke substraat degradatie.
Vervolgens werd de steady-state overvloed van de ° 1 -Sec62-his3 eiwitten in gist uitdrukken of ontbreekt de Hrd1 enzym direct getest. Western blot analyse gaf een vergelijkbare toename ° 1 -Sec62-HIS3 en -Sec62 ° 1 eiwit in gist hrd1Δ opzichte van het wild-type cellen (Figuur 5). Dit bevestigt de rol van Hrd1 in de regulatie van niveaus van beide eiwitten. Hrd1-afhankelijke afbraak van ° 1 -Sec62 gaat na het eiwit aberrantly grijpt de ER translocon 32. Belangrijk ° 1 -Sec62-HIS3 grijpt aberrantly de translocon op een soortgelijke wijze (ongepubliceerde gegevens), het gebruik van ° 1 -Sec62-his3 als groei gebaseerde reporter voor de afbraak van ° 1 -Sec62 specifiek en translocatie-geassocieerde eiwitten algemeen verder valideren.
s ">
Figuur 2:.. Model voor de afbraak van ° 1 -Sec62 volgende afwijkende translocon opdracht (A) Schematische weergave van ° 1 -Sec62 ° 1 (de amino-terminale 67 aminozuren uit MATα2) wordt gevolgd, in volgorde, door de Vlag (F) epitoop , de 2-transmembraan endoplasmatisch reticulum (ER) eiwitten Sec62, en twee exemplaren van de S. aureus proteïne A (PRA). Voor de duidelijkheid, wordt het fusie-eiwit aangeduid als ° 1 -Sec62. (B) Na normale inbrengen van de twee transmembraansegmenten in het ER membraan, aanhoudende interactie van ° 1 -Sec62 met de translocon triggers abnormale, ° 1 -afhankelijk translocon engagement. Een deel van de aanvankelijk cytosole amino-terminale staart aberrantly binnenkomt-en waarschijnlijk blijft binnen-de translocon. (C) Na abnormale translocatie engagement, Hrd1 erkent en ubiquitylates ° 1 -Sec62. Rode cirkels geven ubiquitine moleculen. (D) ° 1 -Sec62 wordt geëxtraheerd uit het ER membraan en afgebroken door het proteasoom, waarschijnlijk verlichten translocon obstructie.
Figuur 3:. Schematische weergave van ° 1 -Sec62-his3 volgende afwijkende translocon betrokkenheid ° 1 wordt gevolgd, in volgorde, door de Vlag (F) epitoop, de 2-transmembraan ER eiwit Sec62, twee exemplaren van de S. aureus proteïne A (PRA) en het gist his3 enzym. Voor de duidelijkheid, wordt het fusie-eiwit aangeduid als ° 1 -Sec62-his3.
Figuur 4: Fusing his3 naar ° 1 ° 1 -Sec62-his3 wild-type (HRD1) en hrd1Δ gist werden gespot op medium zonder tryptofaan, medium zonder tryptofaan en histidine en medium zonder tryptofaan en histidine, aangevuld met 3-amino-1H-1,2,3-triazool (3-AT), een competitieve remmer van his3, in de aangegeven concentraties. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken .
Figuur 5:. Verhoogde overvloed ° 1 ° 1 -Sec62 en -Sec62-HIS3 in cellen zonder Hrd1 Proteïne extracten werden bereid uit wild-type (+) en hrd1Δ(Δ) gist uiten ° 1 -Sec62 of ° 1 -Sec62-his3. Eiwitten (equivalent aan 0,125 OD 600 eenheden) werden gescheiden met SDS-PAGE, gevolgd door Western blotting met konijnen anti-muis secundaire antilichamen die de proteïne A epitopen van het fusie-eiwitten direct binden. Daaropvolgende western blotting met antilichamen die specifiek PGK1 verschaft een beladingscontrole.
| Oplossing | Onderdelen | Reacties | ||
| Synthetische Defined (SD) Minimal Gist Medium | 2% glucose, 0,67% giststikstofbase zonder aminozuren, 0,002% adenine, 0,004% uracil, 0.002% arginine, histidine 0,001%, 0,006% isoleucine, leucine 0,006%, 0,004% lysine, methionine 0,001%, 0,006% fenylalanine, 0,005 % threonine, 0,004% tryptofaan. Voor vaste (plaat) medium, onder 2% agar. | 1. Selectieve medium wordt bereid door het weglaten appropriate aminozuur (aminozuren) of stikstofbasen. | ||
| 2. Voor het gemak kan deze ingrediënten als volgt worden gehandhaafd geconcentreerde voorraadoplossingen. Aminozuren kunnen worden gehandhaafd 100X voorraadoplossing die alle gewenste aminozuren. Giststikstofbase worden gehandhaafd in een 20X voorraadoplossing (13,4%). Dextrose kan worden gehandhaafd in een 40% voorraadoplossing. Adenine en uracil kan worden gehandhaafd met 1% voorraadoplossingen in 0,1 M NaOH. | ||||
| 3. Steriliseer medium in een autoclaaf. | ||||
| 1X Laemmli Sample Buffer | 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-mercaptoethanol, 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,008% broomfenolblauw | 1. 1X Sample buffer wordt vaak bereid door verdunning van een meer geconcentreerde (bijv 5X) voorraad. | ||
| 2. De kleurstof broomfenolblauw kunnen worden toegevoegd om de gewenste intensiteit. Een "pinch" (zeer kleine hoeveelheid afgetapt van de rand van een spatel) is typisch voldoende. | ||||
| 0,2 M natriumhydroxide | Bereid in het water. Natrium hydroxide reageert met glas. Daarom is voor langdurige opslag, 0,2 M natriumhydroxide te handhaven in plastic containers. | |||
| Laemmli lopende buffer (5x) | 125 mM Tris, 960 mM glycine, 0,5% SDS | Tot 1 L 1X Laemmli lopende buffer te bereiden, verdunnen 1: 5 in dH 2 O | ||
| Tris acetaat-SDS Transfer Buffer (5x) | 125 mM Tris-acetaat (pH 8,8), 960 mM glycine, 0,05% SDS | Aan 20 L 1X Tris acetaat-SDS bereiden Transfer Buffer combineren 4 L 5X stock, 4 liter methanol en 12 L dH 2 O | ||
| 10X Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) | 500 mM Tris, 1,5 M NaCl; pH ingesteld op 7,5 | Tot 1 L 1X TBS voor te bereiden, te verdunnen 1:10 in dH 2 O. 1X TBS kan worden aangevuld met de detergens Tween-20 en gepoederde magere melk, zoals passend. |
| Stam Naam | Alias | Relevante Genotype | Cijfers | Bron |
| VJY6 | MHY500 | MATa | 4 en 5 | Chen et al., 1993 |
| his3-Δ200 | ||||
| leu2-3,112 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| gal2 | ||||
| VJY10 | MATa | 4 en 5 | Deze studie | |
| his3- Δ 200 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| gal2 | ||||
| hrd1 :: kanMX4 |
Tabel 2:. Giststammen gebruikt in deze studie Details van de bouw zijn beschikbaar op aanvraag.
| Plasmide Aantal | Volledige Plasmid Naam | Figuur | Bron |
| pVJ30 | pRS414-P MET25 -Deg1 -FLAG-Sec62-2xProtA | 5 | Rubenstein et al., 2012 |
| pVJ121 | pRS414-P MET25 (lege vector met MET25 promotor) | 4 | Mumberg et al., 1994 |
| pVJ467 | pRS414-P MET25 -Deg1 -FLAG-Sec62-2xProtA-his3 | 5 | Deze studie |
| pVJ477 | pRS414-P GAL4- -Deg1 -FLAG-Sec62-2xProtA-his3 | 4 | Deze studie |
Tabel 3:. Plasmiden die in deze studie Merk op dat alle plasmiden een gist centromeer replicatie in gistcellen, het TRP1 gen voor selectie in gist cellen mogelijk, en AmpR gen voor onderhoud in bacteriecellen. Plasmide kaarten, sequenties, en de details van de bouw zijn beschikbaar op aanvraag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde methode laat een snelle bepaling en biochemische bevestiging van genetische eisen eiwitafbraak in gistcellen. Deze experimenten benadrukken het nut en de kracht van gist als model eukaryoot organisme (meerdere uitstekende recensies van gist biologie en compilaties van protocollen voor de behandeling, de opslag en het manipuleren van gistcellen (bijvoorbeeld 41-44) zijn beschikbaar voor nieuwe onderzoekers het organisme). De technieken kunnen gemakkelijk worden toegepast voor de afbraak en overvloed van verschillende klassen van eiwitten te onderzoeken. Zo hebben anderen deze strategie om de degradatie van onstabiel cytosol, nucleaire en ER luminale en transmembraan eiwitten 45-49 karakteriseren toegepast.
Enkele factoren moeten worden overwogen bij het kiezen van metabole enzym te fuseren een onstabiel proteïne. Ten eerste is het essentieel dat een functionele versie van het gen dat codeert voor het enzym nietaanwezig in het gastheergenoom. Om vals positieve resultaten te minimaliseren (dwz groei onder selectieve omstandigheden als de instabiele eiwit is eigenlijk gedegradeerd), is het raadzaam om te werken met stammen die haven niet-terugkeer mutante allelen van het reporter-gen (bij voorkeur volledige gendeleties) 50. Een andere overweging voor reporterenzym selectie de beschikbaarheid van competitieve remmers, die kunnen in het selectieve groeimedium achtergrond groei verminderen en assay stringentie. Dit kan nuttig zijn in gevallen van eiwitten met een relatief lage turnover zelfs in aanwezigheid van volledig functionele degradatie. In de representatieve experimenten hier gepresenteerde de opname van 3-AT, die competitief remt het HIS3 enzym vermindert achtergrond groei 40. Ook de verbinding 6-azauracil Ura3 remt, een enzym vereist voor biosynthese uracil 51. De inhibitor concentratie waarbij groei optreedt in degradatie-defective, maar niet wild-type cellen moet empirisch worden bepaald. Sommige metabolische enzymen kunnen ook contra-geselecteerde tegen. Onder teller-selectieve omstandigheden, kunnen cellen groeien wanneer het instabiele eiwit wordt afgebroken (en de gefuseerde metabole enzym ontbreekt). Bijvoorbeeld, Ura3 zet de verbinding 5-fluororotinezuur (5-FOA) om de toxische verbinding 5-fluorouracil 52. Cellen die een Ura3-fusie-eiwit alleen groeien in de aanwezigheid van 5-FOA indien de Ura3 fusie-eiwit wordt afgebroken. Ook de verbinding 5-fluoroanthranilic acid (5-FAA) is giftig voor cellen met een functionele tryptofaan biosynthese route. 5-FAA kan dus worden gebruikt om tegen selecteren op cellen die Trp1-fusie-eiwitten 53. Counter-selectie strategieën kunnen nuttig zijn voor de identificatie van suppressors van afbraak-afbreuk mutaties.
De promoter toegepast om expressie van een reporter degradatie rijden moet zorgvuldig worden geselecteerd. Al niveaus van BiosyntheTIC enzymen kan voldoende zijn om groei in afwezigheid van exogeen geleverde metaboliet is, wordt een zwakke promoter aanbevolen 54. In de representatieve experimenten hier gepresenteerde de GAL4 promoter, die onderdrukt in aanwezigheid van glucose 55, wordt gebruikt om de transcriptie van ° 1 -Sec62-his3 promoten. Basale expressie van het fusie-eiwit onder repressie uitgevoerd (2% glucose) voldoende is om groei onder selectieve omstandigheden (dwz in afwezigheid van histidine en de aanwezigheid van 1-2 mM 3-AT) als de degradatiemechanisme uitgeschakeld. Echter, eiwitniveaus voldoende ondersteuning van de groei onder selectieve condities waarschijnlijk onder de drempel van detectie door Western blotting. Daarom kan het nodig zijn om de expressie besturen met een zwakke promoter voor de groei assay en een sterkere promoter voor biochemische bevestiging. Bij ° 1 -Sec62 (met of zonder HIS3 fusie), een Robust promotor (hier, de MET25 promotor 39) is vereist voor eiwit visualisatie door westerse analyse.
Zoals hier beschreven, kan de basis van gist groei test worden uitgevoerd op een kleinschalige, kandidaat-gebaseerde benadering. Seriële verdunningen van gistcellen worden bereid in een 96-well plaat en overgebracht door pipetteren om vast groeimedium; Een alternatieve werkwijze voor de efficiënte en reproduceerbare overdracht verdunde gistcel suspensies op vast medium is het gebruik van een multi-pin replicator, gewoonlijk aangeduid als een "frogger" 56. Het ideale moment om te fotograferen platen zal variëren met giststammen en voorwaarden. Het wordt aanbevolen om een bepaalde plaat als kolonies van de snelst groeiende cultuur net zichtbaar worden op de meest verdunde plek te fotograferen. Dit is meestal het punt waarop groeiverschillen tussen de monsters zijn het meest voor de hand liggende. Het kan raadzaam fotograferen op meerdere dagen, vooral in het geval van gistvertonen een breed scala van groeicijfers.
De groei op basis reporter test kan ook worden aangepast voor grootschalige analyses. Bijvoorbeeld kan een degradatie reporter worden ingebracht in een commercieel verkrijgbare bibliotheek van ~ 5000 levensvatbare haploïde gistgen deletiestammen middels Synthetic Genetic Array (SGA) technologie 46,57. In deze techniek wordt een haploïde giststam met een chromosomaal geïntegreerde reporter metabole fusie-eiwit gekoppeld aan elke stam van het gen deletie bibliotheek. De resulterende diploïde cellen worden geïnduceerd om sporulatie (ondergaan meiose) en onderworpen aan selectie op haploïde meiose Nageslacht zowel metabool melder en individuele gendeleties. Deze stammen worden vervolgens massaal selectief medium voor cellen waarin het eiwit wordt gestabiliseerd. Voor kleinschalige analyses, als een gen met een rol in eiwitafbraak verwijderd, het fusie-eiwit wordt gestabiliseerd en celgroei wordt versterkt. Vergelijkbaar eenpproaches zijn ontwikkeld die het mogelijk maken voor gelijktijdige transformatie van een grote collectie van stammen met extra-chromosomaal onderhouden plasmiden; deze strategie ondervangt chromosomale integratie, paring, sporulatie, en meiotische selectie 54.
Wanneer een mutatie blijkt een groei voordeel aan cellen die een metabole reporter, moet biochemisch bevestigen dat de mutatie verhoogt de overvloed van het eiwit van interesse. Een snelle en betrouwbare gist lysis procedure, nauw aangepast van de werkwijze Kuhsnirov 31 gepresenteerd. Dit protocol maakt de extractie van eiwitten in een vorm direct voor de analyse met Western blotting. Voor de analyse van een bepaald eiwit, de hoeveelheid lysaat per put, acrylamide gel eigenschappen keuze membraan, gebruikte antilichamen en verdunningen daarvan, en detectiemethode moet empirisch worden bepaald geladen. De representatieve Western blot protocol beschreven utilizes secundaire antilichamen geconjugeerd met fluorescerende kleurstoffen; andere veelgebruikte protocollen afhankelijk chemiluminescentie afhankelijk antilichaam-geconjugeerde enzymen 58. Zoals hier beschreven kan het membraan gebruikt voor het eiwit van belang te detecteren direct opnieuw gesondeerd met een antilichaam voor een laad-eiwit. Als de primaire antilichamen gebruikt om het eiwit van interesse en belastingsbegrenzing eiwit detecteren zijn verhoogd van dezelfde soort, reprobing het membraan mogelijk zolang de banden die door deze eiwitten niet co-migreren. Indien echter de primaire antilichamen gebruikt om het eiwit van interesse en belastingsbegrenzing eiwit detecteren zijn verhoogd van verschillende soorten kan hetzelfde membraan achtereenvolgens worden gesondeerd, zelfs indien bands co-migreren als de secundaire antilichamen geconjugeerd met fluoroforen verschillende emissiegolflengten. In het geval dat het eiwit van interesse en belastingsbegrenzing eiwit co-migreren en de respectieve primaire antilichamen rai geweestsed van dezelfde soort, kunnen monsters worden gescheiden op twee SDS-PAGE gels, overgebracht naar PVDF membraan en afzonderlijk gemerkt met antilichamen specifiek voor het eiwit van belang en het laden controle-eiwit. Als alternatief kan het laden van de consistentie worden beoordeeld door incubatie van membranen met niet-specifiek eiwit vlekken (bijv Coomassie- of Ponceau S). Verder, de vertegenwoordiger western blotting protocol veronderstelt een eiwit of epitoop dat wordt herkend door opeenvolgende incubatie van primaire en secundaire antilichamen, zoals kenmerkend is. De fusie-eiwitten in de representatieve resultaten geanalyseerd bevatten twee epitopen afgeleid van Staphylococcus aureus proteïne A (PRA in figuren 2 en 3). Proteïne A bindt direct aan zoogdieren immunoglobulinen kunnen derhalve worden gedetecteerd met secundair antilichaam alleen (dwz geen primair antilichaam incubatiestap vereist) 59. Het is mogelijk dat fusie van een reporter enzym eiwitgehalte kunnen beïnvloeden ofdegradatie. Het is daarom raadzaam om de resultaten met behulp van een versie van het substraat onbelast door de verslaggever eiwit biochemisch bevestigen. Tot slot, beide testen hier beschreven rekenen op verschillen in steady-state-eiwit niveaus als proxy voor verschillen in eiwit stabiliteit. Omdat eiwit overvloed weerspiegelt de integratie van de tarieven van de eiwitsynthese en degradatie, verdere biochemische analyse (bijv cycloheximide chase of pulse chase experimenten) moet worden gebruikt om direct te analyseren dynamische degradatie profiel van een eiwit.
De representatieve resultaten stellen een nieuwe toepassing van dit protocol voor de bepaling van de genetische eisen voor de afbraak van een eiwit dat afwijkend grijpt de ER translocon. ° 1 -Sec62-his3 verleende een gist groeivoordeel onder selectieve omstandigheden bij de afbraak route werd geïnactiveerd (dwz in de afwezigheid van de Hrd1 ubiquitine ligase). Een snelle en betrouwbare eiwit extractiewijze gevolgd door Western blotting bevestigd een toename overvloed ° 1 -Sec62 (met of zonder HIS3) in afwezigheid van Hrd1. Er werd vastgesteld dat het mechanisme van Hrd1-afhankelijke afbraak van translocon geassocieerde eiwitten verschillen van die van andere Hrd1 ER luminale of transmembraan substraten 32. Toekomstige werkzaamheden zal de ° 1 -Sec62-his3 fusie-eiwit in grootschalige genetische screens gebruiken om nieuwe genen die nodig zijn voor dit unieke degradatiemechanisme identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de huidige en voormalige leden van de Rubenstein lab voor het verstrekken van een ondersteunende en enthousiaste onderzoeksomgeving. Wij danken Ryan T. Gibson voor hulp bij het protocol optimalisatie. Wij danken Mark Hochstrasser (Yale University) en Dieter Wolf (Universität Stuttgart) voor giststammen en plasmiden. Wij danken onze anonieme reviewers voor hun hulp bij het verbeteren van de duidelijkheid en het nut van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door een onderzoek award van het hoofdstuk Ball State University van Sigma Xi naar SGW, een National Institutes of Health subsidie (R15 GM111713) aan EMR, een Ball State University ASPiRE onderzoek award voor EMR, en fondsen van de Ball State University Provost's Office en het Departement Biologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
| 3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs. |
| Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer. |
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers. |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes. |
| Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) | Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
References
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
- Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
- Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1. S11 (2007).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
- Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
- Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
- Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
- Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
- Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
- Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
- Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
- Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
- Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
- Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
- Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
- Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
- Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
- Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
- Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
- Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093 (2012).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
- Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
- Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
- Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
- Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
- Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
- Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
- Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
- Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
- Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
- Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , Elsevier. San Diego. (2004).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
- Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
- Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
- Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
- Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
- Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
- Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
- Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
- Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791 (2012).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
- Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
- Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).
Tags
Molecular Biology Ubiquitine-proteasoom systeem,
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
