Abstract
Geregelten Proteinabbau ist entscheidend für praktisch jede Zellfunktion. Vieles von dem, was über die molekularen Mechanismen und genetischen Erfordernisse für eukaryotische Proteinabbau bekannt wurde zunächst in Saccharomyces cerevisiae hergestellt. Klassische Analysen der Proteinabbau haben biochemische Pulse-Chase und Cycloheximid-Chase-Methoden verlassen. Während diese Techniken empfindliche Mittel zur Beobachtung des Proteinabbaus sind mühsam, zeitaufwendig und niedrigem Durchsatz. Diese Ansätze sind nicht geeignet, um eine schnelle und großflächige Screening auf Mutationen, die den Proteinabbau zu verhindern. Hier wird ein Wachstum der Hefe-basierenden Assay für die leichte Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau beschrieben. In diesem Test wird ein Reporterenzym für das Wachstum unter bestimmten Selektionsbedingungen erforderlich, um ein instabiles Protein fusioniert ist. Zellen, denen das endogene Reporter-Enzym exprimieren, aber das Fusionsprotein unter sele wachsenctive Bedingungen nur, wenn das Fusionsprotein stabilisiert ist (dh, wenn der Proteinabbau gefährdet ist). Bei dem hier beschriebenen Wachstumstest werden Verdünnungsreihen von Wildtyp und mutierten Hefezellen ein Plasmid ein Fusionsprotein kodiert, auf selektiven und nicht-selektiven Medium entdeckt. Wachstum unter selektiven Bedingungen entspricht Abbau Beeinträchtigung von einer bestimmten Mutation. Erhöhte Proteinmenge sollte biochemisch bestätigt werden. Ein Verfahren zur schnellen Extraktion von Hefe-Proteinen in einer für die Elektrophorese und Western-Blotting Form wird auch gezeigt. Ein Wachstum basierende Auslesen für die Proteinstabilität, kombiniert mit einer einfachen Protokoll für die Proteinextraktion zur biochemischen Analyse, erleichtert die schnelle Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau. Diese Techniken können angepaßt, um den Abbau einer Vielzahl von kurzlebigen Proteinen zu überwachen. In dem dargestellten Beispiel des HIS3-Enzym, das für die Biosynthese von Histidin erforderlich ist, fusioniertum deg1 -Sec62. deg1 -Sec62 ist für den Abbau gezielt nach der aberrant die Endoplasmatischen Retikulum Translokon einrastet. Zellen, die deg1 -Sec62-His3 konnten unter selektiven Bedingungen wachsen, wenn das Protein stabilisiert wurde.
Introduction
Selektive Proteinabbau ist für eukaryontische Leben und veränderten Proteinabbau trägt zu einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich verschiedene Arten von Krebs, neurodegenerativen Erkrankungen, Herz-Kreislaufkrankheiten und Mukoviszidose 1-5. Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS), die selektive Proteinabbau katalysiert, ist eine aufstrebende therapeutisches Ziel für diesen Bedingungen 10.6. Ubiquitin-Ligase kovalent an Polymere der 76-Aminosäure-Ubiquitin an Proteine 11. Proteine, die mit Polyubiquitinketten markiert wurden, werden erkannt und durch die ~ 2,5 Megadalton 26S Proteasom proteolysiert 12. Studien im Modell eukaryotischen Organismus Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) initiiert wurden grund bei der Aufklärung von Proteinabbaumechanismen in eukaryotischen Zellen. Der erste Beweis physiologischen Substrat der USV war die Hefe Transkriptionsrepressor MATα2 13, 14, und viele hoch konservierte Komponenten des UPS wurden zuerst identifiziert oder gekennzeichnet Hefe (zB 15-26). Entdeckungen in diesem vielseitigen und genetisch manipulierbaren Modellorganismus hergestellt werden wahrscheinlich weiterhin wichtige Einblicke in konservierten Mechanismen des Ubiquitin-vermittelten Abbau liefern.
Anerkennung und Abbau der meisten UPS Substrate erfordern die konzertierte Aktion von mehreren Proteinen. Daher ist ein wichtiges Ziel bei der Charakterisierung des geregelten Abbau einer bestimmten instabilen Protein die genetischen Erfordernisse für die Proteolyse zu bestimmen. Klassische Ansätze (zB Pulse-Chase und Cycloheximid-Chase-Experimente 27) zur Überwachung der Proteinabbau in Säugetier- oder Hefezellen sind mühsam und zeitaufwendig. Während diese Art von Methode bereitzustellen hochempfindliche Einrichtung zum Erfassen des Proteinabbaus für eine schnelle Analyse des Proteinabbaus oder Groß screeni sind sie nichtng für Mutationen, die den Proteinabbau zu verhindern. Hier wird ein Wachstum der Hefe-basierenden Assay zur schnellen Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Abbau von instabilen Proteinen präsentiert.
Im Hefewachstum basiertes Verfahren zur Analyse von Protein-Abbau, ein instabiles Protein von Interesse (oder Abbausignals) fusioniert, im Rahmen, ein Protein, das für das Wachstum der Hefe unter bestimmten Umständen erforderlich ist. Das Ergebnis ist ein künstliches Substrat, das als ein mächtiges Werkzeug, um die genetischen Voraussetzungen des Proteinabbaus der instabilen Protein von Interesse festzustellen, dienen können. Zweckmßigerweise beherbergen am häufigsten verwendeten Labor Hefestämme eine Gruppe von Mutationen in Genen, die Stoffwechselenzyme in der Biosynthese von bestimmten Aminosäuren oder stickstoffhaltigen Basen (zB 20,28-30) beteiligt kodiert. Diese Enzyme sind für die zelluläre Proliferation in Abwesenheit von exogen bereitgestellt Metaboliten in deren Synthese der Enzyme beteiligt. Sometabolische Enzyme können so als Wachstumsbasis Reporter für den Abbau von instabilen Proteinen, denen sie fusioniert sind. Die genetischen Voraussetzungen für den Proteinabbau kann leicht erklärt werden, da Mutationen, die Proteolyse zu verhindern, können Zellen, die das Abbau Reporter, unter selektiven Bedingungen wachsen.
Einen Wachstumsvorteil ist ein indirekter Hinweis auf eine bestimmte Mutation erhöht die Häufigkeit des Proteins von Interesse. Allerdings ist direkte biochemische Analyse erforderlich, um zu bestätigen, dass eine Mutation ermöglicht Wachstum durch erhöhte Protein-Ebene und nicht durch indirekte oder Artefakt Ursachen. Die Wirkung einer Mutation auf Proteinmenge kann durch Western-Blot-Analyse der Steady-State-Protein-Spiegel in den Zellen, und tun nicht die bestimmte Mutation beherbergen bestätigt werden. Ein Verfahren für die schnelle und effiziente Gewinnung von Hefeproteinen (sequentielle Inkubation der Hefezellen mit Natriumhydroxid und Probenpuffer) in einer geeigneten Formfür die Analyse durch Western-Blot wird ebenfalls vorgestellt 31. Zusammen stellen diese Experimente ermöglichen die schnelle Identifizierung von Kandidatenregulatoren der Proteinabbau.
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Protocol
1. Hefe-Wachstumstest zur Kandidaten Mutanten Defekte in Proteinabbau identifizieren
- Transformieren Wildtyp- und mutierten Hefe-Zellen mit einem Plasmid einen instabilen Protein fusioniert codiert, im Rahmen, mit einem Reporter-Stoffwechselenzym.
- Beimpfen von Transformanten in 5 ml synthetischem definiert (SD) Minimalmedium, das selektiv für Zellen, die Plasmid-Moleküle sind. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C, rotiert.
- Anschließend wird die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) von jeder Übernachtkultur.
HINWEIS: Nach Inkubation über Nacht, können die Zellen in Kultur in entweder logarithmisch oder stationären Wachstumsphase sein, sollte aber eine minimale OD 600 von 0,2 erreicht. Sehr langsam wachsenden Hefestämme können Inkubationszeiten von einer größeren Anzahl von Zellen benötigen länger als eine Nacht oder Inokulation empirisch bestimmt. - Bereiten sechsfache serielle Verdünnungen von transformierten Hefezellen in einem sterilen 96-Well-Platte, beginnend mit den Zellen, um eine verdünnten OD 600 von 0,2. Platzieren jedes Hefetransformante in einer anderen Reihe in der Platte mit 96 Vertiefungen untersucht werden.
- Für jede Transformante, die Berechnung des Volumens der Übernacht-Kultur erforderlich ist, um Zellen zu einer OD 600 von 0,2 in einem Endvolumen von 200 ul verdünnt. Fügen Sie diese Volumen von Übernacht-Kultur, um die entsprechende Vertiefung in Spalte 1. Fügen Sie die entsprechende Menge an sterilem Wasser, um das Volumen auf 200 ul zu bringen.
- Für jede Reihe von Hefe, fügen 125 ul sterilem Wasser, um die Vertiefungen in den Spalten 2, 3 und 4.
HINWEIS: Einzeln verpackte sterile 96-Well-Platten mit einer sterilen Deckeln verpackt werden. Der Deckel kann als Reservoir für das sterile Wasser, das in dieser Stufe verteilt werden. Dies ermöglicht die gleichzeitige Übertragung von sterilem Wasser zu allen Vertiefungen in einer bestimmten Spalte mit einer Mehrkanalpipette. - Mischen Sie den Inhalt der ersten Spalte (Hefe zu einer OD 600 von 0,2 verdünnt) durch Auf- und Abpipettieren mit einer Mehrkanalpipette.
- Transfer 25 ul Hefe aus Spalte 1 bis Spalte 2, mit einer Mehrkanalpipette. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren. Transfer 25 ul aus Spalte 2 bis Spalte 3, und 25 ul aus Spalte 3 bis Spalte 4 (gut mischen bei jedem Schritt).
- Mischen Sie jede Probe mit einer Mehrkanalpipette. Ausgehend von den meisten verdünnten in wenigstens verdünnte Spalten von Hefe, einer Pipette 4 ul jeder Probe auf beiden Platten, die den entsprechenden Selektionsmedium. Verwenden Sie eine Platte mit Medium, das Plasmid-Selektion (diese Platte dient als Hefe-Spotting und Wachstumskontrolle) unterhält. Verwenden einer zweiten Platte mit Medium, das für die Erhaltung des Plasmids und Expression des instabilen Protein an das Reporterenzym fusioniert auswählt. Da Hefe begleichen schnell, mischen Zellen durch Auf- und Abpipettieren in regelmäßigen Abständen.
HINWEIS: Trockenplatten werden leichter absorbiert Flüssigkeit als frisch zubereiteten Platten und sind daher für diese Versuche zu empfehlen. Feuchten Platten können durch Inkubation bei Raumtemperatur in lo trocknendenw Luftfeuchtigkeit für 1 - 2 Tage oder kürzer Inkubationen in einer Haube mit laminarer Strömung. Platten können ungleichmäßig trocknen, wenn sich die laminare Luftströmung parallel zu der Bank. Verwendung einer Schablone erleichtert die Hefezellen in regelmäßigen Abständen zu erkennen. Zwei Mustervorlagen sind in Figur 1 zur Verfügung gestellt. Diese können gedruckt werden, ausgeschnitten und in das Innere der Petrischale mit Deckel versehen. - Lassen Platten auf der Bank oben trocknen.
- Inkubation erfolgt bei 30 ° C für 2 - 6 Tagen haben.
- Fotografieren Sie jede Platte nach Inkubation.
Abbildung 1. Vorlagen für das Auffinden Hefezellen auf 100-mm-Agar-Platten. Diese Vorlagen können verwendet werden, um zu ermöglichen Spotting Hefe in regelmäßigen Abständen mit einem Mehrkanalpipette werden. Templates können ausgedruckt, ausgeschnitten und in das Innere der Petrischale mit Deckel versehen. Zeigen Petrischale mit WachstumMedium im Deckel mit Schablone angebracht. Vorlagen werden mit einer Einkerbung markiert, um Orientierung zu verfolgen. Es wird empfohlen, dass die Platten in Wachstumsassays verwendet in ähnlicher Weise mit einer Kerbe markiert werden, um die Orientierung zu verfolgen. Vorlagen für die Erkennung von vier (A) oder fünf (B) Reihenverdünnungen von Hefezellen zur Verfügung gestellt werden. Bitte klicken Sie hier um eine druckfähige Version dieser Figur mit 100-mm-Vorlagen zu sehen.
2. Biochemische Bestätigung des Hefe-Wachstumstest
- Das Wachstum der Hefezellen und Post-Alkaline Proteinextraktion (von 31 modifiziert)
- Transform-Wildtyp und mutierten Hefe-Zellen mit einem Plasmid der instabilen Protein kodiert.
- Beimpfen von Transformanten in 5 ml SD-Medium, das selektiv für Zellen, die Plasmid-Moleküle sind. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C, rotiert.
- Messen Sie die OD600 von jeder Nacht culture.
HINWEIS: Nach Inkubation über Nacht, können die Zellen entweder in logarithmische oder stationäre Wachstumsphase sein, sollte aber eine OD 600 die Verdünnung bis zu einer OD 600 von 0,2 in 10 ml frisches Selektivmedium (Schritt 2.1.4) erlauben wird erreicht. Sehr langsam wachsenden Hefestämme können Inkubationszeiten von einer größeren Anzahl von Zellen benötigen länger als eine Nacht oder Inokulation empirisch bestimmt. - Verdünne Hefezellen bis zu einer OD 600 von 0,2 in 10 ml frischem selektivem Medium.
- Weiter zu den Zellen bei 30 ° C inkubieren, Drehen oder Schütteln, bis Kulturen erreichen einer OD 600 zwischen 0,8 und 1,2 (dh sind Mitte logarithmischen Wachstums).
Hinweis: Wenn der instabile Protein von Interesse unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors, kann die optimale Zeitsteuerung der Induktion der Proteinexpression und der Zellgewinnung nach den vorherigen Studien oder empirischen Beobachtungen variieren. - Sammeln 2,5 OD 600 Einheiten der Kultur in 15 ml konischenal Rohr durch Zentrifugation bei 5.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen.
Hinweis: eine OD600-Einheit wird als die Menge der vorhandenen Hefe von 1 ml der Kultur bei einer OD 600 von 1,0 definiert. V = 2,5 OD 600 Einheiten / Mess OD 600: Das Volumen der Kultur (in ml) erforderlich, um 2,5 OD 600 Einheiten (V) zu ernten kann mit der folgenden Gleichung bestimmt werden - Zellen in 1 ml destilliertem Wasser. Übertragen suspendierten Zellen in ein Mikrozentrifugenrohr.
- Pelle Zellen durch Zentrifugation bei 6.500 xg für 30 sec bei Raumtemperatur. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen.
- Zellen in 100 ul destilliertem Wasser durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung, und fügen Sie 100 ul 0,2 M NaOH. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren. Proben für 5 min bei Raumtemperatur.
- Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 18.000 x (von denen die meisten noch nicht veröffentlicht Proteine und sind noch lebensfähig)g für 5 min. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen.
- Pellet in 50 bis 100 ul 1x Laemmli-Probenpuffer, die Zellen zu lysieren wird, durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbeln.
HINWEIS: Die Entfernung des Alkaliüberstand nach Zentrifugation und anschließende Resuspension der Zellen in Laemmli-Probenpuffer extrahiert Proteine bei einem pH-Wert mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) kompatibel mit einem Tris-Glycin-Laufpuffersystem und Western Blotting. - Um vollständig zu denaturieren, Inkubation Lysate bei 95 ° C für 5 min.
HINWEIS: Aggregation neigende Proteine (zB Proteine mit mehreren Transmembransegmente) können unlöslich werden, wenn sie bei 95 ° C inkubiert. Daher sollte Lysate bei niedrigeren Temperaturen inkubiert werden (zB 37 ° C - 70 ° C) für 10 bis 30 min, wie empirisch ermittelt, für die Analyse von solchen Proteinen. - Kühle Lysaten durch Anordnen auf Eis für 5 min.
- Zentrifuge Lysate bei 18000 g für 1 min bei Raumtemperatur, um unlösliches Material zu pelletisieren. Trennen Sie den Überstand (in Lösung extrahierte Protein) durch SDS-PAGE vor der anschließenden Western Blot-Analyse (Abschnitt 2.2). Alternativ Shop Lysate bei -20 ° C.
- Vertreter Western Blot Protokoll
- Laden empirisch ermittelten Volumen Lysate in einem SDS-PAGE-Gel.
- Führen Gel bei 200 V, bis Farbstofffront den Boden des Gels erreichte.
- Transferproteine aus Gel auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran durch Nasstransfer bei 20 V für 60 bis 90 min bei 4 ° C.
- Block Membran durch Inkubation in 5% Magermilch in Tris-gepufferter Saline (TBS), schaukeln, für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
- Dekantieren Blockierungslösung.
- Dazu werden die Membranen mit primärem Antikörper, der für das Protein von Interesse (oder Epitoptag davon) in 1% Magermilch in TBS mit 0,1% Tween-20 (TBS / T) für 1 h bei Raum temperatur, schaukeln.
- Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln.
- Dazu werden die Membranen mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers in 1% Magermilch in TBS / T für 1 Stunde bei Raumtemperatur schaukeln.
Hinweis: Da Fluorophore sind lichtempfindlich, sollte Verdünnungen fluorophorkonjugierten Antikörper im Dunkeln hergestellt werden. Zusätzlich sollte die Inkubation von Membranen in Gegenwart von fluorophorkonjugierten Antikörpern in lichtundurchlässigen Behältern auftreten. Dies kann durch Umwickeln Inkubationsschalen in Aluminiumfolie durchgeführt werden. - Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln.
- Erwerben Bild der Membran unter Verwendung von Li-Cor Odyssey CLx und Bild Studio-Software (oder einem vergleichbaren bildgebenden Geräten und Software), entsprechend den Empfehlungen des Herstellers.
- Nach Abbilden Membran inkubieren der Membran mit einem primären Antikörper, der spezifisch für einen Lasting Kontrollprotein in 1% Magermilch in TBS / T für 1 Stunde bei Raumtemperatur schaukeln.
- Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln.
- Dazu werden die Membranen mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers in 1% Magermilch in TBS / T für 1 Stunde bei Raumtemperatur schaukeln.
- Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln.
- Erwerben Bild der Membran unter Verwendung von Li-Cor Odyssey CLx und Bild Studio-Software (oder einem vergleichbaren bildgebenden Geräten und Software), entsprechend den Empfehlungen des Herstellers.
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Representative Results
Diese Methodik zu veranschaulichen, hat das HIS3-Enzyms zu dem Carboxy-Terminus des Modells endoplasmatischen Retikulum (ER) assoziierte Abbau fusioniert (ERAD) -Substrat deg1 -Sec62 (2A) zu deg1 -Sec62-His3 schaffen (Figur 3) . deg1 -Sec62 eine Gründungsmitglied einer neuen Klasse von ERAD Substrate, die folgenden persistenten, anomale Verbindung mit dem Translokon ausgerichtet sind, wird der Kanal in erster Linie für die Bewegung Proteine durch die ER-Membran 32 bis 34 zuständig. Solche instabilen Proteine vorläufig genannt worden ERAD-T (für Translokon-assoziierten) Substraten. Vorherige Studien zeigen, daß bei abweichenden Translokon Eingriff deg1 -Sec62 ist für den Abbau durch das Hrd1 Ubiquitin-Ligase (2B-D) 32, 34, 35 ausgerichtet. Faktoren, die für den Abbau von weiteren Hrd1 Substrate erforderlich erscheint entbehrlich zu sein <em> deg1 -Sec62 Abbau, was auf eine neuartige Abbaumechanismus 32. Unter Bedingungen von Lipid beeinträchtigt Bindung und verlängerte Translokon Assoziation, Apolipoprotein B, die Protein-Komponente von Säugetier-Low-Density-Lipoproteine, scheint von dem zugehörigen Mechanismus 36-38 beeinträchtigt werden. Daher kann deg1 -Sec62 ein nützliches Modell für den Abbau von medizinisch relevanten Translokon assoziierte Proteine liefern.
Wildtyp- und hrd1Δ Hefezellen, die die chromosomalen HIS3-Gen fehlt wurden mit einem leeren Vektor 39 oder eines Plasmids, das deg1 -Sec62-His3 transformiert und auf selektivem Wachstumsmedium (4) ausgemacht. Um zu bestätigen, dass die gleiche Anzahl von transformierten Hefezellen wurden auf Platten übertragen, wurden die Zellen auf Medium ohne Tryptophan (die Zellen, die das Plasmid wählt), sondern enthält Histidin gesichtet. Ähnliche Wachstums wurde für alle transformierten Hefezellen beobachtet.Zellen, deg1 -Sec62-His3 exprimieren, wurden erwartet, in Abwesenheit von Histidin, nur wenn das Fusionsprotein stabilisiert wird wachsen (dh wenn ERAD-T beeinträchtigt). Tatsächlich hrd1Δ Hefe exprimieren deg1 -Sec62-His3 zeigte einen Wachstumsvorteil gegenüber Wildtyp-Zellen, die deg1 -Sec62-His3 auf Medium ohne Tryptophan und Histidin. Allerdings markiert Fusionsprotein-abhängige Wachstum in Abwesenheit von Histidin wurde auch in Gegenwart von Hrd1 beobachtet. Um die Stringenz der Assay zu erhöhen, wurde das Medium ohne Histidin mit 3-Amino-1H-1,2,3-triazol (3-AT) ergänzt, die einen kompetitiven Inhibitor des HIS3-Enzym 40. Hefe exprimieren Hrd1 wuchs sehr schlecht auf Medium ohne Histidin mit 1 ergänzt - 2 mM 3-AT; wenn Hrd1 gelöscht wurde, wurde das Zellwachstum wieder hergestellt. Aufnahme von 3-AT in einer Konzentration von 3 mM drastisch inhibiert das Wachstum von allen Zellen, unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Hrd1. Diese res ultate stimmen mit Hrd1 abhängige Substratabbau.
Als nächstes wurde der Steady-State-Fülle des deg1 -Sec62-His3 Protein in Hefe exprimieren oder nicht über die Hrd1 Enzym direkt getestet. Western-Blot-Analyse zeigte eine vergleichbare Erhöhung deg1 -Sec62-His3 und deg1 -Sec62 Protein in hrd1Δ Hefe im Vergleich zu Wildtyp-Zellen (Abbildung 5). Dies bestätigt eine Rolle Hrd1 bei der Regulation der Ebenen der beiden Proteine. Hrd1 abhängigen Abbau deg1 -Sec62 geht, nachdem das Protein aberrant das ER Translokon 32 greift. Wichtig ist, deg1 -Sec62-His3 aberrant eingreift Translokon in ähnlicher Weise (nicht veröffentlichte Daten), weiterhin die Validierung der Nutzung deg1 -Sec62-His3 als Wachstums basierenden Reporter Abbau deg1 -Sec62 spezifisch und Translokon assoziierten Proteinen im allgemeinen.
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Abbildung 2:.. Modell für den Abbau von deg1 -Sec62 folgende anomale Translokon Engagement (A) Schematische Darstellung der deg1 -Sec62 deg1 (die aminoterminalen 67 Aminosäuren aus MATα2) gefolgt wird, der Reihe nach, durch die Flagge (F) Epitop das 2-Transmembran endoplasmatischen Retikulum (ER) Protein Sec62 und zwei Kopien der S. aureus Protein A (PRA). Zur Klarheit ist das Fusionsprotein als deg1 -Sec62. (B) Nach der normalen Einsetzen der beiden Transmembransegmente in die ER-Membran bezeichnet, persistent Wechselwirkung von deg1 -Sec62 mit Translokon löst abnormal, deg1 -abhängigen Translokon Eingriff. Ein Teil des ursprünglich cytosolische aminoterminalen Schwanz aberrant eintritt-und wahrscheinlich bleibt in-the Translokon. (C) Nach abnorme Translokon engagement, erkennt und ubiquitylates deg1 -Sec62 Hrd1. Rote Kreise zeigen Ubiquitinmoleküle. (D) deg1 -Sec62 wird dann aus der ER-Membran durch das Proteasom extrahiert und abgebaut, wahrscheinlich Linderung Translokon Obstruktion.
Abb. 3: Schematische Darstellung der deg1 -Sec62-His3 folgende anomale Translokon Engagement deg1 gefolgt wird, der Reihe nach, durch die Flagge (F) Epitop, das 2-Transmembranprotein ER Sec62, zwei Kopien des S. aureus Protein A (PRA), und die Hefe His3 Enzyms. Zur Klarheit ist das Fusionsprotein als deg1 -Sec62-His3 bezeichnet.
Abbildung 4: Absicherung His3 zu deg1 (Hrd1) und hrd1Δ Hefe mit einem leeren Vektor oder ein Plasmid deg1 -Sec62-His3 kodiert wurden auf Medium ohne Tryptophan, Medium ohne Tryptophan und Histidin gesichtet und Medium ohne Tryptophan und Histidin ergänzt mit 3-Amino-1H-1,2,3-Triazol (3-AT), ein kompetitiver Inhibitor der His3, in den angegebenen Konzentrationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen .
Abb. 5: Erhöhte Fülle von deg1 -Sec62 und deg1 -Sec62-His3 in Zellen ohne Hrd1 Proteinextrakte wurden aus Wildtyp (+) und hrd1Δ vorbereitet(Δ) Hefe exprimieren deg1 -Sec62 oder deg1 -Sec62-His3. Proteine (entspricht 0,125 OD 600 Einheiten) wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, gefolgt von Western Blot mit Kaninchen-anti-Maus-Sekundärantikörper, der direkt zu binden, die das Protein A-Epitope der Fusionsproteine. Nachfolgende Western Blot mit spezifischen Antikörpern zu PGK1 bietet eine Ladekontrolle.
| Lösung | Components | Kommentare | ||
| Synthetische Defined (SD) Minimal Hefe-Medium | 2% Dextrose, 0,67% Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 0,002% Adenin, 0,004% Uracil, 0,002% Arginin, 0,001% Histidin, 0,006% Isoleucin, Leucin 0,006%, 0,004% Lysin 0,001% Methionin, 0,006% Phenylalanin, 0,005 % Threonin, Tryptophan 0,004%. Feste (Platte) Medium, umfassen 2% Agar. | 1. Selektive Medium durch Weglassen ap vorbereitetsprech Aminosäure (n) oder Stickstoffbasen. | ||
| 2. Der Einfachheit halber kann diese Bestandteile als konzentrierte Stammlösungen wie folgt erhalten werden. Aminosäuren können als 100X Stammlösung, die alle gewünschten Aminosäuren beibehalten werden. Yeast Nitrogen Base kann in einer 20X-Stammlösung (13,4%) erhalten werden. Dextrose kann in einer 40% igen Stammlösung beibehalten werden. Adenin und Uracil als 1% Stammlösung in 0,1 M NaOH aufrechterhalten werden. | ||||
| 3. Sterilisieren Medium durch Autoklavieren. | ||||
| 1X Laemmli Probenpuffer | 2% SDS, 10% Glycerin, 5% β-Mercaptoethanol, 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,008% Bromphenolblau | 1. 1X Probenpuffer wird häufig durch eine konzentrierte (zB 5X) stock Verdünnen. | ||
| 2. Der Farbstoff Bromphenolblau kann, um die gewünschte Intensität hinzugefügt werden. A "pinch" (sehr kleinen Menge von der Kante eines Spatels abgegriffen) üblicherweise ausreichend. | ||||
| 0,2 M Natriumhydroxid | Bereiten Sie in Wasser. Natriumhydroxid reagiert mit Glas. Daher ist für die langfristige Speicherung, 0,2 M Natriumhydroxid sollten in Kunststoffbehältern gehalten werden. | |||
| Laemmli Laufpuffer (5X) | 125 mM Tris, 960 mM Glycin, 0,5% SDS | Zur Herstellung von 1 l 1X Laemmli Laufpuffer verdünnt 1: 5 in dH 2 O | ||
| Tris-Acetat-SDS Transferpuffer (5X) | 125 mM Tris-Acetat (pH 8,8), 960 mM Glycin, 0,05% SDS | Zur Herstellung von 20 l 1X Tris-Acetat-SDS Transferpuffer kombinieren 4 l 5X Lager, 4 l Methanol und 12 l dH 2 O | ||
| 10X Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) | 500 mM Tris, 1,5 M NaCl; pH auf 7,5 eingestellt | Zur Herstellung von 1 l 1X TBS verdünnt 1:10 in dH 2 O 1X TBS kann mit dem Detergens Tween-20 und Magermilchpulver, gegebenenfalls ergänzt werden. |
| Stammname | Alias | Relevante Genotype | Figuren | Quelle |
| VJY6 | MHY500 | MATa | 4 und 5 | Chen et al., 1993 |
| his3-Δ200 | ||||
| leu2-3,112 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| gal2 | ||||
| VJY10 | MATa | 4 und 5 | Diese Studie | |
| his3- Δ 200 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| gal2 | ||||
| Hrd1 :: kanMX4 |
Tabelle 2:. Hefestämme in dieser Studie verwendet konstruktive Details sind auf Anfrage erhältlich.
| Plasmid-Nummer | Voll Plasmid-Name | Abbildung | Quelle |
| pVJ30 | pRS414-P MET25 -Deg1 -Flagge-Sec62-2xProtA | 5 | Rubenstein et al., 2012, |
| pVJ121 | pRS414-P MET25 (Leervektor mit MET25 Promotor) | 4 | Mumberg et al., 1994 |
| pVJ467 | pRS414-P MET25 -Deg1 -Flagge-Sec62-2xProtA-His3 | 5 | Diese Studie |
| pVJ477 | pRS414-P GAL4 -Deg1 -Flagge-Sec62-2xProtA-His3 | 4 | Diese Studie |
Tabelle 3:. Plasmide in dieser Studie verwendet beachten, dass alle Plasmide enthalten einen Hefe-Centromer-Replikation in Hefezellen, das TRP1-Gen zur Selektion in Hefe-Zellen zu ermöglichen, und die AmpR-Gen für die Wartung in Bakterienzellen. Plasmidkarten, Sequenzen und Konstruktionsdetails sind auf Anfrage erhältlich.
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Discussion
Die hier vorgestellte Methode erlaubt die schnelle Bestimmung und biochemischen Bestätigung genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau in Hefezellen. Diese Experimente unterstreichen den Nutzen und die Kraft der Hefe als Modell eukaryotischen Organismus (mehrere ausgezeichnete Bewertungen von Hefe Biologie und Zusammenstellungen von Protokollen für die Handhabung, Speicherung und Manipulation von Hefezellen (zB 41 bis 44) sind für die Ermittler neue für den Organismus verfügbar). Die Techniken können leicht angewendet werden, um den Abbau und die Größe einer Vielzahl von Klassen von Proteinen zu untersuchen. So haben andere diese Strategie, um die Abbaumechanismen von instabilen cytosolische, Kernkraft, und ER luminalen und Transmembranproteine 45 bis 49 kennzeichnen beschäftigt.
Einige Faktoren müssen bei der Wahl der Stoffwechselenzym betrachtet, zu einer instabilen Protein fusionieren. Erstens ist es wesentlich, dass eine funktionsfähige Version eines Gens, das das Enzym nicht codiert,werden im Wirtsgenom vorhanden sind. Um falsch-positive Ergebnisse zu minimieren (dh Wachstum unter selektiven Bedingungen, wenn die instabilen Protein ist eigentlich abgebaut), empfiehlt es sich, mit Stämmen, die nicht-umkehr mutierten Allelen des Reportergens (vorzugsweise vollständige Gendeletionen) 50 Hafen arbeiten. Eine weitere Überlegung für Reporterenzym Auswahl ist die Verfügbarkeit von kompetitiven Inhibitoren, die bei der selektiven Wachstumsmedium enthalten sein kann, um das Hintergrundwachstum zu reduzieren und die Assay Stringenz. Dies kann auch in Gegenwart von voll funktionsAbbauMechanismen nützlich in Fällen von Proteinen mit einem relativ niedrigen Umsatzraten sein. In den repräsentativen Experimenten hier vorgestellten reduziert die Aufnahme von 3-AT, das hemmt die His3 Enzym, Hintergrund Wachstum 40. Ähnlich kann die Verbindung 6-Azauracil hemmt Ura3, ein Enzym Uracil-Biosynthese 51 erforderlich. Im Abbau-d die Inhibitorkonzentration, bei der Wachstum trittUmfang erfolgreich, aber nicht Wildtyp, müssen Zellen empirisch ermittelt werden. Einige Stoffwechselenzyme können auch mit Gegen ausgewählt. Unter Gegen selektiven Bedingungen können Zellen wachsen nur, wenn der instabile Protein abgebaut wird (und der kondensierte metabolische Enzym nicht vorhanden ist). Zum Beispiel wandelt Ura3 die Verbindung 5-Fluororotsäure (5-FOA) an die toxische Verbindung 5-Fluoruracil 52. Zellen, die ein Ura3-Fusionsprotein exprimieren, nur in Anwesenheit von 5-FOA zu wachsen, wenn das Ura3-Fusionsprotein wird abgebaut. Ebenso ist die Verbindung 5-Fluoranthranilsäure (5-FAA) für Zellen toxisch mit einer funktionellen Tryptophan-Biosyntheseweg. 5-FAA kann somit verwendet werden Gegen wählen für Zellen, die Trp1-Fusionsproteine 53. Gegenselektionsstrategien können für die Identifizierung von Suppressoren Abbau einschränkende Mutationen sein.
Die zum Ausdruck einer Verschlechterung Reporter fahren Träger muss auch sorgfältig ausgewählt werden. Als geringe Biosynthetic Enzyme kann ausreichen, um das Wachstum in der Abwesenheit von exogen zugeführtem Metaboliten zu unterstützen, wird ein schwacher Promotor empfohlenen 54. In der repräsentativen Experimente hier präsentierten die GAL4-Promotor, der in Gegenwart von Glucose 55 verdrängt wird, wird verwendet, um die Transkription von deg1 -Sec62-His3 fördern. Basale Expression dieses Fusionsproteins unter reprimierenden Bedingungen (das heißt 2% Glucose) ausreicht, um das Wachstum unter selektiven Bedingungen zu unterstützen (dh Abwesenheit von Histidin und die Anwesenheit von 1 bis 2 mM 3-AT), wenn der Abbaumechanismus deaktiviert ist. Jedoch Proteinniveaus aus, um Wachstum zu unterstützen unter selektiven Bedingungen, die unterhalb der Nachweisgrenze durch Western-Blotting werden. Daher kann es notwendig sein, die Expression mit einem schwachen Promotor für die Wachstumsassay und einem stärkeren Promotor zur biochemischen Bestätigung anzutreiben. Im Fall von deg1 -Sec62 (mit oder ohne die His3 Fusion), einer robust-Promotors (hier die MET25-Promotor 39) für die Proteinvisualisierung durch Western-Analyse.
Wie hier beschrieben, kann die auf Hefe basierende Wachstumstest auf einer kleinen, Kandidatenbasierten Ansatzes durchgeführt werden. Serielle Verdünnungen von Hefe-Zellen werden in einer Platte mit 96 Vertiefungen hergestellt und durch Pipettieren auf festes Wachstumsmedium übertragen werden; Ein alternatives Verfahren für die effiziente und reproduzierbare Übertragung verdünnt Hefezelle Suspensionen auf Festmedium ist die Verwendung eines Multi-Pin-Replikator, die allgemein als "frogger" 56 bezeichnet. Die ideale Zeit, um zu fotografieren Bleche werden mit Hefestämmen und Bedingungen variieren. Es wird empfohlen, um eine bestimmte Platte, wenn Kolonien von der am schnellsten wachsenden Kultur sichtbar wird am meisten verdünnten Spot fotografieren. Dies ist typischerweise der Punkt, an dem Unterschiede in den Wachstumsraten der Proben am deutlichsten sind. Es kann ratsam sein, Fotos auf mehrere Tage in Anspruch nehmen, insbesondere im Fall von HefeAussteller eine Vielzahl von Wachstumsraten.
Das Wachstum basierenden Reporter-Assay kann auch angepasst für Groß analysiert werden. Beispielsweise kann ein Abbau Reporter in einen kommerziell erhältlichen Bibliothek von ~ 5000 lebensfähige haploide Hefegen Deletionsstämme Verwendung Synthetic Genetic Array (SGA) Technologie 46,57 eingebracht werden. Bei dieser Technik wird ein haploiden Hefestamm mit einem chromosomal integrierten metabolischen Reporter-Fusionsproteins an jeden Stamm der Gendeletion Bibliothek gepaart. Die sich daraus ergebenden diploiden Zellen dazu gebracht werden, sporulieren (Meiose durchlaufen) und die Auswahl für die haploiden meiotischen Nachkommen, sowohl die Stoffwechsel Reporter und individuelle Gendeletionen unterzogen. Diese Stämme werden dann en masse zu Medium selektiv für Zellen, in denen das Protein stabilisiert wurde übertragen. Wie für kleinere analysiert, wenn ein Gen, das mit einer Rolle in der Proteinabbau gelöscht wird, wird das Fusionsprotein stabilisiert wird, und das Zellwachstum wird verstärkt. Vergleichbare einpproaches entwickelt worden, die für die gleichzeitige Umwandlung von einer großen Sammlung von Stämmen mit extrachromosomal aufrechterhalten Plasmide ermöglichen; Diese Strategie vermeidet chromosomale Integration, Paarung, Sporenbildung und Reife Auswahl 54.
Wenn eine Mutation festgestellt wird, einen Wachstumsvorteil auf Zellen mittels eines metabolischen Reporter verleihen, ist es notwendig, biochemisch bestätigen, dass die Mutation erhöht die Häufigkeit des Proteins von Interesse. Eine schnelle und zuverlässige Hefelyse Verfahrens eng von dem Verfahren der Kuhsnirov 31 angepasst dargestellt. Dieses Protokoll ermöglicht die Extraktion von Proteinen in einer unmittelbar geeignet zur Analyse durch Western-Blot-Form. Für die Analyse eines bestimmten Proteins, um die Menge an Lysat pro Vertiefung, Acrylamid Geleigenschaften, die Wahl der Membran, Antikörper verwendet und Verdünnungen davon und Nachweisverfahren müssen empirisch bestimmt werden geladen. Der Vertreter der Western-Blot-Protokoll beschrieben utilizes Sekundärantikörper, um fluoreszierende Farbstoffe konjugiert; andere häufig verwendete Protokolle setzen auf Chemilumineszenz abhängig antikörperkonjugierten Enzyme 58. Wie hier beschrieben, kann die Membran verwendet werden, um das Protein von Interesse erkennen direkt mit einem Antikörper für eine Ladekontrollprotein sondiert werden. Wenn die primären Antikörper verwendet, um das Protein von Interesse und Ladesteuerproteins aus derselben Spezies gezüchtet wurde, die Western Blot der Membran möglich ist, solange die Streifen, die aus diesen Proteinen nicht co-migrieren. Wenn jedoch die primären Antikörper verwendet, um das Protein von Interesse und Ladesteuerproteins wurden aus verschiedenen Spezies gezüchtet wurde, kann die gleiche Membran sequentiell abgetastet werden, auch wenn Bands co-migrieren, wenn die sekundären Antikörper zu Fluorophoren konjugiert unterschiedlichen Emissionswellenlängen. In dem Fall, dass das Protein von Interesse und Ladekontrollprotein co-migrieren und den jeweiligen primären Antikörper wurden RaiSED von der gleichen Spezies, können Proben auf zwei SDS-PAGE-Gelen auf eine PVDF-Membran übertragen gelöst werden, und die spezifisch für das Protein von Interesse und Ladekontrollprotein Antikörper separat sondiert. Alternativ dazu kann das Laden Konsistenz durch Inkubation von Membranen mit nicht-spezifischen Protein Flecken (zB Coomassie oder Ponceau S) beurteilt werden. Ferner übernimmt die repräsentative Western Blot-Protokoll für ein Protein oder ein Epitop, das durch sequentielle Inkubation von primären und sekundären Antikörper nachgewiesen wird, wie es typisch ist. Die Fusionsproteine in den repräsentativen Ergebnissen analysiert enthalten zwei Epitope aus Staphylococcus aureus Protein A abgeleitete (PrA in den Figuren 2 und 3). Protein A bindet direkt an Säuger-Immunglobulinen und kann daher unter Verwendung sekundärer Antikörper allein (keine primären Antikörper Inkubationsschritt erforderlich ist) 59 detektiert werden. Es ist möglich, dass die Fusion eines Reporterenzym Proteinmenge beeinflussen oderAbbau. Es ist daher ratsam, die Ergebnisse mit einer Version des Substrats frei von Reporterproteins biochemisch zu bestätigen. Schließlich beide hier beschriebenen Tests setzen auf Unterschiede im stationären Protein-Ebene als Proxy für Unterschiede in der Proteinstabilität. Da Proteinmenge spiegelt die Integration von Raten von Proteinsynthese und Abbau, weitere biochemische Analyse (zB Cycloheximid Chase oder Puls Chase-Experimente) müssen eingesetzt werden, um dynamische Abbauprofil eines Proteins direkt analysieren.
Die repräsentativen Ergebnisse etablieren eine neuartige Anwendung dieses Protokoll für die Bestimmung der genetischen Erfordernisse für den Abbau eines Proteins, die aberrant das ER Translokon eingreift. Deg1 -Sec62-His3 tragenen eine Hefe-Wachstumsvorteil unter selektiven Bedingungen, wenn der Abbauweg inaktiviert wurde (dh in das Fehlen des Hrd1 Ubiquitinligase). Eine schnelle und zuverlässige Protein abTreibverfahren, gefolgt von Western-Blotting bestätigt eine Zunahme von Fülle deg1 -Sec62 (mit oder ohne His3) in Abwesenheit von Hrd1. Frühere Studien zeigen, dass der Mechanismus der Hrd1 abhängige Abbau Translokon assoziierte Proteine unterscheidet sich von denen der anderen Hrd1 ER luminalen oder Transmembransubstraten 32. Zukünftige Arbeiten werden die deg1 -Sec62-His3 Fusionsprotein in großen genetischen Screens verwenden, um neue Gene für diesen einzigartigen Abbaumechanismus erforderlich zu identifizieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Rubenstein Labor zur Bereitstellung eines unterstützenden und begeisterten Forschungsumfeld. Wir danken Ryan T. Gibson um Hilfe bei der Protokolloptimierung. Wir danken Markus Hochstrasser (Yale University) und Dieter Wolf (Universität Stuttgart) für Hefestämme und Plasmide. Wir danken unseren anonymen Gutachtern für ihre Hilfe bei der Verbesserung der Klarheit und Nützlichkeit dieses Manuskript. Diese Arbeit wurde von einem Forschungspreis der Ball State University Kapitel der Sigma Xi zu SGW unterstützt, ein National Institutes of Health Zuschuss (R15 GM111713) zu EMR, ein Ball State University ASPiRE Forschungspreis zur EMR und Mittel aus der Ball State University Provost Büro und Fachbereich Biologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
| 3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs. |
| Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer. |
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers. |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes. |
| Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) | Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
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Molecular Biology Ausgabe 96 Ubiquitin-Proteasom-System,
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