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Biology

ग्रोथ आधारित निर्धारण और प्रोटीन गिरावट के लिए जेनेटिक आवश्यकताएँ की बायोकेमिकल पुष्टि में Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/52428
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital
* These authors contributed equally

Abstract

नियमित प्रोटीन गिरावट लगभग हर सेलुलर समारोह के लिए महत्वपूर्ण है। आणविक तंत्र और यूकेरियोटिक प्रोटीन गिरावट के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं के बारे में जाना जाता है की बहुत शुरू में Saccharomyces cerevisiae में स्थापित किया गया था। प्रोटीन गिरावट के शास्त्रीय विश्लेषण के जैव रासायनिक पल्स-चेस और cycloheximide-पीछा के तरीके पर भरोसा किया है। इन तकनीकों प्रोटीन गिरावट के अवलोकन के लिए संवेदनशील साधन उपलब्ध कराते हैं, वे श्रमसाध्य, समय लेने वाली है, और कम-से throughput हैं। इन तरीकों प्रोटीन गिरावट को रोकने कि म्यूटेशन के लिए तेजी से या बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। इधर, प्रोटीन गिरावट के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं की सतही पहचान के लिए एक खमीर विकास आधारित परख में वर्णित है। इस परख में, विशिष्ट चयनात्मक शर्तों के तहत विकास के लिए आवश्यक एक पत्रकार एंजाइम एक अस्थिर प्रोटीन से जुड़े हुए है। प्रकोष्ठों अंतर्जात संवाददाता एंजाइम की कमी है, लेकिन संलयन प्रोटीन sele के तहत विकसित कर सकते हैं व्यक्तसंलयन प्रोटीन स्थिर है केवल जब ctive शर्तों (यानी प्रोटीन गिरावट के साथ छेड़छाड़ की है)। यहाँ वर्णित विकास परख में, जंगली प्रकार और एक संलयन प्रोटीन एन्कोडिंग एक प्लाज्मिड शरण उत्परिवर्ती खमीर कोशिकाओं के धारावाहिक dilutions चयनात्मक और गैर चयनात्मक माध्यम पर देखा जाता है। चयनात्मक शर्तों के तहत विकास के लिए एक दिया उत्परिवर्तन से गिरावट हानि के साथ संगत है। वृद्धि की प्रोटीन बहुतायत को biochemically पुष्टि की जानी चाहिए। वैद्युतकणसंचलन और पश्चिमी सोख्ता के लिए उपयुक्त एक फार्म में खमीर प्रोटीन का तेजी से निकासी के लिए एक विधि को भी प्रदर्शन किया है। जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए प्रोटीन निकासी के लिए एक सरल प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त प्रोटीन स्थिरता के लिए एक विकास आधारित readout, प्रोटीन गिरावट के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं की तेजी से पहचान की सुविधा। इन तकनीकों में अल्पकालिक प्रोटीन की एक किस्म की गिरावट पर नजर रखने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रस्तुत उदाहरण में, हिस्टडीन जैवसंश्लेषण के लिए आवश्यक है जो HIS3 एंजाइम, इनकार किया गया थायह aberrantly endoplasmic जालिका translocon संलग्न बाद Deg1 को -Sec62। Deg1 -Sec62 गिरावट के लिए लक्षित है। Deg1 -Sec62-HIS3 शरण कोशिकाओं में प्रोटीन स्थिर हो गया था जब चयनात्मक शर्तों के तहत विकसित करने में सक्षम थे।

Introduction

चयनित प्रोटीन गिरावट यूकेरियोटिक जीवन के लिए आवश्यक है, और बदल प्रोटीन गिरावट कैंसर के कई प्रकार, neurodegenerative रोग, हृदय रोग, और सिस्टिक फाइब्रोसिस 1-5 सहित चिकित्सा शर्तों के एक नंबर के लिए योगदान देता है। चयनात्मक प्रोटीन गिरावट उत्प्रेरित जो ubiquitin-Proteasome प्रणाली (यूपीएस), इन शर्तों के 6-10 के लिए एक उभरती हुई चिकित्सीय लक्ष्य है। Ubiquitin ligases covalently प्रोटीन से 11 76 एमिनो एसिड ubiquitin की पॉलिमर देते हैं। Polyubiquitin चेन के साथ चिह्नित किया गया है कि प्रोटीन मान्यता प्राप्त है और ~ 2.5 megadalton 26S द्वारा 12 Proteasome proteolyzed कर रहे हैं। मॉडल यूकेरियोटिक जीव Saccharomyces cerevisiae (नवोदित खमीर) में शुरू अध्ययन यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रोटीन गिरावट तंत्र की व्याख्या में मूलभूत कर दिया गया है। यूपीएस के पहले प्रदर्शन किया शारीरिक सब्सट्रेट MATα2 13 खमीर ट्रांसक्रिप्शनल repressor थायूपीएस के 14, और कई अत्यधिक संरक्षित घटकों पहली पहचान की गई या (जैसे 15-26) खमीर में होती है। इस बहुमुखी और आनुवंशिक रूप से विनयशील मॉडल जीव में की गई खोजों ubiquitin की मध्यस्थता गिरावट के संरक्षित तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए जारी होने की संभावना है।

सबसे यूपीएस substrates की मान्यता और गिरावट एकाधिक प्रोटीन की ठोस कार्रवाई की आवश्यकता है। इसलिए, एक दिया अस्थिर प्रोटीन की विनियमित गिरावट निस्र्पक में एक महत्वपूर्ण लक्ष्य प्रोटियोलिसिस के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं को निर्धारित करने के लिए है। स्तनधारी या खमीर कोशिकाओं में प्रोटीन गिरावट की निगरानी के लिए शास्त्रीय दृष्टिकोण (जैसे पल्स-चेस और cycloheximide-पीछा प्रयोगों 27) श्रमसाध्य और समय लेने वाली हैं। कार्यप्रणाली के इन प्रकार के प्रोटीन गिरावट का पता लगाने के लिए अत्यधिक संवेदनशील साधन उपलब्ध कराते हैं, वे प्रोटीन गिरावट या बड़े पैमाने पर screeni का तेजी से विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैंप्रोटीन गिरावट को रोकने कि म्यूटेशन के लिए एनजी। इधर, अस्थिर प्रोटीन की गिरावट के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं की तेजी से पहचान के लिए एक खमीर विकास आधारित परख प्रस्तुत किया है।

प्रोटीन गिरावट, ब्याज (या गिरावट संकेत) के एक अस्थिर प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए खमीर विकास आधारित पद्धति में विशिष्ट परिस्थितियों में खमीर विकास के लिए आवश्यक है कि एक प्रोटीन के लिए, फ्रेम में, जुड़े हुए है। परिणाम ब्याज की अस्थिर प्रोटीन की प्रोटीन गिरावट के आनुवंशिक आवश्यकताओं को निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में सेवा कर सकता है कि एक कृत्रिम सब्सट्रेट है। सुविधाजनक, सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रयोगशाला खमीर उपभेदों विशेष अमीनो एसिड या नाइट्रोजन कुर्सियां ​​(जैसे 20,28-30) के जैवसंश्लेषण में शामिल चयापचय एंजाइमों एन्कोडिंग जीन में म्यूटेशन के एक पैनल बंदरगाह। इन एंजाइमों जिसका संश्लेषण एंजाइमों भाग लेने में exogenously प्रदान की चयापचयों के अभाव में सेलुलर प्रसार के लिए आवश्यक हैं। ऐसाअस्थिर प्रोटीन की गिरावट के लिए विकास आधारित संवाददाताओं से जो वे जुड़े हुए हैं के रूप में चयापचय एंजाइमों इस प्रकार से कार्य कर सकता है। प्रोटियोलिसिस रोकने कि म्यूटेशन गिरावट रिपोर्टर को शरण देने की कोशिकाओं चयनात्मक शर्तों के तहत विकसित करने की अनुमति होगी, क्योंकि प्रोटीन गिरावट के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं को आसानी से elucidated किया जा सकता है।

एक विकास लाभ एक विशेष उत्परिवर्तन ब्याज की प्रोटीन की प्रचुरता बढ़ जाती है कि एक अप्रत्यक्ष संकेत है। हालांकि, प्रत्यक्ष जैव रासायनिक विश्लेषण एक उत्परिवर्तन बल्कि अप्रत्यक्ष या artifactual कारणों के माध्यम से वृद्धि हुई प्रोटीन के स्तर के माध्यम से विकास कि परमिट पुष्टि करने के लिए आवश्यक है। प्रोटीन बहुतायत पर एक उत्परिवर्तन का असर करते हैं और विशेष रूप से उत्परिवर्तन नहीं बंदरगाह कि कोशिकाओं में स्थिर राज्य प्रोटीन के स्तर के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से इसकी पुष्टि की जा सकती है। उपयुक्त एक फार्म में खमीर प्रोटीन का तेजी से और कुशल निष्कर्षण (सोडियम हाइड्रोक्साइड और नमूना बफर के साथ खमीर कोशिकाओं के अनुक्रमिक ऊष्मायन) के लिए एक विधिपश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण के लिए भी 31 से प्रस्तुत किया है। साथ में, इन प्रयोगों प्रोटीन गिरावट के उम्मीदवार नियामकों की तेजी से पहचान की सुविधा।

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Protocol

प्रोटीन गिरावट में दोषपूर्ण उम्मीदवार म्यूटेंट की पहचान के लिए 1. खमीर विकास परख

  1. एक पत्रकार के चयापचय एंजाइम, फ्रेम में, जुड़े एक अस्थिर प्रोटीन एन्कोडिंग एक प्लाज्मिड के साथ जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती खमीर कोशिकाओं रूपांतरण।
  2. प्लाज्मिड अणुओं को शरण देने की कोशिकाओं के लिए चयनात्मक है कि सिंथेटिक परिभाषित (एसडी) कम से कम मध्यम के 5 मिलीलीटर में transformants टीका लगाना। घूर्णन, 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  3. प्रत्येक रातोंरात संस्कृति के 600 एनएम (आयुध डिपो 600) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने।
    नोट: रातोंरात ऊष्मायन के बाद, संस्कृति में कोशिकाओं या तो लघुगणक या स्थिर विकास के चरण में हो सकता है, लेकिन कम से कम एक आयुध डिपो 0.2 से 600 तक पहुँच जाना चाहिए था। अनुभव से निर्धारित के रूप में बहुत धीमी गति से बढ़ रही है खमीर उपभेदों, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के ऊष्मायन बार अब से एक रात, या टीका आवश्यकता हो सकती है।
  4. एक पतला कोशिकाओं के साथ शुरुआत है, एक बाँझ 96 अच्छी तरह से थाली में तब्दील खमीर कोशिकाओं का छह गुना धारावाहिक dilutions तैयारएन आयुध डिपो 0.2 के 600। 96 अच्छी तरह से थाली में एक अलग पंक्ति में assayed किया जा करने के लिए प्रत्येक खमीर transformant रखें।
    1. प्रत्येक transformant के लिए, 200 μl के अंतिम मात्रा में 0.2 के एक आयुध डिपो 600 कोशिकाओं को कमजोर करने के लिए आवश्यक रातोंरात संस्कृति की मात्रा की गणना। 200 μl के लिए मात्रा लाने के लिए बाँझ पानी की उचित मात्रा में जोड़ें कॉलम 1 में अच्छी तरह से करने के लिए इसी रातोंरात संस्कृति की इस मात्रा में जोड़ें।
    2. खमीर की प्रत्येक पंक्ति के लिए, स्तंभ 2, 3 और 4 में वेल्स को बाँझ पानी के 125 μl जोड़ें।
      नोट: व्यक्तिगत लिपटे बाँझ 96 अच्छी तरह प्लेटें बाँझ lids के साथ पैक किया जा सकता है। पलकों इस चरण में वितरित किया जाता है कि बाँझ पानी के लिए जलाशयों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह एक multichannel pipettor के साथ एक दिया स्तंभ में सभी कुओं को बाँझ पानी का एक साथ स्थानांतरण की अनुमति देता है।
    3. ऊपर pipetting द्वारा और एक multichannel pipettor के साथ नीचे पहले कॉलम (एक आयुध डिपो 0.2 की 600 पतला खमीर) की सामग्री मिलाएं।
    4. Transfएक multichannel pipettor का उपयोग कॉलम 2 के लिए कॉलम 1 से खमीर के 25 μl, एर। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स। स्थानांतरण कॉलम 3 करने के लिए कॉलम 2 से 25 μl, और स्तंभ तीन से स्तंभ 4 के लिए 25 μl (प्रत्येक कदम पर अच्छी तरह से मिश्रण)।
  5. एक multichannel pipettor के साथ प्रत्येक नमूना मिलाएं। सबसे पतला से कार्यवाही कम से कम उपयुक्त चयनात्मक मध्यम युक्त दो प्लेटों पर खमीर, पिपेट प्रत्येक नमूने के 4 μl के स्तंभ को कमजोर करने के लिए। प्लाज्मिड चयन (इस प्लेट एक खमीर खोलना और विकास के नियंत्रण के रूप में कार्य करता है) का कहना है कि मध्यम के साथ एक प्लेट का उपयोग करें। संवाददाता एंजाइम के लिए जुड़े हुए अस्थिर प्रोटीन की प्लाज्मिड रखरखाव और अभिव्यक्ति के लिए चुनता है कि मध्यम के साथ एक दूसरे की थाली का प्रयोग करें। खमीर तेजी से बसने की वजह से नियमित अंतराल पर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं मिश्रण।
    नोट: सुखाने की मशीन प्लेटें और अधिक आसानी से हौसले से तैयार प्लेटों से तरल अवशोषित करेंगे और इसलिए इन प्रयोगों के लिए सिफारिश कर रहे हैं। नम प्लेटें लो में कमरे के तापमान पर ऊष्मायन से सूखे की जा सकती हैएक लामिना का प्रवाह हुड में 2 दिन या कम incubations - 1 के लिए W आर्द्रता। लामिना हवा का प्रवाह बेंच के समानांतर है अगर प्लेट्स असमान शुष्क कर सकते हैं। एक टेम्पलेट का उपयोग करने के लिए यह आसान नियमित दूरी पर खमीर कोशिकाओं हाजिर करने के लिए बनाता है। दो नमूने टेम्पलेट्स चित्र 1 में प्रदान की जाती हैं। ये मुद्रित बाहर कटौती, और एक पेट्री डिश ढक्कन के अंदर से चिपका जा सकता है।
  6. प्लेटों बेंच शीर्ष पर सूखे की अनुमति दें।
  7. 6 दिन - 2 के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
  8. ऊष्मायन के बाद प्रत्येक थाली तस्वीर।

चित्र 1
100 मिमी अगर प्लेटों पर खमीर कोशिकाओं खोलना के लिए चित्रा 1. टेम्पलेट्स। इन खाकों एक multichannel pipettor के साथ नियमित दूरी पर खमीर खोलना सुविधाजनक बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। टेम्पलेट, मुद्रित बाहर कटौती, और एक पेट्री डिश ढक्कन के अंदर से चिपका जा सकता है। विकास के साथ पेट्री डिश रखेंटेम्पलेट के साथ मध्यम अंदर ढक्कन चिपका। टेम्पलेट्स अभिविन्यास ट्रैक करने के लिए एक पायदान के साथ चिह्नित हैं। यह वृद्धि assays में इस्तेमाल किया प्लेटें इसी तरह अभिविन्यास ट्रैक करने के लिए एक पायदान के साथ चिह्नित किया है कि सिफारिश की है। चार (ए) या ​​पांच (बी) खमीर कोशिकाओं के धारावाहिक dilutions प्रदान की जाती हैं खोलना करने के लिए टेम्पलेट्स। 100 मिमी टेम्पलेट्स के साथ यह आंकड़ा की एक मुद्रण योग्य संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

खमीर विकास परख की 2. बायोकेमिकल पुष्टि

  1. खमीर कोशिकाओं और पोस्ट-क्षारीय प्रोटीन निष्कर्षण के विकास (31 से संशोधित)
    1. अस्थिर प्रोटीन एन्कोडिंग एक प्लाज्मिड के साथ जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती खमीर कोशिकाओं रूपांतरण।
    2. प्लाज्मिड अणुओं को शरण देने की कोशिकाओं के लिए चयनात्मक है कि एसडी मध्यम के 5 मिलीलीटर में transformants टीका लगाना। घूर्णन, 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
    3. प्रत्येक रातोंरात घन की 600 आयुध डिपो उपायlture।
      नोट: रातोंरात ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं या तो लघुगणक या स्थिर विकास के चरण में हो सकता है, लेकिन 0.2 मिलीलीटर 10 में ताजा चयनात्मक मध्यम (कदम 2.1.4) के एक आयुध डिपो 600 कमजोर पड़ने की अनुमति होगी कि एक आयुध डिपो 600 पर पहुंच जाना चाहिए था। अनुभव से निर्धारित के रूप में बहुत धीमी गति से बढ़ रही है खमीर उपभेदों, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के ऊष्मायन बार अब से एक रात, या टीका आवश्यकता हो सकती है।
    4. 0.2 मिलीलीटर 10 में ताजा चयनात्मक मध्यम के एक आयुध डिपो 600 खमीर कोशिकाओं पतला।
    5. संस्कृतियों (मध्य लघुगणक विकास में हैं यानी) 0.8 और 1.2 के बीच एक आयुध डिपो 600 तक, घूर्णन या मिलाते हुए, 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते लिए आगे बढ़ें।
      नोट: ब्याज की अस्थिर प्रोटीन एक regulatable प्रमोटर के नियंत्रण में है, तो प्रोटीन अभिव्यक्ति और सेल फसल की प्रेरण का इष्टतम समय पिछले अध्ययनों या अनुभवजन्य टिप्पणियों के अनुसार भिन्न हो सकते हैं।
    6. एक 15 मिलीलीटर शांकव में संस्कृति के 2.5 ओवर ड्राफ्ट 600 इकाइयों लीजिएकमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 5000 XG पर centrifugation द्वारा अल ट्यूब। Pipetting या आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
      नोट: 600 यूनिट 1.0 के आयुध डिपो 600 पर संस्कृति के 1 मिलीलीटर में खमीर वर्तमान की राशि के रूप में परिभाषित किया गया है एक आयुध डिपो। वी = 2.5 आयुध डिपो के 600 इकाइयों / मापा 600 आयुध डिपो: 2.5 आयुध डिपो के 600 इकाइयों (वी) फसल के लिए आवश्यक (माले में) संस्कृति की मात्रा निम्न समीकरण का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है
    7. 1 मिलीलीटर में Resuspend कोशिकाओं पानी आसुत। एक microcentrifuge ट्यूब के लिए निलंबित कर दिया कोशिकाओं स्थानांतरण।
    8. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 6500 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं। Pipetting या आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    9. 100 μl में Resuspend कोशिकाओं नीचे या vortexing के ऊपर pipetting और से आसुत जल, और 100 μl 0.2 एम NaOH जोड़ें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
    10. 18,000 एक्स पर centrifugation द्वारा (अभी तक प्रोटीन जारी की है और अभी भी सक्षम हैं नहीं किया है, जिनमें से अधिकांश) गोली कोशिकाओं5 मिनट के लिए जी। Pipetting या आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    11. ऊपर और नीचे pipetting या vortexing द्वारा, कोशिकाओं lyse जाएगा जो 100 μl 1x Laemmli नमूना बफर, - 50 में resuspend गोली।
      नोट: centrifugation और Laemmli नमूना बफर में कोशिकाओं के बाद मेजबान निम्नलिखित क्षारीय सतह पर तैरनेवाला का हटाया जाना एक Tris-ग्लाइसिन चल बफर सिस्टम और पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) के साथ संगत एक पीएच में प्रोटीन निकालता है।
    12. पूरी तरह से प्रोटीन denature करने के लिए, 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर lysates सेते हैं।
      नोट: 95 डिग्री सेल्सियस पर incubated जब एकत्रीकरण की आशंका वाले प्रोटीन (कई ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्रों के साथ जैसे प्रोटीन) अघुलनशील बन सकते हैं। इसलिए, lysates कम तापमान पर incubated किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस - 70 डिग्री सेल्सियस) के लिए 10 - 30 मिनट, के रूप में अनुभव से ऐसे प्रोटीन का विश्लेषण के लिए, निर्धारित की।
    13. 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखकर कूल lysates।
    14. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 18,000 XG पर अपकेंद्रित्र lysates अघुलनशील सामग्री गोली। पूर्व बाद पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (धारा 2.2) के लिए एसडीएस पृष्ठ से सतह पर तैरनेवाला (solubilized निकाले प्रोटीन) अलग। वैकल्पिक रूप से, -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर lysates।
  2. प्रतिनिधि पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल
    1. एक एसडीएस पृष्ठ जेल में lysates के अनुभव से निर्धारित मात्रा लोड करें।
    2. डाई सामने जब तक 200 वी पर जेल चला जेल के नीचे पहुंच गया है।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट - 60 के लिए 20 वी पर गीला हस्तांतरण द्वारा polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली को जेल से प्रोटीन स्थानांतरण।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए, कमाल या, Tris बफर खारा (टीबीएस) में 5% दूध स्किम में incubating द्वारा ब्लॉक झिल्ली।
    5. अवरुद्ध समाधान छानना।
    6. कमरे ते पर 1 घंटे के लिए 0.1% बीच 20 (टीबीएस / टी) के साथ टीबीएस में 1% दूध स्किम में (या उसके मिलान टैग) प्राथमिक हित के प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेतेmperature, कमाल।
    7. एंटीबॉडी समाधान छानना, और कमाल, कमरे के तापमान पर टीबीएस / टी के साथ झिल्ली 3 एक्स 5 मिनट धो लें।
    8. कमाल, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए टीबीएस / टी में 1% दूध स्किम में उपयुक्त फ्लोरोफोरे संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं।
      नोट: fluorophores के प्रकाश के प्रति संवेदनशील होते हैं, क्योंकि फ्लोरोफोरे संयुग्मित एंटीबॉडी की dilutions के अंधेरे में तैयार किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोफोरे संयुग्मित एंटीबॉडी की उपस्थिति में झिल्ली की ऊष्मायन lightproof कंटेनरों में हो जाना चाहिए। इस एल्यूमीनियम पन्नी में ऊष्मायन ट्रे लपेटकर द्वारा पूरा किया जा सकता है।
    9. एंटीबॉडी समाधान छानना, और कमाल, कमरे के तापमान पर टीबीएस / टी के साथ झिल्ली 3 एक्स 5 मिनट धो लें।
    10. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार, ली-कोर ओडिसी CLX का उपयोग कर झिल्ली और छवि स्टूडियो सॉफ्टवेयर (या तुलनीय इमेजिंग उपकरण और सॉफ्टवेयर) की छवि मोल।
    11. झिल्ली इमेजिंग के बाद, एक लोड के लिए विशिष्ट एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेतेकमाल, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए टीबीएस / टी में 1% दूध स्किम में नियंत्रण प्रोटीन आईएनजी।
    12. एंटीबॉडी समाधान छानना, और कमाल, कमरे के तापमान पर टीबीएस / टी के साथ झिल्ली 3 एक्स 5 मिनट धो लें।
    13. कमाल, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए टीबीएस / टी में 1% दूध स्किम में उपयुक्त फ्लोरोफोरे संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं।
    14. एंटीबॉडी समाधान छानना, और कमाल, कमरे के तापमान पर टीबीएस / टी के साथ झिल्ली 3 एक्स 5 मिनट धो लें।
    15. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार, ली-कोर ओडिसी CLX का उपयोग कर झिल्ली और छवि स्टूडियो सॉफ्टवेयर (या तुलनीय इमेजिंग उपकरण और सॉफ्टवेयर) की छवि मोल।

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Representative Results

इस पद्धति को वर्णन करने के लिए, HIS3 एंजाइम मॉडल endoplasmic जालिका (ईआर) -associated गिरावट के carboxy टर्मिनस से जुड़े हुए किया गया है (ERAD) सब्सट्रेट, Deg1 -Sec62 (2A चित्रा) Deg1 -Sec62-HIS3 बनाने के लिए (चित्रा 3) । Deg1 -Sec62 translocon साथ लगातार, न्यायपालिका एसोसिएशन निम्नलिखित लक्षित कर रहे हैं कि ERAD substrates के एक उपन्यास वर्ग के एक संस्थापक सदस्य का प्रतिनिधित्व करता है, ईआर झिल्ली 32-34 प्रोटीन के पार जाने के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार चैनल। इस तरह के अस्थिर प्रोटीन प्रावधिक substrates (translocon जुड़े लिए) ERAD टी बुलाया गया है। पिछले अध्ययनों न्यायपालिका translocon सगाई पर, Deg1 -Sec62 Hrd1 ubiquitin ligase (चित्रा 2B-डी) के 32, 34, 35 से गिरावट के लिए लक्षित है, कि संकेत मिलता है। अन्य Hrd1 substrates की गिरावट के लिए आवश्यक कारक के लिए नगण्य होना प्रकट <उन्हें> Deg1 -Sec62 गिरावट, एक उपन्यास गिरावट तंत्र 32 सुझाव दे। बाध्यकारी बिगड़ा लिपिड और लंबे समय तक translocon एसोसिएशन, अपोलीपोप्रोटीन बी की शर्तों के तहत, स्तनधारी कम घनत्व लिपो प्रोटीन का प्रोटीन घटक, एक संबंधित तंत्र 36-38 से अपमानित होना प्रतीत होता है। इसलिए, Deg1 -Sec62 चिकित्सकीय प्रासंगिक translocon जुड़े प्रोटीन की गिरावट के लिए एक उपयोगी मॉडल उपलब्ध करा सकता है।

गुणसूत्र HIS3 जीन की कमी है कि जंगली प्रकार और hrd1Δ खमीर कोशिकाओं एक खाली वेक्टर 39 या एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग Deg1 -Sec62-HIS3 के साथ बदल गया है और चयनात्मक मध्यम विकास (चित्रा 4) पर देखा गया था। तब्दील खमीर कोशिकाओं की है कि बराबर संख्या की पुष्टि करने के लिए प्लेटों के लिए स्थानांतरित कर दिया गया, कोशिकाओं (प्लाज्मिड को शरण देने की कोशिकाओं के लिए चयन करता है) मध्यम कमी ट्रिप्टोफान लेकिन युक्त हिस्टडीन पर देखा गया था। इसी प्रकार विकास सभी तब्दील खमीर की कोशिकाओं के लिए मनाया गया।Deg1 -Sec62-HIS3 व्यक्त कोशिकाओं है कि संलयन प्रोटीन स्थिर है केवल जब हिस्टडीन के अभाव में वृद्धि होने की उम्मीद कर रहे थे (यानी ERAD टी समझौता किया है जब)। दरअसल, Deg1 -Sec62-HIS3 व्यक्त hrd1Δ खमीर मध्यम कमी tryptophan और हिस्टडीन पर Deg1 -Sec62-HIS3 व्यक्त जंगली प्रकार की कोशिकाओं के लिए एक विकास लाभ रिश्तेदार का प्रदर्शन किया। हालांकि, हिस्टडीन के अभाव भी Hrd1 की उपस्थिति में मनाया गया में संलयन प्रोटीन पर निर्भर विकास के रूप में चिह्नित। परख की तंगी को बढ़ाने के लिए आदेश में, मध्यम कमी हिस्टडीन, 3-एमिनो 1H-1,2,3-triazole (3-एटी) के साथ HIS3 एंजाइम 40 की एक प्रतिस्पर्धी अवरोध करनेवाला सहारा लिया जाता था। Hrd1 व्यक्त खमीर 1 के साथ पूरक मध्यम कमी हिस्टडीन पर बहुत खराब बढ़ी - 2 मिमी 3-पर; HRD1 हटा दिया गया था, जब सेल के विकास बहाल कर दी गई। की परवाह किए बिना Hrd1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति की सभी कोशिकाओं के 3 मिमी नाटकीय रूप से हिचकते विकास, के एक एकाग्रता में 3-एटी का समावेश। ये रिस ults Hrd1 निर्भर सब्सट्रेट गिरावट के साथ संगत कर रहे हैं।

अगला, व्यक्त या Hrd1 एंजाइम की कमी खमीर में Deg1 -Sec62-HIS3 प्रोटीन की स्थिर राज्य बहुतायत सीधे परीक्षण किया गया था। पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण Deg1 -Sec62-HIS3 और Deg1 -Sec62 प्रोटीन जंगली प्रकार की कोशिकाओं को hrd1Δ खमीर सापेक्ष में (चित्रा 5) में एक तुलनीय वृद्धि का संकेत दिया। यह दोनों प्रोटीन के स्तर के नियमन में Hrd1 के लिए एक भूमिका की पुष्टि करता है। प्रोटीन aberrantly ईआर translocon 32 संलग्न बाद Deg1 -Sec62 की Hrd1 निर्भर गिरावट आय। महत्वपूर्ण बात है, Deg1 -Sec62-HIS3 aberrantly आगे विशेष रूप से Deg1 -Sec62 की गिरावट और आम तौर पर translocon जुड़े प्रोटीन के लिए एक विकास आधारित पत्रकार के रूप में Deg1 -Sec62-HIS3 के उपयोग को मान्य, एक समान तरीके से (अप्रकाशित डेटा) में translocon संलग्न है।

एस "> चित्र 2
चित्रा 2:।। न्यायपालिका translocon सगाई निम्नलिखित Deg1 -Sec62 की गिरावट के लिए मॉडल (ए) Deg1 -Sec62 Deg1 (MATα2 से एमिनो टर्मिनल 67 अमीनो एसिड) के योजनाबद्ध चित्रण चिह्नित करके, अनुक्रम में, पीछा किया जाता है (एफ) मिलान 2-ट्रांसमेम्ब्रेन endoplasmic जालिका (ईआर) प्रोटीन Sec62, और एस की दो प्रतियां ऑरियस के एक प्रोटीन (प्रा)। स्पष्टता के लिए, संलयन प्रोटीन Deg1 -Sec62। (बी) ईआर झिल्ली में अपने दो ट्रांसमेम्ब्रेन खंडों के सामान्य प्रविष्टि के रूप में निम्नलिखित में जाना जाता है, translocon साथ Deg1 -Sec62 की लगातार बातचीत असामान्य चलाता है, Deg1 निर्भर translocon सगाई। शुरू में साइटोसोलिक एमिनो टर्मिनल पूंछ के एक हिस्से को aberrantly भीतर-translocon रहता संभावना में प्रवेश करती है और। (सी) असामान्य translocon engagemen के बादटी, Hrd1 पहचानता है और Deg1 -Sec62 ubiquitylates। लाल हलकों ubiquitin अणुओं से संकेत मिलता है। (डी) Deg1 -Sec62 तो संभावना translocon बाधा से राहत, Proteasome द्वारा ईआर झिल्ली से निकाला जाता है और अपमानित किया जाता है।

चित्र तीन
चित्रा 3:। न्यायपालिका translocon सगाई निम्नलिखित Deg1 -Sec62-HIS3 के योजनाबद्ध चित्रण Deg1 ध्वज (एफ) मिलान करके, अनुक्रम में, पीछा किया जाता है, दो-ट्रांसमेम्ब्रेन ईआर प्रोटीन Sec62, एस की दो प्रतियां ऑरियस के एक प्रोटीन (प्रा), और खमीर HIS3 एंजाइम। स्पष्टता के लिए, संलयन प्रोटीन Deg1 -Sec62-HIS3 के रूप में जाना जाता है।

चित्रा 4
चित्रा 4: Deg1 को HIS3 Fusing Deg1 -Sec62-HIS3 एन्कोडिंग एक प्लाज्मिड के साथ बदल जंगली प्रकार (HRD1) और hrd1Δ खमीर के धारावाहिक dilutions मध्यम कमी नियासिन, मध्यम कमी tryptophan और हिस्टडीन पर देखा गया , और साथ पूरक tryptophan और हिस्टडीन कमी मध्यम 3-एमिनो 1H-1,2,3-triazole (3) में, HIS3 की एक प्रतिस्पर्धी अवरोध करनेवाला, संकेत दिया सांद्रता में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 5
चित्रा 5:। Hrd1 कमी कोशिकाओं में Deg1 -Sec62 और Deg1 -Sec62-HIS3 का बढ़ता बहुतायत प्रोटीन अर्क जंगली प्रकार (+) और hrd1Δ से तैयार किए गए(Δ) Deg1 -Sec62 या Deg1 -Sec62-HIS3 व्यक्त खमीर। प्रोटीन (0.125 आयुध डिपो के 600 इकाइयों के समकक्ष) पश्चिमी सीधे संलयन प्रोटीन के एक प्रोटीन epitopes जो बाँध खरगोश विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सोख्ता द्वारा पीछा किया, एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे। Pgk1 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ बाद में पश्चिमी सोख्ता एक लोडिंग नियंत्रण प्रदान करता है।

समाधान अवयव कमेंट्स
सिंथेटिक परिभाषित (एसडी) मिनिमल खमीर मध्यम 2% डेक्सट्रोज, अमीनो एसिड के बिना 0.67% खमीर नाइट्रोजन बेस के साथ, 0.002% एडिनाइन, 0.004% uracil, 0.002% arginine, 0.001% हिस्टडीन, 0.006% isoleucine, 0.006% leucine, 0.004% लाइसिन, 0.001% मेथिओनिन, 0.006% फेनिलएलनिन, 0.005 % threonine, 0.004% ट्रिप्टोफान। ठोस (प्लेट) मध्यम के लिए, 2% अगर शामिल हैं। 1. चयनात्मक मध्यम एपी omitting द्वारा तैयार किया जाता हैpropriate अमीनो एसिड (s) या नाइट्रोजन कुर्सियां।
इस प्रकार के रूप सुविधा के लिए 2. इन अवयवों केंद्रित शेयर समाधान के रूप में बनाए रखा जा सकता है। एमिनो एसिड सभी वांछित अमीनो एसिड से युक्त 100X शेयर समाधान के रूप में बनाए रखा जा सकता है। खमीर नाइट्रोजन बेस एक 20X शेयर समाधान (13.4%) में बनाए रखा जा सकता है। डेक्सट्रोज एक 40% शेयर समाधान में बनाए रखा जा सकता है। एडिनाइन और uracil 0.1 एम NaOH में 1% शेयर समाधान के रूप में बनाए रखा जा सकता है।
3. autoclaving द्वारा मध्यम जीवाणुरहित।
1X Laemmli नमूना बफर 2% एसडीएस, 10% ग्लिसरॉल, 5% β-mercaptoethanol, 60 मिमी Tris एचसीएल पीएच 6.8, नीले 0.008% bromophenol 1. 1X नमूना बफर अक्सर एक अधिक ध्यान केंद्रित किया है (जैसे 5x) शेयर गिराए द्वारा तैयार किया जाता है।
2. डाई bromophenol नीले वांछित तीव्रता करने के लिए जोड़ा जा सकता है। एक "चुटकी" (एक रंग के किनारे से टेप बहुत छोटी राशि) आम तौर पर पर्याप्त है।
0.2 एम सोडियम हीड्राकसीड पानी में तैयार करें। सोडियम हाइड्रोक्साइड गिलास के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। इसलिए, लंबी अवधि के भंडारण के लिए, 0.2 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड प्लास्टिक के कंटेनर में रखा जाना चाहिए।
Laemmli चल बफर (5x) 125 मिमी Tris, 960 मिमी ग्लाइसिन, 0.5% एसडीएस DH 2 हे में 5: चल बफर 1X Laemmli की एक एल तैयार करने के लिए, एक पतला
Tris एसीटेट एसडीएस स्थानांतरण बफर (5x) 125 मिमी Tris एसीटेट (पीएच 8.8), 960 मिमी ग्लाइसिन, 0.05% एसडीएस , बफर स्थानांतरण 1X Tris एसीटेट एसडीएस के 20 एल को तैयार 5X शेयर के 4 एल, मेथनॉल के 4 एल, और DH 2 हे के 12 एल गठबंधन करने के लिए
10X खारा (टीबीएस) Tris बफर 500 मिमी Tris, 1.5 एम NaCl; पीएच 7.5 करने के लिए समायोजित 1X टीबीएस की एक एल तैयार करते हैं, DH 2 ओ में 01:10 पतला 1X टीबीएस के रूप में उपयुक्त डिटर्जेंट बीच 20 और पाउडर दूध स्किम, साथ पूरक हो सकता है।
तालिका 1: इस अध्ययन में इस्तेमाल समाधान और buffers।

<टीडी> leu2-3,112
तनाव का नाम उपनाम प्रासंगिक जीनोटाइप आंकड़े स्रोत
VJY6 MHY500 माता 4 और 5 चेन एट अल।, 1993
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
VJY10 माता 4 और 5 यह अध्ययन
his3- Δ 200
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
hrd1 :: kanMX4

तालिका 2:। खमीर इस अध्ययन में इस्तेमाल उपभेदों निर्माण का विवरण अनुरोध पर उपलब्ध हैं।

प्लास्मिड संख्या पूर्ण प्लाज्मिड नाम आकृति स्रोत
pVJ30 pRS414-पी MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA 5 Rubenstein एट अल।, 2012
pVJ121 pRS414-पी MET25 (MET25 प्रमोटर के साथ खाली वेक्टर) 4 Mumberg एट अल।, 1994
pVJ467 pRS414-पी MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-HIS3 5 यह अध्ययन
pVJ477 pRS414-पी GAL4 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-HIS3 4 यह अध्ययन

तालिका 3:। इस अध्ययन में इस्तेमाल प्लास्मिड सभी प्लास्मिड खमीर कोशिकाओं में प्रतिकृति, खमीर कोशिकाओं में चयन के लिए TRP1 जीन अनुमति देने के लिए एक खमीर गुणसूत्रबिंदु होते ध्यान दें कि, और बैक्टीरियल कोशिकाओं में रखरखाव के लिए AmpR जीन। प्लास्मिड नक्शे, दृश्यों, और निर्माण के विवरण के अनुरोध पर उपलब्ध हैं।

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत पद्धति तेजी से दृढ़ संकल्प और खमीर कोशिकाओं में प्रोटीन गिरावट के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं के जैव रासायनिक पुष्टि करने के लिए अनुमति देता है। इन प्रयोगों () (जैसे 41-44, हैंडलिंग, भंडारण, और खमीर कोशिकाओं जोड़ तोड़ के लिए प्रोटोकॉल के खमीर जीव विज्ञान के कई उत्कृष्ट समीक्षा और संकलन जीव के लिए नए जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं) उपयोगिता और शक्ति खमीर का एक मॉडल यूकेरियोटिक जीव के रूप में प्रकाश डाला। तकनीक आसानी से प्रोटीन की कक्षाओं की एक किस्म की गिरावट और बहुतायत जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, दूसरों को अस्थिर साइटोसोलिक, परमाणु, और ईआर luminal और transmembrane प्रोटीन 45-49 की गिरावट तंत्र चिह्नित करने के लिए इस रणनीति कार्यरत है।

कुछ कारकों एक अस्थिर प्रोटीन को फ्यूज करने के लिए चयापचय एंजाइम के चुनाव में विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, यह जीन की एक कार्यात्मक संस्करण एंजाइम नहीं एन्कोडिंग जरूरी है किमेजबान जीनोम में उपस्थित हो। (अस्थिर प्रोटीन वास्तव में अपमानित जब चयनात्मक शर्तों के तहत यानी विकास) झूठी सकारात्मक परिणाम को कम से कम करने के लिए, यह रिपोर्टर जीन (अधिमानतः पूरा जीन विलोपन) 50 के उत्परिवर्ती alleles गैर लौटना बंदरगाह कि उपभेदों के साथ काम करने के लिए सिफारिश की है। संवाददाता एंजाइम के चयन के लिए एक और विचार पृष्ठभूमि वृद्धि को कम करने और परख तंगी को बढ़ाने के लिए चयनात्मक मध्यम विकास में शामिल किया जा सकता है, जो प्रतियोगी निरोधक, की उपलब्धता है। यह भी पूरी तरह से कार्यशील तंत्र गिरावट की उपस्थिति में अपेक्षाकृत कम कारोबार दरों के साथ प्रोटीन के मामलों में उपयोगी हो सकता है। यहाँ प्रस्तुत प्रतिनिधि प्रयोगों में, प्रतिस्पर्धात्मक रूप HIS3 एंजाइम को रोकता है जो 3-एटी, के शामिल किए जाने की पृष्ठभूमि वृद्धि 40 कम कर देता है। इसी तरह, यौगिक 6-azauracil Ura3, uracil जैवसंश्लेषण 51 के लिए आवश्यक एक एंजाइम को रोकता है। जो विकास में अवरोध करनेवाला एकाग्रता गिरावट डी में होता हैefective, लेकिन नहीं जंगली प्रकार, कोशिकाओं अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। कुछ चयापचय एंजाइमों भी खिलाफ जवाबी चुना जा सकता है। जवाबी चयनात्मक शर्तों के तहत, कोशिकाओं अस्थिर प्रोटीन अपमानित किया जाता है (और इनकार चयापचय एंजाइम मौजूद नहीं है) ही है जब विकसित हो सकता है। उदाहरण के लिए, Ura3 विषाक्त यौगिक, 5 fluorouracil 52 के लिए यौगिक 5-fluoroorotic एसिड (5-FOA) धर्मान्तरित। Ura3 संलयन प्रोटीन अपमानित किया जाता है अगर एक Ura3-संलयन प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं केवल 5-FOA की उपस्थिति में विकसित होगा। इसी तरह, यौगिक 5-fluoroanthranilic एसिड (5-एफएए) एक कार्यात्मक tryptophan के जैवसंश्लेषण मार्ग के साथ कोशिकाओं को विषैला होता है। 5-एफएए इस प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है Trp1-संलयन प्रोटीन 53 व्यक्त कोशिकाओं के लिए काउंटर का चयन करें। काउंटर चयन रणनीतियों गिरावट-आई परिवर्तन के दमन की पहचान के लिए उपयोगी हो सकता है।

एक गिरावट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल प्रमोटर भी ध्यान से चयनित किया जाना चाहिए। Biosynth के रूप में निम्न स्तरetic एंजाइमों exogenously आपूर्ति मेटाबोलाइट के अभाव में विकास का समर्थन करने के लिए पर्याप्त हो सकता है, एक कमजोर प्रमोटर 54 की सिफारिश की है। यहाँ प्रस्तुत प्रतिनिधि प्रयोगों में, ग्लूकोज 55 की उपस्थिति में दमित है जो GAL4 प्रमोटर, Deg1 -Sec62-HIS3 के प्रतिलेखन को बढ़ावा देने के लिए किया जाता है। गिरावट तंत्र निष्क्रिय किया जाता है जब - दमन शर्तों (यानी 2% ग्लूकोज) के तहत इस संलयन प्रोटीन के बेसल अभिव्यक्ति चयनात्मक शर्तों के तहत विकास का समर्थन करने के लिए पर्याप्त (2 मिमी 3-एटी हिस्टडीन और 1 की मौजूदगी की यानी अनुपस्थिति) है। चयनात्मक शर्तों पश्चिमी सोख्ता द्वारा पता लगाने की सीमा से नीचे जाने की संभावना के तहत हालांकि, पर्याप्त प्रोटीन का स्तर विकास का समर्थन करने के लिए। इसलिए, यह विकास परख के लिए एक कमजोर प्रमोटर और जैव रासायनिक पुष्टि करने के लिए एक मजबूत प्रमोटर के साथ अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए आवश्यक हो सकता है। (HIS3 फ्यूजन के साथ या बिना) Deg1 -Sec62, एक और अधिक robus के मामले मेंटी प्रमोटर (यहाँ, MET25 प्रमोटर 39) पश्चिमी विश्लेषण द्वारा प्रोटीन दृश्य के लिए आवश्यक है।

यहाँ वर्णित है, खमीर आधारित विकास परख एक छोटे पैमाने पर, उम्मीदवार आधारित दृष्टिकोण पर प्रदर्शन किया जा सकता है। खमीर कोशिकाओं के धारावाहिक dilutions एक 96 अच्छी तरह से थाली में तैयार किया और ठोस मध्यम विकास के लिए pipetting द्वारा स्थानांतरित कर रहे हैं; ठोस माध्यम पर पतला खमीर सेल निलंबन के कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हस्तांतरण के लिए एक वैकल्पिक तरीका आमतौर पर एक "Frogger" 56 के रूप में संदर्भित एक बहु-पिन प्रतिलिपिकार का उपयोग करते हैं, है। आदर्श समय प्लेटें खमीर उपभेदों और शर्तों के साथ अलग-अलग होगा तस्वीर करने के लिए। यह सबसे तेजी से बढ़ती संस्कृति से कालोनियों पहले सबसे पतला स्थान पर दिखाई देने लगते हैं, जब एक दिया प्लेट तस्वीर करने के लिए सिफारिश की है। यह आम तौर पर नमूने के बीच विकास दर में अंतर सबसे स्पष्ट कर रहे हैं, जिस पर बिंदु है। यह विशेष रूप से खमीर के मामले में, कई दिनों पर तस्वीरें लेने के लिए सलाह दी जा सकतीविकास दर की एक विस्तृत श्रृंखला का प्रदर्शन।

बड़े पैमाने पर विश्लेषण के लिए विकास आधारित संवाददाता परख भी अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक गिरावट संवाददाता सिंथेटिक जेनेटिक ऐरे (SGA) तकनीक 46,57 का उपयोग कर ~ 5000 व्यवहार्य अगुणित खमीर जीन विलोपन उपभेदों के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुस्तकालय में पेश किया जा सकता है। इस तकनीक में, एक chromosomally एकीकृत चयापचय संवाददाता संलयन प्रोटीन के साथ एक अगुणित खमीर तनाव जीन विलोपन पुस्तकालय के प्रत्येक तनाव के लिए mated है। परिणामी द्विगुणित कोशिकाओं sporulate करने के लिए प्रेरित किया (अर्धसूत्रीविभाजन गुजरना) और अगुणित meiotic संतान चयापचय रिपोर्टर और व्यक्तिगत जीन विलोपन दोनों को शरण देने के लिए चयन किया जाता है। इन उपभेदों तो प्रोटीन स्थिर हो गई है जिसमें कोशिकाओं के लिए मध्यम चयनात्मक करने के लिए सामूहिक रूप से स्थानांतरित कर रहे हैं। छोटे पैमाने पर विश्लेषण के लिए के रूप में प्रोटीन गिरावट में एक भूमिका के साथ एक जीन हटा दिया जाता है, तो, संलयन प्रोटीन स्थिर हो जाएगा, और सेल के विकास बढ़ाया जाएगा। तुलनीयpproaches अतिरिक्त chromosomally बनाए रखा plasmids के साथ उपभेदों का एक बड़ा संग्रह का एक साथ परिवर्तन के लिए अनुमति देते हैं कि तैयार किया गया है; इस रणनीति के गुणसूत्र एकीकरण, संभोग, sporulation, और meiotic चयन 54 obviates।

एक उत्परिवर्तन कोशिकाओं एक चयापचय रिपोर्टर को शरण देने के लिए एक विकास लाभ प्रदान करने के लिए मिला है, यह biochemically उत्परिवर्तन ब्याज की प्रोटीन की प्रचुरता बढ़ जाती है कि पुष्टि करने के लिए आवश्यक है। बारीकी से Kuhsnirov 31 की विधि से अनुकूलित एक तेजी से और विश्वसनीय खमीर सेल प्रक्रिया, प्रस्तुत किया है। इस प्रोटोकॉल पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण के लिए सीधे उपयुक्त एक फार्म में प्रोटीन की निकासी के लिए अनुमति देता है। एक दिया प्रोटीन का विश्लेषण के लिए, lysate के राशि खैर, acrylamide जेल गुण, झिल्ली, उसका इस्तेमाल किया एंटीबॉडी और dilutions के लिए, और पता लगाने की विधि की पसंद अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए प्रति लोड करने के लिए। प्रतिनिधि पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल केन्द्र शासित प्रदेशों में वर्णितफ्लोरोसेंट रंगों संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी ilizes; अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल एंटीबॉडी संयुग्मित एंजाइमों 58 पर निर्भर chemiluminescence पर भरोसा करते हैं। यहाँ वर्णित है, ब्याज की प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया झिल्ली सीधे एक लोडिंग नियंत्रण प्रोटीन के लिए एक एंटीबॉडी के साथ reprobed जा सकता है। ब्याज और लदान नियंत्रण प्रोटीन की प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जाता प्राथमिक एंटीबॉडी एक ही प्रजाति से उठाया गया है, झिल्ली reprobing के रूप में लंबे समय से इन प्रोटीनों से उत्पन्न होने वाले बैंड सह विस्थापित नहीं कर के रूप में संभव है। , हालांकि, ब्याज और लदान नियंत्रण प्रोटीन की प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जाता प्राथमिक एंटीबॉडी विभिन्न प्रजातियों में से उठाया गया है तो माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ fluorophores संयुग्मित किया गया है, तो एक ही झिल्ली क्रमिक रूप से, यहां तक ​​कि बैंड के सह-माइग्रेट, तो जांच की जा सकती है अलग उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य। मामले में ब्याज और लदान नियंत्रण प्रोटीन सह विस्थापित और संबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रोटीन राय से किया गया है किSED एक ही प्रजाति से नमूने, PVDF झिल्ली को हस्तांतरित कर दो एसडीएस पृष्ठ जैल, पर हल किया जा सकता है, और ब्याज और लदान नियंत्रण प्रोटीन की प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ अलग से जांच की। वैकल्पिक रूप से, लोड हो रहा स्थिरता गैर विशिष्ट प्रोटीन दाग (जैसे Coomassie या रक्तवर्ण रंग एस) के साथ झिल्ली incubating द्वारा न्याय किया जा सकता है। ठेठ है के रूप में आगे, प्रतिनिधि पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के अनुक्रमिक ऊष्मायन से पता चला है कि एक प्रोटीन या मिलान हो जाती है। प्रतिनिधि परिणाम में विश्लेषण संलयन प्रोटीन (आंकड़े 2 और 3 में पीआरए) स्ताफ्य्लोकोच्चुस एक प्रोटीन से निकाली गई दो epitopes होते हैं। प्रोटीन एक स्तनधारी इम्युनोग्लोबुलिन को सीधे बांधता है और इसलिए अकेले (कोई प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन कदम आवश्यक है यानी) 59 माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है। यह एक पत्रकार के एंजाइम की संलयन प्रोटीन बहुतायत को प्रभावित कर सकते हैं या संभव है किगिरावट। यह biochemically संवाददाता प्रोटीन द्वारा अभारग्रस्त सब्सट्रेट के एक संस्करण का उपयोग कर परिणामों की पुष्टि करने के लिए इसलिए उचित है। अंत में, यहाँ वर्णित दोनों assays के प्रोटीन स्थिरता में मतभेद के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में स्थिर राज्य प्रोटीन के स्तर में अंतर पर भरोसा करते हैं। प्रोटीन बहुतायत प्रोटीन संश्लेषण और गिरावट, आगे जैव रासायनिक विश्लेषण (जैसे cycloheximide पीछा या नाड़ी पीछा प्रयोगों) की दरों के एकीकरण को दर्शाता है क्योंकि सीधे एक प्रोटीन के गतिशील गिरावट प्रोफाइल विश्लेषण करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए।

प्रतिनिधि परिणाम aberrantly ईआर translocon संलग्न है कि एक प्रोटीन की गिरावट के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं के निर्धारण के लिए इस प्रोटोकॉल के एक उपन्यास आवेदन की स्थापना। Deg1 -Sec62-HIS3 चयनात्मक शर्तों के तहत एक खमीर विकास फायदा प्रदत्त गिरावट मार्ग निष्क्रिय किया गया था जब (यानी में Hrd1 ubiquitin ligase के अभाव)। एक तेज और विश्वसनीय प्रोटीन पूर्वपश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा कर्षण विधि Hrd1 के अभाव में (HIS3 के साथ या बिना) Deg1 -Sec62 की बहुतायत में वृद्धि की पुष्टि की। पिछले अध्ययनों translocon जुड़े प्रोटीन की Hrd1 निर्भर गिरावट के तंत्र अन्य Hrd1 ईआर luminal या ट्रांसमेम्ब्रेन substrates के 32 के उन लोगों से अलग है कि संकेत मिलता है। भविष्य के काम के इस अनूठे गिरावट तंत्र के लिए आवश्यक उपन्यास जीन की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन में Deg1 -Sec62-HIS3 संलयन प्रोटीन को रोजगार देगा।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम एक सहायक और उत्साही अनुसंधान के माहौल प्रदान करने के लिए Rubenstein प्रयोगशाला के वर्तमान और पूर्व सदस्यों को धन्यवाद। हम प्रोटोकॉल अनुकूलन में सहायता के लिए रयान टी गिब्सन धन्यवाद। हम खमीर उपभेदों और प्लास्मिड के लिए मार्क Hochstrasser (येल विश्वविद्यालय) और डीटर वुल्फ (यूनिवर्सिटैट स्टटगार्ट) धन्यवाद। हम इस पांडुलिपि की स्पष्टता और उपयोगिता में सुधार करने में उनकी मदद के लिए हमारे गुमनाम समीक्षक धन्यवाद। इस काम SGW को सिग्मा ग्यारहवीं की गेंद राज्य विश्वविद्यालय अध्याय से एक अनुसंधान पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था, गेंद राज्य विश्वविद्यालय से एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के संस्थानों (R15 GM111713) EMR के लिए, ईएमआर को एक गेंद राज्य विश्वविद्यालय की ख्वाहिश अनुसंधान पुरस्कार, और धन प्रोवोस्ट के कार्यालय और जीवविज्ञान विभाग।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole Fisher Scientific AC264571000 Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) Roche 11088726001 May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped Sarstedt 82.1581.001 Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl Gilson F14401 Available from a variety of manufacturers
 
 
 

 
Name Company Catalog Number Comments
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl Gilson F14403 Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216 Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.
Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) Bio-Rad 170-8195 A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater Fisher Scientific 1172011AQ Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

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References

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  3. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
  4. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
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आण्विक जीवविज्ञान अंक 96 Ubiquitin-Proteasome प्रणाली, खमीर विकास परख प्रोटीन के अर्क पश्चिमी सोख्ता खमीर आनुवंशिकी म्यूटेंट endoplasmic जालिका जुड़े गिरावट नवोदित प्रोटीन गिरावट
ग्रोथ आधारित निर्धारण और प्रोटीन गिरावट के लिए जेनेटिक आवश्यकताएँ की बायोकेमिकल पुष्टि में<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
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Watts, S. G., Crowder, J. J.,… More

Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (96), e52428, doi:10.3791/52428 (2015).

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