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Biology

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/52428
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital
* These authors contributed equally

Abstract

安定化されたタンパク質分解は、事実上すべての細胞機能のために重要である。真核生物のタンパク質分解のための分子機構と遺伝的要件について知られていることの多くは、最初は出芽酵母に設立されました。タンパク質分解の古典の分析は、生化学的なパルスチェイスとシクロヘキシミドチェイスの方法論に依存してきた。これらの技術は、タンパク質の分解を観察するための高感度の方法を提供するが、それらは、面倒で時間がかかり、低スループットである。これらのアプローチは、タンパク質の分解を防ぐ変異についての迅速なまたは大規模なスクリーニングに適していない。ここでは、タンパク質分解のための遺伝的要件の容易な同定のための酵母の増殖に基づくアッセイが記載されている。このアッセイでは、特定の選択条件下で増殖に必要なレポーター酵素は不安定なタンパク質に融合される。細胞の内因性レポーター酵素を欠いているが、融合タンパク質を発現するセレ下で成長することができ融合タンパク質が安定化されるだけctive条件（ すなわちタンパク質分解が損なわれている場合）。ここに記載の増殖アッセイにおいて、野生型および融合タンパク質をコードするプラスミドを有する変異体酵母細胞の段階希釈物を選択的および非選択培地上にスポットされる。選択条件下で成長が所定の変異による分解障害と一致する。増加したタンパク質存在量は、生化学的に確認すべきである。電気泳動及びウエスタンブロッティングに適した形態の酵母タンパク質の迅速な抽出のための方法も示されている。生化学分析のためのタンパク質抽出のための単純なプロトコルと組み合わせたタンパク質の安定性のための成長ベースの読み出しは、タンパク質分解のための遺伝的要件の迅速な同定を容易にします。これらの技術は、短命の種々のタンパク質の分解を監視するように適合させることができる。示した例では、ヒスチジン生合成に必要とされるのHis3酵素は、融合したそれが異常に小胞体トランスロコンに係合後にDeg1に-Sec62。Deg1 -Sec62は分解の標的とされている。 Deg1 -Sec62-のHis3を保有する細胞は、タンパク質が安定した時に選択的条件下で増殖することができた。

Introduction

選択的なタンパク質分解は、真核生物の生活のために不可欠であり、変化したタンパク質分解は、数種類の癌、神経変性疾患、心血管疾患、および嚢胞性線維症1-5を含む医学的状態の数に寄与する。選択的なタンパク質分解を触媒するユビキチン-プロテアソーム系（UPS）は、これらの条件6-10のための新たな治療標的である。ユビキチンリガーゼは共有結合したタンパク質11に76アミノ酸ユビキチンのポリマーを添付してください。ポリユビキチン鎖でマークされたタンパク質は、12プロテアソーム 〜2.5メガダルトン26Sによって認識され、タンパク質分解されている。モデル真核生物サッカロミセス·セレビシエ （出芽酵母）で開始研究は、真核細胞におけるタンパク質分解メカニズムの解明における基礎となっている。 UPSの最初の実証生理的基質は、酵母転写抑制因子MATα213だった、UPSの14、および多くの高度に保存されたコンポーネントは、最初に同定されたか（ 例えば 15-26）酵母特徴。この汎用性と遺伝的に扱いやすいモデル生物で行われた発見は、ユビキチン媒介分解の保存されたメカニズムに重要な洞察を提供し続ける可能性が高い。

認識とほとんどのUPSの基質の分解は、複数のタンパク質の協調行動が必要です。したがって、与えられた不安定なタンパク質の調節された劣化を特徴付ける重要な目標は、タンパク質分解のための遺伝的要件を決定することです。哺乳動物または酵母細胞におけるタンパク質分解を監視するための古典的なアプローチ（ 例えば 、パルスチェイスとシクロヘキシミドチェイス実験27）は、面倒で時間がかかる。方法のこれらのタイプのタンパク質分解を検出するための高感度の手段を提供するが、それらは、タンパク質分解または大規模screeniの迅速な分析には適していないタンパク質分解を防ぐ突然変異についてngの。ここでは、不安定なタンパク質の分解のための遺伝的要件の迅速な同定のための酵母増殖に基​​づくアッセイが提示されている。

タンパク質分解を分析するための酵母の増殖に基づく方法では、対象（または劣化信号）の不安定なタンパク質は、特定の状況下での酵母の増殖に必要とされるタンパク質を、インフレームで融合されている。結果は、関心のある不安定なタンパク質のタンパク質分解の遺伝的要件を決定するための強力なツールとして機能することができる人工的な基質である。好都合なことに、最も一般的に使用される実験室酵母株は、特定のアミノ酸または窒素含有塩基（ 例えば、20,28-30）の生合成に関与する代謝酵素をコードする遺伝子における変異のパネルを保有する。これらの酵素は、合成酵素が参加する中で、外因的に提供代謝物の非存在下での細胞増殖のために必須である。このような代謝酵素は、従って、それらが融合されるため、不安定なタンパク質の分解のための増殖に基づくレポーターとして機能することができる。タンパク質分解を防ぐ変異が劣化レポーターを有する細胞が選択的条件下で成長することができますので、タンパク質分解のための遺伝的要件は容易に解明することができます。

増殖の利点は、特定の変異が、目的のタンパク質の存在量を増加させる間接的な指標である。しかし、直接生化学分析は、変異が増加したタンパク質のレベルを介してではなく、間接的または人為的な原因を経由して成長を可能することを確認する必要がある。タンパク質存在量における変異の効果を行い、特定の変異を保有しない細胞における定常状態タンパク質レベルのウェスタンブロット分析によって確認することができる。適した形態の酵母タンパク質（水酸化ナトリウムおよびサンプル緩衝液を用いて酵母細胞の逐次インキュベーション）の迅速かつ効率的に抽出するための方法ウェスタンブロッティングによる分析のためにも31を提示する。一緒に、これらの実験は、タンパク質分解の候補調節因子の迅速な同定を容易にする。

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Protocol

タンパク質分解に欠陥候補突然変異体を同定する1.酵母増殖アッセイ

  1. レポーター代謝酵素と、フレームで融合された不安定なタンパク質をコードするプラスミドを、野生型および突然変異体酵母細胞を形質転換する。
  2. プラスミド分子を保有する細胞に対して選択的である合成に定義（SD）最小培地5ml中の形質転換体を接種する。回転、30℃で一晩インキュベートする。
  3. 各一晩培養物を600nm（OD 600）での光学密度を測定します。
    注：一晩のインキュベーション後、培養中の細胞のいずれか、対数または定常増殖期にあってもよいが、0.2の最小限のOD 600に達している必要があります。経験的に決定されるような非常に成長の遅い酵母株は、1晩、または細胞のより多くの接種より長いインキュベーション時間が必要な場合があります。
  4. に希釈した細胞をはじめとする無菌の96ウェルプレート中で形質転換された酵母細胞の六倍連続希釈液を調製するN OD 0.2の600。 96ウェルプレート内の異なる行でアッセイされる各酵母形質転換体を配置します。
    1. 各形質転換のために、200μlの最終容量で0.2のOD 600に細胞を希釈するために必要な一晩培養の体積を計算。コラム1に対応するウェルに一晩培養のこのボリュームを追加200μlにボリュームをもたらすために滅菌水の適切な量を追加します。
    2. 酵母の各行について、列2、3、および4のウェルに滅菌水125μlを添加する。
      注：個別に包装された無菌の96ウェルプレートは、滅菌蓋でパッケージされてもよい。蓋は、このステップで配布され、滅菌水のリザーバとして使用することができる。これはマルチチャンネルピペッターに与えられた列のすべてのウェルに滅菌水の同時転送を可能にする。
    3. ピによってマルチチャンネルピ ​​ペッターを下の最初の列（OD 0.2の600に希釈した酵母）の内容を混ぜる。
    4. TRANSFマルチチャンネルピペッターを使用して列2に列1から酵母25μlの、えー。ピペッティングにより混和する。転送列3の列2から25μL、列3から列4に25μL（各ステップでよく混合）。
  5. マルチチャンネルピペッターで各サンプルを混ぜる。最も希薄から出発すると、少なくとも適切な選択培地を含む2プレートに酵母、ピペット各サンプルの4μlの列を希釈する。プラスミド選択を（このプレートは酵母スポッティングと成長制御となります）維持培地で一つのプレートを使用してください。プラスミド維持とレポー​​ター酵素に融合された不安定なタンパク質の発現のために選択した媒体と第二のプレートを使用してください。酵母は、急速に沈降し、一定の間隔で上下にピペッティングして細胞を混ぜているため。
    注：乾燥機のプレートをより容易に、新たに調製したプレートよりも液体吸収し、したがって、これらの実験のために推奨されている。湿ったプレートを見よ中、室温でインキュベートすることによって乾燥させることができる層流フード中で2日またはより短いインキュベーション - 1ワット湿度。層流ベンチに対して平行である場合、プレートを不均一に乾燥することができる。テンプレートの使用は、簡単に正規の距離で酵母細胞を発見することができる。 2つのサンプルテンプレートが図1に提供される。これらは、印刷された切り出し、ペトリ皿の蓋の内側に取り付けることができる。
  6. プレートが作業台の上に乾燥することができます。
  7. 6日 - 2、30℃でプレートをインキュベートする。
  8. インキュベーション後に各プレートを撮影。

図1
100mmの寒天プレート上の酵母細胞をスポッティングするための図1のテンプレート。これらのテンプレートは、マルチチャンネルピ ​​ペッターを持つ通常の距離で酵母をスポッティング容易にすることができる。テンプレートは、印刷された切り出し、ペトリ皿の蓋の内側に取​​り付けることができる。成長にシャーレを置きテンプレートとメディア内部の蓋が固定された。テンプレートは、向きを追跡するためにノッチが付いています。これは、成長アッセイで使用したプレートは、同様に方向性を追跡するためにノッチでマークすることをお勧めします。 4（A）または5（B）酵母細胞の連続希釈が提供されてスポッティングためのテンプレート。 100 mmのテンプレートと、この図の印刷可能バージョンを表示するには、こちらをクリックしてください。

酵母増殖アッセイの2生化学確認

  1. 酵母細胞およびポストアルカリ性タンパク質抽出の成長（31から変更）
    1. 不安定なタンパク質をコードするプラスミドを、野生型および突然変異体酵母細胞を形質転換する。
    2. プラスミド分子を保有する細胞に選択的であるSD培地5ml中で形質転換体を接種する。回転、30℃で一晩インキュベートする。
    3. 各一晩、CuのOD 600を測定しますlture。
      注：一晩のインキュベーション後に、細胞を、対数または定常増殖期にあってもよいが、0.2 10ミリリットルで新鮮な選択培地（ステップ2.1.4）のOD 600に希釈を可能にするOD 600に達している必要があります。経験的に決定されるような非常に成長の遅い酵母株は、1晩、または細胞のより多くの接種より長いインキュベーション時間が必要な場合があります。
    4. 0.2mlの10の新鮮な選択培地のOD 600に酵母細胞を希釈する。
    5. （中期対数増殖しているIE）培養物は0.8と1.2の間のOD 600に到達するまで、回転または振盪、30℃で細胞をインキュベートし続けます。
      注：関心のある不安定なタンパク質は、調節可能なプロモーターの制御下にある場合には、タンパク質の発現および細胞収穫の誘導の最適なタイミングは、以前の研究又は経験的観察に応じて変化し得る。
    6. 15 mlの円錐での培養の2.5 OD 600単位を収集室温で5分間、5000×gでの遠心分離によってらチューブ。ペッティングまたは吸引により上清を除去します。
      注：One OD 600単位を1.0のOD 600での培養液1ml中に存在する酵母の量として定義される。 V = 2.5 OD 600単位/測定OD 600：2.5のOD 600単位（V）を収穫するために必要な（ミリリットル）の培養物の容量は、以下の式を用いて決定することができる
    7. 1ミリリットル中に細胞を再懸濁し、水を蒸留した。マイクロ遠心チューブに懸濁した細胞を転送します。
    8. 室温で30秒間、6500×gでの遠心分離によって細胞をペレット。ペッティングまたは吸引により上清を除去します。
    9. 100μl中に細胞を再懸濁がダウンしているかボルテックスピペッティングして蒸留水を、そして100μl、0.2MのNaOHを追加します。ピペッティングにより混和する。室温で5分間、サンプルをインキュベートする。
    10. 18000 xでの遠心分離により細胞をペレット化（そのほとんどはまだタンパク質をリリースし、まだ生存しているしていない）5分間のグラム。ペッティングまたは吸引により上清を除去します。
    11. 上下にピペッティングまたはボルテックスによって、細胞を溶解します100μlの1×Laemmliサンプルバッファー、 - 50でペレットを再懸濁。
      NOTE：Laemmliサンプル緩衝液中で遠心分離し、細胞のその後の再懸濁以下アルカリ上清の除去はトリス - グリシンランニング緩衝系およびウェスタンブロッティングを使用して、ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）と互換性のpHでタンパク質を抽出する。
    12. 完全にタンパク質を変性させ、5分間95℃で溶解物をインキュベートする。
      注：95℃でインキュベートしたときに凝集しやすいタンパク質（いくつかの膜貫通セグメントを持つ例えば、タンパク質）が不溶性になることがあります。経験的にこのようなタンパク質の分析のために、決定されるように、30分- 10について-このため、溶解物は、より低い温度（70℃、 例えば 37℃）でインキュベートされるべきである。
    13. 氷上で5分間置くことによって溶解物を冷却する。
    14. 室温で1分間、18000×gで遠心分離溶解物の不溶性物質をペレット化する。事前のその後のウエスタンブロット分析（セクシ​​ョン2.2）に、SDS-PAGEにより上清（可溶化抽出したタンパク質）を分離。また、-20℃で保存溶解物。
  2. 代表ウェスタンブロッティングプロトコル
    1. SDS-PAGEゲルで溶解物の実験的に決定されたボリュームをロードします。
    2. 色素フロントがゲルの底に到達するまで200Vでゲルを実行します。
    3. 4℃で90分間 - 60 20 Vでウェット移送によりポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜にゲルからタンパク質を移す。
    4. 4℃で一晩、室温で1時間、揺動または、トリス緩衝生理食塩水（TBS）中の5％スキムミルク中でインキュベートすることによりブロック膜。
    5. ブロッキング溶液デカントします。
    6. 室温テで1時間、0.1％のTween-20（TBS / T）を含むTBS中の1％スキムミルク中の目的のタンパク質（またはそのエピトープタグ）に特異的な一次抗体で膜をインキュベートするmperature、ロッキング。
    7. 抗体溶液をデカントし、そして室温でTBS / Tで膜3×5分間洗浄し、ロッキング。
    8. ロッキング、室温で1時間、TBS / T中の1％スキムミルク中の適切なフルオロフォア結合二次抗体で膜をインキュベートする。
      注：蛍光団は光に敏感であるため、フォア標識抗体の希釈は暗闇の中で準備する必要があります。さらに、フォア標識抗体の存在下での膜のインキュベーションは、遮光容器内に発生する必要があります。これはアルミ箔でインキュベーショントレイをラップすることによって達成することができる。
    9. 抗体溶液をデカントし、そして室温でTBS / Tで膜3×5分間洗浄し、ロッキング。
    10. 製造業者の推奨に従って、LI-CORオデッセイCLxのを用いた膜と画像Studioソフトウェア（または同等の画像機器およびソフトウェア）の画像を取得する。
    11. 膜を画像化した後、ロード用の具体的な一次抗体で膜をインキュベートロッキング、室温で1時間、TBS / T中の1％スキムミルクで制御タンパク質る。
    12. 抗体溶液をデカントし、そして室温でTBS / Tで膜3×5分間洗浄し、ロッキング。
    13. ロッキング、室温で1時間、TBS / T中の1％スキムミルク中の適切なフルオロフォア結合二次抗体で膜をインキュベートする。
    14. 抗体溶液をデカントし、そして室温でTBS / Tで膜3×5分間洗浄し、ロッキング。
    15. 製造業者の推奨に従って、LI-CORオデッセイCLxのを用いた膜と画像Studioソフトウェア（または同等の画像機器およびソフトウェア）の画像を取得する。

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Representative Results

この方法論を説明するために、のHis3酵素はモデル小胞体（ER）関連分解のカルボキシ末端に融合されている（ERAD）基板、Deg1 -Sec62（ 図2A）Deg1 -Sec62-のHis3を作成する（ 図3） 。Deg1 -Sec62はロコンとの永続的な、異常な関連付けを次のターゲットとしているERAD基質の新規クラスの創立メンバーを表し、ER膜32-34間でタンパク質を移動するための主に担当チャンネル。このような不安定なタンパク質は、暫定的に基質（トランスロコン関連用）ERAD-Tと呼ばれています。以前の研究では、異常なロコン係合すると、Deg1 -Sec62がHRD1ユビキチンリガーゼ（ 図2B-D）32、34、35で分解の標的された、ことを示している。他のHRD1基質の分解に必要な因子がために不要であると思われる<em>のDeg1 -Sec62劣 ​​化、小説の劣化機構32を示唆している。結合が損なわ脂質および長期のトランスロコン関連付け、アポリポタンパク質Bの条件の下で、哺乳動物の低密度リポタンパク質のタンパク質成分は、関連する機構36~38によって分解されるようである。したがって、Deg1 -Sec62は医学的に関連するトランスロコン関連タンパク質の分解に有用なモデルを提供することができる。

染色体HIS3遺伝子を欠く野生型およびhrd1Δ酵母細胞は、空のベクターまたは39をコードするプラスミドDeg1 -Sec62-のHis3で形質転換し、選択培地（ 図4）上にスポットした。形質転換された酵母細胞の等しい数のプレートに移したことを確認するために、細胞を、（プラスミドを有する細胞を選択）、トリプトファンを欠くが、ヒスチジンを含む培地上にスポットした。同様の成長は、すべての形質転換された酵母細胞を観察した。Deg1 -Sec62-のHis3を発現する細胞は、融合タンパク質が安定化されるだけヒスチジンの非存在下で成長すると予想された（すなわち、ERAD-Tが損なわれている場合）。実際、Deg1 -Sec62-のHis3を表現hrd1Δ酵母は欠く培地トリプトファンおよびヒスチジンにDeg1 -Sec62-のHis3を表現する野生型細胞に増殖優位性を相対的に示した。しかし、ヒスチジンの不在下でのマーク融合タンパク質依存性増殖さえHRD1の存在下で観察された。アッセイのストリンジェンシーを増加させるために、欠く培地ヒスチジン、3-アミノ-1H-1,2,3-トリアゾール（3-AT）とのHis3酵素40の競合的阻害剤を補充した。 HRD1を発現する酵母は、1を添加した培地ヒスチジンを欠く上、非常に悪い育っ - 2mMの3-AT。 HRD1が削除されたとき、細胞増殖を回復した。かかわらず、HRD1の存在下または非存在下の全細胞3mMの劇的増殖を阻害し、濃度の3-ATを含める。これらのRES ultsはHRD1依存基質分解と一致する。

次に、発現するかまたはHRD1酵素を欠く酵母でDeg1 -Sec62-のHIS3タンパク質の定常状態の存在量は、直接試験した。ウェスタンブロット分析は、野生型細胞（ 図5）にhrd1Δ酵母相対匹敵Deg1 -Sec62-のHis3の増加とDeg1 -Sec62タンパク質を示した。これは、両方のタンパク質のレベルの調節にHRD1の役割を確認する。タンパク質が異常にERトランスロコン32に係合後にDeg1 -Sec62のHRD1依存性分解が進行する。重要なことは、Deg1 -Sec62-のHis3は異常にさらに具体的Deg1 -Sec62の劣化と、一般的にトランスロコン関連タンパク質の成長ベースのレポーターとしてDeg1 -Sec62-のHis3の使用を検証し、同様の方法（未発表データ）でトランスロコンに係合する。

S "> 図2
図2：異常なトランスロコンの関与以下Deg1 -Sec62の分解のためのモデル（A）Deg1 -Sec62 Deg1（MATα2からアミノ末端67アミノ酸）の概略図旗によって、順番に、続いている（F）エピトープ、2回膜貫通型小胞体（ER）タンパク質Sec62、及びS.の2つのコピーブドウ球菌プロテインA（PrAを）。明確にするために、融合タンパク質はDeg1 -Sec62。（B）は、ER膜に、その2つの膜貫通セグメントの正常な挿入の後と呼ばれ、トランスロコンとDeg1 -Sec62の永続的な相互作用は、異常なトリガ、Deg1依存ロコン係合。最初にサイトゾルアミノ末端尾部の一部が異常に内-ロコン残る可能性が入り、及び（C）の異常ロコンengagemen続いT、HRD1はDeg1 -Sec62を認識し、ubiquitylates。赤い円は、ユビキチン分子を示す。（D）Deg1 -Sec62次いで、ER膜から抽出され、おそらくトランスロコン閉塞を軽減する、プロテアソームによって分解される。

図3
図3：異常なトランスロコンの関与以下Deg1 -Sec62-のHis3の概略図 Deg1フラグ （F）エピトープによって、順番に、続いて、2回膜貫通型ERタンパク質Sec62、S.の2つのコピー黄色ブドウ球菌プロテインA（PRA）、および酵母のHIS3酵素。明確にするために、融合タンパク質は、Deg1 -Sec62-のHis3と呼ばれる。

図4
図4：Deg1にフュージングのHis3 Deg1 -Sec62-のHis3をコードするプラスミドで形質転換された野生型（HRD1）とhrd1Δ酵母の連続希釈を欠く培地トリプトファン、欠く培地トリプトファンおよびヒスチジン上にスポットした、および補充したトリプトファン及びヒスチジンを欠く培地3-アミノ1H-1,2,3-トリアゾール（3-AT）、のHis3の競合的阻害剤、示された濃度で。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図5
図5：HRD1を欠く細胞にDeg1 -Sec62とDeg1 -Sec62-のHis3を豊富に増加したタンパク質抽出物を、野生型（+）から調製したとhrd1Δ。（Δ）Deg1 -Sec62またはDeg1 -Sec62-のHis3を発現する酵母。 （0.125 OD 600単位に相当）タンパク質は直接融合タンパク質のプロテインAのエピトープに結合ウサギ抗マウス二次抗体とのウェスタンブロッティングに続いて、SDS-PAGEにより分離した。 PGK1に特異的な抗体を用いたその後のウエスタンブロット法は、ローディングコントロールを提供します。

表1：本研究に用いられる溶液および緩衝剤。

ソリューションコンポーネント注釈
合成定義（SD）最小酵母ミディアムアミノ酸を含まない2％デキストロース、0.67％酵母窒素塩基、0.002％アデニン、0.004％ウラシル、0.002％アルギニン、0.001％のヒスチジン、0.006％のイソロイシン、0.006％ロイシン、0.004％のリジン、0.001％のメチオニン、0.006％のフェニルアラニン、0.005 ％のスレオニン、0.004％のトリプトファン。固体（プレート）中の場合は、2％の寒天を含む。 1.選択培地をapは省略することによって調製されるpropriateアミノ酸（単数または複数）または窒素含有塩基。
2.以下のようには、便宜上、これらの成分は、濃縮ストック溶液として維持することができる。アミノ酸は、全ての所望のアミノ酸を含む100Xストック溶液として維持することができる。酵母窒素塩基は、20Xストック溶液（13.4％）に維持することができる。デキストロース、40％ストック溶液中に維持することができる。アデニンおよびウラシルは0.1 M NaOH中の1％ストック溶液として維持することができる。
3.オートクレーブでメディアを滅菌する。
1X Laemmliサンプルバッファー 2％SDS、10％グリセロール、5％βメルカプトエタノール、0.008％ブロモフェノールブルー、60mMのトリス塩酸pH6.8で、 1. 1×サンプルバッファーは、多くの場合、より濃縮（例えば5×）ストックを希釈することによって調製される。
2.色素ブロモフェノールブルーは、所望の強度に加えてもよい。 「ピンチ」（へらの端からタップ微量）、典型的には十分である。
0.2 M水酸化ナトリウム水に準備します。水酸化ナトリウムは、ガラスと反応する。したがって、長期保存のために、0.2 M水酸化ナトリウムをプラスチック容器内に維持されるべきである。
レムリランニングバッファー（5X） 125 mMトリス、960 mMグリシン、0.5％SDS のdH 2 Oで5：ランニングバッファー1Xレムリの1リットルを製造するために、1を希釈
トリス酢酸-SDS転送バッファ（5X） 125mMのトリス酢酸（pHは8.8）、960 mMグリシン、0.05％SDS 1Xトリス酢酸-SDSの20 Lを用意するには、5倍の株式の4 L、メタノールの4 L、とのdH 2 Oの12 Lを組み合わせて、バッファの転送
10Xトリス緩衝食塩水（TBS） 500 mMトリス、1.5 MのNaCl。 pH7.5に調整 1X TBSの1リットルを製造するために、のdH 2 Oで1:10に希釈1X TBSは、必要に応じて界面活性剤のTween-20及び脱脂粉乳を補充することができる。
<TD> leu2-3,112
系統名エイリアス関連する遺伝子型統計ソース
VJY6 MHY500 のMATa 図4および図5 Chenら、1993
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
GAL2
VJY10 のMATa 図4および図5 この研究
his3-Δ200
ura3-52
lys2-801
trp1-1
GAL2
HRD1 :: kanMX4

表2：本研究で用いた酵母株構造の詳細は、リクエストに応じてご利用いただけます。

プラスミド数完全なプラスミド名前フィギュアソース
pVJ30 pRS414-P MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA 5 ルーベンシュタインら、2012
pVJ121 pRS414-P MET25（MET25プロモーターを有する空のベクター） 4 Mumbergら、1994
pVJ467 pRS414-P MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-のHis3 5 この研究
pVJ477 pRS414-P GAL4 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-のHis3 4 この研究

表3：本研究で使用したプラスミドは、全てのプラスミドは、酵母細胞、酵母細胞における選択のためのTRP1遺伝子 、および細菌細胞における維持のためのampR遺伝子における複製を可能にするために、酵母セントロメアを含むことに留意されたい。プラスミドマップ、シーケンス、および構成の詳細はリクエストを承ります。

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Discussion

ここで紹介する方法は、迅速な決定と酵母細胞内のタンパク質分解のための遺伝的要件の生化学的に確認することができます。これらの実験は、モデル真核生物として酵母の有用性とパワーを強調（処理するための酵母生物学およびプロトコルのコンピレーションのいくつかの優れたレビューは、保管、および酵母細胞を操作する（ 例えば 41-44）生物に新たな研究者のために利用可能です）。技術は、容易にタンパク質のクラスの様々な分解および存在量を調査するために適用することができる。例えば、他のものは不安定な細胞質ゾル、核、およびER内腔と貫通タンパク質45-49の劣化メカニズムを特徴づけるためにこの戦略を採用している。

いくつかの要因が不安定なタンパク質に融合するために、代謝酵素の選択において考慮されなければならない。まず、遺伝子の機能的バージョンはない酵素をコードすることが必須である宿主ゲノム中に存在する。 （不安定なタンパク質が実際に分解されるとき、選択的条件下すなわち成長）偽陽性の結果を最小限にするためには、レポーター遺伝子の非復帰変異対立遺伝子（好ましくは、完全な遺伝子欠失）50を保有する菌株で動作することをお勧めします。レポーター酵素の選択のための別の考慮事項は、バックグラウンドの成長を減少させ、アッセイのストリンジェンシーを高めるために選択増殖培地中に含めることができる競合的阻害剤の利用可能性である。これも完全に機能劣化メカニズムの存在下で比較的低い回転率を有するタンパク質の場合に有用であり得る。ここで紹介する代表的な実験では、競争のHIS3酵素を阻害する3-AT、を含むことは、バックグラウンドの成長40を低減します。同様に、化合物6-アザウラシルは、URA3、ウラシル生合成51に必要な酵素を阻害する。成長が劣化-dの中に生じるインヒビター濃度プライバシー侵害ではなく、野生型は、細胞が経験的に決定されなければならない。いくつかの代謝酵素はまたに対して反選択することができる。対抗選択条件下で、細胞は、不安定なタンパク質が分解される（溶融代謝酵素が存在しない）場合にのみ成長することができる。例えばUra3遺伝子は、毒性化合物、5-フルオロウラシル52の化合物5-フルオロオロチン酸（5-FOA）に変換する。のUra3融合タンパク質が分解される場合のUra3融合タンパク質を発現する細胞は5-FOAの存在下で成長する。同様に、化合物5- fluoroanthranilic酸（5-FAA）は、機能トリプトファン生合成経路を有する細胞に対して毒性である。 5-FAAは、このように使用することができるTRP1融合タンパク質53を発現する細胞を、カウンターを選択。対抗選択戦略が劣化-損なう突然変異の抑制因子を同定するために有用であり得る。

劣化レポーターの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、また慎重に選択しなければならない。 biosynthの低レベルとして、ETIC酵素は外因的に供給代謝物の非存在下での成長をサポートするのに十分であり、弱いプロモーターは54を推奨します。ここに提示代表的な実験では、グルコース55の存在下で抑制されるGAL4プロモーター、Deg1 -Sec62-のHis3の転写を促進するために使用される。劣化メカニズムが無効になっている場合-抑制条件（ すなわち 、2％グルコース）下で、この融合タンパク質の基底発現は、選択条件下での増殖を支持するのに十分な（2mMの3-ATヒスチジンと1の存在、すなわち不在）である。しかし、選択条件下での成長を支持するのに十分なタンパク質レベルをウェスタンブロッティングによる検出の閾値より下である可能性が高い。したがって、増殖アッセイのために、弱いプロモーターおよび生化学的確認のために強力なプロモーターで発現を駆動するために必要であり得る。 （のHIS3融合の有無にかかわらず）Deg1 -Sec62、よりrobusの場合トンプロモーター（ここで、MET25プロモーター 39）は 、ウェスタン分析によってタンパク質の可視化のために必要とされる。

ここで説明したように、酵母ベースの増殖アッセイは、小規模、候補ベースのアプローチを行ってもよい。酵母細胞の連続希釈を、96ウェルプレート中で調製し、固体増殖培地にピペッティングすることによって転送される。固体培地上に希釈された酵母細胞懸濁液の効率的かつ再現可能な転送のための別の方法は、一般に「フロッガー」56と呼ばれる、多ピンレプリケーターの使用である。プレートを撮影するのに理想的な時間は、酵母株や条件によって異なります。これは、最も急速に成長している培養物からコロニーが最初に最も希薄スポットに見えるようになる与えられたプレートを撮影することをお勧めします。これは、典型的には、試料間の成長速度の違いが最も明らかである点である。これは、特に酵母の場合には、複数の日に写真を撮ることが推奨される成長速度の広い範囲を示す。

増殖に基​​づくレポーターアッセイはまた、大規模な分析のために適合させることができる。例えば、分解レポーターは合成遺伝子アレイ（SGA）技術46,57を用い〜5000生存倍体酵母遺伝子欠失株の市販のライブラリーを導入してもよい。この技術では、染色体に組み込まれた代謝レポーター融合タンパク質と一倍体酵母株は、遺伝子欠失ライブラリーの各株と交配される。結果として得られる二倍体細胞は、胞子形成するように誘導する（減数分裂を起こす）と半数体減数分裂の子孫は、代謝レポーターおよび個々の遺伝子欠失の両方を保有するための選択に供される。これらの株は、その後、タンパク質を安定化された細胞を選択培地に一斉に転送される。小規模分析用として蛋白質分解において役割を有する遺伝子が削除された場合、融合タンパク質が安定化され、細胞増殖が増強される。匹敵Approaches染色体外で維持されたプラスミドを有する株の大規模なコレクションの同時形質転換を可能にすることが考案されている。この戦略は、染色体への組み込み、交配、胞子形成、および減数分裂の選択54を不要にする。

突然変異は、代謝レポーターを保有する細胞に成長上の利点を与えることが判明した場合には、生化学的に変異が、目的のタンパク質の存在量を増加させることを確認する必要がある。密接Kuhsnirov 31に記載の方法から適合迅速かつ信頼酵母溶解手順は、提示される。このプロトコルは、ウエスタンブロット法による分析のために直接適した形態のタンパク質の抽出が可能になります。与えられたタンパク質の分析のために、溶解物の量がよく、アクリルアミドゲルの特性は、膜、その使用される抗体及び希釈物、及び検出方法の選択は、経験的に決定されなければならないごとにロードされる。代表ウエスタンブロット法プロトコルは、UTを説明した蛍光色素に結合させた二次抗体をilizes。他の一般的に使用されるプロトコルは、抗体結合酵素58に依存して化学発光に依存している。ここで説明したように、目的のタンパク質を検出するために使用される膜は、直接ローディングコントロールタンパク質に対する抗体で再プローブしてもよい。関心ローディング対照タンパク質のタンパク質を検出するために用いた一次抗体は、同じ種から提起されている場合は、膜を再プローブする限り、これらのタンパク質から生じるバンドを同時移行しないように可能である。しかし、関心ローディング対照タンパク質のタンパク質を検出するために用いた一次抗体は、異なる種から提起されている場合は、二次抗体がでフルオロフォアにコンジュゲートされている場合、同じ膜を順次、バンド共移行しても、プローブされてもよい異なる発光波長。ケースでは、関心とロード制御タンパク質の共同移行し、それぞれの一次抗体のタンパク質がraiされていることsedの同じ種から、試料をPVDF膜に移し2 SDS-PAGEゲル上で解決することができ、関心とローディングコントロールタンパク質のタンパク質に特異的な抗体を用いて別々にプローブした。あるいは、ロード整合性が非特異的タンパク質染色剤（ 例えばクマシーまたはポンソーS）で膜をインキュベートすることによって判断することができる。典型的であるようにさらに、代表的なウエスタンブロット法プロトコルは、一次および二次抗体の逐次インキュベーションによって検出されるタンパク質またはエピトープを前提としています。代表的な結果で分析融合タンパク質は、 黄色ブドウ球菌プロテイン A（ 図2および図3でのPrA）に由来する2つのエピトープを含む。プロテインAは、哺乳動物の免疫グロブリンに直接結合し、したがって、二次抗体のみを用いて検出することができる（ すなわち、一次抗体のインキュベーション工程が必要とされない）59。これは、レポーター酵素との融合タンパク質の存在量に影響を与える、または可能性がある劣化。それは、生化学的にレポータータンパク質によって邪魔されない基板のバージョンを使用して結果を確認することをお勧めします。最後に、ここで説明する両方のアッセイは、タンパク質安定性の相違のためのプロキシとしての定常状態タンパク質レベルの違いに依存している。タンパク質量は、タンパク質合成と分解の速度の統合を反映しているため、さらなる生化学的分析（ 例えばシクロヘキシミドチェイスまたはパルスチェイス実験）を直接タンパク質の動的分解プロファイルを分析するために使用されなければならない。

代表的な結果は、異常にERトランスロコンに係合するタンパク質の分解のための遺伝的要件を決定するためのこのプロトコルの新規のアプリケーションを確立する。分解経路が不活性化されたときにDeg1 -Sec62-のHis3（ すなわちにおける選択条件下で酵母増殖優位性を与えHRD1ユビキチンリガーゼの欠如）。高速で信頼性の高いタンパク質EXウエスタンブロット法に続いてトラクション法がHRD1の非存在下での（のHis3の有無にかかわらず）Deg1 -Sec62の存在量の増加が確認された。以前の研究は、トランスロコン関連タンパク質のHRD1依存性分解の機構は他のHRD1 ER内腔または膜の基板32とは異なっていること。示す今後は、このユニークな劣化メカニズムに必要な新規遺伝子を同定するために、大規模な遺伝子スクリーニングでDeg1 -Sec62-のHis3融合タンパク質を使用するであろう。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もない。

Acknowledgments

私たちは、協力的かつ熱狂的な研究環境を提供するためのルーベンラボの現在および過去のメンバーに感謝。私たちは、プロトコルの最適化の支援のためにライアンT.ギブソンに感謝。我々は、酵母株およびプラスミドのためにマークHochstrasser（エール大学）とディーター·ウルフ（シュトゥットガルト大学）を感謝。我々は、この原稿の明快さと実用性の改善に彼らの助けのために私たちの匿名の査読者に感謝。この作品は、ボール州立大学からEMR、EMRにボール州立大学ASPIRE研究賞、および資金にSGWにシグマXIのボール州立大学の章から研究賞、国立衛生研究所の助成金（R15 GM111713）によってサポートされていました学長のOfficeと生物学科。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole Fisher Scientific AC264571000 Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) Roche 11088726001 May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped Sarstedt 82.1581.001 Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl Gilson F14401 Available from a variety of manufacturers
 
 
 

 
Name Company Catalog Number Comments
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl Gilson F14403 Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216 Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.
Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) Bio-Rad 170-8195 A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater Fisher Scientific 1172011AQ Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

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