Abstract
규제 단백질 분해는 거의 모든 세포의 기능에 매우 중요합니다. 분자 메커니즘 및 진핵 세포 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항에 대해 알려진 대부분은 처음 사카로 미세스 세 레비 시아 년에 설립되었습니다. 단백질 분해의 고전 분석은 생화학 펄스 추적 및 사이클로 헥 - 추적 방법에 의존했다. 이들 기술은 단백질 분해에 대한 민감성을 관찰하는 수단을 제공하지만, 이들은 힘들고, 시간 소모, 및 낮은 처리량이다. 이러한 접근 방법은 단백질 분해를 방지 또는 돌연변이 신속한 대규모 스크리닝 의무가 없다. 여기에서, 단백질 분해에 대한 유전 적 요건 용이 한 식별을위한 효모의 성장 기반 분석법을 설명한다. 이 분석에서, 특정 조건 하에서 선택적 성장에 필요한 리포터 효소 불안정한 단백질에 융합된다. 내생 세포를 리포터 효소가 결여되지만 융합 단백질이 실리 하에서 성장할 수있는 발현융합 단백질 안정화 만 뽑은 상태 (즉, 단백질 분해가 노출되어있는 경우). 여기에 설명 된 성장 분석에서, 야생형 및 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드를 보유하는 돌연변이 효모 세포의 연속 희석이 선택적 및 비 선택적 매체에 발견된다. 선택적 성장 조건 하에서 주어진 돌연변이 열화 손상과 일치한다. 증가 된 단백질 풍부 생화학 적으로 확인해야합니다. 전기 영동 및 웨스턴 블 랏팅을위한 적합한 형태로 효모 단백질의 신속한 추출 방법도 설명된다. 생화학 적 분석을위한 단백질 추출을위한 간단한 프로토콜과 결합 단백질 안정성 성장 기반 판독, 단백질 분해에 대한 유전 적 요건의 신속한 식별을 용이하게한다. 이러한 기술들은 단명 다양한 단백질의 열화를 모니터링하도록 구성 될 수있다. 제시된 예에서, 히스티딘 생합성에 필요한 효소는 HIS3, 융합시켰다이 비정상적으로 소포체의 translocon을 종사 한 후 Deg1에 -Sec62. Deg1 -Sec62은 분해의 대상이된다. Deg1 -Sec62-HIS3 은닉 세포 단백질을 안정화시킨 때 선택적 조건 하에서 성장할 수 있었다.
Introduction
선택적 단백질 분해 진핵 생명에 필수적이며, 변화된 단백질 분해는 여러 종류의 암, 퇴행성 신경 질환, 심혈관 질환, 낭포 성 섬유증을 포함하는 의료 1-5 조건의 수에 기여한다. 선택적인 단백질 분해를 촉매하는 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (UPS)는, 이러한 조건에 대한 6-10 새로운 치료 표적이다. 유비퀴틴 리가 제는 공유 결합 단백질 11 (76) - 아미노산 유비퀴틴의 폴리머를 연결합니다. polyubiquitin 체인으로 표시 한 단백질은 인정 ~ 2.5 megadalton 26S에 의해 12 프로 테아 proteolyzed 있습니다. 모델 진핵 생물 사카로 미세스 세 레비 시아 (신진 효모)에 시작된 연구는 진핵 세포에서 단백질 분해 메커니즘의 해명에 기초가되고있다. UPS의 첫 번째 시연 생리 기판은 MATα2 13 효모 전사 억제 자했다, UPS의 (14), 및 고도로 보존 된 많은 구성 요소가 처음 확인 된 또는 (예 15-26) 효모 특징으로하는 방법. 이 다목적 유전자 다루기 쉬운 모델 생물에서 만든 발견은 유비퀴틴 중재 저하의 보존 메커니즘에 중요한 통찰력을 지속적으로 제공 할 가능성이 높다.
대부분의 UPS 기판의 인식과 저하는 여러 단백질의 공동 작업이 필요합니다. 따라서, 주어진 불안정한 단백질의 조절 된 분해를 특징 짓는 중요한 목적은 단백질 분해에 대한 유전 적 요건을 결정하는 것이다. 효모 또는 포유 동물 세포에서 단백질 분해를 모니터링하기위한 고전 접근법 (예를 들어 펄스 - 체이스 및 사이클로 헥시 - 체이스 실험 27) 힘들고 시간 소모적이다. 이러한 유형의 방법은 단백질 분해를 검출하는 고감도 방법을 제공하지만, 이들은 단백질 분해 또는 대규모 screeni의 신속한 분석에 적합하지 않다단백질 분해를 방지 ng를 돌연변이. 여기에, 불안정한 단백질의 분해에 대한 유전 적 요구 사항의 신속한 식별을위한 효모의 성장 기반 분석은 제공됩니다.
단백질 분해,이자 (또는 저하 신호)의 불안정한 단백질을 분석하는 효모의 성장 기반 방법에서는 특정 상황에서 효모의 성장에 필요한 단백질, 프레임, 융합된다. 결과는 관심 불안정한 단백질의 단백질 분해의 유전 적 요구 사항을 결정하는 강력한 도구로서 작용할 수 인공 기판이다. 편리하게는, 가장 일반적으로 사용되는 실험실 효모 균주 특정 아미노산 또는 질소 함유 염기 (예 20,28-30)의 생합성에 관여하는 대사 효소를 코딩하는 유전자의 돌연변이 패널 항구. 이 효소는 합성 효소에 참여 외생 제공 대사의 부재하에 세포 증식에 필수적이다. 이러한불안정한 단백질의 분해를위한 성장 기반 기자가 이들이 융합로서 대사 효소에 따라서 기능을 할 수있다. 단백질 분해를 방지 돌연변이가 저하 기자를 숨겨 세포가 선택적 조건에서 성장할 수 있도록하기 때문에 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항을 용이하게 설명 될 수있다.
성장 장점은 특정 돌연변이 관심 단백질 풍부 증가 간접 지표이다. 그러나 직접 생화학 적 분석은 돌연변이가 아니라 간접적 또는 인공적인 원인을 통해보다 증가 된 단백질 수준을 통해 성장을 허용하는지 확인해야합니다. 풍부한 단백질에 돌연변이의 효과는 않으며 특정 돌연변이를 정박하지 않는 세포에서의 정상 상태의 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인 될 수있다. 적합한 형태 효모 단백질의 신속하고 효율적인 추출 (수산화 나트륨 및 샘플 완충액으로 효모 세포의 연속 배양) 미국 방법웨스턴 블롯 분석을 위해도 (31)를 제시한다. 함께, 이러한 실험은 단백질 분해의 후보 레귤레이터의 신속한 식별을 용이하게한다.
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Protocol
단백질 분해에 결함이있는 후보 돌연변이를 확인하기 위해 1. 효모의 성장 분석
- 리포터 대사 효소로, 프레임에서 불안정한 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드와 야생형과 돌연변이 효모 세포를 형질.
- 플라스미드 분자를 보유하는 세포 합성을위한 선택적인 정의 (SD) 최소 배지 5ml에 형질 전환 체를 접종한다. 회전, 30 ° C에서 밤새 품어.
- 각 하룻밤 문화의 600 nm의 (OD 600)에서 광학 밀도를 측정한다.
참고 : 하룻밤 배양 한 다음은, 문화의 세포 중 하나 로그 또는 고정 성장 단계에있을 수 있지만 최소한의 OD에게 0.2 (600)에 도달한다. 경험적으로 결정되는 매우 느리게 성장하는 효모 균주는 세포의 더 많은 수의 배양 시간보다 긴 밤, 또는 접종이 필요할 수 있습니다. - 세포에 희석을 시작으로 멸균 96 웰 플레이트에서 형질 전환 된 효모 세포의 6 배 희석액을 준비N OD 0.2 600. 96 웰 플레이트에 다른 행에 분석 할 각 효모 형질 전환 체를 놓습니다.
- 각 형질 전환 체의 경우, 200 μL의 최종 부피는 0.2 OD (600)에 셀을 희석 할 필요 밤새 배양의 체적을 계산한다. 200 μL에 볼륨을 가지고 멸균의 적절한 금액을 추가 열 1에 잘 대응에 하룻밤 문화의이 볼륨을 추가합니다.
- 효모의 각 행에 대해, 열 2, 3 및 4에 웰 멸균 수 125 μL를 추가한다.
참고 : 개별 포장 멸균 96 웰 플레이트 멸균 뚜껑 포장 할 수있다. 뚜껑은이 단계에 분포 멸균 용 탱크로서 사용될 수있다. 이 멀티 채널 피펫으로 주어진 열의 모든 우물에 멸균을 동시에 전송할 수 있습니다. - 피펫 팅에 의해 멀티 채널 피펫과 아래 첫 번째 열 (OD 0.2 (600)로 희석 효모)의 내용을 섞는다.
- TRANSF멀티 채널 피펫을 사용하여 열 2 열 1에서 효모의 25 μL, 어. 로 pipetting 아래로 섞는다. 전송 열 3 열이 25 μL, 그리고 3 열부터 4 열 25 μL (각 단계에서 잘 혼합).
- 멀티 채널 피펫으로 각 샘플을 섞는다. 가장 묽은에서 진행하는 것은 적어도 적절한 선택 배지를 포함하는 두 접시에 효모, 피펫 각 샘플의 4 μl를 열 희석한다. 플라스미드 선택 (이 판은 효모 안보 및 성장 제어 역할을) 유지 매체와 한 판을 사용합니다. 기자 효소에 융합 불안정한 단백질의 플라스미드 유지 보수 및 표현 선택 매체와 제 2 플레이트를 사용합니다. 효모가 빠르게 정착 때문에, 정기적으로 피펫 팅에 의해 아래로 세포를 혼합한다.
참고 : 건조기 판은 더 쉽게 새로 제조 한 판보다 액체 흡수하기 때문에 이러한 실험을 권장합니다. 댐프 플레이트 LO 실온에서 인큐베이션하여 건조 될 수있다층류 후드에 2 일 또는 짧은 배양 - 1 w 습도. 층류 공기 유동은 벤치에 평행 인 경우, 플레이트 불균일하게 건조 할 수있다. 템플릿을 사용하면 쉽게 일반 거리에서 효모 세포를 발견 할 수 있습니다. 두 샘플 템플릿은 그림 1에 나와 있습니다.이, 인쇄 잘라하고, 페트리 접시 뚜껑의 안쪽에 부착되어 있습니다. - 플레이트가 벤치 위에 건조하도록 허용합니다.
- 2-6일 30 ° C에서 접시를 품어.
- 배양 후 각 판의 사진.
100 mm 한천 플레이트에 효모 세포에 얼룩을지게 그림 1. 템플릿. 이러한 템플릿은 멀티 채널 피펫과 정기적으로 거리에서 효모를 파악하고 용이하게 사용할 수있다. 템플릿은, 인쇄 잘라 및 페트리 접시 뚜껑의 안쪽에 부착 될 수있다. 성장 페트리 접시를 배치템플릿 매체 내부 뚜껑에 부착. 템플릿은 방향을 추적하기 위해 한 단계로 표시됩니다. 그것은 성장 분석에 사용되는 판 마찬가지로 방향을 추적하기 위해 한 단계로 표시하는 것이 좋습니다. 네 (A) 또는 오 (B) 효모 세포의 연속 희석이 제공됩니다 안보를위한 템플릿. 100-mm 템플릿이 그림의 인쇄 가능한 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
효모의 성장 분석 2. 생화학 확인
- 효모 세포 및 사후 알칼리성 단백질 추출의 성장 (31 수정)
- 불안정한 단백질을 코딩하는 플라스미드와 야생형과 돌연변이 효모 세포를 형질.
- 플라스미드 분자를 보유하는 세포 선택성 SD 배지 5ml에 접종 형질. 회전, 30 ° C에서 밤새 품어.
- 각 하룻밤 CU의 OD 600을 측정lture.
참고 : 하룻밤 배양 한 다음, 셀 중 로그 또는 고정 성장 단계에있을 수 있지만, 0.2 ml의 10에 신선한 선택 배지 (단계 2.1.4)의 OD 600 희석을 허용하는 OD (600)에 도달한다. 경험적으로 결정되는 매우 느리게 성장하는 효모 균주는 세포의 더 많은 수의 배양 시간보다 긴 밤, 또는 접종이 필요할 수 있습니다. - 0.2 ml의 10에 신선한 선택 배지의 OD 600 효모 세포를 희석.
- 문화가 (중간 로그 성장에 IE) 0.8과 1.2 사이의 OD 600에 도달 할 때까지, 회전 또는 떨고, 30 ° C에서 세포를 배양하기 위해 계속합니다.
참고 : 관심의 불안정한 단백질이 조절 가능한 프로모터의 통제하에있는 경우, 단백질 발현 및 세포 수확의 유도의 최적의 타이밍은 이전의 연구 또는 경험적 관찰에 따라 달라질 수 있습니다. - 15 ml의 원뿔 곡선 (이차 곡선)에 문화의 2.5 OD 600 단위를 수집실온에서 5 분 동안 5,000 XG에서 원심 분리하여 알루미늄 관. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
주 : 600 부 1.0의 OD 600에서 배양액 1mL 효모 본의 양으로 정의된다 한 OD. V = 2.5 OD 600 단위 / 600 OD 측정 : 2.5 OD 600 단위 (V)을 수확하는 데 필요한 (ML)에서의 배양 부피는 다음 식을 사용하여 결정될 수있다 - 한 용액에 재현 탁 된 세포를 증류수. 마이크로 원심 튜브에 정지 세포를 전송합니다.
- 실온에서 30 초 동안 6500 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
- 100 μL에 재현 탁 세포가 다운되거나 와동 피펫 팅에 의해 증류수, 100 ㎕의 0.2 M NaOH를 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다. 실온에서 5 분간 샘플을 부화.
- 18,000 X에서 원심 분리하여 (아직 단백질을 발표 여전히 가능한 아르하지 않은 대부분의) 펠렛 세포5 분 g. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
- 로 pipetting 아래로 또는 와동에 의해, 세포를 용해됩니다 100 μL 1X 램 믈리 샘플 버퍼, - 50에 재현 탁 펠렛.
주 : 원심 램 믈리 시료 완충액 세포의 후속 재 부유 다음 알칼리 상등액 제거는 글리신 러닝 버퍼 시스템과 웨스턴 블롯을 사용하여 나트륨 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)와 호환 pH에서 단백질을 추출한다. - 완전 단백질 변성, 5 분 동안 95 ° C에서 배양 한 해물.
참고 : 95 ° C에서 배양 할 때 집계가 발생하기 쉬운 단백질 (여러 횡단 세그먼트 예를 들면 단백질) 불용성 될 수 있습니다. 따라서 해물 낮은 온도에서 배양한다 (예를 들면 37 ° C - 70 ° C) 10 - 30 분, 같은 단백질의 경험적 분석, 결정 하였다. - 5 분 동안 얼음 상에 배치하여 냉각 용 해물.
- 실온에서 1 분 18,000 XG에 원심 분리기 해물을 불용성 물질을 펠렛. 이전 이후의 웨스턴 블롯 분석 (2.2 절)을 SDS-PAGE에 의해 상층 액 (용해 추출 된 단백질)를 분리합니다. 또한, -20 ° C에서 저장 용 해물.
- 대표 웨스턴 블로 팅 프로토콜
- SDS-PAGE 젤에 해물의 경험적으로 결정 볼륨을로드합니다.
- 염료 앞까지 200 V에서 젤을 실행 겔의 바닥에 도달했습니다.
- 4 ℃에서 90 분 - 60 20 V 젖은 송금 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인 겔에서 단백질을 전송합니다.
- 4 ℃에서 하룻밤 동안 실온에서 1 시간 동안, 흔들거나, TBS 버퍼 (TBS)에서 5 % 탈지 우유에서 배양함으로써 차단 막.
- 차단 솔루션 가만히 따르다.
- 방 테에서 1 시간 동안 0.1 % 트윈 20 (TBS / T)와 TBS에서 1 % 탈지 우유 (또는 에피토프 태그) 가장 큰 관심의 단백질에 특이적인 항체와 멤브레인을 품어mperature, 락.
- 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다.
- 락, 실온에서 1 시간 동안 TBS / T 중 1 % 탈지유 적절한 형광 공역 이차 항체와 함께 막을 인큐베이션.
참고 : 형광 물질이 빛에 민감한 때문에, 형광 접합 된 항체의 희석이 어둠 속에서 준비를해야합니다. 또한, 형광 - 복합 항체의 존재 막 부화는 차광 용기에 발생한다. 이 알루미늄 포일 인큐베이션 트레이를 배치함으로써 달성 될 수있다. - 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다.
- 제조업체의 권장 사항에 따라, 리튬 고전 오디세이 (CLx)에서는을 사용하여 막과 이미지 스튜디오 소프트웨어 (또는 비교 영상 장비 및 소프트웨어)의 이미지를 획득.
- 멤브레인을 묘화 한 후, 부하에 특이 차 항체와 함께 막을 인큐베이션락, 실온에서 1 시간 동안 TBS / T 중 1 % 탈지 우유 단백질을 제어 보내고.
- 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다.
- 락, 실온에서 1 시간 동안 TBS / T 중 1 % 탈지유 적절한 형광 공역 이차 항체와 함께 막을 인큐베이션.
- 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다.
- 제조업체의 권장 사항에 따라, 리튬 고전 오디세이 (CLx)에서는을 사용하여 막과 이미지 스튜디오 소프트웨어 (또는 비교 영상 장비 및 소프트웨어)의 이미지를 획득.
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Representative Results
이 방법을 설명하기 위해, HIS3 효소가 모델 소포체 (ER) -associated 저하의 카르복시 말단에 융합 된 (ERAD) 기판, Deg1 -Sec62 (그림 2A) Deg1 -Sec62-HIS3를 만들 수 있습니다 (그림 3) . Deg1 -Sec62는 translocon와 지속, 비정상적인 관계를 다음 타겟으로 ERAD 기판의 새로운 클래스의 창립 멤버이고, ER 막 32-34에서 단백질을 이동 주로 담당하는 채널입니다. 이러한 불안정한 단백질은 잠정적으로 기판 (translocon 관련에 대한) ERAD-T라고되어있다. 이전의 연구는 비정상적인 translocon 참여시, Deg1 -Sec62가 Hrd1 유비퀴틴 리가 아제 (그림 2B-D) (32), (34), (35)에 의해 분해를 대상으로, 나타냅니다. 다른 Hrd1 기판의 분해에 필요한 요인은 비용 소비 것으로 보인다 <EM> Deg1 -Sec62 저하, 새로운 열화기구 (32)를 제안. 결합 된 지질 및 장기간 손상 translocon 협회, 아포지 단백질 B의 조건 하에서, 포유류 저밀도 지단백질의 단백질 성분은 36-38 관련된 메카니즘에 의해 분해 될 듯하다. 따라서, Deg1 -Sec62는 의학적으로 관련 translocon 관련 단백질의 분해에 유용한 모델을 제공 할 수있다.
염색체 HIS3 유전자 결여 야생형 hrd1Δ 효모 세포는 빈 벡터 (39) 또는 플라스미드 인코딩 Deg1 -Sec62-HIS3로 형질 전환 및 선택 성장 배지 (도 4) 상에 발견되었다. 형질 전환 된 효모 세포의 동일한 번호를 확인하기 위해 플레이트로 전송하고, 세포 (플라스미드를 숨겨 셀 선택) 매체 부족 트립토판하지만 포함 히스티딘에 발견되었다. 유사 성장은 모든 형질 전환 효모 세포가 관찰되었다.Deg1 -Sec62-HIS3을 발현하는 세포는 융합 단백질을 안정화 만 히스티딘의 부재 하에서 성장할 것으로 예상되었다 (즉 ERAD-T가 손상되는 경우). 실제로 Deg1 -Sec62-HIS3 발현 hrd1Δ 효모 부족한 배지에 트립토판 및 히스티딘 Deg1 -Sec62-HIS3 발현 야생형 세포 성장 상대적인 이점을 나타내었다. 그러나, 히스티딘의 부재는 심지어 Hrd1의 존재하에 관찰 하였다 융합 단백질에 의존적 성장을 표시했다. 분석의 엄격 성을 증가시키기 위하여, 히스티딘이 결여 된 배지, 3- 아미노 -1H-1,2,3- 트리아 졸 (3-AT)와 HIS3 40 효소의 경쟁적 저해제를 첨가 하였다. Hrd1을 표현 효모 1로 보충 매체 부족한 히스티딘에 매우 저조한 성장 - 2 mM의 3-AT; HRD1가 삭제되었을 때, 세포 성장이 복원되었습니다. 상관없이 Hrd1의 유무의 모든 셀의 3 mM의 극적 성장 억제의 농도 -3- AT의 포함. 이 입술 ULTS는 기판 Hrd1 의존적 분해와 일치한다.
다음에, 발현 또는 Hrd1 효소 결핍 효모 Deg1 -Sec62-HIS3 단백질의 정상 상태 풍부 직접 테스트 하였다. 웨스턴 블롯 분석 Deg1 -Sec62-HIS3 및 Deg1 -Sec62 단백질 야생 형 세포에 hrd1Δ 효모 상대적으로 (그림 5)에 필적하는 증가를 나타냈다. 이것은 두 단백질의 수준을 조절하는데 Hrd1위한 역할을 확인한다. 단백질이 비정상적으로 응급실 translocon (32)에 결합 후 Deg1 -Sec62의 Hrd1 의존 열화가 진행된다. 중요한 것은, Deg1 -Sec62-HIS3이 비정상적으로 더 구체적으로 Deg1 -Sec62의 저하와 일반적으로 translocon 관련 단백질 성장 기반 기자로 Deg1 -Sec62-HIS3의 사용을 검증, 유사한 방식 (게시되지 않은 데이터)의 translocon을 결합한다.
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그림 2 :.. 비정상적인 translocon 참여 다음 Deg1 -Sec62의 분해 모델 (A) Deg1 -Sec62 Deg1 (MATα2에서 아미노 - 말단 67 아미노산)의 개략도 플래그로, 순서, 다음에 (F) 에피토프 , 2 횡단 소포체 (ER) 단백질 Sec62 및 S. 두 개의 복사본 구균 단백질 A (PRA). 명확화를 위해, 융합 단백질 Deg1 -Sec62. (B)는 ER 막에 두 개의 트랜스 세그먼트 정상적인 삽입을 다음과 같이 언급된다, translocon와 Deg1 -Sec62의 지속적인 상호 작용이 비정상 트리거 Deg1 의존적 translocon 맞물림. 초기 아미노 - 말단 세포질 꼬리 부분 내에 비정상적-translocon 유지 가능성 및 입사. (C)를 비정상 translocon의 engagemen 이어t는, Hrd1 인식하고 Deg1 -Sec62을 ubiquitylates. 레드 원은 유비퀴틴 분자를 나타냅니다. (D) Deg1 -Sec62는 가능성이 translocon 폐색을 완화, 프로 테아 좀에 의해 ER 막에서 추출 저하된다.
그림 3 :. 비정상적인 translocon 참여 다음 Deg1 -Sec62-HIS3의 개략도 Deg1가 플래그 (F) 항원에 의해, 순서에, 다음에, 2 횡단 ER 단백질 Sec62, S. 두 개의 복사본 아우 레 우스 단백질 A (PRA) 및 효모 HIS3 효소. 명확화를 위해, 융합 단백질 Deg1 -Sec62-HIS3로 지칭된다.
그림 4 : Deg1에 HIS3 융합 Deg1 -Sec62-HIS3를 암호화하는 플라스미드로 형질 전환 된 야생형 (HRD1)과 hrd1Δ 효모의 연속 희석 중간 부족 트립토판, 매체 부족 트립토판과 히스티딘에 발견되었다 및 보충 트립토판과 히스티딘이 결여 된 매체 (3) 아미노 1H-1,2,3- 트리아 졸 (3-AT), HIS3의 경쟁 억제제, 표시된 농도에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5 :. Hrd1 부족한 세포에서 Deg1 -Sec62과 Deg1 -Sec62-HIS3의 증가 풍부한 단백질 추출물 야생형 (+) 및 hrd1Δ에서 제조 하였다(Δ) Deg1 -Sec62 또는 Deg1 -Sec62-HIS3을 표현 효모. 단백질 (0.125 OD 600 단위에 상당) 웨스턴 직접 융합 단백질의 단백질 에피토프에 결합 토끼 항 - 마우스 이차 항체로 블 롯팅 한 후, SDS-PAGE에 의해 분리 하였다. Pgk1에 특이적인 항체와 이후의 서양 블롯은 부하 제어를 제공합니다.
| 해결 | 구성 요소들 | 댓글 | ||
| 합성 정의 (SD) 최소 효모 중간 | 2 % 포도당, 아미노산없이 0.67 % 효모 질소 염기, 0.002 % 아데닌, 0.004 % 우라실, 0.002 %의 아르기닌, 0.001 % 히스티딘, 0.006 %의 이소 루이 신, 0.006 % 루신, 0.004 %의 리신, 0.001 % 메티오닌, 0.006 % 페닐알라닌 0.005 % 트레오닌, 0.004 % 트립토판. 고체 (판) 매체의 경우, 2 % 한천을 포함한다. | 1. AP가 선택 배지를 생략함으로써 제조방법은 적절한 아미노산 (들) 또는 질소 염기. | ||
| 다음과 같이 편의를 위해 2.,이 성분을 농축 원액으로 유지 될 수있다. 아미노산 원하는 모든 아미노산을 함유 100X 원액으로 유지 될 수있다. 효모 질소 염기는 20X 스톡 용액 (13.4 %)에서 유지 될 수있다. 포도당은 40 % 저장 용액으로 유지 될 수있다. 아데닌과 우라실 0.1 M NaOH를 1 %의 원액으로 유지 될 수있다. | ||||
| 3. 고압 증기 멸균에 의해 매체를 소독. | ||||
| 1X 램 믈리 샘플 버퍼 | 2 % SDS, 10 % 글리세롤, 5 % β 메르 캅토 에탄올, 60 mM 트리스 염산 pH를 6.8, 블루 0.008 % 브로 모 페놀 | 1. 1X 샘플 버퍼는 종종 더욱 농축 (예 5X) 스톡을 희석함으로써 제조된다. | ||
| 2. 염료 브로 모 페놀 블루 원하는 강도에 첨가 될 수있다. A "핀치"(주걱의 에지로부터 태핑 미량)는 일반적으로 충분하다. | ||||
| 0.2 M 수산화 나트륨 | 물에 준비합니다. 수산화 나트륨은 유리와 반응한다. 따라서, 장기 저장에 대해, 0.2 M 수산화 나트륨을 플라스틱 용기에 유지되어야한다. | |||
| 램 믈리 버퍼를 실행 (5 배) | 125 mM 트리스, 960 mM의 글리신, 0.5 % SDS | dH보다 2 O 5 : 버퍼를 실행 1X 램 믈리 1 L를 준비하려면 1을 희석 | ||
| 트리스 아세테이트-SDS 전송 버퍼 (5 배) | 125 mM 트리스 아세테이트 (PH 8.8), 960 mM의 글리신, 0.05 % SDS | , 전송 버퍼 1X 트리스 아세테이트 - SDS의 20 L를 준비 5 배 주식의 4 L, 메탄올 4 L, 및 dH보다 2 O 12 L를 결합하려면 | ||
| 10X 식염수 (TBS) 트리스 버퍼 | 500 mM 트리스, 1.5 M의 NaCl; pH는 7.5로 조정 | 1X TBS의 1 L를 준비하려면, dH보다 2 O에서 1:10 희석 1X TBS는 적절한 세제 트윈 -20 및 분말 탈지유, 보충 될 수있다. |
| 스트레인 이름 | 별명 | 관련 유전자형 | 그림 | 출처 |
| VJY6 | MHY500 | 마타 | 도 4 및도 5 | 첸 등., 1993 |
| HIS3-Δ200 | ||||
| leu2-3,112 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| gal2 | ||||
| VJY10 | 마타 | 도 4 및도 5 | 이 연구 | |
| his3- Δ (200) | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| gal2 | ||||
| hrd1 :: kanMX4 |
표 2 :. 효모 본 연구에 사용 된 균주 건설의 세부 사항은 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
| 플라스미드 번호 | 전체 플라스미드 이름 | 그림 | 출처 |
| pVJ30 | pRS414-P MET25 -Deg1 -flag-Sec62-2xProtA | (5) | 루벤스 타인 등. 2012 |
| pVJ121 | pRS414-P MET25 (MET25 프로모터와 빈 벡터) | 4 | Mumberg 등. 1994 |
| pVJ467 | pRS414-P MET25 -Deg1 -flag-Sec62-2xProtA-HIS3 | (5) | 이 연구 |
| pVJ477 | pRS414-P GAL4 -Deg1 -flag-Sec62-2xProtA-HIS3 | 4 | 이 연구 |
표 3 :. 본 연구에 사용 된 플라스미드 모든 플라스미드는 효모 세포에서 복제, 효모 세포의 선택을위한 TRP1 유전자를 허용하도록 효모 센트로 포함될 뿐이고, 박테리아 세포에서의 정비를위한 AmpR 유전자. 플라스미드지도, 시퀀스, 건설의 세부 사항은 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
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Discussion
여기에 제시된 방법론은 빠른 결정과 효모 세포에서 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항의 생화학 적 확인을 할 수 있습니다. 이 실험은 () (예 : 41 ~ 44을, 처리, 저장 및 효모 세포 조작을위한 프로토콜의 효모 생물학의 여러 우수 리뷰 및 컴파일 유기체에 새로운 연구자에 사용할 수있는) 유틸리티 및 전원 효모의 모델 진핵 생물 유기체 등을 강조 표시합니다. 기술은 용이하게 단백질의 다양한 클래스의 열화 풍부 조사에 적용될 수있다. 예를 들어, 다른 불안정한 세포질, 핵 및 ER의 내강과 막 관통 단백질 45-49의 열화 메카니즘을 특성화이 전략을 이용했다.
몇 가지 요인이 불안정한 단백질에 융합 대사 효소의 선택에 고려되어야한다. 먼저, 유전자의 기능 버전이 효소를 코딩하지 것이 중요숙주 게놈에 존재. (불안정한 단백질이 실제로 성능이 저하 된 경우 선택적 조건 즉, 성장)을 거짓 긍정적 인 결과를 최소화하기 위해서는 리포터 유전자 (바람직하게는 전체 유전자 삭제) (50)의 돌연변이 대립 유전자를 복귀되지 않은 항구 균주로 작업하는 것이 좋습니다. 리포터 효소의 선택에 대한 또 다른 고려 사항은 배경의 성장을 감소시키고 분석 엄격 성을 향상시키기 위해 선택 성장 배지에 포함될 수있는 경쟁적인 저해제의 유용성이다. 이 경우에도 완전한 기능 저하 메커니즘의 존재에 상대적으로 낮은 이직률과 단백질의 경우에 유용 할 수 있습니다. 여기에 제시된 대표적인 실험에서 경쟁적으로 HIS3 효소를 억제 3-AT,의 포함은 배경 성장 (40)을 감소시킨다. 유사하게, 화합물 6은 URA3 우라실, 우라실 (51)의 생합성에 필요한 효소를 억제한다. 성장에 억제제 농도 저하-D에서 발생efective 아니라 야생형, 셀 경험적으로 결정되어야한다. 일부 대사 효소도에 대해 반대 선택할 수있다. 이의 선택적인 조건 하에서, 세포들은 불안정한 단백질이 열화 (융합 및 대사 효소가 존재하지 않는) 경우에만 성장할 수있다. 예를 들어 URA3은 독성 화합물, 5- 플루오로 우라실 (52) 화합물을 5- 플루오로 오로 아세트산 (5-FOA)를 변환한다. URA3 융합 단백질이 저하되는 경우 URA3 융합 단백질을 발현하는 세포들은 5-FOA의 존재 하에서 성장할 것이다. 유사하게, 화합물 5- fluoroanthranilic 산 (5-FAA)은 기능적 트립토판 생합성 경로와 세포 독성이다. 5 FAA 따라서 할 수있다 TRP1 융합 단백질 (53)를 발현하는 세포에 대한 반대를 선택합니다. 카운터 선택 전략이 저하 방해하는 돌연변이 억제의 식별을 위해 유용 할 수 있습니다.
열화 리포터의 발현을 구동하는데 사용되는 프로모터는 또한 신중하게 선택되어야한다. biosynth의 낮은 수준etic 효소 외생 공급 대사의 부재 하에서 성장을 지원하기에 충분할 수있다, 약한 프로모터는 54을 권장한다. 여기에 제시된 대표적인 실험에서, 글루코스 (55)의 존재 하에서 억제되고 GAL4 촉진제, Deg1 -Sec62-HIS3의 전사를 촉진하는 데 사용된다. 분해 메커니즘이 해제 된 경우 - 억압 조건 (즉, 2 % 포도당)에서이 융합 단백질의 기저 표현은 선택적 조건에서 성장을 지원하기에 충분 (2 mM의 3-AT 히스티딘과 1의 존재, 즉 부재)입니다. 선택적 조건 웨스턴 블 롯팅에 의한 검출 한계 이하로 될 가능성이 아래 그러나 충분한 단백질 수준은 성장을 지원한다. 따라서, 성장 분석에서 약한 프로모터 및 생화학 적 확인을 위해 강한 프로모터와 발현을 구동 할 필요가있다. (HIS3 융합 유무에 관계없이) Deg1 -Sec62, 더 robus의 경우t 프로모터 (여기, MET25 프로모터 39) 서부 분석에 의한 단백질의 시각화가 필요합니다.
여기에서 설명한 바와 같이, 효모의 성장 기반 분석은 소규모, 후보 기반 접근법에 대해 수행 될 수있다. 효모 세포의 희석액은 96 웰 플레이트에서 제조하고 고체 성장 배지로 피펫 팅하여 전송된다; 고체 매체에 희석 효모 세포 현탁액의 효율과 재현성 전송 대안적인 방법은 일반적으로 "Frogger와"(56)라고 함 멀티 핀 리플리케이터의 사용이다. 이상적인 시간은 판 효모 균주 및 조건에 따라 달라질 촬영합니다. 그것은 가장 빠르게 성장하는 문화에서 식민지 먼저 가장 묽은 지점에 가시가 주어진 판을 촬영하는 것이 좋습니다. 이것은 일반적으로 샘플 중 성장 속도의 차이가 가장 분명되는 지점입니다. 그것은 특히 효모의 경우, 여러 날에 사진을 찍을하는 것이 바람직 할 수있다성장 속도의 넓은 범위를 나타내는.
대규모 분석을위한 성장 기반 리포터 분석은 또한 적응 될 수있다. 예를 들어, 열화 기자 합성 유전자 배열 (SGA) 기술을 사용 46,57 ~ 5,000 가능한 반수성 효모 유전자 결실 균주 시판되는 라이브러리로 도입 될 수있다. 이 기술에서, 염색체 통합 대사 리포터 단백질과 융합 반수성 효모 균주는 유전자 결실 균주 라이브러리의 각각에 어울리게된다. 결과 이배체 세포는 포자를 형성하도록 유도 (감수 분열을 거쳐) 및 반수체 감수 자손 대사 기자와 개별 유전자의 삭제도 숨겨에 대한 선택을 실시한다. 이들 균주를 다음 단백질 안정화 된 배지에서 세포를 선택적으로 한꺼번에 전송된다. 소규모 분석에 관해서는 단백질 분해에 관여하는 유전자와이 삭제되면, 융합 단백질은 안정화되며, 세포 성장이 향상 될 것이다. Comparable를pproaches은 여분의 염색체 유지 플라스미드와 균주의 큰 컬렉션의 동시 변환을 허용하는 고안되었다; 이 전략은 염색체 통합, 결합, 포자 형성 및 감수 선택 (54)을 제거한다.
돌연변이 세포 대사 리포터 은닉에 성장 이점을 부여하는 것으로 확인되면, 생화학 돌연변이 관심 단백질 풍부 증가하는지 확인하는 것이 필요하다. 밀접 Kuhsnirov 31 항에있어서에서 적응 신속하고 신뢰성있는 효모 세포 용해 과정이 제시된다. 이 프로토콜은 웨스턴 블롯 분석을 위해 직접 적합한 형태로 단백질을 추출 할 수 있습니다. 주어진 단백질의 분석을 위해, 해물의 양이 아니라, 아크릴 아마이드 겔 특성, 막, 이들의 사용 항체 희석 및 검출 방법의 선택은 경험적으로 결정해야 당로드 할 수 있습니다. 대표 서부 블로 팅 프로토콜은 유타를 설명형광 염료에 접합 된 이차 항체를 ilizes; 일반적으로 사용되는 프로토콜은 항체 접합 효소 (58)에 따라 화학 발광에 의존하고있다. 여기에 설명 된 바와 같이, 관심있는 단백질을 검출하는 데 사용되는 막에 직접 로딩 조절 단백질 항체 reprobed 될 수있다. 관심 및로드 제어 단백질의 단백질을 검출하는데 사용 일차 항체와 동일한 종으로부터 발생 된 경우, 멤브레인을 한 reprobing 것은 이들 단백질에서 발생하는 대역 공동 이주하지 않는 한 가능하다. 그러나, 관심 및로드 제어 단백질의 단백질을 검출하는 데 사용되는 일차 항체는 다른 종으로부터 발생 된 경우 이차 항체와 함께 형광체에 접합 된 경우, 동일한 막 순차 심지어 대역 공동 마이그레이션하는 경우, 프로브 될 수있다 발광 파장이 다른. 경우 관심과로드 제어 단백질의 공동 마이그레이션 및 각 주 항체의 단백질은 라이되었는지SED 동일한 종으로부터, 샘플을 PVDF 막으로 전달 개의 SDS-PAGE 겔에 해결 될 수 있고, 관심 및로드 컨트롤 단백질의 단백질에 특이적인 항체로 프로빙 별도로. 또한,로드 일관성은 비 특정 단백질 얼룩 (예를 들어 코마 또는 개양귀비 빛 S)와 세포막을 배양하여 판단 할 수있다. 전형적으로 또한, 대표적인 웨스턴 블롯 프로토콜은 일차 및 이차 항체의 연속 배양에 의해 검출되는 단백질 또는 에피토프를 가정한다. 대표적인 분석 결과 융합 단백질은 (도 2 및도 3에 PRA) 포도상 구균 단백질로부터 유도 된 두 에피토프를 함유한다. 단백질은 포유 동물의 면역 글로불린에 직접적으로 결합하고, 따라서, 단독으로 (더 차 항체 항온 처리 단계가 필요하지 IE) (59) 이차 항체를 이용하여 검출 될 수있다. 이 기자 효소의 융합 단백질 풍부에 영향을 미치거나 수있다분해. 이는 생화학 적 리포터 단백질에 의한 방해 기판의 버전을 사용하여 결과를 확인하는 것이 바람직하다. 마지막으로, 여기에 설명 된 분석은 두 단백질의 안정성에서 차이에 대한 프록시 정상 단백질 수준의 차이에 의존한다. 단백질 풍부 단백질 합성 및 분해, 상기 생화학 적 분석 (예 : 사이클로 헥 체이스 또는 펄스 추적 실험)의 비율의 통합을 직접 반영하기 때문에 단백질 분해의 동적 프로파일을 분석하기 위해 사용되어야한다.
대표적인 결과는 비정상적 ER의 translocon 결합 단백질의 분해를위한 유전 적 요건의 판정은이 프로토콜의 신규 한 어플리케이션을 확립한다. Deg1 -Sec62-HIS3 선택적 조건하에 효모 성장 이점을 부여 분해 경로가 비활성화 될 때 (즉,의 Hrd1 유비퀴틴 리가 아제의 부재). 빠르고 신뢰할 수있는 단백질 전웨스턴 블롯 하였다 트랙션 Hrd1 방법의 부재 (HIS3 또는 제외) Deg1 -Sec62의 개체수의 증가를 확인했다. 이전의 연구 translocon 관련 단백질의 Hrd1 의존 저하의 메커니즘이 다른 Hrd1 ER의 내강 또는 횡단 기판 (32)의 것과 다르다는 것을 나타냅니다. 향후 연구가 이러한 고유 분해를위한기구 신규 유전자를 동정하기 위해 대규모의 유전자 스크린에 Deg1 -Sec62-HIS3 융합 단백질을 이용하는 것이다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는지지하고 열정적 인 연구 환경을 제공하기 위해 루벤스 타인 실험실의 현재와 전 회원을 감사드립니다. 우리는 프로토콜 최적화에 도움 라이언 T. 깁슨 감사합니다. 우리는 효모 균주 및 플라스미드에 대한 마크 Hochstrasser (예일 대학)과 디터 늑대 (Universität의 슈투트가르트) 감사합니다. 우리는이 원고의 선명도와 유틸리티 개선에 도움을 준 익명의 검토를 부탁드립니다. 이 작품은 SGW에 시그마 사이의 볼 주립 대학의 장에서 연구 수상에 의해 지원되었다, 볼 주립 대학에서 국민 건강 보조금 연구소 (R15 GM111713) EMR에, EMR에 볼 주립 대학 바램이 연구 상, 자금 사무장의 사무실과 생물학과.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
| 3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs. |
| Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer. |
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers. |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes. |
| Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) | Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
References
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