Abstract
Degradação de proteínas Regulado é crucial para praticamente todas as funções celulares. Muito do que se sabe sobre os mecanismos moleculares e requisitos genéticos para a degradação da proteína eucariótica foi inicialmente estabelecida em Saccharomyces cerevisiae. Análises clássicas de degradação de proteínas têm contado com metodologias de pulso-Chase e cycloheximide-perseguição bioquímicos. Embora essas técnicas de fornecer os meios sensíveis para a observação de degradação de proteínas, eles são trabalhoso, demorado, e de baixo rendimento. Estas abordagens não são passíveis de triagem rápida ou em larga escala de mutações que impedem a degradação da proteína. Aqui, um ensaio baseado no crescimento das leveduras para a identificação fácil dos requisitos genéticos para a degradação da proteína é descrito. Neste ensaio, uma enzima repórter necessária para o crescimento sob condições selectivas específicas é fundida com uma proteína instável. As células a que falta a enzima repórter endógeno mas expressam a proteína de fusão pode crescer sob selecondições CTIVE apenas quando a proteína de fusão é estabilizado (ou seja, quando a degradação da proteína é comprometida). No ensaio de crescimento descrito aqui, diluições em série de tipo selvagem e mutantes de células de levedura contendo um plasmídeo que codifica uma proteína de fusão são manchados para o meio selectivo e não selectivo. O crescimento em condições selectivas é consistente com insuficiência degradação por uma dada mutação. O aumento da abundância de proteína deve ser confirmada bioquimicamente. Um método rápido para a extracção de proteínas de levedura numa forma adequada para a electroforese e Western blotting é também demonstrada. Uma leitura à base de crescimento para a estabilidade da proteína, combinado com um protocolo simples para a extracção de proteínas para análise bioquímica, facilita a rápida identificação dos requisitos genéticos para a degradação da proteína. Estas técnicas podem ser adaptadas para controlar a degradação de uma variedade de proteínas de vida curta. No exemplo apresentado, a enzima His3, o qual é necessário para a biossíntese de histidina, foi fundidapara Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 é alvo de degradação após a aberrante engata a translocon retículo endoplasmático. As células que albergam Deg1 -Sec62-His3 foram capazes de crescer em condições selectivas quando a proteína foi estabilizado.
Introduction
Degradação selectiva de proteínas é essencial para a vida eucariótica, e a degradação da proteína alterada contribui para um certo número de condições médicas, incluindo vários tipos de cancro, doença neurodegenerativa, doença cardiovascular, e fibrose cística 1-5. O sistema ubiquitina-proteassoma (UPS), que catalisa a degradação da proteína seletivo, é um alvo terapêutico emergente para estas condições 6-10. Ubiquitina ligases covalentemente anexar polímeros da ubiquitina ácido 76-amino de proteínas 11. Proteínas que foram marcados com correntes poliubiquitina são reconhecidos e proteolizada pelos 2,5 megadalton ~ proteassoma 26S 12. Estudos iniciados no organismo eucariota modelo Saccharomyces cerevisiae (levedura de brotamento) ter sido fundamental na elucidação dos mecanismos de degradação de proteínas em células eucarióticas. O primeiro substrato fisiológico demonstrou da UPS foi a levedura repressor da transcrição MATα2 13, 14, e muitos componentes altamente conservadas da UPS foram inicialmente identificados ou caracterizado por leveduras (por exemplo, 15-26). Descobertas feitas neste organismo modelo versátil e geneticamente tratável são susceptíveis de continuar a fornecer importantes insights sobre os mecanismos conservadas de degradação mediada por ubiquitina.
Reconhecimento e degradação da maioria dos substratos UPS exigem uma acção combinada de várias proteínas. Por conseguinte, um objectivo importante na caracterização da degradação regulada de uma dada proteína é instável a determinar os requisitos genéticos para a proteólise. As abordagens clássicas (por exemplo pulse-chase e experiências cicloheximida-chase 27) para monitorar a degradação de proteínas em células de mamífero ou de levedura são trabalhosos e demorados. Embora estes tipos de metodologia proporcionar meios muito sensíveis para a detecção da degradação de proteínas, eles não são adequados para a análise rápida de degradação da proteína ou screeni grande escalang para as mutações que impedem a degradação da proteína. Aqui, um ensaio à base de levedura de crescimento para a rápida identificação dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas instáveis é apresentado.
No método baseado no crescimento da levedura para analisar a degradação de proteínas, uma proteína instável de interesse (ou sinal de degradação) é fundida, na estrutura, para uma proteína que é necessária para o crescimento de levedura em circunstâncias específicas. O resultado é um substrato artificial, que pode servir como uma ferramenta poderosa para determinar os requisitos genéticos de degradação de proteínas da proteína instável de interesse. Convenientemente, as estirpes de levedura laboratorial mais comummente utilizados abrigar um painel de mutações em genes que codificam enzimas metabólicas envolvidas na biossíntese de aminoácidos específicos ou bases azotadas (por exemplo, 20,28-30). Estes enzimas são essenciais para a proliferação celular na ausência de metabolitos fornecidos exogenamente em cuja síntese das enzimas participar. Talenzimas metabólicas podem assim funcionar como repórteres à base de crescimento para a degradação de proteínas instáveis ao qual se encontram fundidos. Os requisitos genéticos para a degradação da proteína pode ser facilmente elucidadas, uma vez que as mutações que impedem a proteólise irá permitir que as células portadoras do repórter degradação de crescer em condições selectivas.
Uma vantagem de crescimento é uma indicação indirecta que uma mutação em particular aumenta a abundância da proteína de interesse. No entanto, a análise bioquímica direta é necessário para confirmar que uma mutação permite o crescimento através do aumento dos níveis de proteína e não através de causas indiretas ou artificial. O efeito de uma mutação na abundância da proteína pode ser confirmada por análise de mancha de Western dos níveis de proteína em estado estacionário em células que fazem e não abrigam a mutação em particular. Um método para a extracção rápida e eficiente de proteínas de levedura (incubação sequencial de células de levedura com hidróxido de sódio e tampão de amostra) numa forma adequadapara análise por transferência Western também é apresentada 31. Em conjunto, estas experiências facilitar a rápida identificação de candidatos reguladores de degradação da proteína.
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Protocol
1. Yeast Crescimento ensaio para identificar mutantes candidatos defeituosos na degradação de proteínas
- Transformação de tipo selvagem e mutantes de células de levedura com um plasmídeo que codifica uma proteína instável fundida, na estrutura, para um repórter enzima metabólica.
- Inocular os transformantes em 5 ml de sintético definido (SD) meio mínimo que é selectivo para células contendo moléculas de plasmídeo. Incubar durante a noite a 30 ° C, rotação.
- Medir a densidade óptica a 600 nm (OD600) de cada cultura durante a noite.
NOTA: A seguir à incubação durante a noite, as células em cultura podem ser, em cada fase de crescimento logarítmica ou estacionária, mas deverá ter atingido um mínimo OD 600 de 0,2. De crescimento lento muito estirpes de levedura pode exigir tempos de incubação mais longo do que uma noite, ou a inoculação de um maior número de células, como determinado empiricamente. - Prepare seis diluições em série de células de levedura transformadas num estéril placa de 96 poços, começando com células diluídas para uman DO600 de 0,2. Colocar cada transformante de levedura a ser doseada numa linha diferente na placa de 96 poços.
- Para cada transformante, calcular o volume de cultura durante a noite necessária para diluir as células até uma OD 600 de 0,2 num volume final de 200 ul. Adicionar este volume de cultura de uma noite para o correspondente poço na coluna 1. Adicionar a quantidade apropriada de água estéril para levar o volume até 200 ul.
- Para cada linha de levedura, adicionar 125 uL de água estéril para os poços nas colunas 2, 3 e 4.
NOTA: placas de 96 poços estéreis embalados individualmente podem ser embalados com tampas estéreis. As tampas podem ser utilizadas como reservatórios para a água estéril que é distribuído neste passo. Isto permite a transferência simultânea de água estéril para todos os poços de uma dada coluna com uma pipeta multicanal. - Misturar os conteúdos da primeira coluna (levedura diluída até uma DO 600 de 0,2), pipetando para cima e para baixo com uma pipeta multicanal.
- Transfer 25 ul de levedura a partir da coluna 1 para a coluna 2, utilizando um pipetador multicanal. Misturar por pipetagem cima e para baixo. Transferir 25 ul da coluna 2 para a coluna 3, e 25 ul da coluna 3 a Coluna 4 (misturando bem a cada passo).
- Misturar cada amostra com uma pipeta multicanal. Partindo mais diluído para menos diluir colunas de levedura, pipeta 4 ul de cada amostra em duas placas contendo o meio selectivo apropriado. Use uma placa com meio que mantém seleção plasmídeo (esta placa serve como uma mancha de levedura e controle do crescimento). Usar uma segunda placa com meio que selecciona para manutenção do plasmídeo e a expressão da proteína instável fundido com a enzima repórter. Porque levedura resolver rapidamente, misture células por pipetagem cima e para baixo em intervalos regulares.
NOTA: Secador de placas será mais facilmente absorver o líquido que as placas preparadas na hora e são, portanto, recomendado para estas experiências. Placas húmidas podem ser secas por incubação a temperatura ambiente em low humidade para 1 - 2 dias ou mais curtos, em incubações uma câmara de fluxo laminar. As placas podem secar desigualmente se o fluxo de ar laminar é paralelo à mesa. A utilização de um molde torna mais fácil de detectar células de levedura, a distâncias regulares. Dois modelos de amostra são fornecidos na Figura 1. Estes podem ser impressa, cortada, e afixada no interior de uma tampa de placa de Petri. - Permitir que as placas para secar em cima da bancada.
- Incubar as placas a 30 ° C durante 2 - 6 dias.
- Fotografar cada placa após a incubação.
Figura 1. Modelos para detectar células em placas de agar de levedura de 100 mm. Estes modelos podem ser utilizados para facilitar a mancha de levedura a distâncias regulares com um pipetador multicanal. Modelos pode ser impressa, cortada, e afixada no interior de uma tampa de placa de Petri. Coloque placa de Petri com o crescimentotampa interna médio com template aposta. Os modelos são marcados com um entalhe para acompanhar a orientação. Recomenda-se que as placas utilizadas em ensaios de crescimento ser marcado de forma semelhante com um entalhe para controlar a orientação. Modelos para manchar quatro (A) ou cinco (B) diluições em série de células de levedura são fornecidos. Por favor, clique aqui para ver uma versão para impressão desta figura com modelos de 100 mm.
2. A confirmação bioquímica do ensaio de crescimento do fermento
- O crescimento de células de levedura e Pós-Extração alcalina Protein (modificado a partir de 31)
- Transformação de tipo selvagem e mutantes de células de levedura com um plasmídeo que codifica a proteína instável.
- Inocular os transformantes em 5 ml de meio SD que é selectivo para células contendo moléculas de plasmídeo. Incubar durante a noite a 30 ° C, rotação.
- Medir a OD 600 de cada dia para o outro cuLTURE.
NOTA: A seguir à incubação durante a noite, as células podem estar em qualquer fase de crescimento logarítmica ou estacionária, mas deverá ter atingido uma densidade óptica 600 que vai permitir a diluição para uma OD600 de 0,2 em 10 ml de meio selectivo fresco (passo 2.1.4). De crescimento lento muito estirpes de levedura pode exigir tempos de incubação mais longo do que uma noite, ou a inoculação de um maior número de células, como determinado empiricamente. - Dilui-se células de levedura para uma DO 600 de 0,2 em 10 ml de meio selectivo fresco.
- Continue-se a incubar as células a 30 ° C, rotação ou agitação, até que as culturas atingem uma DO 600 compreendida entre 0,8 e 1,2 (ou seja, são em meados de crescimento logarítmica).
NOTA: Se a proteína de interesse é instável sob o controlo de um promotor regulável, o tempo óptimo de indução da expressão da proteína e a colheita de células pode variar de acordo com estudos anteriores ou observações empíricas. - Recolha 2,5 OD 600 unidades de cultura em 15 ml cônicaai tubo por centrifugação a 5000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração.
NOTA: Uma unidade DO600 é definida como a quantidade de levedura presente em 1 ml de cultura a OD 600 de 1,0. O volume de cultura (em ml) necessária para a colheita de 2,5 OD 600 unidades (V) pode ser determinada usando a seguinte equação: V = 2,5 unidades de OD 600 / OD 600 Medido - Ressuspender as células em 1 ml de água destilada. Transferir as células em suspensão para um tubo de microcentrífuga.
- Peletizar as células por centrifugação a 6500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração.
- Ressuspender as células em 100 ml de água destilada por pipetagem cima e para baixo ou vórtex, e adicionar 100 mL de NaOH 0,2 M. Misturar por pipetagem cima e para baixo. Incubar as amostras durante 5 min à temperatura ambiente.
- Células de pellets (a maioria dos quais ainda não divulgados proteínas e ainda são viáveis) por centrifugação a 18.000 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração.
- Pelete Ressuspender em 50 - 100 ul de tampão de amostra de Laemmli 1x, que irá lisar as células, pipetando para cima e para baixo ou vórtex.
NOTA: A remoção do sobrenadante após a centrifugação alcalina e subsequente ressuspensão das células em tampão de amostra de Laemmli extrai proteínas a um pH compatível com dodecil sulfato de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), utilizando um sistema tampão de corrida Tris-glicina e western blotting. - Para desnaturar proteínas totalmente, lisados incubar a 95 ° C durante 5 min.
NOTA: As proteínas de agregação propensas (por exemplo, proteínas com vários segmentos transmembranares) pode tornar-se insolúvel quando incubadas a 95 ° C. Portanto, os lisados devem ser incubados a temperaturas mais baixas (por exemplo, 37 ° C - 70 ° C) durante 10 - 30 min, como determinado empiricamente, para a análise de tais proteínas. - Super lisados, colocando em gelo por 5 min.
- Centrifugar os lisados a 18000 xg durante 1 min à temperatura ambiente para precipitar o material insolúvel. Separa-se o sobrenadante (proteína extraída solubilizado) por SDS-PAGE antes da subsequente análise de Western blot (secção 2.2). Alternativamente, armazenar lisados a -20 ° C.
- Protocolo de Western Blotting representativas
- Carregar o volume determinado empiricamente de lisados em um gel de SDS-PAGE.
- Executar gel a 200 V até a frente do corante atingir o fundo do gel.
- Transferir proteínas a partir de gel de fluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana por transferência húmida a 20 V durante 60 - 90 min a 4 ° C.
- Bloco de membrana por incubação em 5% de leite desnatado em Tris-salino tamponado (TBS), balanço, durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Decantar solução de bloqueio.
- Incubar membrana com anticorpo primário específico para a proteína de interesse (ou seu epitopo tag) em 1% de leite desnatado em TBS com 0,1% de Tween-20 (TBS / T) durante 1 hora a sala de temperatura, balançando.
- Decantar solução anticorpo, e lavar membrana 3 x 5 min com TBS / T, à temperatura ambiente, de balanço.
- Incubar membrana com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo adequado em 1% de leite desnatado em TBS / T durante 1 hora à temperatura ambiente, de balanço.
Observação: Como fluorophores são sensíveis à luz, diluições de anticorpos fluoróforos deve ser preparado no escuro. Além disso, a incubação de membranas na presença de anticorpos fluoróforos, deve ocorrer em recipientes opacos. Isto pode ser realizado por envolvimento tabuleiros de incubação em folha de alumínio. - Decantar solução anticorpo, e lavar membrana 3 x 5 min com TBS / T, à temperatura ambiente, de balanço.
- Adquirir imagem da membrana usando Li-Cor Odyssey CLx e software Imagem Studio (ou equipamentos de imagem comparável e software), de acordo com as recomendações do fabricante.
- Depois de imagiologia membrana, incubar a membrana com um anticorpo primário específico de uma cargação com proteína de controlo em 1% de leite desnatado em TBS / T durante 1 hora à temperatura ambiente, de balanço.
- Decantar solução anticorpo, e lavar membrana 3 x 5 min com TBS / T, à temperatura ambiente, de balanço.
- Incubar membrana com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo adequado em 1% de leite desnatado em TBS / T durante 1 hora à temperatura ambiente, de balanço.
- Decantar solução anticorpo, e lavar membrana 3 x 5 min com TBS / T, à temperatura ambiente, de balanço.
- Adquirir imagem da membrana usando Li-Cor Odyssey CLx e software Imagem Studio (ou equipamentos de imagem comparável e software), de acordo com as recomendações do fabricante.
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Representative Results
Para ilustrar esta metodologia, a enzima His3 foi fundido com o terminal carboxilo do modelo de retículo endoplasmático (ER) -associated degradação (ERAD) substrato, Deg1 -Sec62 (Figura 2A) para criar Deg1 -Sec62-His3 (Figura 3) . Deg1 -Sec62 representa um membro fundador de uma nova classe de substratos ERAD que são direcionados seguinte associação persistente, aberrante com a translocon, o canal principal responsável por proteínas em movimento através da membrana ER 32-34. Tais proteínas instáveis foram provisoriamente chamado ERAD-T (para-associado translocon) substratos. Estudos anteriores indicam que, após o ajustamento do translocon aberrante, Deg1 -Sec62 está orientada para a degradação pela Hrd1 ubiquitina-ligase (Figura 2B-D) 32, 34, 35. Factores necessários para a degradação de outros substratos Hrd1 parecem ser dispensáveis para <em> degradação Deg1 -Sec62, sugerindo um novo mecanismo de degradação 32. Sob condições de ligação e de associação de lípidos prejudicada translocon prolongada, apolipoproteína B, o componente de proteína das lipoproteínas de baixa densidade de mamíferos, parece ser degradada por um mecanismo relacionado 36-38. Portanto, Deg1 -Sec62 pode proporcionar um modelo útil para a degradação de proteínas associadas a translocon medicamente relevantes.
Tipo selvagem e hrd1Δ células de levedura que não possuem o gene HIS3 cromossómico foram transformadas com um vector vazio 39 ou um plasmídeo que codifica Deg1 -Sec62-His3 e mancha num meio de crescimento selectivo (Figura 4). Para confirmar que os números iguais de células de levedura transformadas foram transferidas para placas, as células foram manchados em meio sem triptofano (que selecciona para células portadoras do plasmídeo), mas com histidina. Crescimento semelhante foi observado para todas as células de levedura transformadas.As células que expressam Deg1 -Sec62-His3 eram esperados para crescer na ausência de histidina apenas quando a proteína de fusão é estabilizado (isto é, quando ERAD-T é comprometida). Com efeito, hrd1Δ levedura expressando Deg1 -Sec62-His3 exibiu uma vantagem de crescimento relativamente às células de tipo selvagem que expressam Deg1 -Sec62-His3 em falta triptofano e histidina médio. No entanto, marcou-fusão crescimento dependente da proteína na ausência de histidina foi observada mesmo na presença de Hrd1. A fim de aumentar o rigor do ensaio, o meio sem histidina foi suplementado com 3-amino-1H-1,2,3-triazole (3-AT), um inibidor competitivo da enzima His3 40. A levedura que expressa Hrd1 cresceu muito pouco em meio sem histidina suplementado com 1 - 2 mM de 3-AT; quando HRD1 foi eliminado, o crescimento celular foi restaurado. Inclusão de 3-AT, a uma concentração de 3 mM de crescimento dramaticamente inibido de todas as células, independentemente da presença ou ausência de Hrd1. Estes res ÜLTS são consistentes com a degradação do substrato Hrd1-dependente.
Em seguida, a abundância de estado estacionário da proteína Deg1 -Sec62-His3 em levedura expressando ou falta da enzima Hrd1 foi diretamente testada. Western blotting indicou um aumento comparável em Deg1 -Sec62-His3 e proteína Deg1 -Sec62 hrd1Δ em levedura em relação às células do tipo selvagem (Figura 5). Isto confirma um papel para Hrd1 na regulação dos níveis de ambas as proteínas. Degradação Hrd1 dependente de Deg1 -Sec62 prossegue após a proteína aberrante engata a translocon ER 32. Importante, Deg1 -Sec62-His3 aberrantemente engata a translocon de um modo semelhante (dados não publicados), validando ainda a utilização de Deg1 -Sec62-His3 como um repórter baseado em crescimento para a degradação de Deg1 -Sec62 especificamente e proteínas associadas à translocon geral.
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Figura 2:.. Modelo para a degradação de Deg1 -Sec62 seguinte engajamento translocon aberrante (A) Representação esquemática de Deg1 -Sec62 Deg1 (os 67 aminoácidos amino-terminal de MATα2) é seguido, em ordem, pelo Flag (F) epitopo , o 2-transmembranar retículo endoplasmático (ER) proteína sec62, e duas cópias do S. aureus Protein A (PRA). Para maior clareza, a proteína de fusão é referido como Deg1 -Sec62. (B) A seguir à inserção normal dos seus dois segmentos transmembranares para a membrana do RE, a interacção persistente de Deg1 -Sec62 com o translocon desencadeia anormal, Deg1 dependente translocon acoplamento. Uma porção da cauda amino-terminal inicialmente citossólica aberrantemente entra-e provavelmente permanece dentro translocon-a. (C) Seguindo engagemen translocon anormaist, Hrd1 reconhece e ubiquitylates Deg1 -Sec62. Círculos a vermelho indicam moléculas de ubiquitina. (D) Deg1 -Sec62 é então extraído a partir da membrana do ER e degradado pelo proteassoma, aliviando provável obstrução translocon.
Figura 3:. Representação esquemática Deg1 -Sec62-His3 seguinte engajamento translocon aberrante Deg1 é seguido, em ordem, pelo Flag (F) epitopo, a proteína ER-2 transmembrana sec62, duas cópias do S. aureus Proteína A (PRA), e a enzima His3 levedura. Para maior clareza, a proteína de fusão é referido como Deg1 -Sec62-His3.
Figura 4: Fusão His3 para Deg1 (HRD1) e hrd1Δ levedura transformada com um vector vazio ou um plasmídeo que codifica Deg1 -Sec62-His3 foram manchados em falta triptofano média, média falta triptofano e histidina e meio sem triptofano e histidina suplementado com 3-amino-1H-1,2,3-triazol (3-AT), um inibidor competitivo da His3, nas concentrações indicadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura .
Figura 5:. O aumento da abundância de Deg1 -Sec62 e Deg1 -Sec62-His3 em células sem Hrd1 Os extractos proteicos foram preparados a partir do tipo selvagem (+) e hrd1Δ(Δ) levedura expressando Deg1 -Sec62 ou Deg1 -Sec62-His3. Proteínas (equivalente a 0,125 OD 600 unidades) foram separadas por SDS-PAGE, seguida por western blotting com anticorpos secundários de coelho anti-rato, que se ligam directamente os epitopos de Proteína A das proteínas de fusão. Western blotting subsequente com anticorpos específicos para PGK1 fornece um controlo de carga.
| Solução | Componentes | Comentários | ||
| Definido sintética (SD) Meio Mínimo Levedura | 2% de dextrose, 0,67% de base de azoto de levedura sem aminoácidos, 0,002% de adenina, uracilo 0,004%, 0,002%, arginina, histidina 0,001%, 0,006%, isoleucina, leucina 0,006%, 0,004% de lisina, 0,001% de metionina, 0,006% de fenilalanina, 0,005 % treonina, triptofano 0,004%. Para (placa) em meio sólido, incluem 2% agar. | 1. meio selectivo é preparado por omitindo apácido amino propriate (s) ou bases nitrogenadas. | ||
| 2. Por razões de conveniência, estes ingredientes podem ser mantidas como soluções stock concentradas como se segue. Os aminoácidos podem ser mantidas como concentrado 100X solução que contém todos os aminoácidos desejados. Base azotada de levedura pode ser mantido numa solução estoque 20X (13,4%). Dextrose pode ser mantido numa solução estoque de 40%. Adenina e uracilo podem ser mantidas como soluções a 1% em banco de NaOH 0,1 M. | ||||
| 3. Esterilizar médio por autoclavagem. | ||||
| 1X Tampão de amostra de Laemmli | 2% de SDS, 10% glicerol, 5% β-mercaptoetanol, 60 mM de Tris HCl pH 6,8, 0,008% de azul de bromofenol | 1. tampão de amostra 1X é muitas vezes preparada diluindo um (por exemplo, 5X) estoque mais concentrado. | ||
| 2. O corante azul de bromofenol pode ser adicionado a intensidade desejada. Um "pinch" (muito pequena quantidade extraído da extremidade de uma espátula) é tipicamente suficiente. | ||||
| 0,2 M de Hidróxido de Sódio | Prepare-se com água. O hidróxido de sódio reage com o vidro. Por conseguinte, para armazenamento a longo prazo, de hidróxido de sódio 0,2 M deve ser mantido em recipientes de plástico. | |||
| Laemmli tampão de corrida (5x) | 125 mM de Tris, 960 mM glicina, 0,5% de SDS | Para preparar 1 L de 1X tampão de corrida Laemmli, dilua 1: 5 em dH2O | ||
| Tris-Acetato SDS Transferência Buffer (5x) | 125 mM de Tris acetato (pH 8,8), 960 mM de glicina, 0,05% de SDS | Para preparar 20 L de 1X Tris-Acetato-SDS Tampão de Transferência, combinar 4 L de estoque de 5X, 4 L de metanol, e 12 L de dH2O | ||
| 10X Tris Saline (TBS) | Tris 500 mM, NaCl 1,5 M; pH ajustado para 7,5 | Para preparar 1 L de 1X TBS, diluir 1:10 em dH 2 O. 1X TBS pode ser suplementado com o detergente Tween-20 e leite magro em pó, como apropriado. |
| Strain Nome | Pseudônimo | Genótipo Relevante | Figuras | Fonte |
| VJY6 | MHY500 | MATa | 4 e 5 | Chen et al., 1993 |
| his3-Δ200 | ||||
| leu2-3,112 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| Gal2 | ||||
| VJY10 | MATa | 4 e 5 | Este estudo | |
| his3- Δ 200 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| Gal2 | ||||
| hrd1 :: kanMX4 |
Tabela 2:. Levedura estirpes utilizadas neste estudo Pormenores de construção estão disponíveis mediante solicitação.
| Número plasmídeo | Nome Completo plasmídeo | Figura | Fonte |
| pVJ30 | pRS414-P MET25 -Deg1 -flag-Sec62-2xProtA | 5 | Rubenstein et al., 2012 |
| pVJ121 | pRS414-P MET25 (vector vazio com MET25 promotor) | 4 | Mumberg et al., 1994 |
| pVJ467 | pRS414-P MET25 -Deg1 -flag-Sec62-2xProtA-His3 | 5 | Este estudo |
| pVJ477 | pRS414-P GAL4 -Deg1 -flag-Sec62-2xProtA-His3 | 4 | Este estudo |
Tabela 3:. Os plasmídeos usados neste estudo Note-se que todos os plasmídeos contêm um centrómero de levedura para permitir a replicação em células de levedura, o gene TRP1 para selecção em células de levedura, e o gene AmpR para a manutenção em células bacterianas. Mapas de plasmídeos, seqüências e detalhes de construção estão disponíveis mediante solicitação.
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Discussion
A metodologia aqui apresentada permite a determinação rápida e confirmação bioquímica dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas em células de levedura. Este estudo destacou a utilidade e poder de levedura como um organismo modelo eucariótica (vários excelentes comentários da biologia fermento e compilações de protocolos para manuseio, armazenamento e manipulação de células de levedura (por exemplo, 41-44) estão disponíveis para os investigadores novos para o organismo). As técnicas podem ser facilmente aplicado para investigar a degradação ea abundância de uma variedade de classes de proteínas. Por exemplo, outros têm utilizado esta estratégia para caracterizar os mecanismos de degradação de cytosolic instável, nuclear, e ER luminal e proteínas transmembrana 45-49.
Alguns factores devem ser considerados na escolha da enzima metabólica para fundir a uma proteína instável. Em primeiro lugar, é essencial que uma versão funcional do gene que codifica a enzima nãoestar presente no genoma do hospedeiro. Para minimizar os falsos resultados positivos (ou seja, o crescimento em condições selectivas quando a proteína é realmente instável degradado), recomenda-se trabalhar com estirpes que albergam não revertente alelos mutantes do gene repórter (deleções de genes completos de preferência) 50. Outra consideração para selecção enzima repórter é a disponibilidade de inibidores competitivos, os quais podem ser incluídos no meio de crescimento selectivo para reduzir o crescimento de fundo e aumentar ensaio rigor. Isto pode ser útil em casos de proteínas com taxas de rotação relativamente baixas, mesmo na presença de mecanismos de degradação totalmente funcionais. Nas experiências representativas apresentadas aqui, a inclusão de 3-AT, que inibe competitivamente a enzima His3, reduz o crescimento de fundo 40. Do mesmo modo, o composto 6-azauracilo inibe Ura3, uma enzima necessária para a biossíntese de uracilo 51. A concentração de inibidor à qual o crescimento ocorre em degradação-defective, mas não de tipo selvagem, as células devem ser determinadas empiricamente. Algumas enzimas metabólicas também podem ser contra-selecionado contra. Sob condições de contra-selectiva, as células podem crescer apenas quando a proteína instável é degradado (e a enzima metabólica fundido não está presente). Por exemplo, Ura3 converte o composto de ácido 5-fluoroor�ico (5-FOA) para o composto tóxico, 5-fluorouracilo 52. As células que expressam uma proteína de fusão Ura3-só vai crescer na presença de 5-FOA se a proteína de fusão é degradada Ura3. Da mesma forma, o composto de ácido 5-fluoroantranílico (5-FAA) é tóxico para as células com uma via de biossíntese do triptofano funcional. 5-FAA pode assim ser utilizada para contra-seleccionar as células que expressam as proteínas de fusão de 53 TRP1. Estratégias de Counter-seleção pode ser útil para a identificação de supressores de mutações que prejudicam degradação.
O promotor utilizado para conduzir a expressão de um repórter degradação também deve ser cuidadosamente seleccionada. Como os baixos níveis de Biosynthenzimas etic pode ser suficiente para suportar o crescimento na ausência de metabolito fornecido exogenamente, um promotor fraco é recomendado 54. Nas experiências representativas aqui apresentados, o promotor GAL4, o qual é reprimida em presença de glucose 55, é utilizado para promover a transcrição de Deg1 -Sec62-His3. Expressão basal dessa proteína de fusão sob condições reprimidas (ou seja, 2% de glucose) é suficiente para suportar o crescimento sob condições selectivas (por exemplo, ausência de histidina e na presença de 1 - 2 mM de 3-AT), quando o mecanismo de degradação é desactivado. No entanto, os níveis de proteína suficientes para suportar o crescimento sob condições selectivas são susceptíveis de ser inferior ao limiar de detecção por transferência Western. Por conseguinte, pode ser necessário para conduzir a expressão com um promotor fraco para o ensaio de crescimento e um promotor forte para confirmação bioquímica. No caso de Deg1 -Sec62 (com ou sem a fusão His3), um mais Robust promotor (neste caso, o promotor MET25 39) é necessária para a visualização da proteína por análise de Western.
Como descrito aqui, o ensaio de crescimento baseado em levedura pode ser realizada em, uma abordagem baseada no candidato de pequena escala. As diluições em série de células de levedura são preparadas de uma placa de 96 poços e transferido por pipetagem para meio de crescimento sólido; Num método alternativo para a transferência eficiente e reprodutível de suspensões de células de levedura no meio de cultura sólido diluído é o uso de um replicador de multi-pino, normalmente referido como um "frogger" 56. O tempo ideal para fotografar placas vai variar de acordo com cepas de leveduras e condições. Recomenda-se a fotografar um determinado prato quando colônias a partir da cultura que mais cresce se tornar o primeiro visível no local mais diluído. Isso normalmente é o ponto em que as diferenças nas taxas de crescimento entre as amostras são mais óbvias. Pode ser aconselhável para tirar fotografias em vários dias, em particular no caso de leveduraexibindo uma ampla gama de taxas de crescimento.
O ensaio de repórter baseado em crescimento pode também ser adaptado para análises de grande escala. Por exemplo, um repórter degradação pode ser introduzido em uma biblioteca disponível no comércio de ~ 5000 estirpes haplóides viáveis de deleção do gene de levedura que utilizam a tecnologia de matriz genética sintética 46,57 (SGA). Nesta técnica, uma estirpe de levedura haplóide com uma proteína metabólica cromossomicamente integrada fusão repórter é acoplado a cada uma das estirpes de deleção do gene da biblioteca. As células diplóides resultantes são induzidas a esporulação (sofrer meiose) e submetidas a selecção para a descendência meiótica haplóide albergando tanto o repórter metabólica e deleções de genes individuais. Estas estirpes são então transferidos em massa para meio selectivo para as células em que tenha sido estabilizada a proteína. Tal como para as análises de pequena escala, se um gene com um papel na degradação de proteínas é eliminado, a proteína de fusão será estabilizada, e o crescimento celular será melhorada. Um Comparávelpproaches foram concebidas que permitem a transformação simultânea de uma grande coleção de cepas com-chromosomally extras plasmídeos mantidos; esta estratégia evita integração cromossômica, acasalamento, esporulação, e seleção meiotic 54.
Quando é encontrada uma mutação para conferir uma vantagem de crescimento às células abrigando um repórter metabólica, é necessário confirmar que bioquimicamente a mutação aumenta a abundância da proteína de interesse. Um procedimento de levedura lise rápida e fiável, estreitamente adaptado a partir do método de Kuhsnirov 31, é apresentada. Este protocolo permite a extracção de proteínas de uma forma directamente adequados para análise por transferência de western. Para a análise de uma determinada proteína, a quantidade de lisado para ser carregado por poço, as propriedades do gel de acrilamida, a escolha da membrana, os anticorpos utilizados e respectivas diluições, o método de detecção deve ser determinada empiricamente. O protocolo de transferência de western representativo descrito utilizes anticorpos secundários conjugados com corantes fluorescentes; outros protocolos vulgarmente utilizados dependem de enzimas quimioluminescência dependente de anticorpo conjugado 58. Como descrito aqui, a membrana utilizada para detectar a proteína de interesse pode ser directamente sondado com um anticorpo para uma proteína de controlo de carga. Se os anticorpos primários utilizados para detectar a proteína de interesse e da proteína de controlo de carga ter sido levantada a partir da mesma espécie, reprobing a membrana é possível desde que as bandas resultantes destas proteínas não co-migrar. Se, no entanto, os anticorpos primários utilizados para detectar a proteína de interesse e da proteína de controlo de carga ter sido levantada a partir de espécies diferentes, a mesma membrana pode ser sondada sequencialmente, mesmo se as bandas co-migrar, se os anticorpos secundários foram conjugados com fluoróforos com diferentes comprimentos de onda de emissão. No caso em que a proteína de interesse e de controlo de carga de proteína de co-migração e os respectivos anticorpos primários foram raised a partir da mesma espécie, as amostras podem ser resolvidos em dois géis de SDS-PAGE, transferidos para membrana de PVDF e sondadas separadamente com anticorpos específicos para a proteína de interesse e de controlo de carga de proteína. Em alternativa, o carregamento pode ser consistência julgado por incubação de membranas com manchas de proteínas não específicas (por exemplo, Coomassie ou Ponceau S). Além disso, o protocolo de transferência de western representante assume uma proteína ou um epítopo que é detectada por incubação sequencial de anticorpos primários e secundários, como é típico. As proteínas de fusão analisadas nos resultados representativos contêm dois epitopos derivados a partir de Staphylococcus aureus de Proteína A (PRA nas Figuras 2 e 3). Proteína A se liga directamente a imunoglobulinas de mamíferos e, por conseguinte, pode ser detectado utilizando o anticorpo secundário sozinho (isto é, sem o passo de incubação é necessário o anticorpo primário) 59. É possível que a fusão de uma enzima repórter podem influenciar a proteína ou abundânciadegradação. Portanto, é aconselhável para confirmar bioquimicamente os resultados usando uma versão do substrato livre de proteína repórter. Finalmente, ambos os ensaios aqui descritos dependem de diferenças nos níveis de proteína em estado de equilíbrio como um proxy para as diferenças de estabilidade da proteína. Porque abundância de proteínas reflete a integração das taxas de síntese e degradação de proteínas, além de análises bioquímicas (por exemplo cicloheximida perseguição ou pulso de perseguição experimentos) deve ser empregado para analisar diretamente perfil de degradação dinâmica de uma proteína.
Os resultados representativos estabelecer uma nova aplicação deste protocolo para a determinação de requisitos genéticos para a degradação de uma proteína que envolve o aberrante translocon ER. Deg1 -Sec62-His3 conferiu uma vantagem de crescimento de levedura em condições selectivas quando a via de degradação foi inativada (ou seja, em a ausência da ubiquitina-ligase Hrd1). A rápida e confiável proteína exmétodo tração seguida por western blotting confirmou um aumento na abundância de Deg1 -Sec62 (com ou sem His3) na ausência de Hrd1. Estudos anteriores indicam que o mecanismo de degradação Hrd1-dependente de proteínas associadas a translocon difere da de outras Hrd1 ER luminais ou transmembranares substratos 32. O trabalho futuro vai empregar a proteína de fusão Deg1 -Sec62-His3 em telas genética em larga escala para identificar novos genes necessários para o mecanismo de degradação único.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos membros atuais e antigos do laboratório Rubenstein para proporcionar um ambiente de apoio e entusiasmo pesquisa. Agradecemos Ryan T. Gibson de assistência em otimização de protocolo. Agradecemos Mark Hochstrasser (Universidade de Yale) e Dieter Wolf (Universität Stuttgart) para cepas de leveduras e plasmídeos. Agradecemos aos nossos revisores anônimos por sua ajuda para melhorar a clareza ea utilidade deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um prémio de investigação a partir do capítulo Ball State University de Sigma Xi para SGW, a National Institutes of Health subvenção (R15 GM111713) para EMR, um prémio de investigação Ball State University aspirar a EMR, e fundos da Ball State University Gabinete do Reitor e do Departamento de Biologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
| 3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs. |
| Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer. |
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers. |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes. |
| Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) | Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
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Biologia Molecular Edição 96 sistema ubiquitina-proteassoma,
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