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Biology

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/52428
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital
* These authors contributed equally

Abstract

La degradación de proteínas regulado es crucial para prácticamente todas las funciones celulares. Gran parte de lo que se conoce acerca de los mecanismos moleculares y los requisitos genéticos para la degradación de proteínas eucariotas se estableció inicialmente en Saccharomyces cerevisiae. Los análisis clásicos de la degradación de proteínas se han basado en pulso-caza y cicloheximida-caza metodologías bioquímicas. Aunque estas técnicas proporcionan medios sensibles para la observación de la degradación de proteínas, que son laboriosos, consumen mucho tiempo, y de bajo rendimiento. Estos enfoques no son susceptibles de cribado rápido o a gran escala para las mutaciones que impiden la degradación de proteínas. Aquí, se describe un ensayo basado en el crecimiento de la levadura para la identificación fácil de los requisitos genéticos para la degradación de la proteína. En este ensayo, una enzima reportero requerido para el crecimiento bajo condiciones selectivas específicas se fusiona a una proteína inestable. Las células que carecen de la enzima reportero endógena pero que expresan la proteína de fusión puede crecer bajo selecondiciones ctive sólo cuando se estabiliza la proteína de fusión (es decir, cuando se ve comprometida la degradación de proteínas). En el ensayo de crecimiento descrito aquí, diluciones en serie de tipo salvaje y células de levadura mutantes que albergan un plásmido que codifica una proteína de fusión se manchan sobre medio selectivo y no selectivo. Crecimiento en condiciones selectivas es consistente con la degradación de deterioro por una mutación dada. El aumento de la abundancia de proteínas debe ser confirmada bioquímicamente. Un método para la rápida extracción de proteínas de levadura en una forma adecuada para la electroforesis y transferencia Western también se demuestra. Una lectura basada en el crecimiento para la estabilidad de la proteína, combinado con un protocolo sencillo para la extracción de proteína para el análisis bioquímico, facilita la rápida identificación de los requisitos genéticos para la degradación de la proteína. Estas técnicas se pueden adaptar para controlar la degradación de una variedad de proteínas de vida corta. En el ejemplo presentado, la enzima His3, que se requiere para la biosíntesis de histidina, se fusionóa Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 está destinada a la degradación después de que encaje de forma aberrante translocón retículo endoplásmico. Las células que albergan Deg1 -Sec62-His3 fueron capaces de crecer en condiciones selectivas cuando se estabilizó la proteína.

Introduction

La degradación de proteínas selectiva es esencial para la vida eucariota, y la degradación de proteínas alterada contribuye a una serie de condiciones médicas, incluyendo varios tipos de cáncer, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares, y la fibrosis quística 1-5. El sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), que cataliza la degradación selectiva de proteínas, es una diana terapéutica emergente para estas condiciones 6-10. Ubiquitina ligasas unir covalentemente polímeros de la ubiquitina de ácido 76-amino de proteínas 11. Las proteínas que se han marcado con cadenas poliubiquitina son reconocidos y proteolizadas por los ~ 2.5 megadalton proteasoma 26S 12. Los estudios iniciados en el organismo eucariota modelo Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes) han sido fundamental en la elucidación de los mecanismos de degradación de proteínas en células eucariotas. El primer sustrato fisiológico demostrada del UPS era la levadura represor transcripcional MATα2 13, Primero se identificaron 14, y muchos componentes altamente conservadas de la UPS o caracterizadas en la levadura (por ejemplo, 15-26). Los descubrimientos hechos en este modelo versátil y manejable de forma genética organismo es probable que continúe proporcionando importantes conocimientos sobre conservados mecanismos de degradación mediada por ubiquitina.

El reconocimiento y la degradación de la mayoría de los sustratos de UPS requieren la acción concertada de múltiples proteínas. Por lo tanto, un objetivo importante en la caracterización de la degradación regulada de una proteína dada es inestable para determinar los requisitos genéticos para la proteólisis. Los enfoques clásicos (por ejemplo de pulso-caza y experimentos cicloheximida-caza 27) para el seguimiento de la degradación de proteínas en células de mamífero o de levadura son laborioso y consume mucho tiempo. Si bien estos tipos de metodología proporcionan medios altamente sensibles para la detección de la degradación de proteínas, que no son adecuados para el análisis rápido de la degradación de proteína o Prueba de detección a gran escalang para mutaciones que impiden la degradación de proteínas. Aquí, se presenta un ensayo basado en un crecimiento de la levadura para la rápida identificación de los requisitos genéticos para la degradación de las proteínas inestables.

En el método basado en el crecimiento de la levadura para el análisis de la degradación de proteínas, una proteína inestable de interés (o señal de degradación) se fusiona, en marco, a una proteína que se requiere para el crecimiento de la levadura bajo circunstancias específicas. El resultado es un sustrato artificial que puede servir como una herramienta de gran alcance para determinar los requisitos genéticos de degradación de las proteínas de la proteína inestable de interés. Convenientemente, las cepas de levadura de laboratorio más comúnmente utilizados albergan un panel de mutaciones en genes que codifican enzimas metabólicas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos particulares o bases nitrogenadas (por ejemplo, 20,28-30). Estas enzimas son esenciales para la proliferación celular en ausencia de proporcionadas exógenamente metabolitos en cuya síntesis las enzimas participan. Talenzimas metabólicas pueden así funcionar como reporteros basadas en el crecimiento de la degradación de las proteínas inestables a las que se fusionan. Los requisitos genéticos para la degradación de la proteína pueden ser dilucidado fácilmente, ya que las mutaciones que impiden la proteolisis se permitir que las células que albergan el reportero de la degradación crezcan bajo condiciones selectivas.

Una ventaja de crecimiento es una indicación indirecta de que una mutación particular aumenta la abundancia de la proteína de interés. Sin embargo, se requiere un análisis bioquímico directo a confirmar que una mutación permite el crecimiento mediante el aumento de los niveles de proteína en lugar de a través de las causas indirectas o artefactos. El efecto de una mutación en la abundancia de proteínas puede ser confirmado por Western blot de los niveles de proteína en estado de equilibrio en las células que hacen y no albergan la mutación particular. Un método para la extracción rápida y eficiente de las proteínas de levadura (incubación secuencial de células de levadura con hidróxido de sodio y tampón de muestra) en una forma adecuadapara el análisis por transferencia de Western también se presenta 31. En conjunto, estos experimentos facilitar la rápida identificación de los reguladores candidatos de la degradación de proteínas.

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Protocol

1. Ensayo de crecimiento de la levadura para identificar mutantes candidatos defectuosos en la degradación de proteínas

  1. Transformar de tipo salvaje y células de levadura mutante con un plásmido que codifica una proteína inestable fusionado, en cuadro, a una enzima metabólica reportero.
  2. Inocular los transformantes en 5 ml de sintético definido (SD) medio mínimo que es selectivo para células que albergan moléculas de plásmido. Incubar durante la noche a 30 ° C, en rotación.
  3. Medir la densidad óptica a 600 nm (OD 600) de cada cultivo de una noche.
    NOTA: Después de la incubación durante la noche, las células en cultivo puede estar en fase de crecimiento logarítmico o estacionario, pero deberá haber alcanzado una OD 600 de 0,2 mínimo. Cepas de levadura de crecimiento muy lento pueden requerir tiempos de incubación más de una noche, o la inoculación de un mayor número de células, tal como se determina empíricamente.
  4. Preparar seis veces diluciones en serie de células de levadura transformadas en una placa de 96 pocillos estériles, a partir de células diluidas a unan OD 600 de 0,2. Coloque cada transformante de levadura a ensayar en una fila diferente en la placa de 96 pocillos.
    1. Para cada transformante, calcular el volumen de cultivo de una noche requerido para diluir las células hasta una DO 600 de 0,2 en un volumen final de 200 microlitros. Añadir este volumen de cultivo durante la noche al pocillo correspondiente en la columna 1. Añadir la cantidad apropiada de agua estéril para llevar el volumen a 200 l.
    2. Para cada fila de la levadura, añadir 125 l de agua estéril a los pocillos en las columnas 2, 3, y 4.
      NOTA: placas de 96 pocillos estériles envueltas individualmente pueden envasarse con tapas estériles. Las tapas pueden ser utilizados como depósitos para el agua estéril que se distribuye en este paso. Esto permite la transferencia simultánea de agua estéril a todos los pocillos en una columna dada con una pipeta multicanal.
    3. Mezclar el contenido de la primera columna (levadura diluida a un OD 600 de 0,2) pipeteando arriba y abajo con una pipeta multicanal.
    4. Transfer 25 l de levadura de la Columna 1 Columna 2, utilizando una pipeta multicanal. Mezclar pipeteando arriba y abajo. Transferencia de 25 l de la Columna 2 a columna 3, y 25 l de la columna 3 a la columna 4 (mezclando bien en cada paso).
  5. Mezclar cada muestra con una pipeta multicanal. Partiendo de más diluido para diluir menos columnas de levadura, pipeta de 4 l de cada muestra en dos placas que contenían el medio selectivo apropiado. Utilice una placa con medio que mantiene la selección del plásmido (Esta placa sirve como un manchado levadura y el control del crecimiento). Utilice una segunda placa con medio que selecciona para el mantenimiento del plásmido y la expresión de la proteína inestable fusionado a la enzima informadora. Debido a que la levadura resolver rápidamente, mezclar células pipeteando arriba y abajo a intervalos regulares.
    NOTA: Secador placas serán más fácilmente absorber líquidos que los platos recién preparados y por lo tanto se recomienda para estos experimentos. Placas húmedas se pueden secar por incubación a temperatura ambiente en low humedad durante 1-2 días o incubaciones cortas en una campana de flujo laminar. Las placas pueden secar de forma desigual si el flujo de aire laminar es paralelo a la mesa. El uso de una plantilla hace que sea más fácil de detectar células de levadura a distancias regulares. Dos plantillas de ejemplo se proporcionan en la Figura 1. Estos pueden ser impresas, cortadas y colocadas en el interior de un plato de Petri tapa.
  6. Permita que las placas se sequen en la parte superior del banco.
  7. Incubar las placas a 30 ° C durante 2-6 días.
  8. Fotografiar cada placa después de la incubación.

Figura 1
Figura 1. Las plantillas para la detección de células de levadura en placas de agar de 100 mm. Estas plantillas se pueden usar para facilitar la detección de la levadura a distancias regulares con una pipeta multicanal. Las plantillas pueden ser impresas, cortadas y colocadas en el interior de un plato de Petri tapa. Coloque placa de Petri con el crecimientointerior de la tapa medio con plantilla fija. Plantillas están marcados con una muesca para realizar un seguimiento de la orientación. Se recomienda que las placas utilizadas en los ensayos de crecimiento ser marcados de manera similar con una muesca para realizar un seguimiento de la orientación. Plantillas para la detección de cuatro (A) o cinco (B) se proporcionan diluciones seriadas de células de levadura. Haga clic aquí para ver una versión imprimible de esta figura con plantillas de 100 mm.

2. Ensayo de confirmación bioquímica de crecimiento de la levadura

  1. El crecimiento de células de levadura y Post-alcalina proteína Extracción (modificado de 31)
    1. Transformar de tipo salvaje y células de levadura mutante con un plásmido que codifica la proteína inestable.
    2. Inocular los transformantes en 5 ml de medio SD que es selectivo para células que albergan moléculas de plásmido. Incubar durante la noche a 30 ° C, en rotación.
    3. Mida el diámetro exterior 600 de cada cu nochelture.
      NOTA: Después de la incubación durante la noche, las células pueden estar en cualquier fase de crecimiento logarítmico o estática, pero han llegado a un OD 600 que permita la dilución a un OD 600 de 0,2 en 10 ml de medio selectivo fresco (etapa 2.1.4). Cepas de levadura de crecimiento muy lento pueden requerir tiempos de incubación más de una noche, o la inoculación de un mayor número de células, tal como se determina empíricamente.
    4. Diluir las células de levadura a un OD 600 de 0,2 en 10 ml de medio selectivo fresco.
    5. Continuar incubar las células a 30 ° C, rotación o agitación, hasta que los cultivos alcancen un OD 600 entre 0,8 y 1,2 (es decir, están en crecimiento semilogarítmica).
      NOTA: Si la proteína inestable de interés está bajo el control de un promotor regulable, el momento óptimo de la inducción de la expresión de la proteína y la cosecha de células puede variar de acuerdo con estudios previos u observaciones empíricas.
    6. Recoger 2,5 OD 600 unidades de cultivo en un 15 ml cónicaal tubo por centrifugación a 5000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración.
      NOTA: Una OD 600 unidad se define como la cantidad de levadura presente en 1 ml de cultivo a una DO 600 de 1,0. El volumen de cultivo (en ml) requerida para cosechar 2,5 OD 600 unidades (V) se puede determinar usando la siguiente ecuación: V = 2,5 OD 600 unidades / OD Medido 600
    7. Resuspender las células en 1 ml de agua destilada. Transferencia de células suspendidas a un tubo de microcentrífuga.
    8. Sedimentar las células por centrifugación a 6500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración.
    9. Resuspender las células en 100 l de agua destilada con la pipeta hacia arriba y abajo o vórtice, y añadir 100 l de 0,2 M de NaOH. Mezclar pipeteando arriba y abajo. Incubar las muestras durante 5 min a temperatura ambiente.
    10. Células de pellets (la mayoría de los cuales aún no han lanzado proteínas y son todavía viables) por centrifugación a 18.000 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración.
    11. Resuspender pellet en 50 - 100 l de tampón de muestra Laemmli 1x, el cual lisar las células, pipeteando arriba y abajo o agitación con vórtex.
      NOTA: La eliminación del sobrenadante después de la centrifugación alcalina y posterior resuspensión de las células en tampón de muestra Laemmli extrae proteínas a un pH compatible con sodio dodecil sulfato de electroforesis en gel-poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando un sistema de tampón de Tris-glicina y Western Blot.
    12. Para desnaturalizar completamente proteínas, se incuban los lisados ​​a 95 ° C durante 5 min.
      NOTA: Las proteínas de agregación propensos (por ejemplo, proteínas con varios segmentos de transmembrana) pueden llegar a ser insolubles cuando se incuba a 95 ° C. Por lo tanto, los lisados ​​deben incubarse a temperaturas más bajas (por ejemplo 37 ° C - 70 ° C) durante 10 a 30 min, determinado como empíricamente, para el análisis de tales proteínas.
    13. Super lisados ​​mediante la colocación en hielo durante 5 min.
    14. Centrifugar a lisados ​​18000 xg durante 1 min a temperatura ambiente para sedimentar el material insoluble. Separar el sobrenadante (proteína extraída solubilizado) por SDS-PAGE antes del análisis de transferencia de western posterior (sección 2.2). Como alternativa, las tiendas lisados ​​a -20 ° C.
  2. Representante Protocolo de Transferencia Western
    1. Cargar empíricamente determinado volumen de lisados ​​en un gel de SDS-PAGE.
    2. Ejecutar gel a 200 V hasta el frente de colorante ha alcanzado la parte inferior del gel.
    3. Transferencia de proteínas a partir de gel de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de la membrana por transferencia en húmedo a 20 V para 60 a 90 min a 4 ° C.
    4. Bloquear la membrana por incubación en leche descremada al 5% en Tris-solución salina tamponada (TBS), oscilación, durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
    5. Decantar la solución de bloqueo.
    6. Incubar la membrana con el anticuerpo primario específico para la proteína de interés (o etiqueta de epítopo de los mismos) en 1% de leche desnatada en TBS con 0,1% de Tween-20 (TBS / T) durante 1 h en la sala de temperatura, meciéndose.
    7. Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo.
    8. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en 1% de leche desnatada en TBS / T durante 1 hora a temperatura ambiente, de balanceo.
      NOTA: Debido a fluoróforos son sensibles a la luz, las diluciones de anticuerpos fluoróforo conjugado deben prepararse en la oscuridad. Además, la incubación de las membranas en la presencia de anticuerpos conjugado con fluoróforo debe ocurrir en recipientes a prueba de luz. Esto puede lograrse envolviendo las bandejas de incubación en papel de aluminio.
    9. Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo.
    10. Adquirir imagen de membrana utilizando Li-Cor Odyssey CLx y el software Image Studio (o equipos de imagen comparable y software), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
    11. Después de la formación de imágenes de la membrana, se incuba la membrana con un anticuerpo primario específico para una cargaing proteína de control en 1% de leche desnatada en TBS / T durante 1 hora a temperatura ambiente, meciéndose.
    12. Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo.
    13. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en 1% de leche desnatada en TBS / T durante 1 hora a temperatura ambiente, de balanceo.
    14. Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo.
    15. Adquirir imagen de membrana utilizando Li-Cor Odyssey CLx y el software Image Studio (o equipos de imagen comparable y software), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

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Representative Results

Para ilustrar esta metodología, la enzima His3 se ha fusionado con el extremo carboxi-terminal del modelo de retículo endoplásmico (ER) la degradación -Associated (ERAD) sustrato, Deg1 -Sec62 (Figura 2A) para crear Deg1 -Sec62-His3 (Figura 3) . Deg1 -Sec62 representa uno de los fundadores de una nueva clase de sustratos ERAD que están dirigidos siguiente persistente, asociación aberrante con la translocon, el canal de los principales responsables de las proteínas en movimiento a través de la membrana del RE 32-34. Tales proteínas inestables provisionalmente han sido llamados ERAD-T (para translocón asociada) sustratos. Estudios previos indican que, tras el acoplamiento translocon aberrante, Deg1 -Sec62 está destinada a la degradación por la ubiquitina ligasa Hrd1 (Figura 2B-D) 32, 34, 35. Factores necesarios para la degradación de otros sustratos HRD1 parecen ser prescindible para <em> degradación Deg1 -Sec62, lo que sugiere un nuevo mecanismo de degradación 32. En condiciones de alteración de lípidos vinculante y asociación translocon prolongada, apolipoproteína B, el componente proteico de las lipoproteínas de baja densidad de mamíferos, parece estar degradado por un mecanismo relacionado 36-38. Por lo tanto, Deg1 -Sec62 puede proporcionar un modelo útil para la degradación de las proteínas translocon asociada médicamente relevantes.

Las células de tipo salvaje y hrd1Δ levadura que carecen del gen HIS3 cromosómica se transformaron con un vector vacío 39 o un plásmido que codifica Deg1 -Sec62-His3 y avistados en medio de crecimiento selectivo (Figura 4). Para confirmar que los números iguales de células de levadura transformadas se transfirieron a placas, las células fueron vistos en medio que carece de triptófano (que selecciona las células que albergan el plásmido), sino que contiene histidina. Se observó un crecimiento similar para todas las células de levadura transformadas.Se esperaba que las células que expresan Deg1 -Sec62-His3 para crecer en ausencia de histidina sólo cuando se estabiliza la proteína de fusión (es decir, cuando ERAD-T se ve comprometida). De hecho, hrd1Δ levadura que expresa Deg1 -Sec62-His3 exhibió una ventaja de crecimiento en relación con las células de tipo salvaje que expresan Deg1 -Sec62-His3 en triptófano que carecen medio e histidina. Sin embargo, marcado crecimiento fusión de proteína-dependiente se observó en ausencia de histidina incluso en la presencia de Hrd1. A fin de aumentar la rigurosidad del ensayo, medio que carece de histidina fue suplementado con 3-amino-1H-1,2,3-triazol (3-AT), un inhibidor competitivo de la enzima His3 40. La levadura expresando Hrd1 creció muy mal en medio carente de histidina suplementado con 1-2 mM 3-AT; cuando se ha eliminado HRD1, se restauró el crecimiento celular. Inclusión de 3-AT a una concentración de 3 mM de crecimiento drásticamente inhibida de todas las células, independientemente de la presencia o ausencia de Hrd1. Estas res ULTS son consistentes con la degradación del sustrato Hrd1-dependiente.

A continuación, la abundancia de estado estacionario de la proteína Deg1 -Sec62-His3 en la levadura que expresan o que carecen de la enzima Hrd1 se ensayó directamente. Western Blot análisis indicó un aumento comparable en Deg1 -Sec62-His3 y proteínas Deg1 -Sec62 en hrd1Δ levadura relación con las células de tipo salvaje (Figura 5). Esto confirma el papel de Hrd1 en la regulación de los niveles de ambas proteínas. Degradación Hrd1 dependiente de Deg1 -Sec62 procede después de la proteína se involucra de manera aberrante la translocon ER 32. Es importante destacar que, Deg1 -Sec62-His3 se acopla de forma aberrante la translocon de una manera similar (datos no publicados), validando además el uso de Deg1 -Sec62-His3 como reportero basado en el crecimiento de la degradación del Deg1 -Sec62 específicamente y proteínas translocon asociada en general.

s "> Figura 2
Figura 2:.. Modelo para la degradación de Deg1 -Sec62 siguiente compromiso translocon aberrante (A) Representación esquemática de Deg1 -Sec62 Deg1 (los 67 aminoácidos amino-terminal de MATα2) es seguido, en secuencia, por la bandera (F) epítopo , el 2-transmembrana retículo endoplásmico (ER) de proteína Sec62, y dos copias de la S. aureus proteína A (PRA). Para mayor claridad, la proteína de fusión se refiere como Deg1 -Sec62. (B) Después de la inserción normal de sus dos segmentos transmembrana en la membrana del ER, la interacción persistente de Deg1 -Sec62 con el translocon desencadena anormal, Deg1 dependiente translocon compromiso. Una porción de la cola amino-terminal citosólica inicialmente entra y aberrante probable que se mantiene dentro de-la translocon. (C) Siguiendo engagemen translocon anormalest, Hrd1 reconoce y ubiquitylates Deg1 -Sec62. Los círculos rojos indican moléculas de ubiquitina. (D) Deg1 -Sec62 se extrae entonces de la membrana del ER y degradada por el proteasoma, es probable que el alivio de la obstrucción translocon.

Figura 3
Figura 3:. Representación esquemática de Deg1 -Sec62-His3 siguiente compromiso translocon aberrante Deg1 es seguido, en secuencia, por la bandera (F) epítopo, la proteína ER-2 transmembrana Sec62, dos copias de la S. aureus proteína A (PRA), y la enzima His3 levadura. Para mayor claridad, la proteína de fusión se refiere como Deg1 -Sec62-His3.

Figura 4
Figura 4: Fusionando His3 a Deg1 (HRD1) y hrd1Δ levadura transformada con un vector vacío o un plásmido que codifica Deg1 -Sec62-His3 fueron avistados en triptófano que carecen de medio, medio que carece de triptófano y la histidina y medio que carece de triptófano y la histidina suplementado con 3-amino-1H-1,2,3-triazol (3-AT), un inhibidor competitivo de His3, a las concentraciones indicadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .

Figura 5
Figura 5:. El aumento de la abundancia de Deg1 -Sec62 y Deg1 -Sec62-His3 en células que carecen de Hrd1 Los extractos de proteína se prepararon a partir de tipo salvaje (+) y hrd1Δ(Δ) de levadura que expresa Deg1 -Sec62 o Deg1 -Sec62-His3. Proteínas (equivalentes a 0,125 OD 600 unidades) fueron separadas por SDS-PAGE, seguida por transferencia Western con anticuerpos secundarios de conejo anti-ratón, que se unen directamente a los epítopos de la proteína A de las proteínas de fusión. Western Blot posterior con anticuerpos específicos a PGK1 proporciona un control de carga.

Tabla 1: Soluciones y tampones utilizados en este estudio.

Solución Componentes Comentarios
Sintético Definido (SD) Medio Mínimo Levadura 2% de dextrosa, 0,67% de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 0,002% de adenina, uracilo 0,004%, 0,002% de arginina, histidina 0,001%, 0,006% isoleucina, leucina 0,006%, 0,004% de lisina, metionina 0,001%, 0,006% de fenilalanina, 0,005 % treonina, triptófano 0,004%. Para sólido (placa) medio, incluyen 2% de agar. 1. Medio selectivo se prepara omitiendo apade- aminoácido (s) o bases nitrogenadas.
2. Para mayor comodidad, estos ingredientes se pueden mantener como soluciones madre concentradas de la siguiente manera. Los aminoácidos se pueden mantener como solución madre 100X que contiene todos los aminoácidos deseados. Base nitrogenada de levadura se puede mantener en una solución 20X de stock (13,4%). La dextrosa se puede mantener en una solución madre 40%. Adenina y uracilo pueden ser mantenidos como 1% soluciones madre en 0,1 M NaOH.
3. Esterilizar medio en autoclave.
Sample Buffer 1X Laemmli 2% SDS, 10% de glicerol, 5% β-mercaptoetanol, 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,008% de azul de bromofenol 1. tampón de muestra 1X a menudo se prepara diluyendo un (por ejemplo, 5X) stock más concentrada.
2. El colorante azul de bromofenol se puede añadir a la intensidad deseada. A "pellizco" (muy pequeña cantidad girada desde el borde de una espátula) es típicamente suficiente.
0,2 M de hidróxido sódico Preparar en el agua. El hidróxido de sodio reacciona con el vidrio. Por lo tanto, para el almacenamiento a largo plazo, hidróxido de sodio 0,2 M se debe mantener en recipientes de plástico.
Tampón de Laemmli (5X) 125 mM Tris, glicina 960 mM, 0,5% de SDS Para preparar 1 L de 1X tampón de Laemmli, se diluye 1: 5 en dH 2 O
Tris-acetato de SDS Transferencia Buffer (5X) 125 mM de Tris acetato (pH 8,8), glicina 960 mM, 0,05% de SDS Para preparar 20 l de 1X Tris-acetato de SDS Transferencia Buffer, combine 4 L de 5X de stock, 4 L de metanol, y 12 L de dH 2 O
10X Tris-solución salina tamponada (TBS) Tris 500 mM, NaCl 1,5 M; pH ajustado a 7,5 Para preparar 1 litro de 1X TBS, se diluye 1:10 en DH 2 O. 1X TBS puede complementarse con el detergente Tween-20 y la leche desnatada en polvo, según el caso.
<td> leu2-3,112
Strain Nombre Alias Genotipo Relevante Figuras Fuente
VJY6 MHY500 MATa 4 y 5 Chen et al., 1993
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
VJY10 MATa 4 y 5 Este estudio
his3- Δ 200
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
HRD1 :: kanMX4

Tabla 2:. De levadura cepas utilizadas en este estudio los detalles de construcción están disponibles bajo petición.

Número plásmido Nombre Completo plásmido Figura Fuente
pVJ30 pRS414-P MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA 5 Rubenstein et al., 2012
pVJ121 pRS414-P MET25 (vector vacío con el promotor MET25) 4 Mumberg et al., 1994
pVJ467 pRS414-P MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-His3 5 Este estudio
pVJ477 pRS414-P GAL4 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-His3 4 Este estudio

Tabla 3:. Los plásmidos utilizados en este estudio Tenga en cuenta que todos los plásmidos contienen un centrómero de levadura para permitir la replicación en células de levadura, el gen TRP1 para su selección en células de levadura, y el gen AmpR para el mantenimiento en células bacterianas. Mapas de los plásmidos, secuencias y detalles de construcción están disponibles bajo petición.

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Discussion

La metodología que aquí se presenta permite la determinación rápida y la confirmación bioquímica de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas en células de levadura. Estos experimentos ponen de relieve la utilidad y el poder de la levadura como un organismo eucariota modelo (varios excelentes críticas de la biología de la levadura y compilaciones de protocolos para el manejo, almacenamiento y manipulación de células de levadura (por ejemplo 41-44) están disponibles para los investigadores nuevos para el organismo). Las técnicas se pueden aplicar fácilmente para investigar la degradación y la abundancia de una variedad de clases de proteínas. Por ejemplo, otros han utilizado esta estrategia para caracterizar los mecanismos de degradación de citosólica inestable, nuclear y luminal ER y proteínas transmembrana 45-49.

Unos factores deben ser considerados en la elección de la enzima metabólica para fusionar a una proteína inestable. En primer lugar, es esencial que una versión funcional del gen que codifica la enzima noestar presente en el genoma del huésped. Para minimizar falsos resultados positivos (es decir, el crecimiento bajo condiciones selectivas cuando la proteína inestable es en realidad degradado), se recomienda trabajar con cepas que albergan no reversible alelos mutantes del gen reportero (preferiblemente supresiones de genes completos) 50. Otra consideración para la selección de la enzima reportero es la disponibilidad de inhibidores competitivos, que pueden ser incluidos en el medio de crecimiento selectivo para reducir el crecimiento de fondo y mejorar la rigurosidad ensayo. Esto puede ser útil en casos de proteínas con relativamente bajas tasas de rotación incluso en la presencia de mecanismos de degradación completamente funcionales. En los experimentos representativos presentados aquí, la inclusión de 3-AT, que inhibe competitivamente la enzima His3, reduce el crecimiento de fondo 40. Del mismo modo, el compuesto 6-azauracilo inhibe Ura3, una enzima necesaria para la biosíntesis de uracilo 51. La concentración de inhibidor a la que el crecimiento se produce en la degradación-dEfectiva, pero no de tipo salvaje, las células deben determinarse empíricamente. Algunas enzimas metabólicos también pueden ser contra-seleccionados en contra. Bajo condiciones de contra-selectiva, las células pueden crecer sólo cuando se degrada la proteína inestable (y la enzima metabólica fusionado no está presente). Por ejemplo, Ura3 convierte el compuesto de ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) para el compuesto tóxico, 5-fluorouracilo 52. Las células que expresan una proteína de fusión de Ura3 sólo crecerán en presencia de 5-FOA si la proteína de fusión Ura3 se degrada. Del mismo modo, el compuesto de ácido 5-fluoroanthranilic (5-FAA) es tóxico para las células con una ruta de biosíntesis de triptófano funcional. 5-FAA tanto, se puede utilizar para la lucha contra el seleccionar las células que expresan las proteínas de fusión Trp1-53. Las estrategias de selección de contador pueden ser útiles para la identificación de supresores de mutaciones de degradación de una merma.

El promotor utilizado para dirigir la expresión de un reportero de degradación también debe ser cuidadosamente seleccionado. Como bajos niveles de Biosynthetic enzimas pueden ser suficientes para apoyar el crecimiento en ausencia de metabolito suministrado exógenamente, un promotor débil se recomienda 54. En los experimentos representativos presentados aquí, el promotor de GAL4, que es reprimido en presencia de glucosa 55, se utiliza para promover la transcripción de Deg1 -Sec62-His3. La expresión basal de esta proteína de fusión bajo condiciones de represión (es decir, 2% de glucosa) es suficiente para apoyar el crecimiento en condiciones selectivas (es decir, ausencia de histidina y la presencia de 1 - 2 mM 3-AT) cuando el mecanismo de degradación es deshabilitado. Sin embargo, los niveles de proteínas suficientes para apoyar el crecimiento en condiciones selectivas son propensos a estar por debajo del umbral de detección por el Western Blot. Por lo tanto, puede ser necesario para conducir la expresión con un promotor débil para el ensayo de crecimiento y un promotor fuerte para la confirmación bioquímica. En el caso de Deg1 -Sec62 (con o sin la fusión His3), un más robust promotor (en este caso, el promotor MET25 39) se requiere para la visualización de proteínas por análisis de Western.

Como se ha descrito aquí, el ensayo de crecimiento a base de levadura se puede realizar en un enfoque basado en el candidato a pequeña escala. Diluciones en serie de células de levadura se prepararon en una placa de 96 pocillos y se transfirieron por pipeteado a medio de crecimiento sólido; un método alternativo para la transferencia eficiente y reproducible de suspensiones celulares diluidas de levadura, sobre medio sólido es el uso de un replicador de multi-pin, comúnmente conocida como un "frogger" 56. El momento ideal para fotografiar platos variarán con cepas y condiciones de levadura. Se recomienda para fotografiar una placa dada cuando las colonias de la cultura de más rápido crecimiento primero se hacen visibles en el lugar más diluido. Este es típicamente el punto en el que las diferencias en las tasas de crecimiento entre las muestras son más evidentes. Puede ser aconsejable tomar fotografías en múltiples días, particularmente en el caso de la levaduraexhibiendo una amplia gama de tasas de crecimiento.

El ensayo indicador de basado en el crecimiento también se puede adaptar para análisis a gran escala. Por ejemplo, un reportero de la degradación puede ser introducido en una biblioteca disponible en el mercado de ~ 5.000 cepas viables haploides supresión de genes de levadura utilizando tecnología sintética matriz genética (SGA) 46,57. En esta técnica, una cepa de levadura haploide con una proteína de fusión reportero metabólica cromosómicamente integrado está acoplado a cada cepa de la biblioteca deleción del gen. Las células diploides resultantes son inducidas a esporular (someterse a la meiosis) y se sometieron a selección para la progenie meiótica haploide que alberga tanto el reportero metabólica y deleciones de genes individuales. Estas cepas se transfieren a continuación en masa a medio selectivo para células en las que la proteína se ha estabilizado. En cuanto a los análisis a pequeña escala, si se elimina un gen con un papel en la degradación de proteínas, la proteína de fusión se estabiliza, y el crecimiento celular se verá reforzada. Un Comparablepproaches se han ideado que permiten para la transformación simultánea de una gran colección de cepas con plásmidos extra-cromosómicamente mantenidos; esta estrategia evita la integración cromosómica, el apareamiento, la esporulación, y la selección meiótica 54.

Cuando una mutación se encuentra para conferir una ventaja de crecimiento a las células que albergan un reportero metabólica, es necesario confirmar bioquímicamente que la mutación incrementa la abundancia de la proteína de interés. Un procedimiento de lisis de levadura rápida y fiable, estrechamente adaptada del método de Kuhsnirov 31, se presenta. Este protocolo permite la extracción de proteínas en una forma directamente adecuadas para el análisis por Western Blot. Para el análisis de una proteína dada, la cantidad de lisado que se cargue por pocillo, las propiedades del gel de acrilamida, la elección de la membrana, los anticuerpos utilizados y las diluciones de los mismos, y el método de detección debe ser determinado empíricamente. El protocolo de transferencia de western representante describió utilizes anticuerpos secundarios conjugados con tintes fluorescentes; otros protocolos comúnmente utilizados se basan en dependiente de las enzimas-anticuerpo conjugado 58 de quimioluminiscencia. Como se describe aquí, la membrana utilizada para detectar la proteína de interés se puede sondear directamente con un anticuerpo para una proteína de control de carga. Si los anticuerpos primarios utilizados para detectar la proteína de interés y la proteína de control de carga se han levantado de la misma especie, reprobing la membrana es posible siempre y cuando las bandas que surgen de estas proteínas no hacen co-migran. Si, sin embargo, los anticuerpos primarios utilizados para detectar la proteína de interés y la proteína de control de carga se han planteado de diferentes especies, la misma membrana puede ser secuencialmente sondeó, incluso si las bandas co-migrate, si los anticuerpos secundarios se han conjugado con fluoróforos con diferentes longitudes de onda de emisión. En el caso de que la proteína de interés y el control de la carga de proteínas co-migran y los respectivos anticuerpos primarios han sido raised de la misma especie, las muestras pueden ser resueltos en dos geles de SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF y probaron por separado con anticuerpos específicos para la proteína de la proteína de interés y control de carga. Alternativamente, la consistencia de carga puede ser juzgado por la incubación de las membranas con manchas de proteínas no específicas (por ejemplo Coomassie o Ponceau S). Además, el protocolo de transferencia de Western representativa asume una proteína o epítopo que se detecta mediante incubación secuencial de los anticuerpos primarios y secundarios, como es típico. Las proteínas de fusión analizadas en los resultados representativos contienen dos epítopos derivados de Staphylococcus aureus Proteína A (PRA en las Figuras 2 y 3). La proteína A se une directamente a las inmunoglobulinas de mamíferos y por lo tanto se puede detectar utilizando un anticuerpo secundario solo (es decir, no se requiere ninguna etapa de incubación de anticuerpo primario) 59. Es posible que la fusión de una enzima reportero puede influir en la abundancia de proteínas odegradación. Por tanto, es recomendable confirmar bioquímicamente los resultados utilizando una versión del sustrato sin el estorbo de la proteína indicadora. Por último, ambos ensayos descritos aquí se basan en las diferencias en los niveles de proteína en estado estable como un sustituto de las diferencias en la estabilidad de la proteína. Debido a la abundancia de proteínas refleja la integración de las tasas de la síntesis de proteínas y la degradación, su posterior análisis bioquímico (por ejemplo, cicloheximida de persecución o de persecución pulso experimentos) debe ser empleado para analizar directamente perfil de degradación dinámica de una proteína.

Los resultados representativos establecen una novedosa aplicación de este protocolo para la determinación de los requisitos genéticos para la degradación de una proteína que participa de manera aberrante la translocon ER. Deg1 -Sec62-His3 confiere una ventaja de crecimiento de la levadura en condiciones selectivas cuando se desactivó la vía de degradación (es decir, en la ausencia de la ubiquitina ligasa Hrd1). Un rápido y fiable de proteínas exmétodo de tracción seguido por transferencia Western confirmó un aumento en la abundancia de Deg1 -Sec62 (con o sin His3) en ausencia de Hrd1. Estudios previos indican que el mecanismo de la degradación Hrd1 dependiente de las proteínas translocon asociada difiere de los de otras luminales o transmembrana sustratos Hrd1 ER 32. El trabajo futuro se empleará la proteína de fusión Deg1 -Sec62-His3 en las pantallas de genética a gran escala para identificar nuevos genes necesarios para este mecanismo de degradación único.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Damos las gracias a los miembros actuales y anteriores del laboratorio Rubenstein para proporcionar un entorno de investigación y de apoyo entusiasta. Agradecemos a Ryan T. Gibson para la ayuda en la optimización del protocolo. Damos las gracias a Marcos Hochstrasser (Universidad de Yale) y Dieter Wolf (Universität Stuttgart) para las cepas de levadura y plásmidos. Agradecemos a nuestros revisores anónimos por su ayuda en la mejora de la claridad y la utilidad de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un premio de investigación del capítulo de la Universidad Ball State de Sigma Xi a SGW, los Institutos Nacionales de Salud de subvención (R15 GM111713) para EMR, un premio de investigación de la Universidad Ball State aspirar a EMR, y los fondos de la Universidad Ball State Oficina del Rector y del Departamento de Biología.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole Fisher Scientific AC264571000 Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) Roche 11088726001 May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped Sarstedt 82.1581.001 Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl Gilson F14401 Available from a variety of manufacturers
 
 
 

 
Name Company Catalog Number Comments
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl Gilson F14403 Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216 Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.
Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) Bio-Rad 170-8195 A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater Fisher Scientific 1172011AQ Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

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