Abstract
Düzenlenmiş protein yıkımı hemen hemen her hücresel fonksiyon için çok önemlidir. Moleküler mekanizmaları ve ökaryotik protein yıkımı için genetik gereksinimleri hakkında bildiklerimizin çoğu başlangıçta Saccharomyces cerevisiae kurulmuştur. Protein yıkımı Klasik analizleri biyokimyasal darbe-kovalamaca ve sikloheksimid-kovalamaca metodolojileri yararlanmıştır. Bu teknikler, protein degradasyonunu gözlemlemek için duyarlı araçlar sağlarken, zahmetli, zaman alıcı ve düşük verimlilik bulunmaktadır. Bu yaklaşımlar, protein bozulmasını önlemek mutasyonlar için hızlı veya büyük ölçekli tarama için uygun değildir. Burada, protein parçalanması için genetik gereksinimleri kolay tanımlama için bir maya gelişimi tabanlı deney tarif edilecektir. Bu testte, özgül seçici koşullar altında büyüme için gerekli bir raportör enzim kararsız bir proteine kaynaştırılır. Hücreler, endojen raportör enzim eksik olan fakat füzyon proteini sele altında büyüyebilir ifadeFüzyon proteini stabilize yalnızca ktif koşulları (örneğin, protein yıkımı uyuşmazlık olduğunda). Burada tarif edilen büyüme deneyinde, vahşi tipten ve bir füzyon proteinini kodlayan bir plazmid mutant maya hücreleri seri seyreltme seçici ve seçici olmayan ortam üzerine tespit edilir. Seçici koşullar altında büyüme, belirli bir mutasyon ile bozunma bozukluğu ile tutarlıdır. Artan protein bolluğu biyokimyasal teyit edilmelidir. Elektroforez ve Western blot için müsait bir biçimde maya proteinleri hızlı bir şekilde çıkarılması için bir yöntem olup, aynı zamanda gösterilmiştir. Biyokimyasal analizi için protein çıkarılması için basit bir protokol ile birlikte protein istikrarı için bir büyüme temelli okuma, protein parçalanması için genetik gereksinimleri hızlı belirlenmesini kolaylaştırır. Bu teknikler, kısa ömürlü bir çok protein degradasyonunu izlemek için adapte edilebilir. Verilen örnekte, histidin biyosentezi için gerekli olan His3 enzim kaynaştırıldıbu anormal endoplazmik retikulum translokon yürütmektedir sonra Deg1 için -Sec62. Deg1 -Sec62 bozulması için hedeflenmiştir. Deg1 -Sec62-HIS3 barındıran hücreler proteini kararlı hale geldiğinde, seçici koşullar altında büyüyebilir mümkün.
Introduction
Seçici protein yıkımı ökaryotik yaşam için gerekli olduğunu ve değiştirilmiş protein yıkımı, çeşitli kanser tipleri, nörodejeneratif hastalıklar, kardiyovasküler hastalıklar ve sistik fibrozis 1-5 dahil olmak üzere tıbbi koşullar, bir dizi katkıda bulunur. seçici protein degradasyonunu katalize ubikitin-proteazom sistemi (UPS), bu koşullar 6-10 için gelişmekte olan bir tedavi edici hedeftir. Ubikitin ligaz kovalent proteinler 11 76-amino asit ubikitinin polimerleri takın. Poliübikütin zincirleri ile işaretlenmiş proteinler tanınan ve ~ 2.5 megadalton 26S ile 12 proteazom proteolizlenmiş edilir. Model ökaryotik organizma Saccharomyces cerevisiae (çiçek mayası) başlatılan çalışmalar ökaryotik hücrelerde protein yıkımı mekanizmaların açıklanması, temel olmuştur. UPS ilk gösterdi fizyolojik substrat MATα2 13 maya transkripsiyon represörü oldu, UPS 14 ve çok sayıda yüksek derecede korunmuş bileşenler ilk olarak tespit edilmiştir ya da (örneğin, 15-26), maya ile karakterize edilir. Bu çok yönlü ve genetik uysal model organizma yapılan Keşifler ubikuitin-aracılı bozulması korunmuş mekanizmaları önemli açılımlar sağlamaya devam etmesi muhtemeldir.
Çoğu UPS yüzeylerde tanınması ve yıkımı birden proteinlerin uyumlu eylem gerektirir. Bu nedenle, belirli bir kararsız proteinin düzenlenmiş bozulmasını karakterize önemli bir gol proteoliz genetik gereksinimlerini belirlemektir. Memeli ya da maya hücrelerinde protein degradasyonunu izlenmesi için klasik yaklaşımları (örneğin, darbe kovalayıcı ve sikloheksimid kovalayıcı deneyler, 27), zahmetli ve zaman alıcı bir iştir. Yöntem bu tür protein degradasyonunu tespit etmek için çok hassas bir araç temin ederken, protein parçalanması ya da büyük ölçekli bir screeni hızlı analizi için uygun değildirProtein bozulmasını önlemek mutasyonlar için ng. Burada, kararsız proteinlerin bozunması için genetik gereklerine hızlı tespit edilmesi için bir maya gelişimi bazlı analiz sunulmuştur.
Protein degradasyonunu, ilgi (ya da bozulma sinyali) kararsız bir protein analiz etmek için maya gelişimi dayalı yöntemde, belirli koşullar altında maya büyümesi için gerekli olan bir proteine, çerçeve içinde, birleştirilir. Sonuç ilgi kararsız proteinin protein yıkımı genetik gereksinimlerini belirlemek için güçlü bir araç olarak hizmet edebilir yapay substrat. Uygun bir şekilde, en sık kullanılan laboratuar maya cinsleri, özellikle amino asitler ya da azotlu bazların (örneğin, 20,28-30) biyosentezinde yer alan metabolik enzimleri kodlayan genlerdeki mutasyonların bir panel barındırır. Bu enzimler, sentez enzimleri katılmak dışsal olarak sağlanan metabolitlerin yokluğunda hücre proliferasyonu için gereklidir. Böylekararsız proteinlerin bozunması için büyüme bazlı muhabir bağlı oldukları bağlı oldukları gibi metabolik enzimler ve böylece işlev görebilir. proteolizini engellemek mutasyonlar bozunma raportör barındıran hücreleri seçilen şartlar altında büyümeye izin verir çünkü protein yıkımı için genetik olarak gerekli gördükleri kolaylıkla açıklanacaktır edilebilir.
Bir büyüme avantajı, belirli bir mutasyon ve ilgilenilen protein bolluğu arttırır dolaylı bir göstergesidir. Ancak, doğrudan biyokimyasal analiz mutasyon oldukça dolaylı ya da suni nedenler yoluyla daha artmış protein düzeyleri ile büyümeyi izin onaylamak için gereklidir. Protein miktarı hakkında bir mutasyonun etkisi yapabilecek ve özellikle mutasyonu olmayan hücrelerde kararlı durum proteini düzeylerinin Western blot analizleri ile teyit edilebilir. Uygun bir biçimde maya proteinleri hızlı ve etkili bir ekstraksiyon (sodyum hidroksit ve numune tampon maddesi ile maya hücrelerinin sıralı inkübasyonu) için bir yöntem olupwestern blotting ile analiz için de 31 gösterilmektedir. Birlikte, bu deneyler, protein yıkımı aday düzenleyicilerinin hızlı belirlenmesini kolaylaştırmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protein Bozulması Arızalı Aday Mutantlarına tanımak 1. Maya Büyüme Deneyi
- Bir raportör metabolik enzim, çerçeve içinde, erimiş kararsız bir proteini kodlayan bir plasmid ile vahşi tip ve mutant maya hücreleri dönüştürmek.
- Plazmid moleküllerini taşıyan hücreler için seçici olan sentetik tanımlı (SD) minimal ortam 5 ml transformantların inoküle. Döner, 30 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
- Her bir gece boyunca kültür, 600 nm'de (OD600) 'deki optik yoğunluk ölçülür.
NOT: Bir gece inkübe edildikten sonra, kültür içindeki hücreler, ya logaritmik veya sabit gelişme fazında olabilir, fakat en az bir OD 0.2 600 ulaşmış olmalıdır. Ampirik bir şekilde tespit gibi çok yavaş büyüyen maya cinsleri, hücrelerin daha fazla sayıda inkübasyon süresi daha uzun bir gece veya aşılama gerektirebilir. - Bir seyreltilmiş hücreleri ile başlayan, bir steril 96 oyuklu bir plaka içerisinde dönüştürülen maya hücrelerinin altı kat seri dilüsyonları hazırlanmasın, OD 0.2 600. 96 gözlü plaka içindeki farklı üst üste denenecek her biri maya transformant yerleştirin.
- Her bir transformant için, 200 ul nihai hacim içinde 0.2 OD 600 hücreleri sulandırmak için gerekli olan bir gece boyunca kültür hacmi hesaplamak. 200 ul hacmi getirmek için steril su içinde uygun miktarda Sütun 1'de de karşılık gelen, gece boyunca bu kültür hacim.
- Maya her satır için, Sütun 2, 3 ve 4 kuyulara steril su, 125 ul ilave edin.
Not: ayrı paketlenmiş steril 96-yuvalı plakalar, steril kapaklar ile paketlenebilir. Kapaklar bu adımda dağıtılır, steril su için rezervuar olarak kullanılabilmektedir. Bu çok kanallı bir pipet ile belirli bir sütunda tüm oyuklara steril su eşzamanlı transferi sağlar. - Yukarı pipetleme ve bir çok kanallı pipet aşağı ilk sütuna (OD 0.2 600 seyreltilmiş maya) içeriğini karıştırın.
- TransfBir çok kanallı pipet kullanarak sütun 2 Sütun 1 maya 25 ul, er. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Aktarım Sütun 3 Sütun 2 25 ul ve sütun 3 den Sütun 4 25 ul (her adımda iyi karıştırma).
- Bir çok kanallı pipet ile her bir örnek karıştırın. En seyreltilmiş hareketle en uygun seçici ortamı içeren iki plakalar üzerine maya, pipet, her numunenin 4 ul sütunları sulandırmak için. Plazmid seçimi (bu plaka maya lekelenme ve büyüme kontrolü olarak hizmet vermektedir) korur ortamı ile bir tabak kullanın. Raportör enzime bağlı kararsız protein plazmid muhafaza ve ekspresyonu için seçim ortamı ile bir ikinci plaka kullanın. Maya hızla yerleşmek için, düzenli aralıklarla yukarı pipetleme ve aşağı hücreleri karıştırın.
Not: Kurutucu plakalar daha kolay bir şekilde taze hazırlanmış plakalar daha sıvı absorbe edecek ve bu nedenle, bu deneyler için tavsiye edilir. Nemli plakalar lo oda sıcaklığında kuluçkalama ile kurutulabilirbir laminar akış başlığı içinde 2 gün ya da daha kısa bir inkubasyon - 1 ağırlık nem. Laminar hava akımı tezgah paralel ise Tabaklar dengesiz kuruyabilir. Bir şablonun kullanımı kolay düzenli mesafelerde maya hücreleri görmenizi sağlar. İki örnek şablonlar, Şekil 1 'de verilmiştir. Bu, baskılı üzerinden kesilir ve bir Petri kabı, kapağın iç tarafında olabilir. - Plakalar tezgah üstünde kurumaya bırakın.
- 6 gün - 2, 30 ° C'de inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, her plaka fotoğraf.
100 mm agar plakaları üzerine maya hücreleri tespit için Şekil 1 şablonlar. Bu şablonlar, çok kanallı bir pipet ile düzenli aralıklarda maya tespit kolaylaştırmak için kullanılabilir. Şablonlar, baskılı kesip, ve bir Petri kabı kapağının içine yapıştırılmış olabilir. Büyüme ile Petri kabı yerleştirinşablon orta kapağının iç kısmına yapıştırılmıştır. Şablonlar yönünü izlemek için bir çentik ile işaretlenmiştir. Bu büyüme deneylerinde kullanılan plakalar Benzer yönünü izlemek için bir çentik ile işaretlenmiş olması tavsiye edilir. Dört (A) veya beş (B) maya hücrelerinin seri seyreltme sağlanır tespit için şablonlar. 100 mm şablonları ile bu rakamın bir yazdırılabilir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Maya Büyüme Testi 2. Biyokimyasal Onayı
- Maya Hücreleri ve Post-Alkali Protein Ekstraksiyon Büyüme (31 değiştirilmiş)
- Kararsız bir proteini kodlayan bir plasmid ile vahşi tip ve mutant maya hücreleri dönüştürmek.
- Plazmid moleküllerini taşıyan hücreler için seçici olan SD ortamı 5 ml transformantların inoküle. Döner, 30 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
- Her gecede cu OD 600 ölçünlture.
NOT: Bir gece inkübe edildikten sonra hücreler, ya logaritmik veya sabit gelişme fazında olabilir, fakat 0.2 10 ml taze seçici ortam (aşama 2.1.4) OD 600 seyreltme izin verecek bir OD 600 ulaşmış olmalıdır. Ampirik bir şekilde tespit gibi çok yavaş büyüyen maya cinsleri, hücrelerin daha fazla sayıda inkübasyon süresi daha uzun bir gece veya aşılama gerektirebilir. - 0.2 10 ml taze seçici ortam içinde, bir OD 600 maya hücreleri seyreltin.
- Kültürler (orta-logaritmik büyüme olan yani) 0.8 ve 1.2 arasında bir OD 600 ulaşıncaya kadar, döner veya çalkalama, 30 ° C'de kuluçkalayın devam edin.
Not: İlgili kararsız proteini, bir düzenlenebilir promoterin kontrolü altında ise, protein ifadesi ve hücre hasat indüksiyonu için en uygun zamanlama önceki çalışmalarda ya da deneysel gözlemlere göre değişebilir. - 15-ml'lik konik kültür 2.5 OD 600 birimleri toplayınOda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüj ile ark tüpü. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı.
Not: 600 birim 1.0 OD 600 kültürün 1 ml maya mevcut miktarı olarak tanımlanır bir OD. V = 2.5 OD 600 birim / Ölçülen OD 600: 2.5 OD 600 birim (V) hasat için gereklidir (ml) kültür hacmi, aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenebilir - 1 ml tekrar süspansiyon hücreleri distile su. Bir mikrosantrifüj tüp askıya hücreleri aktarın.
- Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 6500 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı.
- 100 ul süspanse hücreleri aşağı veya yukarı vorteksleme pipetleme tarafından damıtılmış su ve 100 ul 0.2 M NaOH ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
- 18.000 x santrifüj (henüz proteinleri serbest ve hala canlı olan değil çoğu) Pelet hücreleri5 dakika boyunca örn. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı.
- Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks ile, hücreleri lize olacak 100 ul 1x Laemmli numune tamponu, - 50 süspanse pelet.
Not: santrifüj ve Laemmli numune tampon maddesi içinde hücrelerin daha sonra yeniden süspansiyonu aşağıdaki alkali yüzer uzaklaştırılması bir Tris-glisin çalışan tamponu sistemi ve Batı lekeleme ile sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile uyumlu bir pH'da proteinleri ayıklar. - Tam proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca 95 ° C 'de lizatları inkübe edin.
Not: 95 ° C de inkübe toplama eğilimli proteinler (çok sayıda zar-ötesi bölümler ile, örneğin proteinler) çözünmez hale gelebilir. Bu nedenle, Lizatlar daha düşük sıcaklıklarda inkübe edilmelidir (örneğin, 37 ° C - 70 ° C), 10 - 30 dakika sonra gibi ampirik proteinlerin analizi için, tespit edilmiştir. - 5 dakika buz üzerine koyarak serin lizatları.
- Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 18,000 x g'de santrifüjleyin lizatları çözünmeyen malzeme peletlendi. Önce, sonra Western blot analizi (kısım 2.2) SDS-PAGE ile süpernatant (çözünmüş ekstre protein), ayırın. Alternatif olarak, -20 ° C'de mağaza lizatları.
- Örnek Western Blot Protokolü
- Bir SDS-PAGE jeli içinde lizatlarının ampirik bir biçimde tespit hacmi yükleyin.
- Boya ön kadar 200 V jel çalıştırın jel alt ulaşmıştır.
- 4 ° C'de 90 dakika - 60 20 V ıslak transferi poliviniliden florür (PVDF) membrana jel proteinleri aktarın.
- 4 ° C 'de bir gece boyunca, oda sıcaklığında 1 saat süre ile, sallanan ya Tris-tamponlu Tuzlu su (TBS) içinde% 5 yağsız süt içinde inkübe edilerek blok membran.
- Çözüm engelleme Durusu.
- Oda sıcaklığına 1 saat süre ile% 0.1 Tween-20 (TBS / T) ile TBS içinde% 1 yağsız süt içinde (ya da bunların epitop) başta ilgi konusu olan proteini için spesifik bir antikor ile membran inkübemperature, sallanan.
- Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın.
- Sallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin.
Not: flüoroforlar ışığa duyarlı olduğu için, florofor konjuge antikor seyreltileri karanlıkta hazırlanmalıdır. Buna ek olarak, florofor-konjuge antikor varlığında membran inkübasyon ışık geçirmeyen kaplarda gerçekleşmelidir. Bu alüminyum folyo ile inkübasyon tepsiler sarılarak yapılabilir. - Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın.
- Üretici tavsiyelerine göre, Li-Cor Odyssey CLX kullanarak membran ve Görüntü Studio yazılımı (veya benzer görüntüleme cihazları ve yazılım) görüntü elde.
- Membran görüntüleme sonra, bir yük için spesifik bir primer antikor ile membran inkübesallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt kontrol proteini ing.
- Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın.
- Sallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin.
- Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın.
- Üretici tavsiyelerine göre, Li-Cor Odyssey CLX kullanarak membran ve Görüntü Studio yazılımı (veya benzer görüntüleme cihazları ve yazılım) görüntü elde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem göstermek için, His3 enzim modeli endoplazmik retikulum (ER) enzimi yüksek yoğunluklu lipoproteinlerde bozulması karboksi-terminaline kaynaştırılmış olduğu (ERAD) alt-tabaka, Deg1 -Sec62 (Şekil 2A) Deg1 -Sec62-HIS3 oluşturmak için (Şekil 3) . Deg1 -Sec62 translokon ile kalıcı, anormal bir ilişki aşağıdaki hedeflenen ERAD alt tabakalar yeni bir sınıfının kurucu elemanını temsil ER zar 32-34 arasında proteinlerin taşınması için esas olarak sorumlu kanalı. Böyle dengesiz proteinler geçici yüzeylerde (translokon ilişkili için) ERAD-T olarak adlandırılan edilmiştir. Daha önce yapılan çalışmalar anormal translokon geçişi üzerine, Deg1 -Sec62 Hrd1 ubikitin ligaz (Şekil 2B-D), 32, 34, 35 ile indirgenmesi için hedeflenen olduğunu göstermektedir. Diğer Hrd1 alt-tabakaların bozulması için gerekli faktörler için vazgeçilmez olduğu görülmektedir <em> Deg1 -Sec62 bozulma, yeni bir bozunma mekanizması 32 göstermektedir. Zayıflamış bağlanma lipid ve uzun süreli translokon federasyonu, apolipoprotein B koşulları altında, bir memeli, düşük yoğunluklu lipoproteinlerin protein bileşeni, ilgili bir mekanizma 36-38 ile bozulmuş olduğu görülmektedir. Bu nedenle, Deg1 -Sec62 Tıbbi bakımdan ilintili translokon ilişkili proteinlerin indirgenmesi için yararlı bir model temin edilebilir.
Kromozomal HIS3 geni içermezler Yabani tip ve hrd1Δ maya hücreleri bir boş vektör 39 ya da bir plasmid kodlayan Deg1 -Sec62-His3 ile transforme edilir ve seçici bir büyüme ortamında (Şekil 4) üzerine tespit edilmiştir. Transforme edilmiş maya hücreleri, eşit sayıda doğrulamak için plakalara transfer edilmiştir, hücreler (plasmidi koruyan hücreler için seçim yapmaktadır) ortamı eksik triptofan içeren ama histidin üzerine tespit edildi. Benzer büyüme bütün dönüştürülmüş maya hücreleri için gözlenmiştir.Deg1 -Sec62-HIS3 ifade eden hücreler, füzyon proteini stabilize yalnızca histidin yokluğunda büyümesi beklenmektedir (yani ERAD T uyuşmazlık olduğunda). Gerçekten de, Deg1 -Sec62-HIS3 ifade hrd1Δ maya ortamı barındırmayan triptofan ve histidin ile Deg1 -Sec62-HIS3 ifade eden vahşi tip hücrelere bir büyüme avantajı ortaya sergilemiştir. Bununla birlikte histidin yokluğunda bile Hrd1 mevcudiyetinde gözlenmiştir füzyon proteine bağımlı büyüme oldu. Tahlilinde sertliği arttırmak amacıyla, orta eksik histidin, 3-amino-1 H-1,2,3-triazol (3-AT) ile His3 enzimi 40 rekabetçi bir önleyicisi ilave edilmiştir. Hrd1 ifade eden maya 1 ile takviye edilmiş ortam eksik histidin ait zayıf büyümesinden - 2 mM 3-AT; HRD1 silindi zaman, hücre büyümesi restore edildi. Bağımsız olarak Hrd1 varlığında ya da yokluğunda her hücre, 3 mM önemli ölçüde inhibe büyüme, bir konsantrasyonda 3-AT dahil edilmesi. Bu res ka bul etmez Hrd1 bağımlı alt-tabaka bozulması ile tutarlıdır.
Daha sonra, ifade eden ya da Hrd1 enzimi eksik maya içinde Deg1 -Sec62-His3 proteininin kararlı durum bolluğu doğrudan test edildi. Western lekeleme analizi, Deg1 -Sec62-HIS3 ve Deg1 -Sec62 proteininin, vahşi tip hücrelere hrd1Δ maya göreceli olarak (Şekil 5) de benzer bir artışı göstermektedir. Bu, her iki protein seviyelerinin düzenlenmesinde Hrd1 bir rolünü teyit etmektedir. Protein anormal ER translokon 32 angaje sonra Deg1 -Sec62 bölgesinin Hrd1 bağımlı bozulması ilerler. Önemli olarak, Deg1 -Sec62-His3 anormal daha özel olarak Deg1 -Sec62 bozulması ve genellikle translokon-ilişkili proteinler için bir büyüme tabanlı raportör olarak Deg1 -Sec62-HIS3 kullanımını geçerli, benzer bir şekilde (yayınlanmamış veri) translokon takılmaktadır.
s ">
Şekil 2.:. Anormal translokon bağlanmasını takiben Deg1 -Sec62 bozulması için model (A) 'Deg1 -Sec62 Deg1 (MATα2 amino-terminal 67 amino asit) şematik olarak gösterilmesi Flag ile sırayla takip edilmektedir (F) epitopunun , 2-transmembran endoplazmik retikulum (ER), protein Sec62 ve S. iki kopyası aureus Protein A (PRA). Netlik sağlamak için, füzyon proteini Deg1 -Sec62. (B) 'ER zarı içine iki transmembran segmentlerinin normal sokulmasını takiben olarak adlandırılır, translokon ile Deg1 -Sec62 kalıcı etkileşimi anormal tetikler Deg1 bağımlı translokon birleştirme. Ilk olarak sitosolik amino terminal kuyruk bir bölümü anormal içi translokon kalır muhtemelen girer-ve. (C), anormal translokon engagemen taraftat, Hrd1 tanır ve Deg1 -Sec62 ubiquitylates. Kırmızı çevreler ubikuitin molekülleri gösterir. (D) Deg1 -Sec62 sonra büyük olasılıkla translokon tıkanıklığı giderici, proteazomun tarafından ER zarında çıkarılır ve parçalanır.
Şekil 3:. Anormal translokon bağlanmasını takiben Deg1 -Sec62-HIS3 şematik olarak gösterilmesi Deg1 Bayrak (F) epitop ile sırayla takip edilmektedir, 2-transmembran ER proteini Sec62, S. iki kopyası aureus Protein A (PRA) ve maya His3 enzim. Netlik sağlamak için, füzyon proteini Deg1 -Sec62-HIS3 olarak ifade edilir.
Şekil 4: Deg1 için HIS3 Füzyon Deg1 -Sec62-HIS3 kodlayan bir plazmid ile transforme edilmiş yabani tip (HRD1) ve hrd1Δ maya seri seyreltileri ortamı barındırmayan triptofan, orta eksik triptofan ve histidin üzerine lekeli ve ile takviye triptofan ve histidin eksik orta 3-amino-1H-1,2,3-triazol (3-AT), HIS3 bir rekabet inhibitörü, belirtilen konsantrasyonlarda. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız .
Şekil 5:. Hrd1 eksik hücrelerde Deg1 -Sec62 ve Deg1 -Sec62-HIS3 artan bolluk protein hülasaları, vahşi tip (+) ve hrd1Δ hazırlandı(Δ) Deg1 -Sec62 veya Deg1 -Sec62-HIS3 ifade eden maya. Proteinler (0.125 OD 600 birime eşit) Western doğrudan füzyon proteinlerinin Protein A epitoplarını bağlayan tavşan anti-fare ikincil antikorlar ile lekeleme ve ardından SDS-PAGE ile ayrıldı. PGK1 özel antikorlar ile daha sonraki western lekeleme, bir yükleme kontrolü sağlar.
| Çözüm | Bileşenler | Yorumlar | ||
| Sentetik Tanımlı (SD) Minimal Maya Orta | % 2 dekstroz, amino asitler içermeyen% 0.67 maya azot baz,% 0.002 adenin,% 0.004 urasil,% 0.002 arginin,% 0.001 histidin,% 0.006 izolösin,% 0.006 leusin,% 0.004 lisin,% 0.001 metionin,% 0.006 fenilalanin, 0.005 % treonin, triptofan% 0.004. Bir katı madde (plaka) ortam için,% 2 agar bulunmaktadır. | 1. Seçici ortam ap ihmal ederek hazırlanırpropriate amino asit (ler) i ya da azotlu bazlar. | ||
| Aşağıda kolaylık sağlamak için 2, bu katkı maddeleri konsantre stok çözeltiler halinde muhafaza edilebilir. Amino asitler, tüm istenen amino asitleri ihtiva eden 100X stok çözeltisi olarak muhafaza edilebilir. Maya azot baz 20X stok çözeltisi (% 13.4) 'de muhafaza edilebilir. Dekstroz% 40 stok çözelti içinde muhafaza edilebilir. Adenin ve ürasil 0.1 M NaOH içinde% 1 stok solüsyonları olarak sağlanabilir. | ||||
| 3. otoklav ile sterilize orta. | ||||
| 1X Laemmli numune tampon | % 2 SDS,% 10 gliserol,% 5 β-merkaptoetanol, 60 mM Tris HCI, pH 6.8,% 0.008 bromofenol mavisi | 1. 1X örnek tampon maddesi genellikle daha konsantre (örneğin, 5X) stok seyreltilmesi ile hazırlanır. | ||
| 2. boya bromofenol mavi istenen yoğunluğuna ilave edilebilir. Bir "tutam" (bir spatula kenarından aday çok az miktarda), tipik olarak yeterlidir. | ||||
| 0.2 M Sodyum Hidroksit | Su içinde hazırlayın. Sodyum hidroksit, cam ile reaksiyona girer. Bu nedenle, uzun süreli depolama için, 0.2 M sodyum hidroksit plastik kaplarda muhafaza edilmelidir. | |||
| Laemmli Buffer Koşu (5X) | 125 mM Tris, 960 mM glisin,% 0.5 SDS | DH 2 O 5: Tamponu'nda Running 1X Laemmli 1 L hazırlamak için, 1 sulandırmak | ||
| Tris asetat-SDS transfer tampon maddesi (5X) | 125 mM Tris asetat (pH 8.8), 960 mM glisin,% 0.05 SDS | , Buffer Transferi 1X Tris Asetat-SDS 20 L hazırlamak 5X stokunun 4 L, metanol 4 L, ve DH 2 O 12 L birleştirmek için | ||
| 10X tuz (TBS), tris-tamponlu bir | 500 mM Tris, 1.5 M NaCI; pH 7.5 değerine ayarlandı | 1X TBS 1 L hazırlamak için, DH 2 O. 01:10 sulandırmak 1X TBS uygun deterjan Tween-20 ve toz haline getirilmiş kaymaksız süt ile takviye edilebilir. |
| Gerilme Adı | Takma ad | İlgili Genotip | Rakamlar | Kaynak |
| VJY6 | MHY500 | Mata | Şekil 4 ve 5 | Chen ve diğ., 1993 |
| his3-Δ200 | ||||
| leu2-3,112 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| gal2 | ||||
| VJY10 | Mata | Şekil 4 ve 5 | Bu çalışma, | |
| his3- Δ 200 | ||||
| ura3-52 | ||||
| lys2-801 | ||||
| trp1-1 | ||||
| gal2 | ||||
| hrd1 :: kanMX4 |
Tablo 2:. Maya, bu çalışmada kullanılan suşlar inşaat Detayları istek üzerine mevcuttur.
| Plazmid sayısı | Tam Plazmid adı | Şekil | Kaynak |
| pVJ30 | pRS414-P MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA | 5 | Rubenstein ve diğ., 2012 |
| pVJ121 | pRS414-P MET25 (MET25 promotör ile, boş vektör) | 4 | Mumberg ve ark., 1994 |
| pVJ467 | pRS414-P MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-His3 | 5 | Bu çalışma, |
| pVJ477 | pRS414-P GAL4 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-His3 | 4 | Bu çalışma, |
Tablo 3:. Bu çalışmada kullanılan plazmidler, tüm plazmitler, maya hücrelerinde replikasyon, maya hücreleri seleksiyon için TRP1 genini izin vermek için bir maya sentromer içerdiğine dikkat ediniz ve bakteri hücrelerinde bakım AmpR geni. Plazmid haritalar, diziler ve inşaat detayları istek üzerine mevcuttur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada yer alan yöntem hızlı bir şekilde belirlenmesi ve maya hücrelerinde protein yıkımı genetik gereklerine biyokimyasal onay sağlar. Bu deneyler () (örn 41-44, taşıma, depolama ve maya hücreleri manipüle etmek için protokollerin maya biyoloji birkaç mükemmel değerlendirmeleri ve derlemeler organizmaya yeni müfettişler için mevcuttur) programı ve güç maya modeli ökaryotik organizma olarak vurgulayın. teknikler kolayca protein sınıflarının birçok degradasyonunu ve bolluk araştırmak için uygulanabilir. Örneğin, diğerleri kararsız sitozolik, nükleer ve ER luminal ve transmembran proteinlerinin 45-49 bozunma mekanizmaları karakterize etmek bu stratejiyi kullanmışlardır.
Birkaç faktör kararsız bir proteine füzyon metabolik enzim seçiminde dikkate alınmalıdır. İlk olarak, bu genin işlevsel bir versiyonu enzimi olup kodlayan esastırkonakçı genom içinde mevcut. (Kararsız Proteinin bozulmuş olduğu zaman seçici koşullar altında, yani büyüme) yanlış pozitif sonuçlar en aza indirmek için, raportör geni (tercihen tam bir gen silmeler) 50 mutant alelleri olmayan geri alma liman suşlar ile çalışılması tavsiye edilmektedir. Raportör enzim seçimi için olan diğer arka plan gelişimini azaltmak ve deney darlığı geliştirmek için seçici bir büyüme ortamına dahil edilmesini rekabetçi önleyicileri, mevcudiyetidir. Bu da tam olarak işlevsel bozunma mekanizmalarının varlığında nispeten düşük bir devir oranına sahip proteinlerin durumlarda yararlı olabilir. Burada sunulan temsilci deneylerde, rekabetçi His3 enzimini inhibe 3-AT, dahil arka plan büyüme 40 azaltır. Benzer şekilde, bileşik, 6-azaurasil Ura3, urasil biyosentezi 51 için gerekli olan bir enzim inhibe eder. Büyüme inhibitör konsantrasyonu bozulması-d oluşurefektif değil, doğal tipte hücreler, deneysel olarak tespit edilmelidir. Bazı metabolik enzimler de karşı karşı-seçilmiş olabilir. Karşı seçici koşullar altında, hücreler, sabit olmayan bir protein parçalanır (ve kaynaşık metabolik enzim yok) sadece gelişebilir. Örneğin, Ura3 toksik bir bileşik, 5-fluorourasil, 52 bileşiği, 5-fluoroorotik asit (5-FOA) dönüştürür. Ura3 füzyon proteini düşer ise, bir URA3-füzyon proteinini ifade eden hücreler, yalnızca 5-FOA varlığında artacaktır. Benzer şekilde, bileşik 5-fluoroanthranilic asit (5-FAA) işlevsel bir triptofan biyosentez yolu ile hücrelere toksiktir. 5-FAA böylece kullanılabilir TRP1-füzyon proteinleri 53 eksprese eden hücreler için karşı-seçin. Karşı seçim stratejileri bozulması bozan mutasyonlar bastırma tanımlanması için faydalı olabilir.
bir parçalanma raportör ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılan promoteri de dikkatle seçilmelidir. BIOSYNTH olarak düşük seviyelerdeasetik enzimler harici olarak verilen metaboliti yokluğunda gelişimini desteklemek için yeterli olabilir, zayıf bir promotör 54 önerilir. Burada yer alan temsili denemelerde, glukoz 55 bastırılır GAL4 promotörü, Deg1 -Sec62-HIS3 transkripsiyonunu teşvik etmek için kullanılır. Bozunma mekanizması devre dışı olduğunda - bastırma koşullarında (örneğin,% 2 glukoz) altında füzyon proteininin bazal ifade seçici koşullar altında büyümeyi desteklemek için yeterli (2 mM 3-histidin, 1 varlığı ya da yokluğu) 'dir. Selektif şartlar western blotting ile tespit eşiğinin altında olması muhtemeldir altında Bununla birlikte, yeterli protein seviyeleri büyümesini desteklemek için. Bu nedenle, büyüme tahlili için zayıf bir promotör ve biyokimyasal onay için daha güçlü bir hızlandırıcı ile ekspresyonunu tahrik etmek için gerekli olabilir. (His3 füzyon olan veya olmayan) Deg1 -Sec62, bir daha Robus durumundat promoteri (buraya, MET25 yükseltici 39) Western leke analiziyle protein görselleştirme için gereklidir.
Burada tarif edildiği gibi, maya bazlı büyüme deneyi, bir küçük ölçekli, aday temelli yaklaşım ile gerçekleştirilebilir. Maya hücreleri seri seyreltileri, 96 oyuklu bir plaka içerisinde hazırlandı ve bir katı madde büyüme ortamına pipetle aktarılır; Katı ortam üzerinde seyreltilmiş maya hücre süspansiyonları etkili ve yeniden üretilebilir bir aktarımı için alternatif bir yöntem, genel olarak "Frogger" 56 olarak ifade edilen bir çok-kutuplu eşleyicisinin kullanımıdır. ideal zaman plakaları maya suşları ve şartlara göre değişir fotoğrafını çekmek. Bu hızlı büyüyen kültürden koloniler ilk olarak en inceltilmiş noktada görünür hale belirli bir plaka fotoğraflamak için tavsiye edilir. Bu genellikle örnekleri arasında büyüme oranlarındaki farklılıklar en belirgin olduğu noktadır. Özellikle maya durumunda, birden fazla gün fotoğrafını çekmek için tavsiye edilebilirbüyüme oranlarının geniş sergilerler.
Büyük ölçekli analizler için büyüme dayalı haberci deneyi de adapte edilebilir. Örneğin, bir bozunma raportör Sentetik Gen dizisi (SGD) teknolojisi 46,57 kullanılarak ~ 5,000 canlı haploid maya gen silinmesi türlerinin bir ticari olarak temin edilebilir bir kütüphaneye sokulabilir. Bu teknikte, bir kromozomal olarak entegre metabolik raportör füzyon proteini ile haploid maya soyu gen silinmesi kütüphanenin her bir suş için birleştirilir. Elde edilen diploit hücreleri sporlanmalanna bağlı (mayoz geçmesi) ve haploit öz değişmesine ait döl metabolik raportör ve ayrı gen silme, hem yataklık seçime tabi tutulur. Bu soy daha sonra, protein stabilize edilmiş olduğu hücreler için seçici topluca aktarılır. Küçük ölçekli analizler için de protein degradasyonu bir role sahip bir gen silinirse, füzyon proteini stabilize edecek ve hücre büyümesi artırılacaktır. Karşılaştırılabilir birpproaches kromozom dışı biçimde muhafaza plazmidlerle soylarının büyük bir toplama aynı anda dönüşüme izin olduğu öne sürülmüştür; Bu strateji kromozomal entegrasyonu, çiftleşme, sporulasyonunu ve mayoz seçimi 54 ortadan kaldırır.
Bir mutasyonun hücreleri metabolik raportör barındıran bir büyüme avantajı olduğu bulunmuştur, bu biyokimyasal mutasyon ilgili proteinin bolluğu arttırdığını teyit edilmesi gereklidir. Yakından Kuhsnirov 31 ile verilen yöntemle uyarlanan bir hızlı ve güvenilir bir maya parçalama prosedürü, sunulmuştur. Bu protokol, batı lekeleme ile analiz için doğrudan uygun bir formda protein ekstre sağlar. Bir proteinin analizi için, lizat miktarı, akrilamid jel özellikleri, diyaframın, bunun kullanılan antikorlar ve seyrelti ve algılama yönteminin seçimi ampirik olarak tespit edilmelidir başına yüklenecek. temsili bir Western blot protokolü ut tarifFloresan boyalar konjuge sekonder antikor ilizes; Diğer sık kullanılan protokoller antikor konjuge enzimler 58 bağımlı chemiluminescence güveniyor. Burada tarif edildiği gibi, ilgili proteini tespit etmek için kullanılan membran ile doğrudan bir yükleme kontrol proteini için bir antikor ile yeniden sondaj olabilir. İlgi ve yükleme kontrol proteini proteini tespit etmek için kullanılan primer antikorlar, aynı türden gelen yükseltilmiş olması durumunda, zarın reprobing sürece, bu proteinlerden kaynaklanan bant eş geçirmek yok gibi mümkündür. Bununla birlikte, ilgi ve yükleme kontrol proteini proteini tespit etmek için kullanılan primer antikorlar, farklı türlerden gündeme gelmiş ise ikincil antikorlar ile florofor konjuge edildiği takdirde, aynı zar ardışık olarak da şeritler birlikte geçirmek eğer sondalanabilir Farklı emisyon dalga boylarında. Durumunda faiz ve yükleme kontrol proteini birlikte geçmeleri ve ilgili birincil antikor protein rai olmuştursed aynı türden, numuneler PVDF membrana aktarıldı iki SDS-PAGE jelleri üzerinde çözülebilir ve ilgi ve yükleme kontrol proteini protein için spesifik antikorlar ile ayrı olarak problandı. Seçenek olarak ise, yükleme tutarlılık spesifik olmayan protein lekeleri (örneğin, Coomassie ya da Ponceau S) membranlar kuluçka ile değerlendirilebilir. Tipik olarak daha fazla, temsili bir Western blot protokolü, birinci ve ikinci antikor sıralı içerikli inkübasyon ile tespit edilen bir protein ya da epitopu kabul eder. Örnek sonuçlar analiz füzyon proteinleri (Şekiller 2 ve 3, PRA) Staphylococcus aureus Protein A elde edilen iki epitoplar içerir. Protein A, memeli immünoglobulinler doğrudan bağlanan ve bu nedenle de tek başına (birincil antikor inkübasyon aşaması gerekmektedir örneğin) 59 ikincil antikoru kullanılarak tespit edilebilir. Bir raportör enzim füzyon proteini bolluğu etkileyebilecek veya olasıdırbozulması. Bu biyokimyasal raportör protein tarafından ipoteksiz alt tabakanın bir sürümünü kullanarak sonuçları doğrulamak için bu nedenle tavsiye edilir. Son olarak, burada açıklanan her iki tahliller, protein istikrar farklılıkları bir vekil olarak kararlı durum protein düzeylerinde farklılıklar güveniyor. Protein bolluk protein sentezi ve yıkımı, ileri biyokimyasal analizler (örn sikloheksimid kovalamaca veya darbe kovalamaca deneyler) oranları entegrasyonunu yansıtan Çünkü doğrudan proteinin dinamik bozulma profilini analiz etmek istihdam edilmelidir.
temsili sonuçlar anormal ER translokon angaje bir proteinin parçalanması için genetik ihtiyaçların belirlenmesi için bu protokolün yeni bir uygulama kurmak. Deg1 -Sec62-His3 seçici koşullar altında maya büyüme avantajı doğan bozulma yolu inaktive zaman (yani içinde Hrd1 ubikitin ligaz yokluğu). Hızlı ve güvenilir bir protein exWestern blotting ile ve ardından çekme yöntemi Hrd1 yokluğunda (HIS3 ile veya olmadan) Deg1 -Sec62 bolluğu bir artış doğruladı. Önceki çalışmalar, translokon ilişkili proteinlerin Hrd1 bağımlı bozunma mekanizması için diğer Hrd1 ER lümen veya transmembran alt tabakalar 32 olanlardan farklı olduğunu göstermektedir. Gelecekteki çalışmalar, bu eşsiz bozulma mekanizması için gerekli yeni genleri tanımlamak için büyük ölçekli genetik ekranlarında Deg1 -Sec62-His3 füzyon proteini istihdam sağlayacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz bir destekleyici ve coşkulu bir araştırma ortamı sağlamak için Rubenstein laboratuar mevcut ve eski üyeleri teşekkür ederiz. Biz protokol optimizasyonu konusunda yardım almak için Ryan T. Gibson teşekkür ederim. Biz maya suşları ve plazmidler Mark Hochstrasser (Yale Üniversitesi) ve Dieter Kurt (Universität Stuttgart) teşekkür ederim. Biz bu yazının netlik ve programı geliştirmeye yardım ettikleri için anonim yorumcular teşekkür ederiz. Bu çalışma SGW'den Sigma Xi Ball State Üniversitesi bölümünden bir araştırma ödülü tarafından desteklenen, Ball State Üniversitesi Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (R15 GM111713) EMR için, EMR bir Ball State Üniversitesi aspire araştırma ödülü ve fonlar Provost Ofisi ve Biyoloji Bölümü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
| 3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs. |
| Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer. |
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers. |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes. |
| Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) | Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
References
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
- Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
- Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1. S11 (2007).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
- Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
- Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
- Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
- Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
- Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
- Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
- Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
- Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
- Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
- Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
- Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
- Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
- Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
- Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
- Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
- Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093 (2012).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
- Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
- Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
- Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
- Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
- Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
- Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
- Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
- Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
- Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
- Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , Elsevier. San Diego. (2004).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
- Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
- Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
- Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
- Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
- Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
- Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
- Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
- Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791 (2012).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
- Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
- Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).
Tags
Moleküler Biyoloji Sayı 96 ubikitin-proteazom sistemi,
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
