Summary
Este bioassay emprega um modelo de peixes predadores para avaliar a presença de metabólitos alimentação-de dissuasão a partir de extratos orgânicos de tecidos de organismos marinhos em concentrações naturais utilizando uma matriz alimentar comparável nutricionalmente.
Introduction
Ecologia química desenvolvido com a colaboração de químicos e ecologistas. Embora a especialidade da ecologia química terrestre tem sido em torno de algum tempo, o de ecologia química marinha é apenas algumas décadas de idade, mas tem fornecido importantes contribuições para a ecologia e comunidade estrutura evolutiva dos organismos marinhos 1-8. Aproveitando-se das tecnologias emergentes de mergulho e espectroscopia de RMN, químicos orgânicos rapidamente gerou um grande número de publicações que descrevem novos metabolitos de invertebrados marinhos bentônicos e algas na década de 1970 e 1980 9. Supondo-se que metabólitos secundários devem servir para alguma coisa, muitas dessas publicações atribuídas propriedades ecologicamente importantes para novos compostos sem evidência empírica. Mais ou menos ao mesmo tempo, os ecologistas também foram aproveitando o advento do mergulho e descreve as distribuições e abundâncias de animais bentônicos e plantas já conhecidas frosou métodos de amostragem relativamente ineficazes, como a dragagem. A hipótese dos pesquisadores foi que nada sésseis e de corpo mole deve ser quimicamente defendidas para evitar o consumo por predadores 10. Em um esforço para introduzir o empirismo ao que foi o trabalho de outra forma descritiva em abundância das espécies, alguns ecologistas começaram extrapolando defesas químicas a partir de ensaios de toxicidade 11. A maioria dos ensaios de toxicidade envolveu a exposição dos peixes inteiros ou em outros organismos para suspensões aquosas de extratos brutos da tecidos de invertebrados, com posterior determinação das concentrações de massa seca de extratos responsáveis por matar metade dos organismos de ensaio. No entanto, os ensaios de toxicidade não imitar a maneira pela qual os predadores potenciais percebem presas em condições naturais, e estudos posteriores não encontraram nenhuma relação entre a toxicidade e palatabilidade 12-13. É surpreendente que as publicações em revistas de prestígio utilizadas técnicas tendo pouca ou nenhuma ecological relevância 14-15 e, hoje, que esses estudos ainda são amplamente citado. Ele é ainda mais alarmante notar que estudos baseados em dados de toxicidade continuam a ser publicados 16-18. O método de bioensaio aqui descrito foi desenvolvido no final de 1980 para fornecer uma abordagem ecologicamente relevantes para os ecologistas marinhos químicos para avaliar as defesas químicas anti-predação. O método requer um modelo de predador para provar um extrato bruto do organismo alvo em uma concentração natural em uma matriz alimentar comparável nutricionalmente, fornecendo dados palatabilidade que são ecologicamente mais significativo do que os dados de toxicidade.
A abordagem geral para a avaliação da actividade anti-predação dos tecidos dos organismos marinhos inclui quatro critérios importantes: (1) um predador generalista apropriado devem ser usadas em ensaios de alimentação, (2) de todos os metabolitos orgânicos polaridades deve ser exaustivamente extraído do tecido do organismo alvo, (3) os metabolitos deve be misturados em um alimento nutricionalmente adequada experimental com a mesma concentração volumétrica como encontrado no organismo a partir do qual foram extraídos, e (4) o desenho experimental e abordagem estatística deve fornecer uma métrica significativa para indicar distastefulness relativa.
O procedimento descrito a seguir é projetado especificamente para avaliar as defesas químicas anti-predação de invertebrados marinhos do Caribe. Nós empregamos o bodião bluehead, Thalassoma bifasciatum, como um peixe predatório do modelo, porque esta espécie é comum em recifes de corais do Caribe e é conhecido por experimentar uma grande variedade de invertebrados bentônicos 19. De tecido do organismo alvo é extraído em primeiro lugar, em seguida, combinada com uma mistura alimentar, e finalmente oferecido para grupos de T. bifasciatum observar se eles rejeitam os alimentos tratados com extrato. Dados de ensaio usando este método forneceram importantes insights sobre a química defensiva de organismos marinhos 12,20-21, lhistória ife trade-offs 22-24 e 25-26 comunidade ecologia.
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Protocol
NOTA: Passo 3 do presente protocolo envolve indivíduos animais vertebrados. O procedimento foi concebido de modo que os animais recebam o tratamento mais humano possível e foi aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade de North Carolina Wilmington.
1) extracção de tecidos
- Use tecido que está em seu estado natural de hidratação e não apertou, seca-out ou excessivamente úmido, pois isso irá alterar a concentração volumétrica de metabólitos secundários. Cortar ou cortar tecido para peças ou fatias que podem ser inseridos dentro de um tubo de centrífuga de 50 ml. Nota: O tecido fresco pode ser utilizado em alguns casos, mas muitas vezes é melhor cortar ou cortar tecido congelado, que não está sujeita a apertar, quando o corte.
- Adicionar porções de tecido a 30 ml de uma mistura 1: 1 de diclorometano (DCM) e metanol (MeOH) em um tubo de centrífuga graduado até um volume final de 40 ml foi atingido. Certifique-se de realizar todas as etapas que envolvem a transferência desolvente em um exaustor com ventilação adequada.
- Tapar o tubo e invertê-lo várias vezes, em seguida, agitar repetidamente durante um período de 4 horas de extracção. Nota: Durante este período, a água combina com o MeOH e o MeOH resultante: fase aquosa separa-se a fase de DCM. O tecido é exposto alternadamente a DCM e MeOH: água como uma emulsão como os tubos são agitados.
- Transferir o extracto de DCM para um balão de fundo redondo e evapora-se até à secura num evaporador rotativo usando-se o calor baixo (<40 ° C). Usando solvente mínima, transferir o extracto seco a um frasco de cintilação de 20 ml. Montar o frasco com um adaptador evaporador rotativo e evapora-se novamente até à secura num evaporador rotativo usando-se o calor baixo (<40 ° C).
Nota: O próximo passo requer o uso de um instrumento de compressão caseiro que pode ser montado por aparafusamento os seguintes artigos em ordem sequencial na extremidade de uma haste roscada (1) da porca (2), louça, e (3) da porca de bolota. A máquina de lavar ou deve ser perfurado oumontado de modo que seja menor que o diâmetro interno de um tubo de centrífuga de 50 ml. - Voltando para o tubo de centrífuga graduado que contém o tecido e o MeOH: extracto de água, espremer o meio de extracção para fora do tecido por meio de compressão. Transferir o MeOH: extracto de água ao mesmo balão de fundo redondo e armazenar refrigeradas (<10 ° C).
- Adicionar MeOH para o tubo de centrífuga graduado até que o tecido já desidratado está submerso para uma segunda extracção de 2 a 6 horas de duração, em seguida, transferir o extrato MeOH novo para o balão de fundo redondo arrefecido contendo o MeOH: extracto de água. Se houver alguma preocupação de que o tecido não tem sido totalmente extraída, repetir a 2 a 6 horas de extracção de MeOH.
- Seque o MeOH num evaporador rotativo usando-se o calor baixo (<40 ° C). Transferir o extracto aquoso remanescente a partir do balão de fundo redondo para o frasco de cintilação contendo o extracto não polar seco, usando um volume mínimo de MeOH para lavar o frasco de fundo redondo.
- Evaporate o extracto aquoso até à secura utilizando calor baixo (<40 ° C) num concentrador de vácuo. O frasco de cintilação agora contém o extracto em bruto seco orgânico total de 10 ml de tecido. Evacuar o espaço superior do frasco com gás N2 para evitar a oxidação, feche bem e armazenar congelados (-20 ° C).
2) Preparação de Alimentos
- Prepare pó liofilizado manto squid.
Nota: manto Squid fornece uma fonte de alimentação que é comparável à de outros invertebrados bentônicos, e irá ser utilizada como um ingrediente nos sub-passos de 2,2.- Anéis congelados descongelamento do manto squid em deionizada quente (DI) de água, em seguida, purê-los em um misturador de alta velocidade.
- Verter uma fina camada de manto puré lulas em uma assadeira rasa e congelamento (-20 ° C), em seguida, romper a folha de puré lulas congeladas em pequenos pedaços para ser liofilizada.
- Liofiliza os congelados purê manto lula seguindo os procedimentos operacionais da freeze de cabelo.
- Pulverizar as peças liofilizadas de lula purê manto em um liquidificador de alta velocidade para formar um pó.
- Em um exaustor, despeje o manto squid em pó em uma peneira rotativa e peneire a farinha para separar grandes pedaços de tecido a partir do pó fino.
- Transfira a multa manto squid em pó para um recipiente lacrado. Evacuar o espaço de cabeça do recipiente com gás N2 para evitar a oxidação e armazenar congelada (-20 ° C).
- Preparar a mistura de alimentos.
Nota: Quando executando vários ensaios consecutivos, é prático para preparar ~ 100 ml de mistura de alimentos, no entanto esta receita pode ser dimensionada para volumes menores, se necessário.- Combinar uma mistura de 3 g de ácido algínico e 5 g de pó liofilizado manto lulas com 100 ml de água desionizada numa proveta de 150 ml. Agita-se vigorosamente com um microspatula durante alguns minutos até que o pó é completamente hidratada e a mistura é homogénea.
NOTA: Se desejar, corante alimentar pode ser adicionado neste step: ele é mais fácil de adicionar à mistura de corante alimentar que vai gerar as duas misturas de controlo e tratados (mascarar o pigmento natural do extracto na mistura tratados com extracto) em vez de tentar fazer corresponder a cor da mistura tratada por adição de extracto tingir para a mistura de controlo. Uma cor esverdeada ou acastanhada alimentos é muitas vezes desejável para mascarar quaisquer pigmentos no extracto em bruto. - Coloque exactamente 10 ml da mistura de alimentos para uma seringa graduada. Tome cuidado para evitar a inclusão de bolhas de ar durante este processo.
- Retirar o frasco de cintilação de 20 ml com extracto orgânico bruto seco do congelador. Adicionar uma ou duas gotas de MeOH, em seguida, misture o extrato em uma mistura homogênea com um microspatula.
- Ejectar o carregado seringa de 10 ml de matriz de alimentos para o frasco de cintilação de 20 ml e agita-se com uma microspatula para homogeneizar a mistura de alimentos tratados com extracto.
Nota: Pode ajudar a ejetar a seringa em incrementos menores (ou seja, ejetar 2 ml e homogeneizar, em seguida, r.epita até que todos os 10 ml foram homogeneizados).
- Combinar uma mistura de 3 g de ácido algínico e 5 g de pó liofilizado manto lulas com 100 ml de água desionizada numa proveta de 150 ml. Agita-se vigorosamente com um microspatula durante alguns minutos até que o pó é completamente hidratada e a mistura é homogénea.
- Prepare os grânulos de ensaio.
- Carregar um volume muito pequeno da mistura de extracto (~ 1 ml) com uma seringa, e submergir a ponta da seringa em uma solução de 0,25 M de CaCl2. Injectar o conteúdo da seringa para formar uma longa, cadeia espaguete semelhante.
- Depois de alguns minutos, retire o fio endurecido, cortá-la em 4 mm de comprimento pelotas em uma placa de corte de vidro com uma lâmina de barbear, e depois enxaguar em água do mar.
- Repita os passos 2.3.1 e 2.3.2 sem incluindo o extrato de tecido para fazer pelotas de controle. Certifique-se para tratar a pellets de controlo com um volume equivalente de solvente (ver adição de MeOH a mistura tratada no passo 2.2.3) para controlar a adição de solvente. Se um controlo negativo é desejado para confirmar que os peixes ensaio pode ser impedido de alimentação, adicionar benzoato de denatónio, a uma concentração de 2 mg ml-1 para a mistura de alimentos crus 27.
3) A palatabilidadeBioensaios
- Realizar ensaios de alimentação com amarelo-fase Wrasse bluehead selvagens capturados, Thalassoma bifasciatum, mantidos em grupos de três em compartimentos opaco face de aquários laboratório.
- Entregar pelotas de alimentos a partir de um copo de água do mar com uma pipeta de vidro com um bulbo de borracha. Nota: Pode demorar alguns dias para treinar peixes para receber o alimento desta forma. Um estímulo condicionado (por exemplo, alguns toques da pipeta no vidro do aquário) que precede a entrega de alimentos pode ser útil para treinar o peixe que esperar a adição de grãos de ração.
- Pontuação peletes. Considere-se uma pelete aceite se prontamente consumida pelos peixes. Considere um pellet rejeitado se não comido depois de um mínimo de três tentativas por parte de um ou mais peixes para levá-la em sua cavidade bucal, ou se o pellet é abordado e ignorado após uma tentativa nesse sentido.
- Amostras de pontuação. Nota: O procedimento de ensaio é descrito como um fluxograma na Figura 1, grupos de peixe que se recusam a comer.pelotas de controle em qualquer etapa do protocolo não são considerados ainda mais. Há dois resultados potenciais de uma única execução do ensaio: a amostra é aceitos ou rejeitados.
- Comece com uma bolinha de controle para confirmar que o grupo de peixes é cooperativa. Oferecer um pellet tratada. Se os peixes aceitar o pellet tratada, marcar a amostra que foi aceite. Se os peixes rejeitar o sedimento tratado, oferecer uma pelete de controlo subsequente para determinar se os peixes tenham cessado de alimentação. Se os peixes aceitar o pellet controle posterior, marcar a amostra como rejeitada.
- Replication. Repita o procedimento de ensaio com dez grupos independentes de peixe para cada extrato.
4) Importância Avaliando
- Avaliar a significância das diferenças no consumo de controle vs pelotas tratados com uma versão modificada do teste exato de Fisher 26. Modificar o teste para que os totais marginais para o controle e pelotas tratados são fixos, Tratando-os como duas amostras aleatórias. Nota: Este fornece p = 0,057 quando 7 pelotas são consumidos; Assim, qualquer extracto é considerada impedimento se 6 ou menos pelotas são comidos, e saboroso se 7 ou mais pelotas são comidos.
- Para comparar a palatabilidade relativa entre os grupos de extractos, calcular um número significativo de peletes consumidos dentro de cada grupo. Manter o limiar a 6 peletes assim um grupo de extractos replicados são considerados dissuasor se o número médio de peletes consumidos + erro padrão (SE) ≤6. Nota: Nos resultados representativos, o trabalho de grupo é espécie, assim replicar extratos provenientes de indivíduos distintos e a palatabilidade relativa pode ser comparada entre as espécies.
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Representative Results
Aqui nós relatamos resultados deste ensaio biológico para seis espécies de esponjas do Caribe comuns (Figura 2). Estes dados foram inicialmente publicado em 1995 por Pawlik et al. 12 e demonstrar o poder dessa abordagem para examinar as diferenças de estratégias de defesa química entre taxa co-ocorrência. Os resultados foram relatados como uma média do número de peletes de alimento comido + erro padrão (SE) para cada espécie. Quase não há sedimentos foram consumidos em ensaios com extratos brutos de clathrodes Agelas, Amphimedon compressa e cauliformis Aplysina. Em contraste, os aglomerados feitos com extratos de Callyspongia vaginalis, Geodia gibberosa e Mycale laevis foram prontamente consumido no ensaio 12. Menos de seis pelotas foram comidos para as três primeiras espécies, para que eles eram considerados significativamente impedimento. Em contraste, os segundos três espécies não foram significativamente diferentes dos controlos, e eramconsiderado aceitável.
Figura 1:. Esquemática do procedimento de ensaio Em todas as fases, a rejeição de um sedimento de controlo indica que este conjunto de ensaio de peixe não cooperam ou saciados e não pode ser usado posteriormente. O protocolo começa por oferecer cada conjunto de peixes a pelota controle seguido por um sedimento tratado. Em seguida, se o sedimento tratado é aceita a amostra é classificada como aceito. Se o sedimento tratado é rejeitada, mas a pelota controle subseqüente for aceite, a amostra é classificada como rejeitada.
Figura 2: Consumo por Thalassoma bifasciatum de pelotas de alimentos (média + SE) contendo extratos brutos da esponjas em concentrações naturais, relatada primeiramente em 1995 por Pawlik
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Discussion
O procedimento aqui descrito fornece um protocolo laboratorial relativamente simples, ecologicamente relevantes para a avaliação defesas químicas anti-predação em organismos marinhos. Aqui vamos rever os critérios importantes que sejam satisfeitas por este conjunto de métodos:
(1) A condição de predador. Este ensaio alimentação emprega o bodião bluehead, Thalassoma bifasciatum, um dos peixes mais abundantes nos recifes de coral em todo o Caribe. O bluehead é um carnívoro generalista conhecido para provar uma grande variedade de invertebrados bentônicos 19. Predadores generalistas são a melhor escolha para estes ensaios iniciais, porque a maioria dos peixes predadores em recifes são generalistas, e é de se esperar que as defesas anti-predação seria amplamente dirigida contra eles, ao contrário de predadores especializados que podem ter evoluído mecanismos para burlar as defesas. Pesquisas laboratoriais de defesas químicas, utilizando um único predador em potencial são deten seguido por mais demorado e complicado experimentos de campo que contam com as respostas de um conjunto completo de potenciais predadores em condições de campo 28-33.
(2) Procedimento de extracção. O primeiro passo de extracção do tecido, que utiliza uma mistura solvente de partes iguais de diclorometano (DCM) e metanol (MeOH), permeia-se rapidamente o tecido, de solubilização de membranas e desidratação de material celular. O tecido é desidratado após este passo, de modo que os passos subsequentes extrair os metabolitos de todos os restantes polaridades em MeOH. Repetindo a extracção em MeOH até que o tecido seja completamente extraído constitui um procedimento de extracção exaustiva. Pequenas variações sobre este esquema de extracção são aceitáveis, tais como a substituição de um solvente de extracção por outro da mesma polaridade, mas a extracção do tecido pode ser incompleta se um solvente inadequado é usado. Armadilhas potenciais de procedimentos de extração de tecido inadequada são discutidos em detalhes em outros lugares <sup> 8.
(3) Preparação do alimento experimental. A matriz de alimento artificial deve simular o tecido do organismo alvo, tanto a qualidade nutritiva e a concentração dos metabolitos secundários. É provável que os mesmos processos sensoriais que utilizam predadores para rejeitar metabolitos alimentação-impeditivas também estão envolvidos na percepção da qualidade nutritiva de alimentos. Alimentos com baixa qualidade nutricional pode ser rejeitado em níveis muito mais baixos de defesa química, e, inversamente, metabólitos secundários só pode ser dissuasor em concentrações mais elevadas do que o natural, se esses metabólitos são apresentados em um alimento artificial que é mais nutritivo do que o tecido a partir do qual foi derivada. Em pó, manto squid liofilizado é um substituto nutricional útil porque está prontamente disponível, fácil de medir, e suas características nutricionais já foram determinadas 34.
A segunda consideração na preparação do experimental alimentos diz respeito à determinação da concentração do extracto, o que deve ser feito com base no volume, não em massa. Predadores comem o tecido molhado, e os tecidos dos organismos marinhos variar largamente no conteúdo de água. Do ponto de vista de um predador, uma mordida de uma água-viva ou anêmona do mar deverá conter substancialmente mais água por unidade de massa seca do que o mesmo tamanho da mordida de uma lula ou mar lesma. Para tecidos altamente hidratados, a concentração do metabolito por unidade de massa seria muito superior por unidade de volume, mas o volume (picadas) é a medida que é ecologicamente relevante. Além disso, os tecidos dos organismos marinhos podem ter diferentes densidades de elementos esqueléticos porque minerais. Determinação da concentração de metabolito em volume resolve ambos os problemas e é a medida mais relevante do ponto de vista do consumo de tecido por um potencial predador. Este tópico, incluindo exemplos da literatura, é discutido em detalhes em outra parte 8.
.. content "> (4) Projeto Experimental e abordagem estatística delineamento experimental adequado e análises estatísticas de dados são tão importantes para os testes comportamentais como para qualquer outra investigação científica que envolve determinar a significância das diferenças nos resultados experimentais A análise aqui descrito é simples: diferenças são determinadas com uma tabela de contingência modificado. O método exige que todas as ofertas de alimentos controle de ser consumido, porque o investigador não estaria usando predadores experimentais que não estavam se alimentando de comidas de controle 8. Embora o uso do teste exato de Fisher foi modificado a partir do seu inicial usar por Pawlik et al. 12, o valor limite de 6 pelotas tratados comido permanece inalterado. Ao longo dos anos, outros testes estatísticos têm sido sugeridos como substitutos, mas descartado após consulta com o colaborador James E. Blum (UNCW Departamento de Matemática e Estatística ). Por exemplo, o teste de McNemar foi sugerido,mas não é adequado, tanto porque lhe falta um conjunto combinado de dados, e porque uma linha da tabela de contingência é fixada em 10 pelotas de controle comido.Apesar da nossa experiência que este método de ensaio fornece resultados de uma clareza surpreendente, que, no entanto, depende de uma resposta comportamental. Se os peixes estão sedentos por um período de tempo antes do ensaio, eles podem comer pelotas mais tratado do que fariam se os peixes foram bem alimentados, principalmente se um metabólito defensivo está presente nas pelotas de alimentos tratados com uma concentração quase limiar de actividade. Por estas razões, os resultados de ensaios de alimentação não deve ser sobre-interpretado. Por exemplo, uma diferença entre as duas amostras de tecido de 1/10 versus 9/10 peletes consumidos indica a primeira amostra é dissuasor e o segundo não é, mas a diferença de 3/10 versus 5/10 peletes consumidos pode ser devido a variação de comportamento entre as dosagens, e a primeira amostra, não é necessariamente mais dissuasor do que o segundo.
A applicat chaveião deste bioensaio é a sua utilização no fraccionamento guiada por bioensaios, em que as partições sucessivas do extracto em bruto são testados em peixes para isolar os compostos químicos responsáveis pela actividade de alimentação de dissuasão 29,32-33,35-38. Uma vez que a presença de uma defesa química foi determinado, o extracto orgânico bruto é cromatograf fraccionadas em subconjuntos mais pequenos de compostos que constituem a mistura, e estes subconjuntos são alimentados para pescar no mesmo ensaio de alimentação. Mais uma vez, isso deve ser feito em uma base volumétrica, utilizando "equivalentes" ml de extrato de tecido, em vez de equivalentes de massa. À medida que os rendimentos de separação, as fracções são ensaiadas quanto melhor uma diluição em série em relação à concentração volumétrica natural: 4 ×, 2 ×, e 1 ×. Este intervalo de concentrações leva em conta a provável redução na actividade de impedimento que vem de dividir os metabolitos activos ao longo de duas ou mais fracções cromatográficas ou de perda de metabolitos activos atragh decomposição, reação, ou apego a cromatográfica mídia. Uma vez que os metabolitos activos foram isoladas por fracionamento biomonitorado, o investigador pode identificá-los usando técnicas espectroscópicas padrão e também deve fazer o mesmo para as frações inativas que podem ter metabólitos secundários. É igualmente importante saber que metabólitos secundários são ativos em experimentos ecologicamente relevantes como saber qual metabolitos não são 8.
Elementos deste processo também podem ser utilizadas para conceber novas técnicas experimentais. Por exemplo, este bioensaio foi adaptado para predadores invertebrados (por exemplo caranguejos 39 e seastars 40), para outras regiões geográficas 41, e até mesmo para abordar outras questões de pesquisa (por exemplo, defesas estruturais 31,34,42 e aposematism 27). Os quatro critérios devem servir como um guia para futuras adaptações deste método. Em resumo, neste procedimento de bioensaio provides um método mais ecologicamente relevantes para a apreciação das defesas químicas anti-predação de tecidos de organismos marinhos. Estudos utilizando este procedimento têm avançado nossa compreensão dos fatores que controlam a distribuição e abundância dos invertebrados marinhos em recifes de corais do Caribe (por exemplo, mais recentemente, Loh e Pawlik 26) e pode informar investigações em diversos campos de pesquisa, incluindo farmacologia, biotecnologia e ecologia evolutiva.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-20 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A41220 | |
| Anhydrous Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-500 | |
| Cryocool Heat Transfer Fluid | Fisher Scientific | 20-548-146 | For vacuum concentrator |
| Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity | MP Biomedicals | 154723 | |
| Squid mantle rings | N/A | N/A | Can be purchased at grocery store |
| Denatonium benzoate | Aldrich | D5765 | |
| 50 ml graduated centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | |
| Disposable Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Rubber bulbs for Pasteur pipets | Fisher Scientific | 03-448-24 | |
| Red bulbs for pellet delivery | Fisher Scientific | 03-448-27 | |
| 250 ml round-bottom flask | Fisher Scientific | 10-067E | |
| Scintillation vial adapter for rotavap | Fisher Scientific | K747130-1324 | |
| Weightboats | Fisher Scientific | 02-202B | |
| Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| 5 ml graduated syringe | Fisher Scientific | 14-817-53 | |
| 10 ml graduated syringe | Fisher Scientific | 14-817-54 | |
| Razor blade | Fisher Scientific | S17302 |
References
- Paul, V. J., ed, Ecological roles of marine natural products. , Comstock Publishing. Associates: Ithaca, N.Y. (1992).
- Pawlik, J. R. Marine invertebrate chemical defenses. Chemical Reviews. 93 (5), 1911 (1993).
- Hay, M. E. Marine chemical ecology: what's known and what's next. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 44 (5), 476-476 (1996).
- McClintock, J. B., Baker, B. J. Marine Chemical Ecology. , CRC Press. Boca Raton, Fla. (2001).
- Amsler, C. D. Algal Chemical Ecology. , Springer. New York. (2008).
- Hay, M. E. Marine chemical ecology: Chemical signals and cues structure marine populations, communities, and ecosystems. Annual Review of Marine Science. 1, 193-212 (2009).
- Pawlik, J. R. The chemical ecology of sponges on Caribbean reefs: Natural products shape natural systems. BioScience. 61 (11), 888 (2011).
- Pawlik, J. R. Antipredatory Defensive Roles of Natural Products from Marine Invertebrates. Handbook of Marine Natural Products. , 677-710 (2012).
- Pawlik, J. R., Amsler, C. D., Ritson-Williams, R., McClintock, J. B., Baker, B. J., Paul, V. J. Marine Chemical Ecology: A Science Born of Scuba. Research and Discoveries: The Revolution of Science through Scuba. 39, 53-69 (2013).
- Randall, J. E., Hartman, W. D. Sponge-feeding fishes of the West Indies. Marine Biology. 1, 216-225 (1968).
- Bakus, G. J., Green, G. Toxicity in sponges and holothurians — geographic pattern. Science. 185, 951-953 (1974).
- Pawlik, J. R., Chanas, B., Toonen, R. J., Fenical, W. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish. 1. Chemical deterrency. Marine Ecology Progress Series. 127, 183-194 (1995).
- Schulte, B. A., Bakus, G. J. Predation deterrence in marine sponges — laboratory versus field studies. Bulletin of Marine Science. 50, 205-211 (1992).
- Jackson, J. B. C., Buss, L. Allelopathy and spatial competition among coral reef invertebrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72, 5160-5163 (1975).
- Bakus, G. J. Chemical defense mechanisms on the great barrier reef. Australia. Science. 211, 497-499 (1981).
- Gemballa, S., Schermutzki, F. Cytotoxic haplosclerid sponges preferred: a field study on the diet of the dotted sea slug Peltodoris atromaculata (doridoidea: nudibranchia). Marine Biology. 144, 1213-1222 (2004).
- Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. Relating species traits to environmental variables in Indonesian coral reef sponge assemblages. Marine and Freshwater Research. 58, 240-249 (2007).
- Mollo, E., et al. Factors promoting marine invasions: a chemolecological approach. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 4582-4586 (2008).
- Randall, J. E. Food habits of reef fishes of the West Indies. Studies in Tropical Oceanography. 5, 665-847 (1967).
- O'Neal, W., Pawlik, J. R. A reappraisal of the chemical and physical defenses of Caribbean gorgonian corals against predatory fishes. Marine Ecology Progress Series. 240, 117-126 (2002).
- Hines, D. E., Pawlik, J. R. Assessing the antipredatory defensive strategies of Caribbean non-scleractinian zoantharians (Cnidaria): is the sting the only thing. Marine Biology. 159 (2), 389-398 (2012).
- Walters, K. D., Pawlik, J. R. Is there a trade-off between wound-healing and chemical defenses among Caribbean reef sponges. Integrative and Comparative Biology. 45 (2), 352-358 (2005).
- Leong, W., Pawlik, J. R. Evidence of a resource trade-off between growth and chemical defenses among Caribbean coral reef sponges. Marine Ecology Progress Series. 406, 71-78 (2010).
- Leong, W., Pawlik, J. R. Comparison of reproductive patterns among 7 Caribbean sponge species does not reveal a resource trade-off with chemical defenses. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 401 (1-2), 80-84 (2011).
- Pawlik, J. R., Loh, T. -L., McMurray, S. E., Finelli, C. M. Sponge Communities on Caribbean Coral Reefs Are Structured by Factors That Are Top-Down, Not Bottom-Up. PLoS ONE. 8 (5), e62573 (2013).
- Loh, T. -L., Pawlik, J. R. Chemical defenses and resource trade-offs structure sponge communities on Caribbean coral reefs. Proceedings of the National Academy of Science. 111, 4151-4156 (2014).
- Miller, A. M., Pawlik, J. R. Do coral reef fish learn to avoid unpalatable prey using visual cues. Animal Behaviour. 85, 339-347 (2013).
- Pawlik, J. R., Fenical, W. A re-evaluation of the ichthyodeterrent role of prostaglandins in the Caribbean gorgonian coral, Plexaura homomalla. Marine Ecology Progress Series. 52, 95-98 (1989).
- Fenical, W., Pawlik, J. R. Defensive properties of secondary metabolites from the Caribbean gorgonian coral Erythropodium caribaeorum. Marine Ecology Progress Series. 75, 1-8 (1991).
- Pawlik, J. R., Fenical, W. Chemical defense of Pterogorgia anceps, a Caribbean gorgonian coral. Marine Ecology Progress Series. 87, 183-188 (1992).
- Chanas, B., Pawlik, J. R. Does the skeleton of a sponge provide a defense against predatory reef fish. Oecologia. 107 (2), 225-231 (1996).
- Chanas, B., Pawlik, J. R., Lindel, T., Fenical, W. Chemical defense of the Caribbean sponge Agelas clathrodes (Schmidt). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 208 (1-2), 185-196 (1997).
- Wilson, D. M., Puyana, M., Fenical, W., Pawlik, J. R. Chemical defense of the Caribbean reef sponge Axinella corrugata against predatory fishes. Journal of Chemical Ecology. 25 (12), 2811-2823 (1999).
- Chanas, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish II. Spicules, tissue toughness, and nutritional quality. Marine Ecology Progress Series. 127 (1), 195-211 (1995).
- Albrizio, S., Ciminiello, P., Fattorusso, E., Magno, S., Pawlik, J. R. Amphitoxin, a new high molecular weight antifeedant pyridinium salt from the Caribbean sponge Amphimedon compressa. Journal of Natural Products. 58 (5), 647-652 (1995).
- Assmann, M., Lichte, E., Pawlik, J. R., Köck, M. Chemical defenses of the Caribbean sponges Agelas wiedenmayeri and Agelas conifera. Marine Ecology Progress Series. 207, 255-262 (2000).
- Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus. Natural Product Letters. 15 (4), 275-285 (2001).
- Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators. Journal of Chemical Ecology. 28 (6), 1103-1115 (2002).
- Waddell, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs. Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).
- Waddell, B., Pawlik, J. R. Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars. Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).
- Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense. Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).
- Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322 (1), 67 (2005).
