Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

مختبر الأحيائي تغذية الأسماك لتقييم آخر Antipredatory من المركبات الثانوية من الأنسجة من الكائنات البحرية

doi: 10.3791/52429 Published: January 11, 2015

Summary

هذا الأحيائي توظف الأسماك المفترسة نموذج لتقييم وجود نواتج التغذية رادع من مقتطفات العضوية من أنسجة الكائنات البحرية في تركيزات الطبيعية باستخدام غذائيا مقارنة مصفوفة الغذاء.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

علم البيئة الكيميائية وضعت من خلال التعاون من الكيميائيين وعلماء البيئة. في حين كان subdiscipline من الأرضية البيئة الكيميائية في جميع أنحاء لبعض الوقت، أن علم البيئة الكيميائية البحرية ليست سوى بضعة عقود القديمة ولكن قدمت معلومات هامة في البيئة والمجتمع هيكل التطوري للكائنات البحرية 1-8. الاستفادة من التكنولوجيات الناشئة من رياضة الغطس وNMR الطيفي، ولدت علماء الكيمياء العضوية بسرعة عدد كبير من المنشورات التي تصف نواتج جديدة من اللافقاريات والطحالب البحرية القاعية في 1970s و 1980s 9. على افتراض أن المركبات الثانوية يجب أن يخدم بعض الأغراض، وكثير من هذه المنشورات المنسوبة بيئيا الخصائص الهامة لمركبات جديدة دون أدلة تجريبية. وفي الوقت نفسه، تم أخذ علماء البيئة أيضا الاستفادة من ظهور الغوص ويصف التوزيعات وفرة من الحيوانات والنباتات القاعية التي كانت تعرف سابقا جيئة وذهابام طرق أخذ العينات غير فعالة نسبيا مثل التجريف. كان الافتراض من هؤلاء الباحثين أن أي شيء لاطئة وميسرة جسديا يجب الدفاع عنه كيميائيا لتجنب الاستهلاك بنسبة 10 الحيوانات المفترسة. في محاولة لإدخال التجريبية إلى ما كان العمل صفي خلاف ذلك على وفرة الأنواع، بدأت بعض علماء البيئة استقراء الدفاعات الكيميائية من المقايسات سمية 11. وشملت معظم فحوصات السمية تعرض الأسماك الكاملة أو الكائنات الأخرى لتعليق المائية من مقتطفات العضوية الخام من الأنسجة اللافقارية، مع قرار لاحق للتركيز كتل جافة مقتطفات مسؤولة عن قتل نصف الكائنات الحية الفحص. ومع ذلك، فحوصات السمية لا تحاكي الطريقة التي الحيوانات المفترسة المحتملة ترى فريسة تحت الظروف الطبيعية، وقد وجدت الدراسات اللاحقة عدم وجود علاقة بين سمية واستساغة 12-13. ومن المثير للدهشة أن المنشورات في المجلات المرموقة تستخدم تقنيات وجود ضئيلة أو معدومة ECOLOGICAلتر أهمية 14-15 وأن هذه الدراسات لا تزال استشهد على نطاق واسع اليوم. بل لعله أكثر إثارة للقلق أن نلاحظ أن استمرار الدراسات على أساس بيانات السمية التي ستنشر 16-18. تم تطوير طريقة الأحيائي الموصوفة هنا في أواخر 1980s لتوفير نهج ذات الصلة بيئيا لعلماء البيئة البحرية الكيميائية لتقييم الدفاعات الكيميائية antipredatory. يتطلب الأسلوب المفترس نموذج لعينة استخراج العضوية الخام من الكائن المستهدف عند تركيز الطبيعي في غذائيا مقارنة مصفوفة الأغذية وتوفير البيانات استساغة التي هي أكثر وضوحا من الناحية البيئية من بيانات السمية.

النهج العام لتقييم النشاط antipredatory من أنسجة الكائنات البحرية ويشمل أربعة معايير المهم: (1) يجب أن تستخدم وهو مفترس اختصاصي المناسب في المقايسات التغذية، (2) الأيض العضوية من جميع أقطاب يجب أن يكون استخراجه مستفيض من أنسجة استهداف الحي، (3) يجب على الأيض بالبريد مختلطة في الغذاء التجريبي المناسب من الناحية التغذوية في نفس التركيز الحجمي كما هو موجود في الكائن الحي من التي تم استخراجها، و (4) التصميم التجريبي والمنهج الإحصائي يجب أن توفر مغزى متري للإشارة distastefulness النسبي.

تم تصميم الإجراء المذكورة أدناه خصيصا لتقييم الدفاعات الكيميائية antipredatory في اللافقاريات البحرية في منطقة البحر الكاريبي. نحن توظيف اللبروس bluehead، Thalassoma bifasciatum، باعتباره الأسماك المفترسة نموذجية لهذا النوع شائع على الشعاب المرجانية في الكاريبي وكما هو معروف لتذوق تشكيلة واسعة من اللافقاريات القاعية 19. يتم استخراج الأنسجة من الكائنات المستهدفة أولا، ثم مجتمعة مع خليط الغذاء، وأخيرا عرضت مجموعة من T. bifasciatum لمراقبة ما إذا كانوا يرفضون الأطعمة المعالجة استخراج. وقد وفرت بيانات الفحص باستخدام هذه الطريقة معلومات هامة في الكيمياء دفاعي من الكائنات البحرية 12،20-21، لالتاريخ IFE المفاضلات 22-24، والبيئة المجتمعية 25-26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: الخطوة 3 من هذا البروتوكول تتضمن موضوعات الحيوانات الفقارية. وقد تم تصميم هذا الإجراء بحيث تتلقى الحيوانات العلاج الأكثر إنسانية ممكن، وتمت الموافقة من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة ولاية كارولينا الشمالية ويلمنجتون.

1) استخلاص الأنسجة

  1. استخدام النسيج الذي هو في حالته الطبيعية من الماء وليس ضغط، والمجففة التدريجي أو الرطب بشكل مفرط حيث سيؤدي ذلك إلى تغيير التركيز الحجمي من المركبات الثانوية. قطع أو ختم الأنسجة إلى قطع أو شرائح التي يمكن إدراجها في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. ملاحظة: الأنسجة الطازجة يمكن استخدامها في بعض الحالات، ولكن من الأفضل في كثير من الأحيان إلى قطع أو ختم الأنسجة المجمدة، والتي لا تخضع لعصر عندما قطع.
  2. تضاف قطع الأنسجة إلى 30 مل من 1: 1 خليط من ثنائي كلورو ميثان (DCM) والميثانول (MeOH) في أنبوب الطرد المركزي تخرج حتى الحجم النهائي من 40 مل يتم التوصل إليه. يجب التأكد من إجراء جميع الخطوات التي تنطوي على نقلالمذيبات في غطاء الدخان مع التهوية الكافية.
  3. غطاء الأنبوب وعكس ذلك عدة مرات، ثم تستنهض الهمم مرارا وتكرارا خلال فترة استخراج 4 ساعة. ملاحظة: خلال هذه الفترة، ويجمع الماء مع MeOH وMeOH الناتجة: المرحلة الماء يفصل من مرحلة DCM. تتعرض الأنسجة بالتناوب لDCM وMeOH: الماء كما مستحلب كما يتم تحريكها الأنابيب.
  4. نقل استخراج DCM إلى دورق كروي وتتبخر إلى جفاف على المبخر الدوار باستخدام حرارة منخفضة (<40 ° C). باستخدام الحد الأدنى من المذيبات، ونقل استخراج المجففة إلى 20 مل التلألؤ القارورة. تناسب القارورة مع محول المبخر الدوار، ومرة ​​أخرى تتبخر للجفاف على المبخر الدوار باستخدام حرارة منخفضة (<40 ° C).
    ملاحظة: تتطلب الخطوة التالية استخدام أداة ضغط محلية الصنع التي يمكن تجميعها من قبل الشد العناصر التالية في ترتيب تسلسلي إلى نهاية قضيب الخيوط: (1) الجوز (2) غسالة، و (3) الجوز بلوط. يجب أن تكون إما مثقبة غسالة أوتركيبها بحيث يكون أقل من القطر الداخلي للأنبوب الطرد المركزي 50 مل.
  5. العودة إلى أنبوب الطرد المركزي تخرج يحتوي على الأنسجة وMeOH: استخراج المياه، والضغط المتوسط ​​استخراج من الأنسجة من خلال الضغط. نقل MeOH: استخراج المياه لنفس دورق كروي وتخزين مبردة (<10 ° C).
  6. إضافة MeOH إلى أنبوب الطرد المركزي تخرج حتى يتم المغمورة الأنسجة الآن المجففة لاستخراج الثاني من 2 إلى 6 مدة ساعة، ثم نقل MeOH جديد استخراج إلى دورق كروي المبردة التي تحتوي على MeOH: استخراج المياه. إذا كان هناك أي قلق من أن الأنسجة لم يتم استخراج تماما، كرر استخراج MeOH 2 إلى 6 ساعة.
  7. تجف قبالة MeOH على المبخر الدوار باستخدام الحرارة المنخفضة (<40 ° C). نقل المستخلص المائي المتبقية من دورق كروي إلى القارورة التلألؤ التي تحتوي على مستخلص قطبي المجففة، وذلك باستخدام حجم الأدنى من MeOH لشطف دورق كروي.
  8. Evaporate المستخلص المائي للجفاف باستخدام حرارة منخفضة (<40 ° C) على المكثف فراغ. يحتوي على قارورة التلألؤ الآن مجموع الجاف استخراج العضوية الخام من 10 مل من الأنسجة. إخلاء مساحة الرأس من القارورة مع N 2 الغاز لمنع أكسدة، وختم بإحكام، وتخزين تجميد (-20 ° C).

2) إعداد الطعام

  1. إعداد الحبار مسحوق عباءة تجميد المجفف.
    ملاحظة: توفر عباءة الحبار مصدر التغذية التي هي مماثلة لتلك التي من اللافقاريات القاعية أخرى، وسيتم استخدامها كعنصر في substeps 2.2.
    1. حلقات المجمدة ذوبان الجليد من عباءة الحبار في منزوع الأيونات الدافئة (DI) الماء، ثم هريس لهم في خلاط عالية السرعة.
    2. صب طبقة رقيقة من المهروس الحبار عباءة على ورقة الكعكة الضحلة وتجميد (-20 ° C)، ثم كسر ورقة من هريس الحبار المجمد الى قطع صغيرة ليتم مجفف بالتجميد.
    3. يجفد والمجمدة والحبار عباءة هريس بعد إجراءات التشغيل من الاب-eeze أكثر جفافا.
    4. يطحنون القطع مجفف بالتجميد من الحبار عباءة هريس في الخلاط عالية السرعة لتشكيل مسحوق.
    5. في غطاء الدخان، صب عباءة الحبار المجفف في الدقيق المغربل الدوارة وتدقيق لفصل أجزاء كبيرة من الأنسجة من مسحوق ناعم.
    6. نقل عباءة الحبار مسحوق غرامة لوعاء قابل للغلق. إخلاء الحاوية مساحة الرأس مع N 2 الغاز لمنع الأكسدة وتخزين مجمدة (-20 ° C).
  2. تحضير خليط المواد الغذائية.
    ملاحظة: عند تشغيل فحوصات متعددة متتالية، فمن العملي لإعداد ~ 100 مل من خليط الغذاء، ولكن هذه الوصفة قد يمكن تحجيمها إلى حجم أصغر إذا لزم الأمر.
    1. الجمع بين خليط من 3 غرام حمض الألجنيك و 5 ز تجميد المجفف مسحوق عباءة الحبار مع 100 مل من الماء DI في كوب 150 مل. يحرك بقوة مع microspatula لبضع دقائق حتى المسحوق هو رطب تماما ويصبح الخليط متجانسا.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، يمكن إضافة تلوين الطعام في هذه الحاديالجيش الشعبي: أنه من الأسهل لإضافة صبغة إلى خليط المواد الغذائية من شأنها أن تولد كل من الخلائط السيطرة المعالجة و(اخفاء الصباغ الطبيعي للاستخراج في استخراج معاملة خليط) بدلا من محاولة لتتناسب مع لون من استخراج معاملة الخليط بإضافة صبغ إلى خليط السيطرة. ومخضر أو ​​البني لون الطعام وغالبا ما يكون من المرغوب فيه لإخفاء أي أصباغ في استخراج النفط الخام.
    2. تحميل بالضبط 10 مل من خليط الغذاء إلى حقنة تخرج. الحرص على تجنب إدراج فقاعات الهواء أثناء هذه العملية.
    3. إزالة 20 مل قارورة التلألؤ مع الجاف استخراج العضوية الخام من الثلاجة. إضافة قطرة أو اثنتين من MeOH، ثم يقلب استخراج في خليط متجانس مع microspatula.
    4. إخراج تحميل حقنة 10 مل من مصفوفة الغذاء في التلألؤ قارورة 20 مل ويحرك مع microspatula لتجانس استخراج معاملة خليط الغذاء.
      ملاحظة: قد تساعد على إخراج الحقنة في دفعات صغيرة (أي إخراج 2 مل والتجانس، ثم ص.EPEAT حتى كل مل 10 تم المتجانس).
  3. إعداد الكريات الفحص.
    1. تحميل حجم صغير جدا من خليط استخراج (~ 1 مل) في حقنة، وغمر طرف الحقنة في حل من 0.25 M CaCl 2. إخراج محتويات حقنة لتشكيل طويلة، تشبه السباغيتي حبلا.
    2. بعد بضع دقائق، وإزالة حبلا صلابة، ختم عليها إلى 4 مم الكريات طويلة على لوحة قطع الزجاج بشفرة حلاقة، ثم يشطف في ماء البحر.
    3. كرر الخطوات من 2.3.1 و2.3.2 دون بما في ذلك استخراج النسيج لجعل الكريات السيطرة. تأكد لعلاج الكريات السيطرة مع حجم مماثل من المذيبات (انظر إضافة MeOH إلى الخليط المعالج في الخطوة 2.2.3) للسيطرة على إضافة مذيب. إذا كان المطلوب السيطرة السلبية للتأكد من أن الأسماك الفحص يمكن ردعها من التغذية، إضافة ديناتونيوم بنزوات بتركيز 2 ملغ مل -1 إلى خليط المواد الغذائية الخام 27.

3) استساغة الاكلاختبارات بيولوجية

  1. أداء المقايسات التغذية مع الصفراء مراحل اللبروس bluehead البرية اشتعلت، Thalassoma bifasciatum، وأبقى في مجموعات من ثلاثة في مقصورات مبهمة من جانب من أحواض المختبر.
  2. تقديم الغذاء الكريات من دورق مياه البحر باستخدام ماصة الزجاج مع لمبة المطاط. ملاحظة: قد يستغرق بضعة أيام لتدريب السمك للحصول على الغذاء في هذه الطريقة. والتحفيز تكييف (على سبيل المثال عدد قليل من الصنابير من ماصة على الزجاج حوض السمك) التي تسبق تسليم الأغذية قد تكون مفيدة لتدريب الأسماك أن نتوقع إضافة الكريات الغذاء.
  3. وسجل الكريات. النظر في قبول بيليه إذا استهلك بسهولة من قبل الأسماك. النظر في رفض بيليه إذا لم يؤكل بعد مدة لا تقل عن ثلاث محاولات الأسماك واحد أو أكثر من أخذه بعين تجويف الفم، أو إذا اقترب من بيليه وتجاهلها بعد واحدة من هذه المحاولة.
  4. عينات التهديف. ملاحظة: وصفت الإجراء فحص باعتباره المخطط الانسيابي في الشكل 1 مجموعة من الأسماك التي ترفض أكل.لا تعتبر الكريات السيطرة على أي خطوة في بروتوكول أبعد من ذلك. هناك نوعان من النتائج المحتملة لتشغيل واحد للمقايسة: العينة إما قبول أو رفض.
    1. تبدأ مع بيليه تحكم للتأكد من أن مجموعة من الأسماك التعاونية. تقدم بيليه المعالجة. إذا كان السمك تقبل بيليه المعالجة، يسجل العينة كما قبلت. إذا كان السمك ترفض بيليه المعالجة، وتقديم بيليه السيطرة لاحق لتحديد ما إذا كانت الأسماك قد توقفت التغذية. إذا كان السمك تقبل سيطرة بيليه لاحق، والنتيجة العينة مرفوضا.
  5. النسخ المتماثل. كرر الإجراء فحص مع عشر مجموعات مستقلة من الأسماك لكل استخراج.

4) تقييم أهمية

  1. تقييم أهمية الاختلافات في استهلاك السيطرة مقابل الكريات تعامل مع نسخة معدلة من اختبار فيشر الدقيق 26. تعديل الاختبار بحيث يتم إصلاح المجاميع الهامشية من أجل السيطرة وكريات تعامل، وعلاج لهم على حد سواء عينات عشوائية كما. ملاحظة: هذا يوفر ع = 0.057 عندما تؤكل 7 الكريات. وبالتالي، يعتبر أي استخراج رادع إذا تؤكل 6 أو أقل الكريات، وقبولا إذا تؤكل 7 أو أكثر الكريات.
  2. لمقارنة استساغة النسبي بين مجموعات من مقتطفات، حساب متوسط ​​عدد الكريات تؤكل داخل كل مجموعة. الحفاظ على عتبة 6 في الكريات ذلك تعتبر مجموعة من مقتطفات تكرار رادع إذا كان متوسط ​​عدد الكريات تؤكل + الخطأ المعياري (SE) ≤6. ملاحظة: في نتائج تمثيلية، تعيين مجموعة من الأنواع، لذلك تكرار مقتطفات تأتي من الأفراد متميزة ويمكن مقارنة استساغة النسبي بين الأنواع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نحن هنا تقرير نتائج هذا الأحيائي لستة أنواع من الإسفنج البحر الكاريبي المشتركة (الشكل 2). ونشرت هذه البيانات في البداية في عام 1995 من قبل بوليك وآخرون. 12 وتظهر قوة هذا النهج لدراسة الاختلافات في استراتيجيات الدفاع الكيميائية بين الأصناف التي تحدث المشترك. تم الإبلاغ عن النتائج بمثابة متوسط ​​عدد الكريات الطعام التي يتم تناولها + الخطأ المعياري (SE) لكل الأنواع. تقريبا كانت تؤكل لا الكريات في المقايسات مع مقتطفات العضوية الخام من clathrodes Agelas، Amphimedon compressa، وcauliformis Aplysina. في المقابل، كانت الكريات المصنوعة من مقتطفات من Callyspongia المهبلية، Geodia gibberosa، وMycale المورق تستهلك بسهولة في فحص 12. كانت تؤكل يقل عن ستة الكريات للأنواع الثلاثة الأولى، لذلك كانت تعتبر إلى حد كبير رادع. في المقابل، كانت الأنواع الثلاثة الثانية لا تختلف كثيرا عن الضوابط، وكانتيعتبر قبولا.

الشكل (1)
الشكل 1:. تخطيطي لإجراء الفحص في جميع المراحل، ورفض بيليه تحكم يشير إلى أن هذه المجموعة من الأسماك الفحص وغير متعاون أو الاشباع، ولا يمكن أن تستخدم أبعد من ذلك. بروتوكول يبدأ من خلال تقديم كل مجموعة من الأسماك بيليه السيطرة تليها بيليه المعالجة. المقبل، وسجل في حال قبول بيليه تعامل العينة كما قبلت. إذا تم رفض بيليه تعامل لكن السيطرة مقبولة بيليه لاحق، وسجل العينة مرفوضا.

الشكل 2
الشكل 2: استهلاك من قبل Thalassoma bifasciatum الكريات الغذائية (يعني + SE) تتضمن مقتطفات العضوية الخام من الإسفنج في تركيزات الطبيعية، لاول مرة في عام 1995 من قبل بوليك 12 السمك كل الكريات السيطرة 10 في جميع الحالات. بعد كل اسم الأنواع، ويتم تحديد عدد العينات تكرار (تكرار كل من استخراج مستقل لعينة متميزة جغرافيا من الأنسجة الإسفنج). للحصول على أي فحص فردي، واعتبرت مقتطفات رادع إذا كان عدد الكريات أكل أقل من أو يساوي 6 = 0.057، تعديل اختبار فيشر الدقيق)، كما يتضح من خط منقط على الرسم البياني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الإجراء الموصوفة هنا يوفر بروتوكول مختبر بسيط نسبيا، ذات الصلة من الناحية البيئية لتقييم الدفاعات الكيميائية antipredatory في الكائنات البحرية. نحن هنا استعراض المعايير الهامة التي يتم توفيرها من قبل هذه المجموعة من الأساليب:

(1) المفترس المناسب. ويعمل هذا الاختبار تغذية اللبروس bluehead، Thalassoma bifasciatum، واحدة من الأسماك الأكثر وفرة على الشعاب المرجانية في جميع أنحاء منطقة البحر الكاريبي. وbluehead هو أكلة اللحوم اختصاصي معروف لتذوق تشكيلة واسعة من اللافقاريات القاعية 19. الحيوانات المفترسة اختصاصي هي أفضل خيار لهذه المقايسات الأولية لأن الغالبية العظمى من الأسماك المفترسة على الشعاب هي عموميين، ويتوقع أن الدفاعات antipredatory ستوجه نطاق واسع مقابل لهم، بدلا من الحيوانات المفترسة المتخصصة التي قد تطورت آليات للتحايل على الدفاعات. استطلاعات مختبر الدفاعات الكيميائية باستخدام حيوان مفترس محتمل واحد هي منعشرة تليها أكثر تستغرق وقتا طويلا والميدان المعقد التجارب التي تعتمد على ردود مجموعة كاملة من الحيوانات المفترسة المحتملة في الظروف الميدانية 28-33.

(2) إجراءات استخراج. أول خطوة استخراج الأنسجة، والذي يستخدم خليط المذيبات من أجزاء متساوية ثنائي كلورو ميثان (DCM) والميثانول (MeOH)، تتخلل بسرعة الأنسجة، والانحلال الأغشية والتجفيف المواد الخلوية. الأنسجة هي المجففة بعد هذه الخطوة، لذلك استخراج الخطوات اللاحقة الأيض المتبقية من جميع أقطاب في MeOH. تكرار الاستخراج في MeOH حتى الأنسجة يتم استخراج بالكامل تشكل إجراءات استخراج شاملة. اختلافات طفيفة في هذا المخطط استخراج مقبولة، مثل استبدال واحد مذيب استخراج لآخر من نفس الأقطاب، ولكن قد يكون استخراج الأنسجة غير مكتمل إذا تم استخدام مذيب غير مناسب. وتناقش المزالق المحتملة للإجراءات استخراج الأنسجة غير لائقة بالتفصيل في مكان آخر <سوب> 8.

(3) إعداد الطعام التجريبية. يجب محاكاة مصفوفة الغذائية الاصطناعية الأنسجة من الكائنات المستهدفة في كل من الجودة الغذائية وتركيز المركبات الثانوية. ومن المرجح أن نفس العمليات الحسية التي تستخدم الحيوانات المفترسة لرفض التمثيل الغذائي التغذية رادع وتشارك أيضا في النظرة إلى نوعية التغذية من الأطعمة. قد يتم رفض الأطعمة مع انخفاض الجودة الغذائية على مستويات أقل بكثير من الدفاع الكيميائي، وعلى العكس، قد تكون المركبات الثانوية فقط رادع بتركيزات أعلى من الطبيعي إذا يتم عرض تلك الأيض في الغذاء الاصطناعي الذي هو أكثر قيمة غذائية من الأنسجة التي وقد اشتق ذلك. مسحوق، وتجميد المجفف عباءة الحبار هو بديل الغذائية مفيدة لأنها متاحة بسهولة، وسهلة لقياس، ولقد تم بالفعل تحديد الخصائص التغذوية 34.

والاعتبار الثاني في إعداد الغذاء التجريبي يتعلق بتحديد تركيز المستخلص، والتي يجب أن يتم على أساس حجم، وليس كتلة. الحيوانات المفترسة تأكل الرطب الأنسجة، وأنسجة الكائنات البحرية تختلف على نطاق واسع في محتوى الماء. من وجهة نظر المفترس، أن لدغة من قنديل في البحر أو البحر النعمان تحتوي على أكثر بكثير المياه لكل وحدة كتلة جافة من نفس دغة الحجم من الحبار أو البحر سبيكة. لأنسجة رطب للغاية، فإن تركيز المستقلب لكل وحدة الكتلة الجافة تكون أعلى بكثير مما في وحدة الحجم، ولكن حجم (لدغ) هو مقياس التي هي ذات الصلة من الناحية البيئية. وعلاوة على ذلك، قد أنسجة الكائنات البحرية لها كثافات مختلفة جدا لأنه من العناصر المعدنية والهيكل العظمي. تحديد تركيز المستقلب من حيث الحجم يحل المشاكل على حد سواء وهي المقياس الأكثر أهمية من وجهة نظر استهلاك الأنسجة من قبل حيوان مفترس محتمل. ويناقش هذا الموضوع، بما في ذلك أمثلة من الأدب وبالتفصيل في مكان آخر 8.

. المحتوى "> (4) التصميم التجريبي والمنهج الإحصائي التصميم التجريبي المناسب والتحليلات الإحصائية للبيانات هي على النحو المهم لفحوصات السلوكية كما لأي بحث علمي الآخر الذي ينطوي على تحديد أهمية الاختلافات في النتائج التجريبية التحليل الموصوفة هنا بسيط: يتم تحديد الاختلافات مع جدول طوارئ المعدلة. يتطلب الأسلوب أن جميع عروض الغذائية السيطرة أن تستهلك بسبب المحقق لن تستخدم الحيوانات المفترسة التجريبية التي لم تتغذى على الأطعمة السيطرة 8. على الرغم من أن استخدام اختبار فيشر الدقيق تم تعديلها من الأولي استخدامها من قبل بوليك وآخرون 12، قيمة عتبة 6 الكريات تعامل تؤكل دون تغيير. وعلى مر السنين، وقد اقترحت الاختبارات الإحصائية الأخرى كبدائل، ولكن تجاهل بعد التشاور مع متعاون جيمس E. بلوم (UNCW قسم الرياضيات والإحصاء ). على سبيل المثال، وقد اقترح اختبار McNemar، وولكن غير مناسب، سواء لأنها تفتقد إلى مجموعة مطابقة من البيانات، ولأن الثابت صف واحد من الجدول طوارئ في الكريات 10 المراقبة تؤكل.

وعلى الرغم من تجربتنا أن يوفر هذا الأسلوب فحص نتائج واضحة بشكل ملحوظ، فإنه مع ذلك يعتمد على استجابة سلوكية. إذا تم تجويع السمك لفترة من الوقت قبل الفحص، فإنها قد أكل الكريات أكثر المعالجة مما لو كانت الأسماك تغذية جيدة، لا سيما إذا كان الأيض دفاعي موجود في الغذاء الكريات تعامل بتركيز شبه عتبة النشاط. لهذه الأسباب، لا ينبغي أن يكون نتائج فحوصات التغذية على تفسير. على سبيل المثال، الفرق بين اثنين من عينات الأنسجة من 1/10 مقابل 9/10 الكريات تؤكل يشير العينة الأولى هي رادع والثاني هو لا، ولكن بفارق 3/10 5/10 مقابل الكريات تؤكل قد يكون راجعا إلى الاختلاف السلوكي بين المقايسات، والعينة الأولى ليست بالضرورة أكثر رادع من الثانية.

وهناك تطبيق و رئيسيأيون من هذا الأحيائي هو استخدامه في موجهة الأحيائي التجزئة، حيث يتم اختبار أقسام متتالية من استخراج النفط الخام على الأسماك لعزل المركبات الكيميائية المسؤولة عن نشاط التغذية رادع 29،32-33،35-38. مرة واحدة وقد تم التحقق من وجود الدفاع الكيميائي، ومجزأة استخراج العضوية الخام chromatographically إلى مجموعات فرعية أصغر من المركبات التي تشكل الخليط، ويتم تغذية هذه المجموعات الفرعية لصيد السمك في نفس التغذية الفحص. مرة أخرى، يجب أن يتم ذلك على أساس الحجمي، وذلك باستخدام "المعادل مل" من انتزاع الأنسجة بدلا من حكمه الجماعية. ومع استمرار الانفصال، وأفضل يعاير الكسور بمثابة التخفيف النسبي التسلسلية لتركيز الحجمي الطبيعي: 4 × 2 ×، و 1 ×. هذه الفترة من تركيزات يأخذ في الاعتبار الانخفاض المحتمل في النشاط الرادع الذي يأتي من تقسيم الأيض نشطة على مدى سنتين أو أكثر الكسور الكروماتوغرافي أو من فقدان الأيض نشطة الجوال عبر هواتف نوكياالتحلل GH، رد فعل، أو التعلق الكروماتوغرافي وسائل الإعلام. مرة واحدة وقد تم عزل نواتج الأيض نشطة من جانب موجهة الأحيائي تجزئة، المحقق قد تحدد لهم باستخدام التقنيات الطيفية القياسية وينبغي أيضا أن تفعل الشيء نفسه بالنسبة الكسور غير النشطة التي قد يكون لها المركبات الثانوية. من المهم أيضا أن تعرف ما هي المركبات الثانوية تنشط في التجارب ذات الصلة بيئيا لمعرفة أي نواتج الأيض هي ليست 8.

ويمكن أيضا أن تستخدم عناصر من هذا الإجراء لتصميم تقنيات تجريبية جديدة. على سبيل المثال، تم تكييفها هذا الأحيائي للحيوانات المفترسة اللافقاريات (مثل السرطانات 39 و seastars 40)، لمناطق جغرافية أخرى 41، وحتى لمعالجة المسائل البحثية الأخرى (على سبيل المثال دفاعات الهيكلية 31،34،42 وaposematism 27). يجب المعايير الأربعة بمثابة دليل على التعديلات المستقبلية لهذا الأسلوب. وباختصار، فإن هذا الإجراء الأحيائي العلاقات العامةovides طريقة أكثر ملاءمة بيئيا لتقييم الدفاعات الكيميائية antipredatory من أنسجة الكائنات البحرية. الدراسات التي تستخدم هذا الإجراء قد تقدم فهمنا للعوامل التي تتحكم في توزيع ووفرة من اللافقاريات البحرية على الشعاب المرجانية في الكاريبي (على سبيل المثال في الآونة الأخيرة، ولوه بوليك 26) وربما إبلاغ التحقيقات في مختلف المجالات من التحقيق، بما في ذلك الأدوية والتكنولوجيا الحيوية، و البيئة التطورية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dichloromethane Fisher Scientific D37-20
Methanol Fisher Scientific A41220
Anhydrous Calcium Chloride Fisher Scientific C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid Fisher Scientific 20-548-146 For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity MP Biomedicals 154723
Squid mantle rings N/A N/A Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate Aldrich D5765
50 ml graduated centrifuge tube Fisher Scientific 14-432-22
20 ml scintillation vial Fisher Scientific 03-337-7
Disposable Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets Fisher Scientific 03-448-24
Red bulbs for pellet delivery Fisher Scientific 03-448-27
250 ml round-bottom flask Fisher Scientific 10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap Fisher Scientific K747130-1324
Weightboats Fisher Scientific 02-202B
Microspatula Fisher Scientific 21-401-10
5 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-53
10 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-54
Razor blade Fisher Scientific S17302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paul, V. J., ed, Ecological roles of marine natural products. Comstock Publishing. Associates: Ithaca, N.Y. (1992).
  2. Pawlik, J. R. Marine invertebrate chemical defenses. Chemical Reviews. 93, (5), 1911 (1993).
  3. Hay, M. E. Marine chemical ecology: what's known and what's next. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 44, (5), 476-476 (1996).
  4. McClintock, J. B., Baker, B. J. Marine Chemical Ecology. CRC Press. Boca Raton, Fla. (2001).
  5. Amsler, C. D. Algal Chemical Ecology. Springer. New York. (2008).
  6. Hay, M. E. Marine chemical ecology: Chemical signals and cues structure marine populations, communities, and ecosystems. Annual Review of Marine Science. 1, 193-212 (2009).
  7. Pawlik, J. R. The chemical ecology of sponges on Caribbean reefs: Natural products shape natural systems. BioScience. 61, (11), 888 (2011).
  8. Pawlik, J. R. Antipredatory Defensive Roles of Natural Products from Marine Invertebrates. Handbook of Marine Natural Products. 677-710 (2012).
  9. Pawlik, J. R., Amsler, C. D., Ritson-Williams, R., McClintock, J. B., Baker, B. J., Paul, V. J. Marine Chemical Ecology: A Science Born of Scuba. Research and Discoveries: The Revolution of Science through Scuba. 39, 53-69 (2013).
  10. Randall, J. E., Hartman, W. D. Sponge-feeding fishes of the West Indies. Marine Biology. 1, 216-225 (1968).
  11. Bakus, G. J., Green, G. Toxicity in sponges and holothurians — geographic pattern. Science. 185, 951-953 (1974).
  12. Pawlik, J. R., Chanas, B., Toonen, R. J., Fenical, W. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish. 1. Chemical deterrency. Marine Ecology Progress Series. 127, 183-194 (1995).
  13. Schulte, B. A., Bakus, G. J. Predation deterrence in marine sponges — laboratory versus field studies. Bulletin of Marine Science. 50, 205-211 (1992).
  14. Jackson, J. B. C., Buss, L. Allelopathy and spatial competition among coral reef invertebrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72, 5160-5163 (1975).
  15. Bakus, G. J. Chemical defense mechanisms on the great barrier reef. Australia. Science. 211, 497-499 (1981).
  16. Gemballa, S., Schermutzki, F. Cytotoxic haplosclerid sponges preferred: a field study on the diet of the dotted sea slug Peltodoris atromaculata (doridoidea: nudibranchia). Marine Biology. 144, 1213-1222 (2004).
  17. Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. Relating species traits to environmental variables in Indonesian coral reef sponge assemblages. Marine and Freshwater Research. 58, 240-249 (2007).
  18. Mollo, E., et al. Factors promoting marine invasions: a chemolecological approach. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 4582-4586 (2008).
  19. Randall, J. E. Food habits of reef fishes of the West Indies. Studies in Tropical Oceanography. 5, 665-847 (1967).
  20. O'Neal, W., Pawlik, J. R. A reappraisal of the chemical and physical defenses of Caribbean gorgonian corals against predatory fishes. Marine Ecology Progress Series. 240, 117-126 (2002).
  21. Hines, D. E., Pawlik, J. R. Assessing the antipredatory defensive strategies of Caribbean non-scleractinian zoantharians (Cnidaria): is the sting the only thing. Marine Biology. 159, (2), 389-398 (2012).
  22. Walters, K. D., Pawlik, J. R. Is there a trade-off between wound-healing and chemical defenses among Caribbean reef sponges. Integrative and Comparative Biology. 45, (2), 352-358 (2005).
  23. Leong, W., Pawlik, J. R. Evidence of a resource trade-off between growth and chemical defenses among Caribbean coral reef sponges. Marine Ecology Progress Series. 406, 71-78 (2010).
  24. Leong, W., Pawlik, J. R. Comparison of reproductive patterns among 7 Caribbean sponge species does not reveal a resource trade-off with chemical defenses. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 401, (1-2), 80-84 (2011).
  25. Pawlik, J. R., Loh, T. -L., McMurray, S. E., Finelli, C. M. Sponge Communities on Caribbean Coral Reefs Are Structured by Factors That Are Top-Down, Not Bottom-Up. PLoS ONE. 8, (5), e62573 (2013).
  26. Loh, T. -L., Pawlik, J. R. Chemical defenses and resource trade-offs structure sponge communities on Caribbean coral reefs. Proceedings of the National Academy of Science. 111, 4151-4156 (2014).
  27. Miller, A. M., Pawlik, J. R. Do coral reef fish learn to avoid unpalatable prey using visual cues. Animal Behaviour. 85, 339-347 (2013).
  28. Pawlik, J. R., Fenical, W. A re-evaluation of the ichthyodeterrent role of prostaglandins in the Caribbean gorgonian coral, Plexaura homomalla. Marine Ecology Progress Series. 52, 95-98 (1989).
  29. Fenical, W., Pawlik, J. R. Defensive properties of secondary metabolites from the Caribbean gorgonian coral Erythropodium caribaeorum. Marine Ecology Progress Series. 75, 1-8 (1991).
  30. Pawlik, J. R., Fenical, W. Chemical defense of Pterogorgia anceps, a Caribbean gorgonian coral. Marine Ecology Progress Series. 87, 183-188 (1992).
  31. Chanas, B., Pawlik, J. R. Does the skeleton of a sponge provide a defense against predatory reef fish. Oecologia. 107, (2), 225-231 (1996).
  32. Chanas, B., Pawlik, J. R., Lindel, T., Fenical, W. Chemical defense of the Caribbean sponge Agelas clathrodes (Schmidt). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 208, (1-2), 185-196 (1997).
  33. Wilson, D. M., Puyana, M., Fenical, W., Pawlik, J. R. Chemical defense of the Caribbean reef sponge Axinella corrugata against predatory fishes. Journal of Chemical Ecology. 25, (12), 2811-2823 (1999).
  34. Chanas, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish II. Spicules, tissue toughness, and nutritional quality. Marine Ecology Progress Series. 127, (1), 195-211 (1995).
  35. Albrizio, S., Ciminiello, P., Fattorusso, E., Magno, S., Pawlik, J. R. Amphitoxin, a new high molecular weight antifeedant pyridinium salt from the Caribbean sponge Amphimedon compressa. Journal of Natural Products. 58, (5), 647-652 (1995).
  36. Assmann, M., Lichte, E., Pawlik, J. R., Köck, M. Chemical defenses of the Caribbean sponges Agelas wiedenmayeri and Agelas conifera. Marine Ecology Progress Series. 207, 255-262 (2000).
  37. Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus. Natural Product Letters. 15, (4), 275-285 (2001).
  38. Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators. Journal of Chemical Ecology. 28, (6), 1103-1115 (2002).
  39. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs. Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).
  40. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars. Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).
  41. Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense. Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).
  42. Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322, (1), 67 (2005).
مختبر الأحيائي تغذية الأسماك لتقييم آخر Antipredatory من المركبات الثانوية من الأنسجة من الكائنات البحرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).More

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter