Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

En fisk-fodring Laboratory bioassay i vurdering af den Antipredatory aktivitet af sekundære metabolitter fra væv af marine organismer

doi: 10.3791/52429 Published: January 11, 2015

Summary

Dette bioassay anvender en model rovfisk til at vurdere forekomsten af ​​fodring-afskrækkende metabolitter fra økologiske ekstrakter af væv af marine organismer ved naturlige koncentrationer ved hjælp af en ernæringsmæssigt sammenlignelig fødevare matrix.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kemisk økologi udviklet gennem et samarbejde med kemikere og økologer. Mens underdisciplin af jordbaseret kemisk økologi har eksisteret i nogen tid, at af havets kemiske økologi er kun et par årtier gammel, men har givet vigtig indsigt i den evolutionære økologi og samfund struktur af marine organismer 1-8. Ved at udnytte de emergente teknologier af dykning og NMR-spektroskopi, økologiske kemikere hurtigt genereret et stort antal publikationer, der beskriver nye metabolitter fra bundlevende marine hvirvelløse dyr og alger i 1970'erne og 1980'erne 9. Antages det, at sekundære metabolitter skal tjene et formål, mange af disse publikationer tilskrives økologisk vigtige egenskaber til nye forbindelser uden empiriske beviser. På nogenlunde samme tid, blev økologer også drage fordel af fremkomsten af ​​dykning og beskrive fordelingerne og mængderne af bunddyr og planter tidligere kendte from relativt ineffektive prøvetagningsmetoder såsom uddybning. Antagelsen af disse forskere var, at noget siddende og blød og rørige skal kemisk forsvares at undgå forbrug af rovdyr 10. I et forsøg på at indføre empiri til, hvad der var ellers beskrivende arbejde arter mængderne, nogle økologer begyndte ekstrapolere kemiske forsvar fra toksicitet assays 11. De fleste toksicitet assays involverede eksponeringen af ​​hele fisk eller andre organismer til vandige suspensioner af rå organiske ekstrakter af hvirvelløse væv, med efterfølgende bestemmelse af tørvægt koncentrationer af ekstrakter, der er ansvarlige for at dræbe halvdelen af ​​assay organismer. Men toksicitet analyser ikke efterligne den måde, hvorpå potentielle rovdyr opfatter bytte under naturlige forhold, og efterfølgende undersøgelser har fundet nogen sammenhæng mellem toksicitet og velsmag 12-13. Det er overraskende, at publikationer i prestigefyldte tidsskrifter brugte teknikker, der har lidt eller ingen Ecological relevans 14-15, og at disse undersøgelser stadig er almindeligt citeret i dag. Det er endnu mere alarmerende at bemærke, at undersøgelser baseret på toksicitetsdata fortsat blive offentliggjort 16-18. Den heri beskrevne bioassay metode blev udviklet i slutningen af ​​1980'erne for at give et økologisk relevant tilgang til marine kemiske økologer at vurdere antipredatory kemiske forsvar. Metoden kræver en model rovdyr at prøve en rå organisk ekstrakt fra målorganismen på en naturlig koncentration i et ernæringsmæssigt sammenlignelig fødevare matrix, der giver smagen data, der er mere økologisk meningsfulde end toksicitetsdata.

Den generelle tilgang til vurdering af antipredatory aktivitet af væv marine organismer indeholder fire vigtige kriterier: (1) en passende generalist rovdyr skal anvendes i foder assays, (2) organiske metabolitter af alle polariteter skal være udtømmende udvindes af væv i målrette organisme, (3) metabolitterne skal be blandet ind i en ernæringsmæssigt egnet eksperimentel mad på samme volumetriske koncentration som findes i organismen, hvorfra de blev udvundet, og (4) den eksperimentelle design og statistiske metode skal give en meningsfuld måling for at angive relative distastefulness.

Proceduren beskrevet nedenfor er designet specielt til at vurdere antipredatory kemiske forsvar i Caribien marine hvirvelløse dyr. Vi anvender den bluehead wrasse, Thalassoma bifasciatum, som model rovfisk, fordi denne art er almindelig på caribiske koralrev og er kendt for at prøve et bredt sortiment af bunddyr 19. Væv fra målet organismen først udvindes, derefter kombineret med en fødevare blanding, og endelig tilbydes til grupper af T. bifasciatum at observere, om de forkaster ekstrakt-behandlede fødevarer. Assay data ved hjælp af denne metode har givet vigtig indsigt i den defensive kemi af marine organismer 12,20-21, lIFE historie afvejninger 22-24 og samfund økologi 25-26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BEMÆRK: Trin 3 i denne protokol indebærer hvirveldyr emner. Proceduren er udformet således, at dyrene får den mest human behandling mulig og er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved University of North Carolina Wilmington.

1) Tissue Extraction

  1. Brug væv, der er i sin naturlige tilstand af hydrering og ikke klemt, udtørrede eller overdrevent våd, da dette vil ændre den volumetriske koncentration af sekundære metabolitter. Skære eller hakke væv i stykker eller skiver, der kan indsættes i et 50 ml centrifugerør. Bemærk: Frisk væv kan bruges i nogle tilfælde, men det er ofte bedre at skære eller hakke frosset væv, som ikke er underlagt klemme når cut.
  2. Tilføj vævsstykker til 30 ml af en 1: 1 blanding af dichlormethan (DCM) og methanol (MeOH) i et gradueret centrifugerør indtil et slutvolumen på 40 ml er opnået. Sørg for at foretage alle trin, der involverer overførsel afopløsningsmiddel i et stinkskab med tilstrækkelig ventilation.
  3. Cap røret og vend det flere gange, og derefter omrøre gentagne gange i løbet af en 4 timers ekstraktion periode. Bemærk: Under denne periode vand kombineres med MeOH, og den resulterende MeOH: vandfasen adskilles fra DCM-fasen. Vævet er skiftevis udsat for DCM og MeOH: vand som en emulsion som rørene omrøres.
  4. Overfør DCM ekstrakt til en rundbundet kolbe og inddampes til tørhed på en rotationsinddamper under anvendelse af lav varme (<40 ° C). Ved hjælp af minimal opløsningsmiddel, overføre tørstof til en 20 ml scintillationshætteglas. Monter hætteglas med en rotationsinddamper adapter og igen inddampes til tørhed på en rotationsinddamper under anvendelse af lav varme (<40 ° C).
    Bemærk: Det næste trin kræver brug af en hjemmelavet kompression instrument, der kan samles ved at skrue de følgende elementer i rækkefølge på enden af ​​en gevindskåret stang (1) møtrik (2) vasker, og (3) hættemøtrikken. Vaskemaskinen skal enten være perforeret ellermonteres således, at den er mindre end den indre diameter af en 50 ml centrifugerør.
  5. Vender tilbage til gradueret centrifugerør, der indeholder væv og MeOH: vand-ekstrakt, klemme ekstraktionsmediet ud af vævet gennem komprimering. Overfør MeOH: vand-ekstrakt til samme rundbundet kolbe og opbevares afkølet (<10 ° C).
  6. Tilføj MeOH til gradueret centrifugerør indtil nu dehydreret væv er nedsænket i en anden ekstraktion fra 2 til 6 timer varighed, og derefter overføre den nye MeOH ekstrakt til den afkølede rundbundet kolbe indeholdende MeOH: vand ekstrakt. Hvis der er nogen bekymring for, at vævet ikke er fuldt udvundet, gentag 2 til 6 timer MeOH ekstraktion.
  7. Tør MeOH på en rotationsfordamper under anvendelse af lav varme (<40 ° C). Overfør den resterende vandige ekstrakt fra rundbundet kolbe til scintillationshætteglas indeholdende den tørrede polær ekstrakt, anvendelse af et minimalt volumen MeOH at skylle rundbundet kolbe.
  8. Evaporate den vandige ekstrakt til tørhed under anvendelse af lav varme (<40 ° C) på en vakuumkoncentrator. Den scintillationshætteglas indeholder nu samlede tørre rå organisk ekstrakt af 10 ml væv. Evakuer head space af hætteglasset med N2-gas til at forhindre oxidation, slutter tæt, og opbevar frosset (-20 ° C).

2) Mad Forberedelse

  1. Forbered frysetørret blæksprutte kappe pulver.
    Bemærk: Squid kappe tilvejebringer en kilde til ernæring, der er sammenlignelig med andre bunddyr, og vil blive anvendt som en ingrediens i undertrinene til 2.2.
    1. Optø frosne ringe af blæksprutte kappe i varmt deioniseret (DI) vand, derefter puré dem i en high-speed blender.
    2. Hæld et tyndt lag af pureret blæksprutte kappe på et lavvandet bagepapir og fryse (-20 ° C), og derefter bryde ark frosne blæksprutter puré i små stykker, der skal frysetørres.
    3. Lyofilisere den frosne blæksprutte kappe puré efter de operationelle procedurer for den frEeze-tørrer.
    4. Pulverisere de lyofiliserede stykker af blæksprutte kappe puré i en high-speed blender til dannelse af et pulver.
    5. I et stinkskab, hæld den pulveriserede blæksprutte kappe til en roterende mel sigten og støvtætte at adskille store klumper af væv fra fint pulver.
    6. Overfør det fine pulveriserede blæksprutte kappe til en lukket beholder. Tøm beholderen headspace med N2-gas til at forhindre oxidation og opbevares nedfrosset (-20 ° C).
  2. Forbered maden blanding.
    Bemærk: Når du kører flere på hinanden følgende analyser, er det praktisk at forberede ~ 100 ml mad blanding, men denne opskrift kan skaleres til mindre mængder, hvis det er nødvendigt.
    1. Kombiner en blanding af 3 g alginsyre og 5 g frysetørret blæksprutte kappe pulver med 100 ml DI-vand i en 150 ml bægerglas. Rør kraftigt med en microspatel i et par minutter, indtil pulveret er helt hydreret og blandingen er homogen.
      BEMÆRK: Hvis det ønskes, frugtfarve kan tilsættes på dette step: det er lettere at tilføje farvestoffet til fødevarer blanding, der vil generere både behandlet og kontrol blandinger (maskering naturlige pigment af ekstrakten i ekstrakten-behandlede blanding) snarere end at forsøge at matche farven af ​​ekstraktet-behandlede blanding ved at tilsætte farvestof til kontrol blandingen. En grønlig eller brunlig fødevarer farve er ofte ønskeligt at maskere eventuelle pigmenter i den rå ekstrakt.
    2. Læg nøjagtigt 10 ml mad blandingen i en gradueret sprøjte. Sørg for at undgå optagelse af luftbobler under denne proces.
    3. Fjern 20 ml scintillationshætteglas med tør rå organisk ekstrakt fra fryseren. Tilføj en dråbe eller to af MeOH, derefter røre ekstraktet til en homogen blanding med en microspatel.
    4. Skub indlæst 10 ml injektionssprøjte af fødevarer matrix i 20 ml scintillationshætteglas og omrøres med en microspatel at homogenisere ekstrakt-behandlede fødevarer blanding.
      Bemærk: Det kan hjælpe at skubbe sprøjten i mindre intervaller (dvs. skubbe 2 ml og homogeniseres, så r.EPEAT indtil alle 10 ml er blevet homogeniseret).
  3. Forbered assay pellets.
    1. Sæt et meget lille volumen af ekstraktet blanding (~ 1 ml) i en sprøjte, og nedsænkes sprøjtespidsen i en opløsning af 0,25 M CaCl2. Skubbe indholdet af sprøjten til dannelse af en lang, spaghetti-lignende streng.
    2. Efter et par minutter, fjern hærdede streng, hak det i 4 mm lange piller på et glas skærebræt med et barberblad, og derefter skylles i havvand.
    3. Gentag trin 2.3.1 og 2.3.2 uden herunder vævsekstrakt at gøre kontrol piller. Sørg for at behandle kontrol pellets med en tilsvarende mængde solvens (se tilsætning af methanol til behandlede blanding i trin 2.2.3) til at kontrollere for tilsætning opløsningsmiddel. Hvis der ønskes en negativ kontrol for at bekræfte, at assay fisk kan afskrækkes fra fodring, tilføje denatoniumbenzoat i en koncentration på 2 mg ml -1 til den rå blanding fødevarer 27.

3) SmagBioassays

  1. Udfør fodring assays med vilde fanget gul-fase bluehead wrasse, Thalassoma bifasciatum, holdes i grupper på tre i uigennemsigtige-sidede rum i laboratoriet akvarier.
  2. Levere fødevarer pellets fra et bæger af havvand ved hjælp af et glas pipette med en gummi pære. Bemærk: Det kan tage et par dage til at træne fisk for at modtage mad på denne måde. En conditioning stimulus (f.eks et par tryk af pipetten på akvariet glas), der går forud for leveringen af fødevarer kan være en hjælp til at træne fiskene forventer tilføjelsen af foderpiller.
  3. Scoring pellets. Overvej en pellet accepteret, hvis let forbruges af fisk. Overvej en pille afvist, hvis ikke spist efter mindst tre forsøg fra en eller flere fisk til at tage det i munden hulrum, eller hvis pillen er nærmede og ignoreret efter en sådant forsøg.
  4. Scoring prøver. Bemærk: Assay procedure er afbildet som et rutediagram i figur 1 Grupper af fisk, der nægter at spise.kontrol piller på ethvert trin i protokollen, ikke yderligere. Der er to mulige udfald af en enkelt kørsel af analysen: prøven enten accepteret eller afvist.
    1. Begynd med en kontrol pille for at bekræfte, at gruppen af ​​fisk er samarbejdsvillig. Tilbyd en behandlet pellet. Hvis fiskene acceptere det behandlede pellet, score prøven som accepteret. Hvis fiskene afviser behandlede pellet, tilbyder en efterfølgende kontrol pille at afgøre, om fiskene er ophørt fodring. Hvis fiskene acceptere den efterfølgende kontrol pille, score prøven som forkastet.
  5. Replikation. Gentag assayproceduren med ti selvstændige grupper af fisk for hver ekstrakt.

4) Evaluering Betydning

  1. Vurdere betydningen af forskelle i forbruget af kontrol vs behandlede pellets med en modificeret udgave af Fishers eksakte test 26. Ændre testen, så de marginale totaler for kontrol og behandlede pellets er faste, Behandle dem begge som stikprøver. Bemærk: Dette giver p = 0,057, når 7 pellets spist; derfor er enhver ekstrakt anses afskrækkende, hvis 6 eller færre piller er spist, og spiselig hvis 7 eller flere piller er spist.
  2. For at sammenligne den relative velsmag blandt grupper af ekstrakter, beregne en gennemsnitlig antal pellets spist inden for hver gruppe. Hold tærsklen på 6 piller så en gruppe af replikat ekstrakter anses afskrækkende, hvis det gennemsnitlige antal pellets spist + standardafvigelse (SE) ≤6. Bemærk: I de repræsentative resultater, opgaven gruppe er arter, så kopierer uddrag kommer fra forskellige individer, og den relative velsmag kan sammenlignes mellem arterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her rapporterer vi resultaterne af denne bioassay for seks arter af fælles Caribbean svampe (figur 2). Disse data blev oprindeligt udgivet i 1995 af Pawlik et al. 12 og demonstrere kraften i denne tilgang til at kortlægge forskelle i kemiske forsvarsstrategier blandt co-forekommende systematiske enheder. Resultaterne blev rapporteret som en gennemsnitlig antal foderpiller spist + standardafvigelse (SE) for hver art. Næsten ingen pellets blev spist i assays med rå organiske ekstrakter fra Agelas clathrodes, Amphimedon compressa og Aplysina cauliformis. I modsætning hertil blev pellets lavet med uddrag fra Callyspongia vaginalis, Geodia gibberosa og Mycale laevis let forbruges i analysen 12. Færre end seks pellets blev spist for de første tre arter, så de blev anset for betydeligt afskrækkende virkning. I modsætning hertil den anden tre arter var ikke signifikant forskellige fra kontrollen, og varbetragtes spiselig.

Figur 1
Figur 1:. Skematisk af analysen forhandling I alle faser, afvisningen af en kontrol pille indikerer, at dette sæt af assay fisk er usamarbejdsvillig eller mæt, og kan ikke bruges længere. Protokollen begynder ved at tilbyde hvert sæt af fisk kontrol pellet efterfulgt af en behandlet pellet. Dernæst hvis det behandlede pellet accepteres prøven scoret som accepteret. Hvis det behandlede pellet afvises, men den efterfølgende kontrol pellet accepteres prøven scoret som afvist.

Figur 2
Figur 2: Forbrug af Thalassoma bifasciatum af fødevarer pellets (gennemsnit + SE), der indeholder rå organiske ekstrakter af svampe på naturlige koncentrationer, først rapporteret i 1995 af Pawlik 12 fisk, der forbruges alle 10 kontrol piller i alle tilfælde. Efter hver artsnavn, er antallet af udtages specificeret (hver replikere fra den separate ekstraktion af en geografisk adskilt prøve af svamp væv). For enhver enkelt assay blev ekstrakter betragtes afskrækkende hvis antallet af pellets spist var mindre end eller lig med 6 (p = 0,057, modificeret Fishers eksakte test), som angivet ved den stiplede linje på grafen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den heri beskrevne fremgangsmåde tilvejebringer en relativt enkel, økologisk relevant laboratorieprotokol for vurderingen antipredatory kemiske forsvar i marine organismer. Her gennemgår vi de vigtige kriterier, som er opfyldt med dette sæt af metoder:

(1) Passende rovdyr. Dette fodring assay anvender bluehead wrasse, Thalassoma bifasciatum, en af de mest udbredte fisk på koralrev i hele Caribien. Den bluehead er en generalist kødædende kendt for at prøve et bredt sortiment af bunddyr 19. Generalist rovdyr er det bedste valg for disse indledende analyser, fordi størstedelen af ​​rovfisk på stenrev er generalister, og det forventes, at antipredatory forsvar stort set blive rettet mod dem, i modsætning til specialiserede rovdyr, der kan have udviklet mekanismer til at omgå forsvar. Laboratorie undersøgelser af kemiske forsvar ved hjælp af en enkelt potentiel rovdyr er afti efterfulgt af flere tidskrævende og kompliceret markforsøg, der er afhængige af svarene fra en komplet supplement af potentielle rovdyr under markforhold 28-33.

(2) Ekstraktion procedure. Det første væv ekstraktionstrin, som anvender en opløsningsmiddelblanding af lige dele dichlormethan (DCM) og methanol (MeOH), hurtigt gennemtrænger væv, solubiliserende membraner og dehydrere cellemateriale. Vævet afvandes efter dette trin, så de efterfølgende trin udtrække resterende metabolitter af alle polariteter i MeOH. Gentagelse af ekstraktion i MeOH indtil vævet er fuldstændigt ekstraheret udgør en udtømmende ekstraktion procedure. Mindre variationer af denne udvinding ordning er acceptable, såsom substitution af én ekstraktionsmiddel for en anden af ​​samme polaritet, men væv udvinding kan være ufuldstændige, hvis der anvendes en uhensigtsmæssig opløsningsmiddel. Potentielle faldgruber forkert væv ekstraktionsprocedurer er diskuteret i detaljer andetsteds <sup> 8.

(3) Fremstilling af eksperimentel mad. Skal Den kunstige mad matrix simulere vævet af målorganismen i både den ernæringsmæssige kvalitet og koncentration af sekundære metabolitter. Det er sandsynligt, at de samme sensoriske processer, rovdyr bruger til at afvise fodring-afskrækkende metabolitter også er involveret i opfattelsen af ​​den ernæringsmæssige kvalitet af fødevarer. Fødevarer med lav ernæringsmæssig kvalitet kan afvises ved meget lavere niveauer af kemisk forsvar, og omvendt kan sekundære metabolitter kun afskrækkende ved højere end naturlige koncentrationer, hvis disse metabolitter præsenteres i en kunstig mad, der er mere nærende end det væv, hvorfra det blev afledt. Pulveriseret, frysetørret blæksprutte kappe er et nyttigt ernæringsmæssig erstatning, fordi det er let tilgængelige, lette at måle, og dets ernæringsmæssige egenskaber er allerede blevet fastlagt 34.

Den anden betragtning ved udarbejdelsen af ​​den eksperimenterende mad vedrører bestemmelse af koncentrationen af ​​ekstrakten, der skal ske på grundlag af volumen, ikke masse. Rovdyr spiser vådt væv, og væv af marine organismer varierer meget i vandindhold. Set fra et rovdyr, ville en bid af en vandmand eller søanemone indeholde væsentligt mere vand pr tør masse end den samme størrelse bid af en blæksprutte eller hav slug. For meget hydrerede væv, vil koncentrationen af ​​metabolitten pr tørvægt være meget højere end pr volumen, men volumen (bid) er den foranstaltning, der er økologisk relevant. Endvidere kan væv af marine organismer har meget forskellige tætheder på grund af mineralske skelet elementer. Bestemmelse af metabolit koncentration i volumen løser både problemer og er den mest relevante foranstaltning ud fra forbruget af væv fra en potentiel rovdyr. Dette emne, herunder eksempler fra litteraturen, er diskuteret i detaljer andetsteds 8.

.. indhold "> (4) Eksperimenterende design og statistisk metode Passende forsøgsdesign og statistiske analyser af data er så vigtige for adfærdsmæssige analyser som for enhver anden videnskabelig forskning, der involverer bestemmelse af betydningen af ​​forskelle i eksperimentelle resultater beskrevet heri analyse er enkel: forskelle opgøres med en modificeret kontingenstabel. Metoden kræver, at alle kontrol fødevarer tilbud forbruges fordi investigator ikke ville bruge eksperimentelle rovdyr, der ikke fodring på kontrol fødevarer 8. Selv om anvendelsen af Fishers eksakte test er blevet ændret fra sin oprindelige brug af Pawlik et al 12., tærskelværdien på 6 behandlede pellets spist forbliver uændret. I årenes løb har andre statistiske tests blevet foreslået som substitutter, men kasseres efter samråd med samarbejdspartner James E. Blum (UNCW Dept. for Matematik og statistik ). For eksempel McNemar test er blevet foreslået,men er uhensigtsmæssigt, både fordi den mangler et matchet sæt data, og fordi en række i kontingenstabel fastsættes til 10 kontrol piller spist.

Trods vores erfaring, at denne analyse metode giver bemærkelsesværdigt klare resultater, er det ikke desto mindre afhængig af en adfærdsmæssig reaktion. Hvis fisken er sultet for en periode inden assay, kan de spiser mere behandlede pellets end de ville, hvis fiskene blev velnærede, især hvis en defensiv metabolit er til stede i de behandlede foderpiller på en nær-tærskelkoncentration af aktivitet. Af disse årsager bør resultaterne af fodring analyser ikke overfortolkes. For eksempel kan en forskel mellem to vævsprøver på 1/10 vs 9/10 pellets spist angiver den første prøve er afskrækkende og den anden er ikke, men en forskel på 3/10 vs 5/10 pellets spist kan skyldes adfærdsmæssige variation mellem assays og den første prøve er ikke nødvendigvis mere afskrækkende end den anden.

Et centralt APPLICATion af denne bioassay er dens brug i bioassaystyret fraktionering, hvorved successive partition på den rå ekstrakt testes på fisk til at isolere de kemiske forbindelser, der er ansvarlige for fodring-afskrækkende aktivitet 29,32-33,35-38. Når tilstedeværelsen af ​​et kemisk forsvar er konstateret, er den rå organiske ekstrakt chromatografisk fraktioneret i mindre delmængder af forbindelser, der udgør blandingen, og disse delmængder fødes til at fiske i samme fodring assay. Igen bør det ske på en volumetrisk basis, ved hjælp af "ml ækvivalenter" af vævsekstrakt stedet masse ækvivalenter. Som separation skrider frem, bliver fraktioner bedst analyseres som en seriel fortynding i forhold til den naturlige volumetriske koncentration: 4 ×, 2 ×, og 1 ×. Denne spændvidde af fusioner tager højde for den sandsynlige reduktion i afskrækkende aktivitet, der kommer fra at opdele de aktive metabolitter over to eller flere kromatografiske fraktioner eller tab af aktive metabolitter through nedbrydning reaktion, eller tilknytning til kromatografiske medier. Når de aktive metabolitter er blevet isoleret ved bioassaystyret fraktionering kan investigator identificere dem ved hjælp af standard spektroskopiske teknikker og bør også gøre det samme for inaktive fraktioner, som kan have sekundære metabolitter. Det er lige så vigtigt at vide, hvilke sekundære metabolitter er aktive i økologisk relevante eksperimenter som at vide, hvilke metabolitter er ikke 8.

Elementer af denne procedure kan også anvendes til at designe nye eksperimentelle teknikker. For eksempel blev denne bioassay tilpasset til hvirvelløse rovdyr (f.eks krabber 39 og Seastars 40), for andre geografiske regioner 41, og selv at tage andre forskningsspørgsmål (f.eks strukturelle forsvar 31,34,42 og Aposematisme 27). De fire kriterier skal tjene som vejledning for fremtidige tilpasninger af denne metode. Sammenfattende bioassay denne procedure provides en mere økologisk relevante metode til vurdering af de antipredatory kemiske forsvar fra væv marine organismer. Undersøgelser med denne procedure har avancerede vores forståelse af de faktorer, der styrer fordelingen og overflod af marine hvirvelløse dyr på caribiske koralrev (f.eks senest Loh og Pawlik 26), og kan oplyse undersøgelser i forskellige områder undersøgelsesudvalg, herunder farmakologi, bioteknologi og evolutionær økologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dichloromethane Fisher Scientific D37-20
Methanol Fisher Scientific A41220
Anhydrous Calcium Chloride Fisher Scientific C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid Fisher Scientific 20-548-146 For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity MP Biomedicals 154723
Squid mantle rings N/A N/A Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate Aldrich D5765
50 ml graduated centrifuge tube Fisher Scientific 14-432-22
20 ml scintillation vial Fisher Scientific 03-337-7
Disposable Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets Fisher Scientific 03-448-24
Red bulbs for pellet delivery Fisher Scientific 03-448-27
250 ml round-bottom flask Fisher Scientific 10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap Fisher Scientific K747130-1324
Weightboats Fisher Scientific 02-202B
Microspatula Fisher Scientific 21-401-10
5 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-53
10 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-54
Razor blade Fisher Scientific S17302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paul, V. J., ed, Ecological roles of marine natural products. Comstock Publishing. Associates: Ithaca, N.Y. (1992).
  2. Pawlik, J. R. Marine invertebrate chemical defenses. Chemical Reviews. 93, (5), 1911 (1993).
  3. Hay, M. E. Marine chemical ecology: what's known and what's next. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 44, (5), 476-476 (1996).
  4. McClintock, J. B., Baker, B. J. Marine Chemical Ecology. CRC Press. Boca Raton, Fla. (2001).
  5. Amsler, C. D. Algal Chemical Ecology. Springer. New York. (2008).
  6. Hay, M. E. Marine chemical ecology: Chemical signals and cues structure marine populations, communities, and ecosystems. Annual Review of Marine Science. 1, 193-212 (2009).
  7. Pawlik, J. R. The chemical ecology of sponges on Caribbean reefs: Natural products shape natural systems. BioScience. 61, (11), 888 (2011).
  8. Pawlik, J. R. Antipredatory Defensive Roles of Natural Products from Marine Invertebrates. Handbook of Marine Natural Products. 677-710 (2012).
  9. Pawlik, J. R., Amsler, C. D., Ritson-Williams, R., McClintock, J. B., Baker, B. J., Paul, V. J. Marine Chemical Ecology: A Science Born of Scuba. Research and Discoveries: The Revolution of Science through Scuba. 39, 53-69 (2013).
  10. Randall, J. E., Hartman, W. D. Sponge-feeding fishes of the West Indies. Marine Biology. 1, 216-225 (1968).
  11. Bakus, G. J., Green, G. Toxicity in sponges and holothurians — geographic pattern. Science. 185, 951-953 (1974).
  12. Pawlik, J. R., Chanas, B., Toonen, R. J., Fenical, W. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish. 1. Chemical deterrency. Marine Ecology Progress Series. 127, 183-194 (1995).
  13. Schulte, B. A., Bakus, G. J. Predation deterrence in marine sponges — laboratory versus field studies. Bulletin of Marine Science. 50, 205-211 (1992).
  14. Jackson, J. B. C., Buss, L. Allelopathy and spatial competition among coral reef invertebrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72, 5160-5163 (1975).
  15. Bakus, G. J. Chemical defense mechanisms on the great barrier reef. Australia. Science. 211, 497-499 (1981).
  16. Gemballa, S., Schermutzki, F. Cytotoxic haplosclerid sponges preferred: a field study on the diet of the dotted sea slug Peltodoris atromaculata (doridoidea: nudibranchia). Marine Biology. 144, 1213-1222 (2004).
  17. Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. Relating species traits to environmental variables in Indonesian coral reef sponge assemblages. Marine and Freshwater Research. 58, 240-249 (2007).
  18. Mollo, E., et al. Factors promoting marine invasions: a chemolecological approach. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 4582-4586 (2008).
  19. Randall, J. E. Food habits of reef fishes of the West Indies. Studies in Tropical Oceanography. 5, 665-847 (1967).
  20. O'Neal, W., Pawlik, J. R. A reappraisal of the chemical and physical defenses of Caribbean gorgonian corals against predatory fishes. Marine Ecology Progress Series. 240, 117-126 (2002).
  21. Hines, D. E., Pawlik, J. R. Assessing the antipredatory defensive strategies of Caribbean non-scleractinian zoantharians (Cnidaria): is the sting the only thing. Marine Biology. 159, (2), 389-398 (2012).
  22. Walters, K. D., Pawlik, J. R. Is there a trade-off between wound-healing and chemical defenses among Caribbean reef sponges. Integrative and Comparative Biology. 45, (2), 352-358 (2005).
  23. Leong, W., Pawlik, J. R. Evidence of a resource trade-off between growth and chemical defenses among Caribbean coral reef sponges. Marine Ecology Progress Series. 406, 71-78 (2010).
  24. Leong, W., Pawlik, J. R. Comparison of reproductive patterns among 7 Caribbean sponge species does not reveal a resource trade-off with chemical defenses. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 401, (1-2), 80-84 (2011).
  25. Pawlik, J. R., Loh, T. -L., McMurray, S. E., Finelli, C. M. Sponge Communities on Caribbean Coral Reefs Are Structured by Factors That Are Top-Down, Not Bottom-Up. PLoS ONE. 8, (5), e62573 (2013).
  26. Loh, T. -L., Pawlik, J. R. Chemical defenses and resource trade-offs structure sponge communities on Caribbean coral reefs. Proceedings of the National Academy of Science. 111, 4151-4156 (2014).
  27. Miller, A. M., Pawlik, J. R. Do coral reef fish learn to avoid unpalatable prey using visual cues. Animal Behaviour. 85, 339-347 (2013).
  28. Pawlik, J. R., Fenical, W. A re-evaluation of the ichthyodeterrent role of prostaglandins in the Caribbean gorgonian coral, Plexaura homomalla. Marine Ecology Progress Series. 52, 95-98 (1989).
  29. Fenical, W., Pawlik, J. R. Defensive properties of secondary metabolites from the Caribbean gorgonian coral Erythropodium caribaeorum. Marine Ecology Progress Series. 75, 1-8 (1991).
  30. Pawlik, J. R., Fenical, W. Chemical defense of Pterogorgia anceps, a Caribbean gorgonian coral. Marine Ecology Progress Series. 87, 183-188 (1992).
  31. Chanas, B., Pawlik, J. R. Does the skeleton of a sponge provide a defense against predatory reef fish. Oecologia. 107, (2), 225-231 (1996).
  32. Chanas, B., Pawlik, J. R., Lindel, T., Fenical, W. Chemical defense of the Caribbean sponge Agelas clathrodes (Schmidt). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 208, (1-2), 185-196 (1997).
  33. Wilson, D. M., Puyana, M., Fenical, W., Pawlik, J. R. Chemical defense of the Caribbean reef sponge Axinella corrugata against predatory fishes. Journal of Chemical Ecology. 25, (12), 2811-2823 (1999).
  34. Chanas, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish II. Spicules, tissue toughness, and nutritional quality. Marine Ecology Progress Series. 127, (1), 195-211 (1995).
  35. Albrizio, S., Ciminiello, P., Fattorusso, E., Magno, S., Pawlik, J. R. Amphitoxin, a new high molecular weight antifeedant pyridinium salt from the Caribbean sponge Amphimedon compressa. Journal of Natural Products. 58, (5), 647-652 (1995).
  36. Assmann, M., Lichte, E., Pawlik, J. R., Köck, M. Chemical defenses of the Caribbean sponges Agelas wiedenmayeri and Agelas conifera. Marine Ecology Progress Series. 207, 255-262 (2000).
  37. Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus. Natural Product Letters. 15, (4), 275-285 (2001).
  38. Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators. Journal of Chemical Ecology. 28, (6), 1103-1115 (2002).
  39. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs. Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).
  40. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars. Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).
  41. Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense. Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).
  42. Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322, (1), 67 (2005).
En fisk-fodring Laboratory bioassay i vurdering af den Antipredatory aktivitet af sekundære metabolitter fra væv af marine organismer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).More

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter