Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

מעבדה מבדק-האכלת דגים לבחינת פעילות Antipredatory של משני מטבוליטים מהרקמות של אורגניזמים ימיים

doi: 10.3791/52429 Published: January 11, 2015

Summary

המבדק זה מעסיק דגים טורפים מודל כדי להעריך את הנוכחות של מטבוליטים האכלה-הרתעה מתמציות אורגניות של הרקמות של יצורים ימיים בריכוזים טבעיים באמצעות מטריצת מזון דומה מבחינה תזונתית.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אקולוגיה כימית שפותחה באמצעות שיתוף הפעולה של כימאים ואקולוגים. בעוד subdiscipline אקולוגיה כימית יבשתית בסביבה כבר זמן מה, זה של אקולוגיה כימית הימית הוא רק בן כמה עשרות שנים, אך סיפק תובנות חשובות מבנה האקולוגיה והקהילה האבולוציונית של יצורים ימיים 1-8. מנצל את הטכנולוגיות המתהוות של צלילה וספקטרוסקופיה NMR, כימאים אורגניים במהירות שנוצרו מספר רב של פרסומים המתארים רומן מטבוליטים מחוליות ימיות של קרקעית ים ואצות בשנתי ה -1970 ו -1980 9. בהנחה שמטבוליטים משניים צריכים לשרת כמה מטרות, שרבים מהפרסומים אלה מיוחסים מבחינה אקולוגית תכונות חשובות לתרכובות חדשות ללא ראיות אמפיריות. בערך באותו הזמן, אקולוגים היו גם מנצלים את כניסתו של צלילה ומתארים את ההפצות ושכיחותם של בעלי חיים וצמחים של קרקעית ים הידוע בעבר הלוך ושובמ 'שיטות דגימה יחסית לא יעילות כמו חפירה. ההנחה של חוקרים אלה הייתה שכל דבר הנייח ורך-גוף חייב להיות מוגן כימי כדי למנוע הצריכה על ידי טורפים 10. במאמץ להציג את האמפיריציזם למה שהייתה עבודה אחרת תיאורים על שכיחות מינים, כמה אקולוגים החלו אקסטרפולציה הגנות כימיות ממבחני רעילות 11. רוב מבחני הרעילות מעורבים החשיפה של דג שלם או אורגניזמים אחרים להשעיות מימיות של תמציות אורגניות גולמיים של רקמות חסרי חוליות, בנחישות הבאה של ריכוזי מסה היבש של תמציות אחראים להריגת מחצית אורגניזמים assay. עם זאת, מבחני רעילות לא לחקות את האופן שבו תופסים את טרף טורפים פוטנציאליים בתנאים טבעיים, ומחקרים עוקבים לא מצאו קשר בין רעילות ואת הטעם 12-13. אין זה מפתיע כי פרסומים בכתבי עת יוקרתיות השתמשו בטכניקות שיש ecologica קטן או לארלוונטי l 14-15 והיום שמחקרים אלה עדיין מצוטטים בהרחבה. זה אפילו יותר מדאיג לציין כי מחקרים המבוססים על נתונים רעילות יוסיפו להתפרסם 16-18. שיטת המבדק המתוארת כאן פותחה בשלהי 1980 על מנת לספק גישה רלוונטית מבחינה אקולוגית לאקולוגים כימיים ימיים להעריך הגנות כימיות antipredatory. השיטה דורשת טורף מודל לדגום תמצית אורגנית גולמי מאורגניזם היעד בריכוז טבעי במטריצת מזון דומה מבחינה תזונתית, המספקת נתונים את הטעם, כי הם יותר מבחינה אקולוגית משמעותית מנתוני רעילות.

הגישה הכללית להערכת פעילות antipredatory של הרקמות של יצורים ימיים כוללת ארבעה קריטריונים חשובים: (1) טורף generalist מתאים יש להשתמש במבחני האכלה, (2) מטבוליטים אורגניים של כל הקטבים חייבים להיות מופקים באופן ממצה מהרקמות של יעד האורגניזם, (3) מטבוליטים חייבים bהדואר מעורב לתוך מזון ניסוי מתאים מבחינה תזונתית באותו הריכוז הנפח כפי שנמצא באורגניזם שממנו הם מופקים, ו- (4) עיצוב הניסיון והגישה סטטיסטית חייבים לספק משמעותי מטרי כדי לציין distastefulness היחסי.

ההליך המתואר להלן תוכנן במיוחד כדי להעריך את ההגנות כימיות antipredatory בחסר חוליות ימיות באיים הקריביים. אנו מעסיקים wrasse bluehead, bifasciatum Thalassoma, כדגים טורפים מודל כי מין זה הוא נפוץ על שוניות אלמוגי האיים הקאריביים, והוא ידוע לדגום מגוון רחב של חסרי חוליות של קרקעית ים 19. רקמה מאורגניזם היעד מופק ראשונה, ולאחר מכן בשילוב עם תערובת מזון, ולבסוף הציעה לקבוצות של ט ' bifasciatum להתבונן אם הם דוחים את המזונות שטופל בתמצית. נתוני assay שימוש בשיטה זו סיפקו תובנות חשובות הכימיה ההגנתית של יצורים ימיים 12,20-21, lהיסטורית ife פשרות 22-24, ואקולוגיה קהילת 25-26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: שלב 3 של פרוטוקול זה כרוך נושאי בעלי חיים בעלי חוליות. ההליך תוכנן כך שבעלים חיים מקבלים הטיפול ההומני ביותר אפשריות ואושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה ווילמינגטון.

1) הפקת רקמות

  1. השתמש ברקמות שנמצאות במצב הטבעי של לחות ולא לחץ, מיובש או מדי רטובה כמו זה יהיה לשנות את ריכוז הנפח של מטבוליטים משתיים. לחתוך או לקצוץ רקמה לחתיכות או פרוסות שיכולות להיות מוכנסת לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר. הערה: רקמה טרי ניתן להשתמש בחלק ממקרים, אבל זה לעתים קרובות יותר כדי לחתוך או לקצוץ רקמה קפוא, שאינה כפוף לסחיטה כאשר חתך.
  2. להוסיף חתיכות רקמה 30 מיליליטר של 1: 1 תערובת של dichloromethane (DCM) ומתנול (MeOH) בצינור צנטריפוגות סיים עד נפח סופי של 40 מיליליטר הוא הגיע. הקפד לבצע את כל השלבים כרוכים בהעברהממס במנדף עם אוורור מתאים.
  3. שווי הצינור ולהפוך אותו כמה פעמים, ואז להתסיס שוב ושוב במהלך תקופת חילוץ 4 שעות. הערה: בתקופה זו, מים משלבים עם MeOH וMeOH וכתוצאה מכך: שלב מים מפריד בין שלב DCM. הרקמה חשופה לסירוגין לDCM וMeOH: מים כתחליב כצינורות נסערים.
  4. העבר את תמצית DCM לבקבוק מסביב לתחתית ולהתאדות עד יובש על מאייד סיבובי באמצעות חום נמוך (<40 ° C). שימוש בממס מינימאלי, להעביר את התמצית יבשה לבקבוקון נצנץ 20 מיליליטר. התאם את הבקבוקון עם מתאם מאייד סיבובי ושוב להתאדות ליובש במאייד סיבובי באמצעות חום נמוך (<40 ° C).
    הערה: השלב הבא מחייב שימוש במכשיר דחיסת תוצרת בית שעשוי להיות מורכב על ידי הברגה את הפריטים הבאים לפי סדר על סוף המוט מושחל: (1) אגוז, (2) ומכונת כביסה, ו- (3) אגוז בלוט. או מכונת הכביסה חייבת להיות או מחוררתמצויד כך שזה פחות מהקוטר הפנימי של צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר.
  5. חוזר לצינור צנטריפוגות סיים המכיל רקמות וMeOH: תמצית המים, לסחוט את מדיום החילוץ מתוך הרקמה באמצעות דחיסה. העבר את MeOH: תמצית מים לאותו בקבוק עגול התחתון ולאחסן מצונן (<10 ° C).
  6. להוסיף MeOH לצינור צנטריפוגות סיים עד הרקמה עכשיו מיובשת היא שקועה לחילוץ שני של 2-6 משך שעה, ולאחר מכן להעביר MeOH החדשה לחלץ לבקבוק מסביב לתחתית המצונן המכיל MeOH: תמצית המים. אם יש חשש שהרקמה לא חולצו באופן מלא, לחזור על 2-6 שעות חילוץ MeOH.
  7. להתנגב MeOH על מאייד סיבובי באמצעות חום נמוך (<40 ° C). העבר את התמצית המימית שנותרה מהבקבוק העגול תחתונה לבקבוקון הנצנץ המכיל את התמצית הפולרית המיובש, באמצעות נפח מינימאלי של MeOH לשטוף את הבקבוק העגול התחתון.
  8. Evaporate התמצית המימית ליובש באמצעות חום נמוך (<40 ° C) על רכז ואקום. בקבוקון הנצנץ עכשיו מכיל תמצית הכוללת היבשה אורגנית הגולמי של 10 מיליליטר של רקמה. לפנות את שטח הראש של הבקבוקון עם N 2 גז כדי למנוע חמצון, לאטום היטב, וחנות קפוא (-20 ° C).

2) הכנת מזון

  1. הכן אבקת מעטפת דיונון המיובש בהקפאה.
    הערה: מעטפת קלמארי מספקת מקור של תזונה שהוא דומה לזה של חסרי חוליות אחרות של קרקעית ים, וישמש כמרכיב בsubsteps של 2.2.
    1. טבעות קפוא הפשרה של מעטפת דיונון במים ללא יונים חמים (DI), ואז רסק אותם בבלנדר במהירות גבוהה.
    2. שפכו שכבה דקה של מעטפת דיונון מחיה על נייר אפייה רדודה והקפאה (-20 ° C), ואז לשבור את גיליון של פירה דיונון הקפוא לחתיכות קטנות כדי להיות lyophilized.
    3. Lyophilize פירה מעטפת דיונון הקפוא הבאים נהלי ההפעלה של freeze-יבש.
    4. לכתוש את חתיכות lyophilized של פירה מעטפת דיונון בבלנדר במהירות גבוהה כדי ליצור אבקה.
    5. , במנדף לשפוך מעטפת דיונון האבקה לתוך נפת קמח סיבובית ולנפות להפריד נתחים גדולים של רקמה מהאבקה דקה.
    6. העבר את מעטפת דיונון אבקת הקנס למכל סגר. לפנות את שטח ראש המכל עם N 2 גז כדי למנוע חמצון ולאחסן קפוא (-20 ° C).
  2. מכין את תערובת מזון.
    הערה: בעת הפעלת מבחני רצופים מרובים, זה מעשי להכין ~ של תערובת מזון 100 מיליליטר, אולם המתכון הזה יכול להיות מדורגים לכמויות קטנות יותר במידת צורך.
    1. לשלב תערובת של חומצת alginic 3 g ואבקת 5 גרם מיובשת הקפאת דיונון מעטפת עם המים DI 100 מיליליטר בכוס 150 מיליליטר. מערבבים נמרצות עם microspatula במשך כמה דקות עד שהאבקה היא התייבשות באופן מלא וקבלת התערובת הומוגנית.
      הערה: אם תרצה, צבעי מאכל ניתן להוסיף בst זהep: קל יותר להוסיף צבע לתערובת המזון שתפיק שני תערובות השליטה טופלו ו( מיסוך פיגמנט הטבעי של התמצית בתערובת שטופלה תמצית) ולא מנסה להתאים את הצבע של התערובת שטופלה על ידי הוספת התמצית לצבוע לתערובת השליטה. צבע מזון ירקרק או חום הוא לעתים קרובות רצוי כדי להסוות כל פיגמנטים בתמצית הגולמי.
    2. לטעון מיליליטר בדיוק 10 של תערובת מזון למזרק סיים. תשמור על עצמך, כדי למנוע את הכללתו של בועות אוויר בתהליך זה.
    3. הסר את בקבוקון נצנץ 20 מיליליטר עם תמצית אורגנית גולמי יבשה מהמקפיא. הוסף טיפה או שתיים של MeOH, מוסיף התמצית לתוך תערובת הומוגנית עם microspatula.
    4. הוצא את מזרק 10 מיליליטר הטעון של מטריצת מזון לבקבוקון נצנץ 20 מיליליטר ומערבבים עם microspatula לhomogenize תערובת מזון שטופל תמצית.
      הערה: זה עשוי לעזור כדי להוציא את המזרק במרווחים קטנים יותר (כלומר, להוציא 2 מיליליטר וhomogenize, אז r.EPEAT עד שכל 10 מיליליטר כבר הומוגני).
  3. הכן את כדורי assay.
    1. לטעון נפח קטן מאוד של תערובת התמצית (~ 1 מיליליטר) לתוך מזרק, ולהטביע את קצה המזרק בתמיסה של 0.25 M CaCl 2. הוצא את תכולת המזרק כדי ליצור גדיל ארוך, כמו ספגטי.
    2. אחרי כמה דקות, להסיר את הגדיל הקשוח, לקצוץ אותו לכדורים ארוכים 4 מ"מ בחיתוך זכוכית לוח עם סכין גילוח, ולאחר מכן לשטוף במי ים.
    3. חזור על שלבים 2.3.1 ו2.3.2 ללא כולל תמצית רקמה לעשות כדורי שליטה. הקפד לטפל כדורי שליטה עם נפח שווה של ממס (ראה תוספת של MeOH לתערובת טופלה בשלב 2.2.3) כדי לשלוט על בנוסף ממס. אם ביקורת שלילית היא רצויה כדי לאשר שדגי assay יכולים להירתע מהאכלה, להוסיף בנזואט denatonium בריכוז של 2 מ"ג מיליליטר -1 לתערובת המזון הגולמית 27.

3) את הטעםBioassays

  1. לבצע מבחני האכלה עם wrasse הניצוד צהוב-שלב bluehead, bifasciatum Thalassoma, המשיך בקבוצות של שלושה בתאים אטומים-צדדיים של אקווריום מעבדה.
  2. לספק כדורי מזון מכוס של מי ים בעזרת פיפטה זכוכית עם הנורה גומי. הערה: זה עלול לקחת כמה ימים כדי להכשיר דגים לקבל מזון בצורה זו. גירוי אוויר (למשל כמה דפיקות של פיפטה על זכוכית האקווריום) שמקדים את המסירה של מזון עשוי להיות מועיל להכשיר את הדג לצפות תוספת של כדורי מזון.
  3. ניקוד כדורים. לשקול גלולה מקובלת אם נצרך בקלות על ידי הדגים. לשקול גלולה דחתה אם לא אכל לאחר מינימום של שלושה ניסיונות של דג אחד או יותר כדי לקחת אותו לחלל הפה שלהם, או אם גלולה הוא התקרב והתעלמה אחרי ניסיון אחד כזה.
  4. דגימות ניקוד. הערה: הליך assay מתואר כתרשים זרימה באיור 1 קבוצות של דגים שמסרבים לאכול.כדורי שליטה בשלב כלשהו בפרוטוקול אינם נחשבים נוסף. ישנן שתי תוצאות אפשריות של ריצה אחת של assay: המדגם או האם לאשר או לדחות.
    1. תתחיל עם גלולה שליטה כדי לוודא שהקבוצה של דגים היא שיתופית. להציע גלולה שטופלה. אם הדגים קיבלו את הכדור טופל, להבקיע המדגם כמקובל. אם הדגים לדחות את גלולה טופלה, להציע גלולה שליטה שלאחר מכן כדי לקבוע אם הדגים הפסיקו האכלה. אם הדגים קיבלו את כדור שליטה שלאחר מכן, להבקיע המדגם נדחה.
  5. שכפול. חזור על הליך assay עם עשר קבוצות עצמאיות של דגים לכל תמצית.

4) משמעות הערכה

  1. להעריך את החשיבות של הבדלים בצריכה של שליטה לעומת כדורים שטופלו בגרסה שונה של המבחן המדויק של פישר 26. שנה את הבדיקה כדי שהסיכומים השוליים לשליטה וכדורים טופלו קבועים, טיפול בשניהם דגימות אקראיות. הערה: זה מספק p = 0.057, כאשר 7 כדורים נאכלים; לכן, כל תמצית נחשבת הרתעה אם 6 או פחות כדורים נאכלים, וטעים אם 7 או יותר כדורים נאכלים.
  2. כדי להשוות את הטעם היחסי בקרב קבוצות של תמציות, לחשב מספר ממוצע של כדורים אכלו בתוך כל קבוצה. שמור את הסף בשעה 6 כדורים כל כך קבוצה של תמציות לשכפל נחשבות הרתעה אם המספר הממוצע של כדורים אכל + שגיאה סטנדרטית (SE) ≤6. הערה: תמציות בתוצאות הנציג, משימת הקבוצה היא מינים, כך לשכפל מגיעות מאנשים שונים ואת הטעם ביחס ניתן להשוות בין מינים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כאן אנו מדווחים תוצאות המבדק זה במשך שישה מינים של ספוגים הקריביים נפוצים (איור 2). נתונים אלה בתחילה פורסמו בשנת 1995 על ידי Pawlik et al. 12 ולהפגין את כוחה של גישה זו לסקור את ההבדלים באסטרטגיות הגנה כימיות בין מיני שיתוף המתרחש. תוצאות דווחו כמספר ממוצע של כדורי מזון נאכלו + שגיאה סטנדרטית (SE) עבור כל מין. כמעט ולא כדורים נאכלו במבחנים עם תמציות אורגניות גולמיים מclathrodes Agelas, Amphimedon compressa, וcauliformis Aplysina. בניגוד לכך, פלטות עם תמציות מCallyspongia vaginalis, gibberosa Geodia, וMycale laevis נאכלו בקלות בassay 12. פחות משישה כדורים נאכלו במשך שלושה המינים הראשונים, ולכן הם נחשבו באופן משמעותי הרתעה. בניגוד לכך, שלושת המינים שני לא היו שונים באופן משמעותי מהבקרות, והיונחשב טעים.

איור 1
איור 1:. סכמטי של הליך assay בכל השלבים, הדחייה של גלולה שליטה מצביעה על כך שזו קבוצה של דגי assay היא לא משתפת פעולה או שבעה ולא ניתן להשתמש בם עוד יותר. הפרוטוקול מתחיל על ידי מתן כל סט של דגי גלולה שליטה ואחרי גלולה שטופלה. בשלב הבא, אם גלולה המטופלים קיבלה את המדגם הוא הבקיע כמקובל. אם גלולה טופלה נדחתה אבל גלולה שליטה שלאחר מכן הוא קיבלה, המדגם הוא הבקיע כנדחה.

איור 2
איור 2: הצריכה על ידי bifasciatum Thalassoma של כדורי מזון (ממוצע + SE) המכיל תמציות אורגניות גולמיים של ספוגים בריכוזים טבעיים, שפורסמו לראשונה בשנת 1995 על ידי Pawlik 12 דגים צרכו את כל 10 כדורי שליטה בכל המקרים. אחרי כל שם מין, מספר הדגימות לשכפל מצוין (כל לשכפל ממיצוי הנפרד של מדגם שונה מבחינה גיאוגרפית של רקמה ספוג). לכל assay בודד, תמציות נחשבו הרתעה אם מספר כדורים אכלו היה פחות או שווה ל 6 (p = 0.057, שונו המבחן המדויק של פישר), כפי שצוינה על ידי הקו המקווקו בגרף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ההליך המתואר במסמך זה מספק פרוטוקול פשוט יחסית, רלוונטי מבחינה אקולוגית מעבדה להערכת הגנות כימיות antipredatory ביצורים ימיים. כאן אנו סוקרים את הקריטריונים החשובים שמרוצים מקבוצה זו של שיטות:

(1) הטורף מתאים. Assay זה ההאכלה מעסיק wrasse bluehead, bifasciatum Thalassoma, אחד מהדגים הנפוצים ביותר על שוניות אלמוגים ברחבי האיים הקאריביים. Bluehead הוא טורף generalist הידוע לדגום מגוון רחב של חסרי חוליות של קרקעית ים 19. טורפי Generalist הם הבחירה הטובה ביותר עבור מבחני הראשוניים אלה משום שרוב דגי טורפים על שוניות הם generalists, וזה שניתן היה לצפות כי ההגנות antipredatory תופנינה באופן כללי נגדם, בניגוד לטורפים מומחה שעשוי היה להתפתח מנגנונים לעקוף את ההגנות. סקרי מעבדה של הגנות כימיות באמצעות טורף פוטנציאלי יחיד הם שלעשר ואחריו עוד ניסויי זמן רבים ומסובך שדה המסתמכים על התגובות של השלמה מלאה של טורפים פוטנציאליים בתנאי שדה 28-33.

(2) הליך הפקה. צעד מיצוי הרקמה הראשון, אשר עושה שימוש בתערובת ממס של dichloromethane שווה חלקים (DCM) ומתנול (MeOH), במהירות מחלחל רקמה, solubilizing קרומים והתייבשות חומר תאי. הרקמה היא מיובשת לאחר שלב זה, כך השלבים הבאים לחלץ מטבוליטים הנותרים של כל הקטבים בMeOH. חוזר על החילוץ בMeOH עד הרקמה מופק באופן מלא מהווה הליך מיצוי ממצה. הבדלים מזעריים בתכנית חילוץ זה מקובלים, כגון החלפה של ממס חילוץ אחד לאחר מאותו הקוטביות, אבל מיצוי רקמה עשוי להיות חלקי אם נעשה שימוש בממס שאינו הולם. חסרונות פוטנציאליים של נהלי חילוץ רקמה לא תקינה הם דנו בפירוט במקום אחר <sup> 8.

הכנת מזון ניסיוני (3). מטריצת המזון המלאכותית חייבת לדמות את הרקמות של האורגניזם היעד הן באיכות והריכוז של מטבוליטים משתיים התזונתיות. סביר להניח כי אותם התהליכים חושיים שטורפים להשתמש בו כדי לדחות מטבוליטים האכלה-הרתעה גם מעורבים בתפיסת האיכות התזונתית של מזון. מזונות עם איכות תזונתית נמוכה עשויים להידחות ברמות נמוכות בהרבה של הגנה כימית, ולחלופין, מטבוליטים משניים יכולים להיות רק הרתעה בריכוזים גבוהים מטבעי אם מטבוליטים אלה מופיעים במזון מלאכותי שהוא מזין יותר מהרקמה שממנו זה נגזר. מעטפת של האבקה, מיובשת בהקפאת דיונון היא תחליף תזונתי מועיל משום שהוא זמין, קל למדידה, והמאפיינים התזונתיים שלה כבר נקבעו 34.

השיקול השני בהכנה מזון ניסיוני נוגע לקביעת הריכוז של התמצית, אשר חייב להיעשות על בסיס הנפח, לא המוני. טורפים לאכול רקמות רטובות, והרקמות של יצורים ימיים להשתנות במידה רבה בתוכן מים. מנקודת המבט של טורף, נשיכה של כלנית מדוזה או ים הייתה להכיל באופן משמעותי יותר מים למסה יבשה יחידה מאשר אותו הביס בגודל של קליע דיונון או ים. לרקמות hydrated מאוד, הריכוז של המטבוליט ליחידת מסה יבשה יהיה גבוה בהרבה ליחידת נפח, אבל נפח (עקיצות) הוא המדד שהוא רלוונטי מבחינה אקולוגית. יתר על כן, רקמות של יצורים ימיים יכולות להיות צפיפויות שונות מאוד בגלל אלמנטי שלד מינרלים. קביעת ריכוז המטבוליט לפי נפח פותרת את שני הבעיות והיא המדד הרלוונטי ביותר מנקודת המבט של הצריכה של רקמה על ידי טורף פוטנציאלי. נושא זה, כולל דוגמאות מהספרות, נדון בפירוט במקום אחר 8.

.. תוכן "> (4) עיצוב ניסיוני וגישה סטטיסטית תכנון ניסוי מתאים וניתוחים סטטיסטיים של נתונים חשובים למבחני התנהגות כמו לכל מחקר מדעי אחר שיש בו קביעת החשיבות של הבדלים בתוצאות ניסוי הניתוח המתוארים כאן הוא פשוט: הבדלים נקבעים עם שולחן מגירה שונה. השיטה דורשת שכל הנפקות מזון השליטה לצרוך משום שהחוקר לא ישתמש טורפים ניסיוניים שלא להאכיל במזון שליטה 8. למרות שימוש המבחן המדויק של פישר שונה משלה ראשוני להשתמש בPawlik et al. 12, ערך הסף של 6 כדורים טופלו אכל נותר ללא שינוי. במרוצת השנים, מבחנים סטטיסטיים אחרים כבר הציעו כתחליף, אבל נזרקו לאחר התייעצות עם משתף פעולה ג'יימס א 'בלום (UNCW מחלקה למתמטיקה וסטטיסטיקה ). לדוגמא, הבדיקה של McNemar כבר הציעה,אבל הוא לא מתאים, הן משום שאין לו סט תואם של נתונים, וכי שורה אחת של השולחן המגירה קבועה בכדורי 10 שליטה אכל.

למרות הניסיון שלנו ששיטת assay זה מספק תוצאות ברורות להפליא, בכל זאת מסתמכת על תגובה התנהגותית. אם דגים רעבים לתקופה של זמן עד שassay, הם עלולים לאכול כדורים טופלו יותר ממה שהם הייתם אם דגים הואכלו היטב, במיוחד אם המטבוליט הגנתי נוכח בכדורי המזון שטופלו בריכוז ליד-סף של פעילות. מסיבות אלה, תוצאות של מבחני האכלה לא צריכים להיות פרשו מעל. לדוגמא, הבדל בין שתי דגימות רקמה של 1/10 לעומת 9/10 כדורים אכלו מציין את הדוגמא הראשונה היא הרתעה והשנייה הוא לא, אבל הבדל של 3/10 vs 5/10 כדורים אכלו יכול להיות בגלל וריאציה התנהגות בין מבחני, והדוגמא הראשונה הוא לא בהכרח יותר הרתעה מאשר השני.

Applicat מפתחיון של המבדק זה הוא השימוש בו בחלוקה מודרכת המבדק, לפיה מחיצות רצופות של התמצית הגולמי נבדקות על דגים כדי לבודד את התרכובות כימיות אחראית לפעילות האכלה-ההרתעה 29,32-33,35-38. ברגע שהנוכחות של הגנה כימית כבר הובררה, התמצית האורגנית הגולמי מופרדת chromatographically לקבוצות משנה קטנה יותר של תרכובות המרכיבות את התערובת, ותת אלה מוזנים לדוג באותו assay ההאכלה. שוב, זה צריך להיעשות על בסיס נפח, באמצעות "שווה מיליליטר" של תמצית רקמה ולא שווה המוני. כתמורת הפרדה, שברים הם assayed הטוב ביותר בהמשכי דילול ביחס לריכוז הנפח הטבעי: 4 ×, 2 ×, ו1 ×. תוחלת זו של ריכוזים לוקחת בחשבון את ההפחתה הצפויה בפעילות הרתעה שמגיעה מפיצול מטבוליטים הפעילים ב שניים או יותר שברי chromatographic או מאובדן של מטבוליטים פעילים throuפירוק, תגובה, או קובץ מצורף GH לזיהוי תכונות תקשורת. ברגע שמטבוליטים הפעילים היו מבודדים על ידי חלוקה מודרכת המבדק, החוקר עשוי לזהות אותם תוך שימוש בטכניקות ספקטרוסקופיות סטנדרטיים וגם צריך לעשות את אותו הדבר לשברים פעילים אשר עשוי להיות לי מטבוליטים משניים. זה חשוב לא פחות לדעת שמשני מטבוליטים פעילים בניסויים רלוונטיים מבחינה אקולוגית כלדעת שמטבוליטים אינם 8.

גם אלמנטים של הליך זה עשויים לשמש לעיצוב ניסיוני בטכניקות חדשות. לדוגמא, המבדק זה הותאם לטורפים חסרי חוליות (למשל סרטני 39 וseastars 40), לאזורים גיאוגרפיים אחרים 41, ואף להתייחס לשאלות מחקר אחרות (למשל הגנות מבניות 31,34,42 וצבעי אזהרה 27). ארבעה קריטריונים צריכים לשמש כמדריך לעיבודים עתידיים של שיטה זו. לסיכום, יחסי ציבור הליך המבדק זהovides יותר מבחינה אקולוגית רלוונטי שיטה להערכת הגנות כימיות antipredatory מרקמות של יצורים ימיים. מחקרים באמצעות הליך זה קידמו את ההבנה של הגורמים המשפיע על התפוצה והשפע של חסרי חוליות ימיות על שוניות אלמוגי האיים הקריביים (למשל לאחרונה, Loh וPawlik 26) חקירות ועשויות להודיע ​​בתחומים מגוונים של חקירה, כוללים פרמקולוגיה, ביוטכנולוגיה, ושלנו אקולוגיה אבולוציונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dichloromethane Fisher Scientific D37-20
Methanol Fisher Scientific A41220
Anhydrous Calcium Chloride Fisher Scientific C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid Fisher Scientific 20-548-146 For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity MP Biomedicals 154723
Squid mantle rings N/A N/A Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate Aldrich D5765
50 ml graduated centrifuge tube Fisher Scientific 14-432-22
20 ml scintillation vial Fisher Scientific 03-337-7
Disposable Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets Fisher Scientific 03-448-24
Red bulbs for pellet delivery Fisher Scientific 03-448-27
250 ml round-bottom flask Fisher Scientific 10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap Fisher Scientific K747130-1324
Weightboats Fisher Scientific 02-202B
Microspatula Fisher Scientific 21-401-10
5 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-53
10 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-54
Razor blade Fisher Scientific S17302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paul, V. J., ed, Ecological roles of marine natural products. Comstock Publishing. Associates: Ithaca, N.Y. (1992).
  2. Pawlik, J. R. Marine invertebrate chemical defenses. Chemical Reviews. 93, (5), 1911 (1993).
  3. Hay, M. E. Marine chemical ecology: what's known and what's next. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 44, (5), 476-476 (1996).
  4. McClintock, J. B., Baker, B. J. Marine Chemical Ecology. CRC Press. Boca Raton, Fla. (2001).
  5. Amsler, C. D. Algal Chemical Ecology. Springer. New York. (2008).
  6. Hay, M. E. Marine chemical ecology: Chemical signals and cues structure marine populations, communities, and ecosystems. Annual Review of Marine Science. 1, 193-212 (2009).
  7. Pawlik, J. R. The chemical ecology of sponges on Caribbean reefs: Natural products shape natural systems. BioScience. 61, (11), 888 (2011).
  8. Pawlik, J. R. Antipredatory Defensive Roles of Natural Products from Marine Invertebrates. Handbook of Marine Natural Products. 677-710 (2012).
  9. Pawlik, J. R., Amsler, C. D., Ritson-Williams, R., McClintock, J. B., Baker, B. J., Paul, V. J. Marine Chemical Ecology: A Science Born of Scuba. Research and Discoveries: The Revolution of Science through Scuba. 39, 53-69 (2013).
  10. Randall, J. E., Hartman, W. D. Sponge-feeding fishes of the West Indies. Marine Biology. 1, 216-225 (1968).
  11. Bakus, G. J., Green, G. Toxicity in sponges and holothurians — geographic pattern. Science. 185, 951-953 (1974).
  12. Pawlik, J. R., Chanas, B., Toonen, R. J., Fenical, W. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish. 1. Chemical deterrency. Marine Ecology Progress Series. 127, 183-194 (1995).
  13. Schulte, B. A., Bakus, G. J. Predation deterrence in marine sponges — laboratory versus field studies. Bulletin of Marine Science. 50, 205-211 (1992).
  14. Jackson, J. B. C., Buss, L. Allelopathy and spatial competition among coral reef invertebrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72, 5160-5163 (1975).
  15. Bakus, G. J. Chemical defense mechanisms on the great barrier reef. Australia. Science. 211, 497-499 (1981).
  16. Gemballa, S., Schermutzki, F. Cytotoxic haplosclerid sponges preferred: a field study on the diet of the dotted sea slug Peltodoris atromaculata (doridoidea: nudibranchia). Marine Biology. 144, 1213-1222 (2004).
  17. Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. Relating species traits to environmental variables in Indonesian coral reef sponge assemblages. Marine and Freshwater Research. 58, 240-249 (2007).
  18. Mollo, E., et al. Factors promoting marine invasions: a chemolecological approach. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 4582-4586 (2008).
  19. Randall, J. E. Food habits of reef fishes of the West Indies. Studies in Tropical Oceanography. 5, 665-847 (1967).
  20. O'Neal, W., Pawlik, J. R. A reappraisal of the chemical and physical defenses of Caribbean gorgonian corals against predatory fishes. Marine Ecology Progress Series. 240, 117-126 (2002).
  21. Hines, D. E., Pawlik, J. R. Assessing the antipredatory defensive strategies of Caribbean non-scleractinian zoantharians (Cnidaria): is the sting the only thing. Marine Biology. 159, (2), 389-398 (2012).
  22. Walters, K. D., Pawlik, J. R. Is there a trade-off between wound-healing and chemical defenses among Caribbean reef sponges. Integrative and Comparative Biology. 45, (2), 352-358 (2005).
  23. Leong, W., Pawlik, J. R. Evidence of a resource trade-off between growth and chemical defenses among Caribbean coral reef sponges. Marine Ecology Progress Series. 406, 71-78 (2010).
  24. Leong, W., Pawlik, J. R. Comparison of reproductive patterns among 7 Caribbean sponge species does not reveal a resource trade-off with chemical defenses. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 401, (1-2), 80-84 (2011).
  25. Pawlik, J. R., Loh, T. -L., McMurray, S. E., Finelli, C. M. Sponge Communities on Caribbean Coral Reefs Are Structured by Factors That Are Top-Down, Not Bottom-Up. PLoS ONE. 8, (5), e62573 (2013).
  26. Loh, T. -L., Pawlik, J. R. Chemical defenses and resource trade-offs structure sponge communities on Caribbean coral reefs. Proceedings of the National Academy of Science. 111, 4151-4156 (2014).
  27. Miller, A. M., Pawlik, J. R. Do coral reef fish learn to avoid unpalatable prey using visual cues. Animal Behaviour. 85, 339-347 (2013).
  28. Pawlik, J. R., Fenical, W. A re-evaluation of the ichthyodeterrent role of prostaglandins in the Caribbean gorgonian coral, Plexaura homomalla. Marine Ecology Progress Series. 52, 95-98 (1989).
  29. Fenical, W., Pawlik, J. R. Defensive properties of secondary metabolites from the Caribbean gorgonian coral Erythropodium caribaeorum. Marine Ecology Progress Series. 75, 1-8 (1991).
  30. Pawlik, J. R., Fenical, W. Chemical defense of Pterogorgia anceps, a Caribbean gorgonian coral. Marine Ecology Progress Series. 87, 183-188 (1992).
  31. Chanas, B., Pawlik, J. R. Does the skeleton of a sponge provide a defense against predatory reef fish. Oecologia. 107, (2), 225-231 (1996).
  32. Chanas, B., Pawlik, J. R., Lindel, T., Fenical, W. Chemical defense of the Caribbean sponge Agelas clathrodes (Schmidt). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 208, (1-2), 185-196 (1997).
  33. Wilson, D. M., Puyana, M., Fenical, W., Pawlik, J. R. Chemical defense of the Caribbean reef sponge Axinella corrugata against predatory fishes. Journal of Chemical Ecology. 25, (12), 2811-2823 (1999).
  34. Chanas, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish II. Spicules, tissue toughness, and nutritional quality. Marine Ecology Progress Series. 127, (1), 195-211 (1995).
  35. Albrizio, S., Ciminiello, P., Fattorusso, E., Magno, S., Pawlik, J. R. Amphitoxin, a new high molecular weight antifeedant pyridinium salt from the Caribbean sponge Amphimedon compressa. Journal of Natural Products. 58, (5), 647-652 (1995).
  36. Assmann, M., Lichte, E., Pawlik, J. R., Köck, M. Chemical defenses of the Caribbean sponges Agelas wiedenmayeri and Agelas conifera. Marine Ecology Progress Series. 207, 255-262 (2000).
  37. Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus. Natural Product Letters. 15, (4), 275-285 (2001).
  38. Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators. Journal of Chemical Ecology. 28, (6), 1103-1115 (2002).
  39. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs. Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).
  40. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars. Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).
  41. Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense. Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).
  42. Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322, (1), 67 (2005).
מעבדה מבדק-האכלת דגים לבחינת פעילות Antipredatory של משני מטבוליטים מהרקמות של אורגניזמים ימיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).More

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter