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Environment

एक मछली खिलाने प्रयोगशाला Bioassay समुद्री जीवों के ऊतकों से माध्यमिक चयापचयों का Antipredatory गतिविधि का आकलन करने के लिए

doi: 10.3791/52429 Published: January 11, 2015

Summary

इस bioassay एक पोषण तुलनीय खाद्य मैट्रिक्स का उपयोग प्राकृतिक सांद्रता में समुद्री जीवों के ऊतकों की जैविक निष्कर्षों से खिला-निवारक चयापचयों की उपस्थिति का आकलन करने के लिए एक मॉडल शिकारी मछली कार्यरत हैं।

Introduction

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रासायनिक पारिस्थितिकी दवा की दुकानों और ecologists के सहयोग के माध्यम से विकसित की है। स्थलीय रासायनिक पारिस्थितिकी के subdiscipline कुछ समय के लिए आस पास कर दिया गया है, समुद्री रासायनिक पारिस्थितिकी की है कि केवल कुछ ही दशकों पुरानी है लेकिन समुद्री जीवों 1-8 की विकासवादी पारिस्थितिकी और समुदाय की संरचना में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है। स्कूबा डाइविंग और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का आकस्मिक प्रौद्योगिकियों का लाभ उठाते हुए, जैविक दवा की दुकानों में तेजी से 1970 के दशक में और 1980 के दशक 9 benthic समुद्री अकशेरूकीय और शैवाल से उपन्यास चयापचयों का वर्णन प्रकाशनों की एक बड़ी संख्या उत्पन्न। माध्यमिक चयापचयों अनुभवजन्य सबूत के बिना नए यौगिकों के लिए महत्वपूर्ण पारिस्थितिकी गुण जिम्मेदार माना इन प्रकाशनों के कई कुछ उद्देश्य की सेवा करनी चाहिए कि मान लिया जाये। के बारे में एक ही समय, परिस्थिति भी वितरण और पहले से fro जाना जाता benthic जानवरों और पौधों की abundances स्कूबा डाइविंग के आगमन का लाभ ले रही है और वर्णन कर रहे थेऐसे निकर्षण के रूप में अपेक्षाकृत अप्रभावी नमूना विधियों हूँ। इन शोधकर्ताओं की धारणा बिना डंठल कुछ भी और कोमल शरीर रासायनिक शिकारियों 10 द्वारा खपत से बचने के लिए बचाव किया जाना चाहिए था। प्रजातियों abundances पर अन्यथा वर्णनात्मक काम क्या था अनुभववाद को पेश करने के प्रयास में, कुछ परिस्थिति विषाक्तता assays के 11 से रासायनिक गढ़ extrapolating शुरू किया। अधिकांश विषाक्तता assays के आधे परख जीवों की हत्या के लिए जिम्मेदार अर्क के शुष्क बड़े पैमाने पर सांद्रता के बाद के दृढ़ संकल्प के साथ, पूरे मछली या अकशेरुकी ऊतकों के कच्चे तेल की जैविक अर्क के जलीय निलंबन को अन्य जीवों के जोखिम शामिल किया गया। हालांकि, विषाक्तता assays के संभावित शिकारियों प्राकृतिक परिस्थितियों के तहत शिकार मानता है जिस तरह का अनुकरण नहीं है, और बाद में पढ़ाई विषाक्तता और स्वादिष्ट 12-13 के बीच कोई संबंध पाया है। यह प्रतिष्ठित पत्रिकाओं में प्रकाशन कम या कोई सभा होने तकनीक का इस्तेमाल किया है कि आश्चर्य की बात हैएल प्रासंगिकता 14-15 और है कि इन अध्ययनों अभी भी व्यापक रूप से उद्धृत कर रहे हैं आज। यह विषाक्तता डेटा के आधार पर पढ़ाई 16-18 प्रकाशित किया जाना जारी है ध्यान दें कि इससे भी ज्यादा खतरनाक है। इस के साथ साथ वर्णित bioassay विधि antipredatory रासायनिक गढ़ का आकलन करने के लिए समुद्री रासायनिक परिस्थिति के लिए एक पारिस्थितिकी प्रासंगिक दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए देर से 1980 के दशक में विकसित किया गया था। विधि अधिक पारिस्थितिकी सार्थक विषाक्तता डेटा की तुलना में कर रहे हैं कि स्वादिष्ट डाटा उपलब्ध कराने, एक पोषण तुलनीय खाद्य मैट्रिक्स में एक प्राकृतिक एकाग्रता में लक्ष्य जीव से एक कच्चे कार्बनिक निकालने नमूने के लिए एक मॉडल के शिकारी की आवश्यकता है।

(1) एक उपयुक्त generalist के शिकारी खिला assays में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, (2) सभी छोर की जैविक चयापचयों विस्तृत रूप से ऊतक से निकाला जाना चाहिए: समुद्री जीवों के ऊतकों के antipredatory गतिविधि का आकलन करने के लिए सामान्य दृष्टिकोण चार महत्वपूर्ण मानदंड शामिल जीव को लक्षित, (3) चयापचयों ख चाहिएएक ही बड़ा एकाग्रता में एक पोषण उचित प्रयोगात्मक भोजन में मिलाया ई वे निकाले गए थे, और (4) प्रयोगात्मक डिजाइन और सांख्यिकीय दृष्टिकोण एक सार्थक मीट्रिक रिश्तेदार distastefulness इंगित करने के लिए प्रदान करनी चाहिए, जहां से जीव के रूप में पाया।

नीचे दिये प्रक्रिया कैरेबियन समुद्री अकशेरूकीय में antipredatory रासायनिक गढ़ का आकलन करने के लिए विशेष रूप से बनाया गया है। इस प्रजाति कैरेबियन प्रवाल भित्तियों पर आम है और benthic अकशेरूकीय 19 की एक विस्तृत वर्गीकरण नमूना करने के लिए जाना जाता है, क्योंकि हम एक मॉडल शिकारी मछली के रूप में bluehead wrasse, Thalassoma bifasciatum, रोजगार। लक्ष्य जीव से ऊतक पहले तो निकाले एक खाद्य मिश्रण के साथ संयुक्त, और अंत में टी के समूहों के लिए पेशकश की है bifasciatum वे निकालने का इलाज खाद्य पदार्थों को अस्वीकार चाहे निरीक्षण करने के लिए। इस पद्धति का उपयोग परख डेटा समुद्री जीवों 12,20-21, एल के बचाव की मुद्रा में रसायन विज्ञान में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की हैIfe इतिहास व्यापार-नापसंद 22-24, और समुदाय पारिस्थितिकी 25-26।

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Protocol

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नोट: इस प्रोटोकॉल के चरण 3 हड्डीवाला पशु विषयों शामिल है। प्रक्रिया जानवरों संभव सबसे मानवीय उपचार प्राप्त इतना है कि डिजाइन किया गया है और उत्तरी कैरोलिना विलमिंगटन के विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1) ऊतक निष्कर्षण

  1. इस माध्यमिक चयापचयों का बड़ा एकाग्रता बदल जाएगा के रूप में जलयोजन और नहीं निचोड़ा, सूखे-बाहर या पीढ़ी गीला की अपनी प्राकृतिक अवस्था में है कि ऊतक का प्रयोग करें। कट या एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में डाला जा सकता है कि टुकड़े या स्लाइस के लिए ऊतक काट लें। नोट: ताजा ऊतक कुछ मामलों में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह जब कटौती फैलाएंगे के अधीन नहीं है जो जमे हुए ऊतक, या काट काट करने के लिए अक्सर बेहतर है।
  2. एक एक की 30 मिलीलीटर के लिए ऊतक टुकड़े जोड़ें: 40 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा तक एक स्नातक की उपाधि प्राप्त अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक dichloromethane के मिश्रण (डीसीएम) और मेथनॉल (MeOH) तक पहुँच जाता है। के हस्तांतरण से जुड़े सभी चरणों का संचालन करना न भूलेंपर्याप्त वेंटीलेशन के साथ एक धूआं हुड में विलायक।
  3. ट्यूब टोपी और इसे कई बार पलटना, तो एक 4 घंटा निकासी की अवधि के दौरान बार-बार आंदोलन। नोट: इस अवधि के दौरान पानी MeOH के साथ जोड़ती है और जिसके परिणामस्वरूप MeOH: जल चरण डीसीएम चरण से अलग करती है। ऊतक एकांतर डीसीएम और MeOH के संपर्क में है: पानी एक पायस के रूप में ट्यूबों उत्तेजित कर रहे हैं।
  4. एक दौर नीचे कुप्पी को डीसीएम निकालने स्थानांतरण और कम गर्मी का उपयोग कर एक रोटरी बाष्पीकरण पर सूखापन के लिए लुप्त हो जाना (<40 डिग्री सेल्सियस)। कम से कम विलायक का उपयोग करना, एक 20 मिलीलीटर जगमगाहट शीशी सूखे निकालने हस्तांतरण। एक रोटरी बाष्पीकरण एडाप्टर के साथ शीशी फ़िट और फिर कम गर्मी का उपयोग कर एक रोटरी बाष्पीकरण पर सूखापन के लिए लुप्त हो जाना (<40 डिग्री सेल्सियस)।
    नोट: (1) अखरोट, (2) वॉशर, और (3) बलूत का फल अखरोट: अगले कदम के लिए एक पिरोया रॉड के अंत पर अनुक्रमिक क्रम में निम्न आइटम पंगा लेना द्वारा इकट्ठा किया जा सकता है कि एक घर का बना संपीड़न यंत्र के उपयोग की आवश्यकता है। वॉशर या तो छिद्रित किया जाना चाहिए यायह एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के आंतरिक व्यास की तुलना में कम है, इसलिए है कि सज्जित।
  5. ऊतक और MeOH में शामिल है कि स्नातक की उपाधि प्राप्त अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए रिटर्निंग: पानी निकालने, संपीड़न के माध्यम से ऊतक से बाहर निकासी मध्यम निचोड़। MeOH स्थानांतरण: एक ही दौर नीचे कुप्पी के लिए पानी निकालने और ठंडा स्टोर (<10 डिग्री सेल्सियस)।
  6. पानी निकालने: फिर नए MeOH MeOH युक्त ठंडा दौर नीचे कुप्पी को निकालने के लिए स्थानांतरण, अब निर्जलित ऊतक 2 से 6 घंटा अवधि की एक दूसरी निकासी के लिए जलमग्न होने तक स्नातक की उपाधि प्राप्त अपकेंद्रित्र ट्यूब MeOH जोड़ें। ऊतक पूरी तरह से निकाला नहीं किया गया है कि किसी भी चिंता का विषय है, तो 2 घंटे से 6 MeOH निष्कर्षण दोहराएँ।
  7. कम गर्मी का उपयोग कर एक रोटरी बाष्पीकरण पर MeOH बंद सूखी (<40 डिग्री सेल्सियस)। दौर नीचे फ्लास्क कुल्ला करने के लिए MeOH की एक न्यूनतम मात्रा का उपयोग करते हुए, सूखे nonpolar निकालने युक्त जगमगाहट शीशी दौर नीचे कुप्पी से शेष जलीय निकालने स्थानांतरण।
  8. एएक शून्य concentrator पर कम गर्मी (<40 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग सूखापन के लिए जलीय निकालने vaporate। जगमगाहट शीशी अब ऊतक के 10 मिलीलीटर की कुल शुष्क कच्चे कार्बनिक निकालने में शामिल है। ऑक्सीकरण रोकने के लिए एन 2 गैस के साथ शीशी के सिर अंतरिक्ष खाली कसकर सील, और दुकान में जमे हुए (-20 डिग्री सेल्सियस)।

2) खाद्य तैयारी

  1. फ्रीज सूखे विद्रूप विरासत पाउडर तैयार करें।
    नोट: व्यंग्य विरासत अन्य benthic अकशेरूकीय के बराबर है, और 2.2 की substeps में एक घटक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा कि पोषण का एक स्रोत प्रदान करता है।
    1. गर्म विआयनीकृत (डीआई) पानी में व्यंग्य विरासत का पिघलना जमे हुए बजता है, तो एक उच्च गति ब्लेंडर में उन्हें भरता है।
    2. एक उथले कुकी शीट और फ्रीज (-20 डिग्री सेल्सियस) पर pureed व्यंग्य विरासत की एक पतली परत डालो, तो छोटे टुकड़ों में lyophilized जा करने के लिए जमे हुए व्यंग्य प्यूरी की चादर टूट गया।
    3. Fr के संचालन प्रक्रियाओं बाद जमे हुए व्यंग्य विरासत प्यूरी LyophilizeEeze-सुखाने की मशीन।
    4. एक पाउडर के रूप में एक उच्च गति ब्लेंडर में व्यंग्य विरासत प्यूरी के lyophilized टुकड़े टुकड़े टुकड़े करना।
    5. एक धूआं हुड में, एक रोटरी आटा sifter में पीसा हुआ व्यंग्य विरासत डालना और ठीक पाउडर से ऊतक का बड़ा हिस्सा अलग करने के लिए झारना।
    6. एक sealable कंटेनर को ठीक पाउडर विद्रूप विरासत स्थानांतरण। ऑक्सीकरण रोकने और जमे हुए स्टोर करने के लिए एन 2 गैस के साथ कंटेनर सिर अंतरिक्ष खाली (-20 डिग्री सेल्सियस)।
  2. खाद्य मिश्रण तैयार करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो कई लगातार assays के चल रहा है, यह ~ खाद्य मिश्रण की 100 मिलीलीटर तैयार करने के लिए व्यावहारिक है, हालांकि यह नुस्खा छोटे संस्करणों के लिए बढ़ाया जा सकता है।
    1. एक 150 मिलीलीटर बीकर में 3 जी alginic एसिड और डि पानी की 100 मिलीलीटर के साथ 5 ग्राम फ्रीज सूखे विद्रूप विरासत पाउडर का एक मिश्रण का मिश्रण। पाउडर पूरी तरह से हाइड्रेटेड है और मिश्रण सजातीय है जब तक कुछ मिनट के लिए एक microspatula के साथ सख्ती से हिलाओ।
      अगर वांछित, खाद्य रंग इस सेंट में जोड़ा जा सकता है: नोटईपी: यह उससे भी जोड़कर निकालने का इलाज मिश्रण के रंग से मेल करने के लिए कोशिश कर रहा से (निकालने का इलाज मिश्रण में निकालने की प्राकृतिक रंग मास्किंग) दोनों का इलाज किया और नियंत्रण मिश्रण उत्पन्न होगा कि खाद्य मिश्रण करने के लिए डाई जोड़ने के लिए आसान है नियंत्रण मिश्रण करने के लिए डाई। एक हरे या भूरे खाद्य रंग कच्चे तेल निकालने में किसी भी पिगमेंट नकाब को अक्सर वांछनीय है।
    2. एक स्नातक की उपाधि प्राप्त सिरिंज में खाद्य मिश्रण के ठीक 10 मिलीलीटर लोड करें। इस प्रक्रिया के दौरान हवा के बुलबुले के शामिल किए जाने से बचने के लिए ध्यान रखना।
    3. फ्रीजर से शुष्क कच्चे कार्बनिक निकालने के साथ 20 मिलीलीटर जगमगाहट शीशी निकालें। एक बूंद जोड़ें या MeOH के दो, तो एक microspatula के साथ एक सजातीय मिश्रण में निकालने हलचल।
    4. 20 मिलीलीटर जगमगाहट शीशी में खाद्य मैट्रिक्स का लोड 10 मिलीलीटर सिरिंज निकालें और निकालने का इलाज खाद्य मिश्रण homogenize करने के लिए एक microspatula साथ हलचल।
      आर, फिर, यह छोटे वेतन वृद्धि (यानी में सिरिंज बेदखल करने के लिए मदद मिल सकती है 2 मिलीलीटर बेदखल करना और homogenize:। नोटसभी 10 मिलीलीटर तक EPEAT) homogenized किया गया है।
  3. परख छर्रों तैयार करें।
    1. एक सिरिंज में निकालने मिश्रण (~ 1 एमएल) की एक बहुत छोटी मात्रा लोड, और 0.25 एम 2 CaCl की एक समाधान में सिरिंज टिप डूब। एक लंबे, स्पेगेटी की तरह किनारा फार्म करने के लिए सिरिंज की सामग्री को बाहर निकालें।
    2. कुछ ही मिनटों के बाद, फिर, एक धार के साथ एक गिलास काटने बोर्ड पर 4 मिमी लंबे छर्रों में काट लें, कठोर किनारा हटाने के समुद्री जल में कुल्ला।
    3. दोहराएँ नियंत्रण छर्रों बनाने के लिए ऊतक निकालने को शामिल किए बिना 2.3.1 और 2.3.2 कदम। विलायक के एक बराबर मात्रा के साथ नियंत्रण छर्रों का इलाज करने के लिए सुनिश्चित विलायक अलावा के लिए नियंत्रित करने के लिए (कदम 2.2.3 में इलाज मिश्रण करने के लिए MeOH के अलावा देखें)। एक नकारात्मक नियंत्रण, कि परख मछली खिलाने से विचलित किया जा सकता है की पुष्टि 2 मिलीग्राम एमएल की एकाग्रता में denatonium बेंजोएट जोड़ने -1 कच्चे खाद्य मिश्रण से 27 करने के लिए वांछित है।

3) स्वादिष्टBioassays

  1. जंगली पकड़ा पीले चरण bluehead wrasse, Thalassoma bifasciatum साथ खिला assays के प्रदर्शन, प्रयोगशाला Aquaria की अपारदर्शी तरफा डिब्बों में तीन के समूह में रखा।
  2. एक रबर बल्ब के साथ एक गिलास पिपेट का उपयोग समुद्री जल की एक बीकर से खाना छर्रों वितरित करें। नोट: यह इस तरीके से भोजन प्राप्त करने के लिए मछली को प्रशिक्षित करने के लिए कुछ दिन लग सकते हैं। भोजन के वितरण पछाड़ दिया है कि एक कंडीशनिंग प्रोत्साहन (मछलीघर कांच पर पिपेट की जैसे कुछ नल) खाना छर्रों के अलावा उम्मीद करने के लिए मछली को प्रशिक्षित करने के लिए सहायक हो सकता है।
  3. छर्रों स्कोरिंग। आसानी से मछली से भस्म अगर एक गोली स्वीकार किए जाते हैं पर विचार करें। उनके मुंह गुहा में इसे लेने के लिए एक या एक से अधिक मछली द्वारा तीन प्रयास की एक न्यूनतम के बाद भी नहीं खाया अगर एक गोली को अस्वीकार कर दिया पर विचार करें, गोली से संपर्क किया और ऐसे ही एक प्रयास के बाद नजरअंदाज कर दिया जाता है या यदि।
  4. स्कोरिंग नमूने हैं। नोट: परख प्रक्रिया चित्रा 1 में एक फ़्लोचार्ट के रूप में दर्शाया जाता है खाने के लिए मना कर दिया है कि मछली का समूह।प्रोटोकॉल में किसी भी कदम पर नियंत्रण छर्रों आगे नहीं माना जाता है। परख का एक भी रन की दो संभावित परिणामों के होते हैं: नमूना स्वीकार या अस्वीकार कर रहा है या तो।
    1. मछली के समूह सहकारी है कि पुष्टि करने के लिए एक नियंत्रण गोली के साथ शुरू करो। एक इलाज गोली प्रस्ताव। मछली में इलाज गोली स्वीकार करते हैं तो स्वीकार किए जाते हैं, के रूप में नमूना स्कोर। मछली में इलाज गोली अस्वीकार करते हैं, तो मछली खिलाने रह गए हैं या नहीं यह निर्धारित करने के लिए बाद में एक नियंत्रण गोली प्रदान करते हैं। मछली बाद नियंत्रण गोली स्वीकार करते हैं तो खारिज कर दिया, के रूप में नमूना स्कोर।
  5. प्रतिकृति। प्रत्येक निकालने के लिए मछली के दस स्वतंत्र समूहों के साथ परख प्रक्रिया को दोहराएं।

4) का मूल्यांकन महत्व

  1. फिशर सटीक परीक्षण 26 का एक संशोधित संस्करण के साथ इलाज छर्रों बनाम नियंत्रण की खपत में अंतर के महत्व का मूल्यांकन करें। नियंत्रण के लिए मामूली योग और इलाज छर्रों तय कर रहे हैं कि इतनी परीक्षण सुधारेउन दोनों के रूप में यादृच्छिक नमूने का इलाज। नोट: यह पी प्रदान करता है = 0.057 7 छर्रों खाया जाता है जब; सात या अधिक छर्रों खा रहे हैं इसलिए, अगर किसी भी निकालने 6 या उससे कम छर्रों खा रहे हैं अगर निवारक माना जाता है, और स्वादिष्ट है।
  2. निष्कर्षों के समूहों के बीच सापेक्ष स्वादिष्ट तुलना करने के लिए, प्रत्येक समूह के भीतर खाया छर्रों का एक मतलब संख्या की गणना। छर्रों का मतलब संख्या + खाया तो अगर दोहराने के अर्क का एक समूह निवारक माना जाता है 6 छर्रों पर दहलीज रखें मानक त्रुटि (एसई) ≤6। नोट: प्रतिनिधि परिणामों में, समूह असाइनमेंट प्रजाति है, इसलिए दोहराने अर्क विशिष्ट व्यक्तियों से आते हैं और रिश्तेदार स्वादिष्ट प्रजातियों के बीच तुलना की जा सकती है।

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Representative Results

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यहाँ हम आम कैरेबियाई स्पंज के छह प्रजातियों (चित्रा 2) के लिए इस bioassay के परिणाम की रिपोर्ट। इन आंकड़ों के शुरू में Pawlik एट अल। 12 द्वारा 1995 में प्रकाशित और सह होने वाली taxa के बीच रासायनिक रक्षा रणनीति में मतभेद सर्वेक्षण करने के लिए इस दृष्टिकोण की शक्ति का प्रदर्शन कर रहे थे। परिणाम मानक त्रुटि (एसई) प्रत्येक प्रजाति के लिए + खाया खाना छर्रों का एक मतलब संख्या के रूप में सूचित किया गया। लगभग कोई छर्रों Agelas clathrodes, Amphimedon compressa, और Aplysina cauliformis से कच्चे तेल की जैविक निष्कर्षों के साथ assays में खा रहे थे। इसके विपरीत, Callyspongia वेजिनेलिस, Geodia gibberosa, और Mycale laevis से निष्कर्षों के साथ बनाया छर्रों आसानी से परख 12 में सेवन कर रहे थे। कम से कम छह छर्रों पहले तीन प्रजातियों के लिए खाया गया, तो वे काफी माना निवारक थे। इसके विपरीत, दूसरा तीन प्रजातियों के नियंत्रण से काफी अलग नहीं थे, और थेस्वादिष्ट माना जाता है।

चित्रा 1
चित्रा 1:। परख प्रक्रिया के योजनाबद्ध सभी स्तरों पर, एक नियंत्रण गोली की अस्वीकृति परख मछली के इस सेट के असहयोगी या तृप्त होते हैं और आगे नहीं किया जा सकता है कि इंगित करता है। प्रोटोकॉल एक इलाज गोली द्वारा पीछा मछली एक नियंत्रण गोली के प्रत्येक सेट की पेशकश के द्वारा शुरू होता है। स्वीकार किए जाते हैं के रूप में अगला इलाज गोली स्वीकार कर लिया है कि अगर नमूना रन बनाए है। में इलाज गोली खारिज कर दिया है, लेकिन बाद में नियंत्रण गोली स्वीकार कर लिया जाता है तो खारिज कर दिया, के रूप में नमूना रन बनाए है।

चित्रा 2
चित्रा 2: खाना छर्रों का Thalassoma bifasciatum द्वारा खपत पहले Pawlik द्वारा 1995 की रिपोर्ट में प्राकृतिक सांद्रता में स्पंज के कच्चे तेल की जैविक अर्क युक्त (एसई + मतलब है) 12 मछली सभी मामलों में सभी 10 नियंत्रण छर्रों का सेवन किया। प्रत्येक प्रजाति का नाम बाद, दोहराने के नमूनों की संख्या (प्रत्येक स्पंज ऊतक का एक भौगोलिक दृष्टि से अलग नमूने की अलग निकासी से दोहराने) निर्दिष्ट किया जाता है। ग्राफ पर बिंदीदार रेखा से संकेत के रूप में किसी भी व्यक्ति की परख के लिए, अर्क, खाया छर्रों की संख्या से कम या 6 के बराबर था अगर (पी = .057, फिशर सटीक परीक्षण संशोधित) निवारक माना जाता था।

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Discussion

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इस के साथ साथ वर्णित प्रक्रिया समुद्री जीवों में antipredatory रासायनिक गढ़ का आकलन करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल, पारिस्थितिकी प्रासंगिक प्रयोगशाला प्रोटोकॉल प्रदान करता है। यहाँ हम विधियों के इस सेट से संतुष्ट हैं कि महत्वपूर्ण मानदंडों की समीक्षा:

(1) उपयुक्त शिकारी। यह खिला परख bluehead wrasse, Thalassoma bifasciatum, कैरेबियन में प्रवाल भित्तियों पर सबसे प्रचुर मात्रा में मछलियों की एक कार्यरत हैं। bluehead benthic अकशेरूकीय 19 की एक विस्तृत वर्गीकरण नमूना करने के लिए जाना जाता है एक generalist मांसभक्षी है। Generalist शिकारियों भित्तियों पर शिकारी मछली के बहुमत के सामान्य कर रहे हैं क्योंकि इन प्रारंभिक assays के लिए सबसे अच्छा विकल्प हैं, और यह गढ़ नाकाम करने के लिए तंत्र विकसित हो सकता है कि विशेषज्ञ शिकारियों के विरोध के रूप antipredatory गढ़ मोटे तौर पर, उनके खिलाफ निर्देशित किया जाएगा कि उम्मीद होगी। एक भी संभावित शिकारी का उपयोग कर रासायनिक गढ़ की प्रयोगशाला सर्वेक्षण के हैंदस क्षेत्र की स्थिति 28-33 के तहत संभावित शिकारियों की एक पूरी पूरक की प्रतिक्रियाओं पर निर्भर है कि अधिक समय लेने वाली और जटिल क्षेत्र प्रयोगों के द्वारा पीछा किया।

(2) निष्कर्षण प्रक्रिया।, बराबर भागों dichloromethane (डीसीएम) और मेथनॉल (MeOH) के एक विलायक मिश्रण का उपयोग करता है तेजी से झिल्ली solubilizing और सेलुलर सामग्री dehydrating, ऊतक व्याप्त है, जो पहले ऊतक निष्कर्षण कदम। ऊतक के इस कदम के बाद निर्जलित है, ताकि बाद के चरणों MeOH में सभी छोर के शेष चयापचयों निकाल सकते हैं। पूरी तरह से निकाला जाता है ऊतक एक संपूर्ण निष्कर्षण प्रक्रिया का गठन किया है जब तक MeOH में निकासी दोहरा। इस निकासी योजना पर मामूली बदलाव ऐसे ही polarity के किसी अन्य के लिए एक विलायक निष्कर्षण के प्रतिस्थापन के रूप में स्वीकार्य हैं, लेकिन एक अनुचित विलायक प्रयोग किया जाता है अगर ऊतक निष्कर्षण अधूरा हो सकता है। अनुचित ऊतक निष्कर्षण प्रक्रियाओं के संभावित नुकसान कहीं और विस्तार से चर्चा कर रहे हैं <समर्थन> 8।

(3) प्रयोगात्मक भोजन की तैयारी। कृत्रिम भोजन मैट्रिक्स पोषण गुणवत्ता और माध्यमिक चयापचयों की एकाग्रता दोनों में लक्ष्य जीव के ऊतकों को अनुकरण करना चाहिए। यह शिकारियों खिला-निवारक चयापचयों अस्वीकार करने के लिए उपयोग उसी संवेदी प्रक्रियाओं को भी खाद्य पदार्थों के पोषण की गुणवत्ता की धारणा में शामिल कर रहे हैं कि संभावना है। कम पोषक तत्वों की गुणवत्ता के साथ फूड्स रासायनिक रक्षा के बहुत निचले स्तर पर अस्वीकार कर दिया जा सकता है, और उन चयापचयों ऊतक से अधिक पौष्टिक होता है कि एक कृत्रिम भोजन में प्रस्तुत कर रहे हैं इसके विपरीत, यदि माध्यमिक चयापचयों केवल अधिक से अधिक प्राकृतिक सांद्रता में बाधा हो सकती है, जिसमें से यह निकाला गया था। इसे मापने के लिए आसान है, आसानी से उपलब्ध है, क्योंकि पाउडर, फ्रीज सूखे विद्रूप विरासत एक उपयोगी पोषक तत्वों की विकल्प नहीं है, और इसके पोषण विशेषताओं पहले से ही 34 निर्धारित किया गया है।

तैयारी में दूसरा विचार प्रयोगात्मक भोजन की मात्रा, नहीं द्रव्यमान के आधार पर किया जाना चाहिए जो निकालने की एकाग्रता, का निर्धारण करने का सवाल है। परभक्षी गीला ऊतक खाते हैं, और समुद्री जीवों के ऊतकों पानी की मात्रा में व्यापक रूप से भिन्न हो। एक शिकारी के दृष्टिकोण से, एक जेलिफ़िश या समुद्री एनीमोन का एक टुकड़ा एक व्यंग्य या समुद्र स्लग का एक ही आकार के काटने से इकाई शुष्क जन के प्रति काफी अधिक पानी को नियंत्रित करेगा। अत्यधिक हाइड्रेटेड ऊतकों के लिए, इकाई शुष्क जन के प्रति मेटाबोलाइट की एकाग्रता मात्रा प्रति इकाई की तुलना में बहुत अधिक होगा, लेकिन मात्रा (काटने) पारिस्थितिकी प्रासंगिक है कि उपाय है। इसके अलावा, समुद्री जीवों के ऊतकों क्योंकि खनिज कंकाल तत्वों की बहुत अलग घनत्व हो सकता है। मात्रा से मेटाबोलाइट एकाग्रता का निर्धारण दोनों समस्याओं को हल करती है और एक संभावित शिकारी द्वारा ऊतकों की खपत की दृष्टि से सबसे अधिक प्रासंगिक उपाय है। साहित्य से उदाहरण सहित इस विषय, विस्तार, कहीं और 8 में चर्चा की है।

।। सामग्री "> (4) प्रयोगात्मक डिजाइन और सांख्यिकीय दृष्टिकोण उपयुक्त प्रयोगात्मक डिजाइन और डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण प्रयोगात्मक परिणामों में मतभेद के महत्व को निर्धारित करने शामिल है कि किसी भी अन्य वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए के रूप में व्यवहार assays के लिए के रूप में महत्वपूर्ण हैं के साथ साथ वर्णित विश्लेषण आसान है: मतभेदों को एक संशोधित आकस्मिकता तालिका के साथ निर्धारित कर रहे हैं। विधि सभी नियंत्रण भोजन प्रसाद अन्वेषक नियंत्रण खाद्य पदार्थों 8 पर खिला नहीं किए गए प्रयोगात्मक शिकारियों का उपयोग नहीं होगा क्योंकि सेवन किया जाना आवश्यक है। फिशर सटीक परीक्षण के उपयोग के अपने प्रारंभिक से संशोधित किया गया है Pawlik द्वारा उपयोग एट अल। 12, खाया 6 इलाज किया छर्रों की दहलीज मूल्य अपरिवर्तित बनी हुई है। इन वर्षों में, अन्य सांख्यिकीय परीक्षण के विकल्प के रूप में सुझाव दिया है, लेकिन सहयोगी जेम्स ई ब्लम (गणित और सांख्यिकी UNCW विभाग के साथ परामर्श के बाद खारिज कर दिया गया है )। उदाहरण के लिए, McNemar के परीक्षण का सुझाव दिया गया है,यह डेटा का एक सेट मिलान का अभाव है, और आकस्मिकता तालिका में से एक पंक्ति में 10 नियंत्रण छर्रों पर तय हो गई है, क्योंकि खाया दोनों लेकिन, क्योंकि अनुचित है।

इस परख विधि उल्लेखनीय स्पष्ट परिणाम प्रदान करता है कि हमारे अनुभव के बावजूद, यह फिर भी एक व्यवहार की प्रतिक्रिया पर निर्भर करता है। मछली परख से पहले समय की अवधि के लिए भूखे हैं, तो वे और अधिक का इलाज किया छर्रों मछली एक रक्षात्मक मेटाबोलाइट गतिविधि के एक निकट दहलीज एकाग्रता में इलाज खाना छर्रों में मौजूद है, खासकर अगर अच्छी तरह से तंग आ चुके थे कि अगर वे चाहते हैं की तुलना में भोजन कर सकते हैं। इन कारणों के लिए, खिला assays के परिणामों पर व्याख्या नहीं होना चाहिए। उदाहरण के लिए, खाया 1/10 9/10 बनाम छर्रों के दो ऊतकों के नमूनों के बीच एक अंतर पहला नमूना बाधा नहीं है और दूसरा नहीं है, लेकिन खाया 3/10 5/10 बनाम छर्रों का अंतर व्यवहार परिवर्तन के कारण हो सकता है इंगित करता है assays के, और पहला नमूना के बीच जरूरी दूसरे की तुलना में अधिक बाधा नहीं है।

एक प्रमुख अनुप्रयोगोंइस bioassay के आयन कच्चे तेल निकालने की लगातार विभाजन खिला-निवारक गतिविधि 29,32-33,35-38 के लिए जिम्मेदार रासायनिक यौगिकों को अलग-थलग करने के लिए मछली पर परीक्षण कर रहे हैं जिससे bioassay निर्देशित विभाजन, में इसके उपयोग के लिए है। एक रासायनिक रक्षा की उपस्थिति का पता लगाया गया है, कच्चे कार्बनिक निकालने chromatographically मिश्रण है कि मेकअप यौगिकों के छोटे सबसेट में fractionated है, और इन कैंपेन्स एक ही खिला परख में मछली खिलाया जाता है। फिर, यह ऊतक निकालने के बजाय बड़े पैमाने समकक्ष के "मिलीलीटर समकक्ष" का उपयोग कर, एक बड़ा आधार पर किया जाना चाहिए। 4 ×, 2 ×, और 1 ×: जुदाई आय के रूप में, भिन्न सबसे अच्छा प्राकृतिक बड़ा एकाग्रता के लिए एक धारावाहिक कमजोर पड़ने रिश्तेदार के रूप में assayed रहे हैं। सांद्रता की इस अवधि के खाते में दो या दो से अधिक chromatographic अंशों पर या सक्रिय चयापचयों के नुकसान में throu से सक्रिय चयापचयों बंटवारे से आता है कि निवारक गतिविधि में होने की संभावना में कमी लेता हैजीएच अपघटन, प्रतिक्रिया, या लगाव मीडिया chromatographic करने के लिए। सक्रिय चयापचयों bioassay निर्देशित विभाजन से पृथक किया गया है एक बार, अन्वेषक मानक स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग कर उन्हें पहचान सकता है और यह भी माध्यमिक चयापचयों हो सकता है कि निष्क्रिय भागों के लिए भी ऐसा ही करना चाहिए। यह 8 नहीं कर रहे हैं, जो चयापचयों पता करने के लिए के रूप में पारिस्थितिकी प्रासंगिक प्रयोगों में सक्रिय हैं माध्यमिक जो चयापचयों पता करने के लिए भी उतना ही महत्वपूर्ण है।

इस प्रक्रिया के तत्वों को भी नए प्रयोगात्मक तकनीक डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इस bioassay (जैसे संरचनात्मक गढ़ 31,34,42 और aposematism 27) अन्य भौगोलिक क्षेत्रों में 41 के लिए, (उदाहरण के लिए 39 और seastars 40 केकड़ों) अकशेरुकी शिकारियों के लिए अनुकूलित किया गया था, और यहां तक कि अन्य अनुसंधान सवालों का पता करने के लिए। चार मापदंड इस विधि के भविष्य के रूपांतरों के लिए एक गाइड के रूप में सेवा करनी चाहिए। सारांश में, इस bioassay प्रक्रिया जनसंपर्कसमुद्री जीवों के ऊतकों से antipredatory रासायनिक गढ़ का आकलन करने के लिए एक से अधिक पारिस्थितिकी प्रासंगिक विधि ovides। इस प्रक्रिया का उपयोग अध्ययन कैरेबियन प्रवाल भित्तियों (जैसे सबसे हाल ही में, लोह और Pawlik 26) औषध विज्ञान, जैव प्रौद्योगिकी सहित जांच के विविध क्षेत्रों में और सूचित कर सकते हैं जांच, और पर वितरण और समुद्री अकशेरूकीय की बहुतायत है कि नियंत्रण कारकों के बारे में हमारी समझ को उन्नत किया है विकासवादी पारिस्थितिकी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dichloromethane Fisher Scientific D37-20
Methanol Fisher Scientific A41220
Anhydrous Calcium Chloride Fisher Scientific C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid Fisher Scientific 20-548-146 For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity MP Biomedicals 154723
Squid mantle rings N/A N/A Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate Aldrich D5765
50 ml graduated centrifuge tube Fisher Scientific 14-432-22
20 ml scintillation vial Fisher Scientific 03-337-7
Disposable Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets Fisher Scientific 03-448-24
Red bulbs for pellet delivery Fisher Scientific 03-448-27
250 ml round-bottom flask Fisher Scientific 10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap Fisher Scientific K747130-1324
Weightboats Fisher Scientific 02-202B
Microspatula Fisher Scientific 21-401-10
5 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-53
10 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-54
Razor blade Fisher Scientific S17302

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References

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एक मछली खिलाने प्रयोगशाला Bioassay समुद्री जीवों के ऊतकों से माध्यमिक चयापचयों का Antipredatory गतिविधि का आकलन करने के लिए
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Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).More

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).

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