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Environment

Un pesce-alimentare Laboratorio Bioassay per valutare l'attività di antipredatory Secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini

doi: 10.3791/52429 Published: January 11, 2015

Summary

Questo saggio biologico si avvale di un modello di pesce predatore per valutare la presenza di metaboliti di alimentazione-deterrenti da estratti organici dei tessuti degli organismi marini a concentrazioni naturali utilizzando un punto di vista nutrizionale analoga matrice alimentare.

Introduction

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Ecologia chimica sviluppata attraverso la collaborazione di chimici ed ecologisti. Mentre la sotto-disciplina di terrestre ecologia chimica è stato intorno per qualche tempo, quello di ecologia chimica marina è solo pochi decenni vecchio, ma ha fornito importanti conoscenze sulla ecologia e comunità la struttura evolutiva degli organismi marini 1-8. Sfruttando le tecnologie emergenti di immersioni subacquee e di spettroscopia NMR, i chimici organici rapidamente generato un gran numero di pubblicazioni che descrivono nuovi metaboliti bentoniche invertebrati e alghe marine negli anni 1970 e 1980 9. Supponendo che metaboliti secondari devono servire a qualcosa, molte di queste pubblicazioni ascritti ecologicamente importanti proprietà a nuovi composti senza prove empiriche. Nello stesso tempo, gli ecologisti sono stati anche approfittando dell'avvento di immersioni subacquee e descrivere le distribuzioni e abbondanze di animali bentonici e piante precedentemente noti from metodi di campionamento relativamente inefficaci come il dragaggio. L'assunzione di questi ricercatori è che qualsiasi cosa sessili e corpo molle devono essere difesi chimicamente per evitare il consumo da parte di predatori 10. Nel tentativo di introdurre l'empirismo a quello che era il lavoro altrimenti descrittivo sulle specie abbondanze, alcuni ecologisti hanno cominciato estrapolando difese chimiche da saggi di tossicità 11. La maggior parte dei test di tossicità l'esposizione di pesci interi o di altri organismi a sospensioni acquose di estratti organici grezzi di tessuti invertebrati, con successiva determinazione delle concentrazioni in massa a secco di estratti responsabili dell'uccisione metà gli organismi di analisi. Tuttavia, i saggi di tossicità non emulare il modo in cui i potenziali predatori percepiscono preda in condizioni naturali, e gli studi successivi hanno trovato alcuna relazione tra la tossicità e l'appetibilità 12-13. E 'sorprendente che le pubblicazioni su riviste prestigiose utilizzate tecniche minimo o nullo ecological rilevanza 14-15 e oggi che questi studi sono ancora ampiamente citati. E 'ancora più allarmante notare che gli studi basati su dati di tossicità continuano ad essere pubblicati 16-18. Il metodo di analisi biologico descritto è stato sviluppato alla fine del 1980 per fornire un approccio ecologicamente rilevante per gli ecologi marini chimiche per valutare le difese chimiche antipredatory. Il metodo richiede un modello predatore di assaggiare un estratto organico greggio da parte dell'organismo bersaglio ad una concentrazione naturale in un punto di vista nutrizionale analoga matrice alimentare, fornendo dati appetibilità che sono più ecologicamente significativo di dati sulla tossicità.

L'approccio generale per valutare l'attività antipredatory dei tessuti di organismi marini comprende quattro criteri importanti: (1) un appropriato predatore generalista deve essere utilizzato in saggi di alimentazione, (2) metaboliti organici di tutte le polarità devono essere esaustivo estratte dal tessuto del bersaglio organismo, (3) i metaboliti devono be mescolato in un alimento nutrizionalmente sperimentale appropriata alla stessa concentrazione volumetrica come trovato nell'organismo da cui sono stati estratti, e (4) il disegno sperimentale e approccio statistico devono fornire una metrica significativa per indicare relativa distastefulness.

La procedura descritta di seguito è stato progettato specificamente per valutare le difese chimiche antipredatory in Caraibi invertebrati marini. Impieghiamo il wrasse bluehead, Thalassoma bifasciatum, come un modello di pesce predatore, perché questa specie è comune in barriere coralline dei Caraibi ed è noto per degustare un vasto assortimento di invertebrati bentonici 19. Tissue da parte dell'organismo bersaglio viene dapprima estratta, poi combinata con una miscela di cibo, e infine offerto ai gruppi di T. bifasciatum osservare se rifiutano i cibi estratto trattati. Dati del dosaggio con questo metodo hanno fornito importanti conoscenze sulla chimica di difesa degli organismi marini 12,20-21, lstoria ife compromessi 22-24, e la comunità ecologia 25-26.

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Protocol

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NOTA: Fase 3 del presente protocollo coinvolge soggetti animali vertebrati. La procedura è stata progettata in modo che gli animali ricevano il trattamento più umano possibile ed è stato approvato dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) presso la University of North Carolina Wilmington.

1) Estrazione del tessuto

  1. Utilizzare tessuto che è nel suo stato naturale di idratazione e non spremuto, secchi-out o eccessivamente umido come questo altera la concentrazione volumetrica di metaboliti secondari. Tagliare o tagliare il tessuto in pezzi o fette che possono essere inseriti in un tubo da centrifuga da 50 ml. Nota: tessuto fresco può essere utilizzato in alcuni casi, ma spesso è meglio tagliare o tritare tessuti congelati, che non è soggetta a spremitura al taglio.
  2. Aggiungere pezzi di tessuto a 30 ml di una miscela 1: 1 di diclorometano (DCM) e metanolo (MeOH) in una provetta da centrifuga graduata fino ad un volume finale di 40 ml è raggiunto. Assicurarsi di eseguire tutti i passaggi che comportano il trasferimento disolvente in una cappa aspirante con ventilazione adeguata.
  3. Tappare la provetta e capovolgerla più volte, poi agitare più volte nel corso di un periodo di estrazione 4 ore. Nota: Durante questo periodo, l'acqua si combina con il MeOH e il risultante MeOH: fase acquosa si separa dalla fase DCM. Il tessuto è alternativamente esposto al DCM e MeOH: acqua come emulsione come i tubi sono agitati.
  4. Trasferire l'estratto DCM in un pallone a fondo rotondo ed evaporare a secchezza su un evaporatore rotante utilizzando basse temperature (<40 ° C). Utilizzando solventi minimal, trasferire l'estratto secco di 20 ml di scintillazione flacone. Montare la fiala con un adattatore evaporatore rotante e di nuovo evaporare a secco in un evaporatore rotante con fuoco basso (<40 ° C).
    Nota: Il passo successivo richiede l'uso di uno strumento di compressione casalingo che possono essere assemblati avvitando i seguenti elementi in ordine sequenziale sull'estremità di un'asta filettata: (1) il dado (2) Rondella, e (3) dado cieco. La rondella deve o essere perforato omontata in modo che sia inferiore al diametro interno di un tubo da centrifuga da 50 ml.
  5. Tornando al tubo da centrifuga graduato contenente tessuti e MeOH: estratto dall'acqua, premere il mezzo di estrazione di tessuto attraverso la compressione. Trasferire il MeOH: estratto acquoso allo stesso pallone a fondo tondo e memorizzare refrigerati (<10 ° C).
  6. Aggiungere MeOH al tubo da centrifuga graduata finché il tessuto ora disidratato è sommerso per una seconda estrazione di 2 a 6 durata ore, poi trasferire la nuova MeOH estratto nel pallone a fondo tondo refrigerati contenente la MeOH: estratto acquoso. Se non vi è alcuna preoccupazione che il tessuto non è stato completamente estratto, ripetere l'estrazione MeOH 2 a 6 ore.
  7. Asciugare la MeOH su un evaporatore rotante con fuoco basso (<40 ° C). Trasferire l'estratto acquoso rimanente dal pallone a fondo tondo nella fiala di scintillazione contenente l'estratto secco non polare, con un volume minimo di MeOH per risciacquare il pallone a fondo tondo.
  8. Evaporate l'estratto acquoso di essiccazione, a fuoco basso (<40 ° C) su un concentratore a vuoto. La fiala di scintillazione ora contiene l'estratto grezzo organico secco totale di 10 ml di tessuto. Evacuare spazio di testa del flaconcino con N 2 gas per prevenire l'ossidazione, sigillare ermeticamente e conservare congelato (-20 ° C).

2) Preparazione alimentare

  1. Preparare calamari polvere manto liofilizzata.
    Nota: mantello Squid fornisce una fonte di alimentazione che è paragonabile a quella di altri invertebrati bentonici, e verrà utilizzato come ingrediente nelle sottofasi di 2.2.
    1. Anelli surgelati Scongelare del mantello calamari a deionizzata calda (DI) di acqua, poi purea in un frullatore ad alta velocità.
    2. Versate un sottile strato di purè calamari mantello su una teglia bassa e congelamento (-20 ° C), quindi rompere il foglio di congelato purea calamari a pezzetti per essere liofilizzato.
    3. Lyophilize la calamari congelati manto purea seguendo le modalità di funzionamento del freeze-essiccatore.
    4. Polverizzare i pezzi liofilizzate di calamari mantello purea in un frullatore ad alta velocità per formare una polvere.
    5. In una cappa aspirante, versare il mantello calamaro in polvere in una farina setaccio rotante e vagliare separare grossi pezzi di tessuto dalla polvere fine.
    6. Trasferire la multa in polvere manto calamari in un contenitore sigillato. Evacuare spazio di testa del contenitore con N 2 gas per prevenire l'ossidazione e memorizzare congelati (-20 ° C).
  2. Preparare l'impasto alimentare.
    Nota: Durante l'esecuzione di più test consecutivi, è pratico di preparare ~ 100 ml di miscela di cibo, ma questa ricetta può essere scalata a volumi più piccoli, se necessario.
    1. Combinare una miscela di 3 g di acido alginico e 5 g liofilizzata mantello polvere calamari con 100 ml di acqua deionizzata in un bicchiere da 150 ml. Mescolare energicamente con una microspatula per qualche minuto fino a quando la polvere è completamente idratata e la miscela è omogenea.
      Nota: Se si desidera, colorante alimentare può essere aggiunto a questo step: è facile aggiungere alla miscela colorante alimentare che genererà entrambe le miscele trattate e di controllo (mascherare il pigmento naturale dell'estratto nella miscela estratto trattati) anziché cercare di abbinare il colore della miscela dell'estratto trattati aggiungendo tingere alla miscela di controllo. Colorante alimentare verde o marrone è spesso desiderabile per mascherare eventuali pigmenti nell'estratto greggio.
    2. Caricare esattamente 10 ml di miscela di cibo in una siringa graduata. Fare attenzione ad evitare l'inclusione di bolle d'aria nel corso di questo processo.
    3. Rimuovere l'20 ml scintillazione flacone con estratto biologico greggio asciutto dal freezer. Aggiungere una o due gocce di MeOH, quindi mescolare l'estratto in una miscela omogenea con un microspatula.
    4. Espellere il caricata siringa da 10 ml di matrice alimentare in 20 ml di scintillazione fiala e mescolare con una microspatula per omogeneizzare la miscela alimentare estratto trattati.
      Nota: Può essere utile per espellere la siringa in incrementi più piccoli (cioè, espellere 2 ml e omogeneizzare, poi r.EPEAT fino tutti i 10 ml sono stati omogeneizzati).
  3. Preparare il pellet di analisi.
    1. Caricare un volume molto piccolo della miscela dell'estratto (~ 1 ml) in una siringa, e immergere la punta della siringa in una soluzione di 0,25 M CaCl 2. Estrarre il contenuto della siringa per formare un lungo spaghetto-like.
    2. Dopo pochi minuti, togliere il filo indurito, tritarlo in 4 mm di lunghezza pellet su un tagliere di vetro con una lama di rasoio, poi sciacquare in acqua di mare.
    3. Ripetere i punti 2.3.1 e 2.3.2 senza includere l'estratto di tessuto per fare pellet di controllo. Assicurarsi di trattamento pellets di controllo con un volume equivalente di solvente (vedi aggiunta di MeOH al composto trattata nel passaggio 2.2.3) per controllare per aggiunta di solventi. Se un controllo negativo è desiderato per confermare che il pesce saggio può essere indotta a rinunciare alimentazione, aggiungere denatonium benzoato ad una concentrazione di 2 mg ml -1 al cibo miscela grezza 27.

3) AppetibilitàBioassays

  1. Eseguire test di alimentazione con il giallo-fase wrasse bluehead catturati, Thalassoma bifasciatum, tenuti in gruppi di tre in compartimenti opaco facciate di acquari di laboratorio.
  2. Invia pellets alimentari da un bicchiere di acqua di mare con una pipetta di vetro con un bulbo di gomma. Nota: Potrebbero essere necessari alcuni giorni per addestrare i pesci per ricevere il cibo in questo modo. Uno stimolo condizionata (es pochi tocchi della pipetta sul vetro dell'acquario) che precede la consegna di cibo può essere utile per addestrare il pesce aspettarsi l'aggiunta di pellets alimentari.
  3. Punteggio pellet. Si consideri un pellet accettato se prontamente consumato dai pesci. Si consideri un pellet respinta se non mangiato, dopo un minimo di tre tentativi da parte di uno o più pesci di prenderlo nella loro cavità orale, o se il pellet si avvicina e ignorato dopo un tentativo del genere.
  4. Campioni di punteggio. Nota: La procedura di test è raffigurato come un diagramma di flusso in Figura 1 Gruppi di pesci che si rifiutano di mangiare.pellets di controllo in qualsiasi fase del protocollo non sono considerati ulteriormente. Ci sono due possibili risultati di una singola esecuzione del test: il campione viene accettato o respinto.
    1. Inizia con un pellet di controllo per confermare che il gruppo di pesci è cooperativa. Offrire un pellet trattata. Se i pesci accettano il pellet trattata, segnare il campione accettata. Se i pesci rifiutano il pellet trattato, offrire una successiva pellet di controllo per determinare se i pesci hanno cessato l'alimentazione. Se i pesci accettano la successiva pellet di controllo, segnare il campione respinta.
  5. Replica. Ripetere la procedura di test con dieci gruppi indipendenti di pesce per ogni estratto.

4) Significato Valutazione

  1. Valutare la significatività delle differenze di consumo di controllo vs pellet trattate con una versione modificata del test esatto di Fisher 26. Modificare il test in modo che siano fissati i totali marginali per il controllo e pellet trattati, Trattandoli due campioni casuali. Nota: Questo fornisce p = 0,057 quando 7 pellet sono mangiati; quindi, ogni estratto è considerato deterrente se 6 o meno pellet sono mangiati, e appetibile se 7 o più pellet sono mangiati.
  2. Per confrontare l'appetibilità relativa tra i gruppi di estratti, calcolare un numero medio di pellet consumato all'interno di ogni gruppo. Mantenere la soglia a 6 pellet così un gruppo di estratti repliche sono considerati deterrente se il numero medio di pellet consumato + errore standard (SE) ≤6. Nota: Nei risultati rappresentativi, l'assegnazione del gruppo è di specie, così replicano estratti provengono da individui distinti e la relativa appetibilità possono essere confrontati tra le specie.

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Representative Results

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Qui riportiamo i risultati di questo saggio biologico per sei specie di spugne caraibiche comuni (Figura 2). Questi dati sono stati inizialmente pubblicati nel 1995 da Pawlik et al. 12 e dimostrano la potenza di questo approccio per esaminare le differenze nelle strategie di difesa chimiche tra taxa concomitanti. I risultati sono stati riportati come un numero medio di pellet cibo mangiato + errore standard (SE) per ogni specie. Quasi nessun pellet sono stati consumati in test con estratti organici grezzi da clathrodes Agelas, Amphimedon compressa, e cauliformis Aplysina. Al contrario, pellet con estratti di Callyspongia vaginalis, Geodia gibberosa, e Micale laevis sono stati prontamente consumati nel test 12. Meno di sei pellet sono stati consumati per i primi tre specie, così sono stati considerati in modo significativo deterrente. Al contrario, il secondo tre specie non erano significativamente differenti dai controlli, ed eranoconsiderato appetibile.

Figura 1
Figura 1:. Schematica della procedura di saggio In tutte le fasi, il rifiuto di un pellet di controllo indica che questo insieme di pesce test sono poco collaborativo o sazi e non può essere utilizzato ulteriormente. Il protocollo inizia offrendo ogni set di pesci un pellet di controllo seguite da un pellet trattata. Poi, se il pellet trattata è accettato il campione viene segnato come accettata. Se il pellet trattato viene respinto, ma il successivo controllo del pellet è accettato, il campione viene segnato come rifiutata.

Figura 2
Figura 2: Consumo per Thalassoma bifasciatum di pellet alimentare (media + SE) che contiene estratti organici grezzi di spugne a concentrazioni naturali, segnalati nel 1995 da Pawlik 12 pesci consumati tutti i 10 pellets di controllo in tutti i casi. Dopo ciascuna specie, viene specificato il numero di campioni replicati (ogni replica dall'estrazione separata di un campione geograficamente distinta di tessuto spugna). Per ogni test individuale, gli estratti sono stati considerati deterrente se il numero di pellet consumati è inferiore o uguale a 6 (p = 0,057, modificate test esatto di Fisher), come indicato dalla linea tratteggiata nel grafico.

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Discussion

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La procedura qui descritta prevede un protocollo di laboratorio relativamente semplice, ecologicamente rilevanti per valutare le difese chimiche antipredatory negli organismi marini. Qui passiamo in rassegna i criteri importanti che sono soddisfatte da questo insieme di metodi:

(1) appropriata predatore. Questa analisi alimentare impiega il wrasse bluehead, Thalassoma bifasciatum, uno dei pesci più abbondanti sulle barriere coralline in tutti i Caraibi. Il bluehead è un carnivoro generalista nota di assaggiare una vasta gamma di invertebrati bentonici 19. Predatori generalisti sono la scelta migliore per questi test iniziali perché la maggior parte dei pesci predatori sulle scogliere sono generalisti, e ci si aspetterebbe che le difese antipredatory sarebbero sostanzialmente diretti contro di loro, al contrario di predatori specializzati che possono essersi evoluti meccanismi per aggirare le difese. Indagini di laboratorio di difese chimiche che utilizzano un unico predatore potenziale sono didieci seguito da più tempo e sul campo complicato esperimenti che si basano sulle risposte di una serie completa di potenziali predatori in condizioni di campo 28-33.

(2) La procedura di estrazione. La prima fase di estrazione del tessuto, che utilizza una miscela solvente di parti uguali di diclorometano (DCM) e metanolo (MeOH), permea rapidamente tessuto, solubilizzare membrane e disidratazione materiale cellulare. Il tessuto è disidratato dopo questa fase, quindi i passaggi successivi estratto residuo metaboliti di tutte le polarità in MeOH. Ripetendo l'estrazione in MeOH fino a quando il tessuto è completamente estratto costituisce una procedura di estrazione esaustiva. Variazioni minori di questo schema di estrazione sono accettabili, come sostituzione di un solvente di estrazione per un altro della stessa polarità, ma l'estrazione del tessuto possono essere incompleto se viene utilizzato un solvente appropriato. I potenziali insidie ​​di procedure di estrazione del tessuto improprio sono discussi in dettaglio altrove <sup> 8.

(3) Preparazione del cibo sperimentale. La matrice alimentare artificiale deve simulare il tessuto dell'organismo bersaglio sia la qualità nutrizionale e la concentrazione dei metaboliti secondari. E 'probabile che gli stessi processi sensoriali che i predatori usano per respingere metaboliti alimentazione-deterrenti sono anche coinvolti nella percezione della qualità nutrizionale degli alimenti. Gli alimenti con bassa qualità nutrizionale possono essere respinte a livelli molto più bassi di difesa chimica, e viceversa, metaboliti secondari possono essere solo deterrente a concentrazioni superiori al naturale se tali metaboliti sono presentati in un alimento artificiale che è più nutriente rispetto al tessuto da cui è stato tratto. In polvere, liofilizzato manto calamaro è un sostituto nutrizionale utile perché è prontamente disponibile, facile da misurare, e le sue caratteristiche nutrizionali sono già stato determinato 34.

La seconda considerazione nella preparazione della cibo sperimentale riguarda la determinazione della concentrazione dell'estratto, che deve essere fatta sulla base del volume, non di massa. Predators mangiano tessuto bagnato, e tessuti degli organismi marini sono molto variabili in contenuto di acqua. Dal punto di vista di un predatore, un morso di un anemone meduse o mare conterrebbe sostanzialmente più acqua per massa secca unità rispetto allo stesso morso dimensioni di una lumaca calamaro o sul mare. Per i tessuti altamente idrati, la concentrazione di metabolita per unità di massa secca sarebbe molto superiore a quello per unità di volume, ma il volume (punture) è la misura che è ecologicamente rilevante. Inoltre, tessuti di organismi marini possono avere densità molto diverse a causa di elementi scheletrici minerali. Determinazione della concentrazione di metabolita in volume risolve entrambi i problemi ed è la misura più rilevante dal punto di vista del consumo di tessuto da un potenziale predatore. Questo argomento, con esempi tratti dalla letteratura, viene discusso in dettaglio altrove 8.

.. content "> (4) progettazione sperimentale e approccio statistico appropriato disegno sperimentale e analisi statistiche di dati sono importanti per le analisi del comportamento, come per ogni altra ricerca scientifica che consiste nel determinare il significato delle differenze nei risultati sperimentali L'analisi qui descritta è semplice: le differenze sono determinate con una tabella di contingenza modificata. Il metodo richiede che tutte le offerte di cibo di controllo da consumare perché l'investigatore non sarebbe utilizzando predatori sperimentali che non sono stati nutrono di cibi di controllo 8. Anche se l'uso di test esatto di Fisher è stato modificato dal suo iniziale utilizzare per Pawlik et al 12., il valore di soglia di 6 pellet trattati mangiato rimane invariato. Nel corso degli anni, altri test statistici sono stati proposti come sostituti, ma scartato dopo aver consultato collaboratore James E. Blum (UNCW Dipartimento di Matematica e Statistica ). Per esempio, il test di McNemar è stato suggerito,ma è inadeguato, sia perché manca un unico set di dati, e perché una riga della tabella di contingenza è fissato a pellet 10 controllo mangiato.

Nonostante la nostra esperienza che questo metodo di analisi fornisce risultati notevolmente chiari, esso tuttavia si basa su una risposta comportamentale. Se pesci sono affamate per un periodo di tempo prima del dosaggio, si possono mangiare pellets più di quelle che avrebbero se pesci sono stati ben nutriti, in particolare se un metabolita difensiva è presente nel pellet alimentari trattati ad una concentrazione quasi soglia di attività. Per questi motivi, risultati dei dosaggi di alimentazione non dovrebbero essere troppo interpretati. Ad esempio, una differenza tra due campioni di tessuto di 1/10 vs 9/10 pellet consumati indica il primo campione è dissuasiva e la seconda no, ma una differenza di 3/10 vs 5/10 pellet consumati può essere dovuto a variazioni del comportamento tra i saggi, e il primo campione non è necessariamente più deterrente rispetto al secondo.

A Applicat chiaveion di questo saggio biologico è il suo uso in test biologico-guidata frazionamento, in base al quale le partizioni successive del greggio estratto sono testati sul pesce per isolare i composti chimici responsabili dell'attività di alimentazione-deterrente 29,32-33,35-38. Una volta che la presenza di una difesa chimica è stata accertata, l'estratto organico grezzo viene cromatograficamente frazionato in piccoli sottoinsiemi di composti che compongono la miscela, e questi sottoinsiemi sono alimentati a pescare nello stesso dosaggio alimentazione. Ancora una volta, questo dovrebbe essere fatto su base volumetrica, utilizzando "equivalenti" ml di estratto di tessuto piuttosto che equivalenti di massa. Con il procedere di separazione, frazioni sono meglio analizzati come diluizione in serie rispetto alla concentrazione volumetrica naturale: 4 ×, 2 ×, e 1 ×. Questo arco di concentrazioni tiene conto della probabile riduzione dell'attività deterrente che proviene da suddividere metaboliti attivi su due o più frazioni cromatografiche o dalla perdita di metaboliti attivi throudi decomposizione gh, reazione, o attaccamento alla cromatografiche media. Una volta che i metaboliti attivi sono stati isolati dal frazionamento test biologico-guidato, l'investigatore può individuare utilizzando tecniche spettroscopiche standard e dovrebbe anche fare lo stesso per le frazioni inattive che possono avere metaboliti secondari. E 'altrettanto importante sapere quali metaboliti secondari sono attivi in esperimenti ecologicamente rilevanti per sapere quali metaboliti non sono 8.

Elementi di questa procedura possono anche essere usati per progettare nuove tecniche sperimentali. Ad esempio, questo saggio biologico è stato adattato per i predatori invertebrati (per esempio granchi 39 e seastars 40), per le altre regioni geografiche 41, e anche per affrontare altre questioni di ricerca (ad es difese strutturali 31,34,42 e Aposematismo 27). I quattro criteri dovrebbero servire come guida per i futuri adattamenti di questo metodo. In sintesi, questo saggio biologico procedura provides un metodo più ecologico rilevante per valutare le difese chimiche antipredatory da tessuti di organismi marini. Gli studi che utilizzano questa procedura hanno avanzato la nostra comprensione dei fattori che controllano la distribuzione e l'abbondanza di invertebrati marini dei Caraibi barriere coralline (ad esempio più recente, Loh e Pawlik 26) e possono informare le indagini in diversi campi di indagine, tra cui la farmacologia, la biotecnologia, e ecologia evolutiva.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dichloromethane Fisher Scientific D37-20
Methanol Fisher Scientific A41220
Anhydrous Calcium Chloride Fisher Scientific C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid Fisher Scientific 20-548-146 For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity MP Biomedicals 154723
Squid mantle rings N/A N/A Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate Aldrich D5765
50 ml graduated centrifuge tube Fisher Scientific 14-432-22
20 ml scintillation vial Fisher Scientific 03-337-7
Disposable Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets Fisher Scientific 03-448-24
Red bulbs for pellet delivery Fisher Scientific 03-448-27
250 ml round-bottom flask Fisher Scientific 10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap Fisher Scientific K747130-1324
Weightboats Fisher Scientific 02-202B
Microspatula Fisher Scientific 21-401-10
5 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-53
10 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-54
Razor blade Fisher Scientific S17302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Un pesce-alimentare Laboratorio Bioassay per valutare l&#39;attività di antipredatory Secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini
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Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).More

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).

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