Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

A Fish-fôring Laboratory Bioassay å Vurdere Antipredatory aktivitet av sekundære metabolitter fra vev av marine organismer

doi: 10.3791/52429 Published: January 11, 2015

Summary

Dette bioassay benytter en modell rovfisk å vurdere tilstedeværelse av fôring-avskrekkende metabolitter fra organiske ekstrakter av vev av marine organismer på naturlige konsentrasjoner ved hjelp av en ernæringsmessig sammenlignbare mat matrise.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kjemisk økologi utviklet gjennom et samarbeid mellom kjemikere og økologer. Mens subdiscipline av terrestriske kjemisk økologi har eksistert i noen tid, at av marin kjemisk økologi er bare noen få tiår gammel, men har gitt viktig innsikt i den evolusjonære økologi og samfunnsstruktur av marine organismer 1-8. Drar nytte av de framvoksende teknologier for dykking og NMR-spektroskopi, organiske kjemikere raskt genereres et stort antall publikasjoner som beskriver nye metabolitter fra bentiske marine virvelløse dyr og alger i 1970 og 1980-tallet ni. Forutsatt at sekundære metabolitter må tjene noen hensikt, mange av disse publikasjonene tilskrevet økologisk viktige egenskaper til nye forbindelser uten empirisk bevis. På omtrent samme tid ble økologer også dra nytte av bruk av dykking og beskrive distribusjoner og Forekomsten av bunndyr og planter som tidligere er kjent from relativt ineffektive prøvetakingsmetoder som for eksempel mudring. Forutsetningen om disse forskerne var at alt fastsittende og soft-bodied må være kjemisk forsvares å unngå inntak av rovdyr 10. I et forsøk på å introdusere empiri til hva var ellers beskrivende arbeid på arts abundances, begynte noen økologer ekstrapolere kjemiske forsvar fra toksisitets analyser 11. De fleste toksisitetsanalyser involvert eksponeringen av hel fisk eller andre organismer i vandige suspensjoner av rå organiske ekstrakter av virvelløse vev, med påfølgende bestemmelse av de tørre massekonsentrasjon av ekstraktene som er ansvarlige for å drepe halvparten av forsøksorganismer. Men ikke toksisitet analysene ikke etterligne den måten som potensielle overgripere oppfatter byttedyr under naturlige forhold, og senere studier har funnet noen sammenheng mellom toksisitet og smakelighet 12-13. Det er overraskende at publikasjoner i prestisjetunge tidsskrifter brukte teknikkene som har liten eller ingen ecological relevans 14-15 og at disse studiene er fremdeles mye sitert i dag. Det er enda mer alarmerende å merke seg at studier basert på data om giftighet fortsette å bli publisert 16-18. Bioanalysen metoden beskrevet her ble utviklet på slutten av 1980-tallet for å gi en økologisk relevant tilnærming for marine kjemiske økologer å vurdere antipredatory kjemiske forsvar. Metoden krever en modell predator å prøve en rå organisk ekstrakt fra målorganismen på en naturlig konsentrasjon i en ernæringsmessig sammenlignbare mat matrise, gir smakelighet data som er mer økologisk meningsfylt enn toksisitetsdata.

Den generelle metode for å vurdere antipredatory aktivitet av vev av marine organismer omfatter fire viktige kriterier: (1) en passende genera predator må brukes i forings assays, (2) organiske metabolitter av alle polariteter må ekstraheres fra vev av målrette organisme, (3) metabolittene må be blandet inn i en ernæringsmessig riktige eksperimentelle mat på samme volumetriske konsentrasjon som finnes i organismen som de ble ekstrahert, og (4) den eksperimentelle design og statistisk tilnærming må gi en meningsfull beregning for å indikere relativ distastefulness.

Prosedyren beskrevet nedenfor er spesielt utviklet for å vurdere antipredatory kjemiske forsvar i Karibia marine virvelløse dyr. Vi benytter den bluehead leppefisk, Thalassoma bifasciatum, som en modell rovfisk fordi denne arten er vanlig på karibiske korallrev og er kjent for å smake på et bredt utvalg av bunnløse 19. Vev fra målorganismen først blir ekstrahert, deretter kombinert med en mat-blanding, og til slutt tilbudt til grupper av T. bifasciatum å observere om de avviser avtrekksbehandlede matvarer. Analyse data ved hjelp av denne metoden har gitt viktig innsikt i den defensive kjemi av marine organismer 12,20-21, life historie avveininger 22-24, og samfunnet økologi 25-26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MERK: Trinn 3 av denne protokollen innebærer virveldyr dyr fag. Prosedyren har blitt utformet slik at dyrene får den mest humane behandling mulig og har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of North Carolina i Wilmington.

1) Tissue Extraction

  1. Bruke vev som er i sin naturlige tilstand av fuktighet og ikke presset, tørket ut eller altfor våt, da dette vil endre volum konsentrasjon av sekundære metabolitter. Skjære vev i stykker eller skiver som kan settes inn i en 50 ml sentrifugerør. Merk: Fresh vev kan brukes i noen tilfeller, men det er ofte bedre å skjære frosset vev, som ikke er underlagt klemme når kuttet.
  2. Legg vev stykker til 30 ml av en 1: 1 blanding av diklormetan (DCM) og metanol (MeOH) i et gradert sentrifugerør inntil et sluttvolum på 40 ml oppnås. Sørg for å gjennomføre alle trinn som involverer overføring avløsemiddel i et avtrekksskap med tilstrekkelig ventilasjon.
  3. Cap røret og snu det flere ganger, deretter agitere gjentatte ganger i løpet av en 4 timers utvinning perioden. Merk: I løpet av denne perioden, og kombinerer vann med MeOH, og den resulterende MeOH: vann-fasen skilles fra DCM-fasen. Vevet blir vekselvis utsatt for DCM og MeOH: vann som en emulsjon som rørene blir agitert.
  4. Overfør DCM ekstrakt til en rundbunnet kolbe og fordamp til tørrhet på en rotasjonsfordamper ved hjelp av svak varme (<40 ° C). Ved hjelp av minimal oppløsningsmiddel, overføre den tørkede ekstrakt til en 20 ml scintillasjonsglass. Passer til flasken med en rotasjonsfordamper adapter og igjen fordamper til tørrhet på en rotasjonsfordamper ved hjelp av svak varme (<40 ° C).
    Merk: Det neste trinn krever bruk av en hjemmelaget kompresjons instrument som kan settes sammen ved å skru de følgende elementer i rekkefølge på enden av en gjenget stang: (1) mutter, (2) skive, og (3) acorn mutter. Vaskemaskinen må enten perforert ellermontert slik at den er mindre enn den innvendige diameter av et 50 ml sentrifugerør.
  5. Retur til uteksaminert sentrifugerør som inneholder vev og MeOH: vann ekstrakt, klem ekstraksjonsmediet ut av vevet gjennom komprimering. Overfør MeOH: vann ekstrakt til den samme rundkolbe og oppbevares avkjølt (<10 ° C).
  6. Legg MeOH til den graderte sentrifugerør inntil nå dehydrert vevet er neddykket for en andre ekstraksjon med 2 til 6 timers varighet, og deretter overføre den nye MeOH pakke til den nedkjølte rundkolbe inneholdende MeOH: vann-ekstrakt. Hvis det er noen bekymring for at vevet ikke har vært fullt ut, gjenta 2 til 6 timers MeOH utvinning.
  7. Tørk av MeOH på en rotasjonsfordamper ved hjelp av svak varme (<40 ° C). Overfør den gjenværende vandige ekstrakt fra rundkolbe til scintillasjonsglass inneholdende den tørkede upolare ekstrakt, ved hjelp av et minimalt volum av MeOH for å skylle rundbunnet kolbe.
  8. Evaporate den vandige ekstrakt til tørrhet ved hjelp av svak varme (<40 ° C) på en vakuum-konsentrator. Den scintillasjonsglass inneholder nå den totale tørr rå organiske ekstrakt av 10 ml vev. Evakuere topprommet av ampullen med N2 gass for å forhindre oksydasjon, slutter tett, og lagre frosset (-20 ° C).

2) Matlaging

  1. Forberede frysetørret blekksprut mantelen pulver.
    Merk: blekksprut mantelen gir en næringskilde som er sammenlignbar med andre bunndyr virvelløse dyr, og vil bli brukt som en ingrediens i den undertrinnene på 2,2.
    1. Tine frosne ringer av blekksprut mantelen i varmt avionisert (DI) vann, deretter puré dem i en high-speed blender.
    2. Hell et tynt lag av most blekksprut mantelen på et grunt kakebrett og frysing (-20 ° C), og deretter bryte arket av frosset akkar puré i små biter som skal lyofiliseres.
    3. Lyofilisere den frosne blekksprut mantelen puré om driftsprosedyrer i freeze-tørrere.
    4. Pulverisere de lyofiliserte blekksprutstykker mantelen pure i en høyhastighets-blander for å danne et pulver.
    5. I en avtrekkshette, hell pulverisert blekksprut mantelen i en roterende mel sifter og sile å skille store biter av vev fra fint pulver.
    6. Overføre den fine pulverisert blekksprut kappe til en lukket beholder. Evakuere beholderen topprommet med N2 gass for å unngå oksydasjon og lagres i frossen tilstand (-20 ° C).
  2. Forberede maten blanding.
    Merk: Når kjøre flere påfølgende analyser, er det praktisk å fremstille ~ 100 ml mat blandingen, men denne oppskrift kan skaleres til mindre volum om nødvendig.
    1. Kombiner en blanding av 3 g alginsyre og 5 g frysetørket blekksprut mantelen pulver med 100 ml avionisert vann i et 150 ml begerglass. Omrør kraftig med en microspatula i noen minutter inntil pulveret er fullstendig hydratisert, og blandingen er homogen.
      Merk: Dersom det er ønskelig, konditorfarge kan bli lagt på dette step: det er lettere å legge fargestoff til mat blanding som vil generere både behandlede og kontrollblandinger (maskering av naturlig pigment av ekstraktet i ekstraktet behandlede blanding) i stedet for å forsøke å tilpasse fargen av ekstraktet behandlet med blandingen ved å tilsette fargestoff til kontrollblandingen. En grønn eller brun mat farge er ofte ønskelig å maskere pigmenter i råekstraktet.
    2. Last nøyaktig 10 ml av mat blandingen i en gradert sprøyte. Pass på å unngå inkludering av luftbobler under denne prosessen.
    3. Ta ut 20 ml tellekar med tørr rå organisk ekstrakt fra fryseren. Tilsett en dråpe eller to av MeOH, og deretter røre ekstraktet til en homogen blanding med en microspatula.
    4. Løse ut lastet 10 ml sprøyte med mat matrisen inn i 20 ml tellekar og rør med en microspatula å homogenisere ekstrakt behandlet mat blanding.
      Merk: Det kan hjelpe å løse ut sprøyten i mindre trinn (dvs. ta ut 2 ml og homogenisere, deretter r.EPEAT inntil alle 10 ml har blitt homogenisert).
  3. Forberede analyse pellets.
    1. Laste et meget lite volum av ekstraktet blanding (~ 1 ml) inn i en sprøyte, og senk sprøytespissen i en oppløsning av 0,25 M CaCl2. Støte ut innholdet i sprøyten for å danne en lang, spaghetti-lignende tråd.
    2. Etter noen minutter, fjerne herdet strand, hogge den opp i 4 mm lange pellets på et glass skjærebrett med et barberblad, og skyll i sjøvann.
    3. Gjenta trinn 2.3.1 og 2.3.2 uten å inkludere vevsekstrakt å gjøre kontroll pellets. Vær sikker på å behandle kontrollpellets med et tilsvarende volum av løsningsmiddel (se tilsetning av MeOH til blandingen behandlet i trinn 2.2.3) for å kontrollere for løsningsmiddeltilsetning. Hvis en negativ kontroll er ønskelig å bekrefte at analysen fisk kan bli hindret fra mate, tilsett denatoniumbenzoat ved en konsentrasjon på 2 mg ml -1 til den rå mat blandingen 27.

3) PalatabilityBioassay

  1. Utføre fôring analyser med villfanget gul-fase bluehead leppefisk, Thalassoma bifasciatum, holdt i grupper på tre i ugjennomsiktig ensidige avdelinger av laboratorie akvarier.
  2. Levere pellets fra et beger med sjøvann ved anvendelse av en glass-pipette med en gummipære. Merk: Det kan ta noen dager å trene fisk å få mat på denne måten. En conditioning stimulus (f.eks noen få trykk av pipetten på Akvariet glass) som går forut for levering av mat kan være nyttig å trene fisken til å forvente tillegg av mat pellets.
  3. Scoring pellets. Betrakt en pellet aksepteres hvis lett konsumert av fisken. Betrakt en pellet avvist hvis den ikke spises etter et minimum på tre forsøk med en eller flere fisk for å ta den inn i deres munnhulen, eller hvis pelleten er kontaktet og ignorert etter et slikt forsøk.
  4. Scorings prøver. Merk: Analysefremgangsmåten er vist som et flytdiagram på figur 1, grupper av fisk som nekter å spise.kontrollpellets på ethvert trinn i protokollen er ikke betraktet videre. Det er to mulige utfall av en enkelt kjøring av analysen: prøven blir enten akseptert eller avvist.
    1. Begynn med en kontroll pellet å bekrefte at gruppen av fisk er samarbeidsvillig. Tilby en behandlet pellet. Dersom fisken godta behandlet pellet, score prøven som akseptert. Dersom fisken avviser behandlet pellet, tilbyr en etterfølgende kontroll pellet å avgjøre om fisken har opphørt fôring. Dersom fisken akseptere etterfølgende kontroll pellet, score prøven som forkastet.
  5. Replikering. Gjenta analyseprosedyren med ti uavhengige grupper av fisk for hver pakke.

4) Evaluering Betydning

  1. Vurdere betydningen av forskjeller i forbruket av kontroll vs behandlede pellets med en modifisert versjon av Fishers eksakte test 26. Endre testen slik at de marginale summer for kontroll og behandlet pellets er faste, Behandle dem begge som stikkprøver. Merk: Dette gir p = 0,057 når 7 pellets er spist; dermed er noen utdrag anses avskrekkende hvis 6 eller færre pellets er spist, og spiselig hvis 7 eller flere pellets er spist.
  2. For å sammenligne den relative velsmakenhet blant grupper av ekstrakter, beregne en midlere antall pellets spist i hver gruppe. Hold terskelen 6 pellets slik at en gruppe av replikate ekstrakter anses avskrekkende hvis det midlere antall pellets spist + standardfeil (SE) ≤6. Merk: I de representative resultater, er det gruppeoppgave arter, så kopierer utdrag kommer fra forskjellige individer, og den relative smaken kan sammenlignes mellom artene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her rapporterer vi resultatene av denne bioassay for seks arter av vanlige Caribbean svamper (figur 2). Disse dataene ble opprinnelig utgitt i 1995 av Pawlik et al. 12 og demonstrere makt denne tilnærmingen å kartlegge forskjeller i kjemiske forsvarsstrategier blant co-forekommende arter. Resultatene ble rapportert som et gjennomsnittlig antall mat pellets spist + standard feil (SE) for hver art. Nesten ingen pellets ble spist i analyser med rå organiske ekstrakter fra Agelas clathrodes, Amphimedon compressa og Aplysina cauliformis. Derimot ble pellets laget med ekstrakter fra Callyspongia vaginalis, Geodia gibberosa, og Mykale laevis lett forbrukes i analysen 12. Færre enn seks pellets ble spist for de tre første artene, slik at de ble ansett betydelig avskrekkende. I motsetning til dette var de andre tre arter som ikke er signifikant forskjellig fra kontrollene, og varansett som akseptabel.

Figur 1
Fig. 1: Skjematisk fremstilling av analyseprosedyren På alle trinn, avvisning av et styre pellet viser at dette sett av analyse fisk er samarbeidsvillig eller mettet og kan ikke brukes videre. Protokollen begynner ved å tilby hvert sett av fisk en styre pellets, etterfulgt av en behandlet pellet. Neste, er hvis den behandles pellet er akseptert prøven scoret som akseptert. Dersom behandlede pellet blir avvist, men den etterfølgende kontroll pellet er akseptert, er prøven scoret som forkastet.

Figur 2
Figur 2: Forbruk av Thalassoma bifasciatum av mat pellets (gjennomsnitt + SE) som inneholder grove organiske ekstrakter av svamper på naturlige konsentrasjoner, først rapportert i 1995 av Pawlik 12 Fisk som forbrukes alle 10 kontrollpellets i alle tilfeller. Etter hvert navn art, er antall gjentatte prøver er angitt (hver replikere fra separat ekstraksjon av en geografisk distinkte prøve av svamp vev). For en hvilken som helst individuell analyse ble ekstraktene betraktes avskrekkende hvis antallet pellets spises var mindre enn eller lik 6 (p = 0,057, modifisert Fishers eksakte test), som vist ved den stiplede linje i diagrammet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fremgangsmåten beskrevet heri tilveiebringer en relativt enkel, miljøvennlig aktuelle laboratorieprotokoll for å vurdere antipredatory kjemiske forsvar i marine organismer. Her har vi gjennom de viktige kriterier som er fornøyd med dette settet av metoder:

(1) Passende rovdyr. Dette fôring analysen benytter bluehead leppefisk, Thalassoma bifasciatum, en av de mest tallrike fisker på korallrev i hele Karibia. Den bluehead er en generalist rovdyr kjent for å smake på et bredt utvalg av bunnløse 19. Genera rovdyr er det beste valget for disse innledende analysene fordi flertallet av rovfisk på revene er generalister, og det forventes at antipredatory forsvar ville være bredt rettet mot dem, i motsetning til spesialist rovdyr som kan ha utviklet seg mekanismer for å omgå forsvar. Laboratorieundersøkelser av kjemiske forsvar ved hjelp av en eneste potensiell predator er avti fulgt av mer tidkrevende og komplisert feltforsøk som er avhengige av svarene av et omfattende tilbud av potensielle predatorer under feltforhold 28-33.

(2) Ekstrahering prosedyre. Den første vevet ekstraksjonstrinn, som bruker en løsningsmiddelblanding av like deler diklormetan (DCM) og metanol (MeOH), syrer hurtig vev, oppløseliggjøring av membraner og dehydratisering cellemateriale. Vevet er dehydrert etter dette trinn, slik at de etterfølgende trinn ekstrahere resterende metabolitter av alle polariteter i MeOH. Å gjenta ekstraksjonen i MeOH inntil vevet er fullstendig ekstrahert utgjør en uttømmende ekstraksjon prosedyre. Mindre variasjoner på denne ekstraksjon ordningen er akseptable, så som substitusjon av ett ekstraksjonsmiddel for en annen av samme polaritet, men vev ekstraksjon kan være ufullstendig hvis en upassende løsningsmiddel anvendes. Potensielle fallgruver feilaktig vev ekstraksjonsmetoder er diskutert i detalj andre steder <sup> 8.

(3) Fremstilling av eksperimentell mat. Den kunstige mat matrisen må simulere vevet av target-organismen i både den ernæringsmessige kvalitet og konsentrasjon av sekundære metabolitter. Det er sannsynlig at de samme sensoriske prosesser som rovdyr bruker til å avvise fôring-avskrekkende metabolitter er også involvert i oppfatningen av den ernæringsmessige kvaliteten på matvarer. Matvarer med lav ernæringsmessige kvaliteten kan bli avvist på mye lavere nivåer av kjemisk forsvar, og omvendt, kan sekundære metabolitter bare være avskrekkende på høyere-enn-naturlige konsentrasjoner hvis disse metabolittene er presentert i en kunstig mat som er mer næringsrik enn vevet som det ble avledet. Pulverisert, fryse-tørket blekksprut mantelen er et nyttig ernæringsmessig erstatning fordi det er lett tilgjengelig, lett å måle, og dens ernæringsmessige egenskaper er allerede blitt fastslått 34.

Den andre ved klargjøring av eksperimentell mat angår bestemmelse av konsentrasjonen av ekstraktet, som må gjøres på grunnlag av volumet, ikke massen. Rovdyr spiser vått vev og vev av marine organismer variere mye i vanninnhold. Fra perspektivet til et rovdyr, ville en bit av en manet eller sjøanemonen inneholde vesentlig mer vann per enhet tørrmasse enn samme størrelse bitt av en blekksprut eller sjø slug. For sterkt hydratiserte vev, ville konsentrasjonen av metabolitten pr enhet tørrmasse være mye høyere enn per volumenhet, men volum (biter) er et mål som er økologisk relevant. Videre kan vev av marine organismer har svært ulike tettheter på grunn av mineralskjelettelementer. Fastsettelse av metabolitt konsentrasjon av volum løser begge problemene, og er den mest aktuelle tiltaket fra standpunktet om forbruket av vev av en potensiell overgriper. Dette emnet, inkludert eksempler fra litteraturen, er diskutert i detalj andre steder åtte.

.. innhold "> (4) Eksperimentell design og statistisk tilnærming Passende eksperimentell design og statistiske analyser av data er så viktig for atferdsanalyser som for enhver annen vitenskapelig forskning som innebærer å bestemme betydningen av forskjeller i eksperimentelle resultater Analysen beskrevet her er enkel: Forskjellene er bestemt med en modifisert beredskaps bord. Metoden krever at alle kontroll mat tilbud bli fortært fordi etterforskeren ikke ville være med eksperimentelle rovdyr som ikke var fôring på kontroll matvarer 8. Selv om bruken av Fishers eksakte test har blitt forandret fra sin opprinnelige bruk av Pawlik et, forblir uendret terskelverdien av 6 behandlet pellets spist. I årenes løp har andre statistiske tester blitt foreslått som erstatter, men kastes etter samråd med samarbeidspartner James E. Blum (UNCW Institutt for matematikk og statistikk al. 12 ). For eksempel, McNemar test har blitt foreslått,men er upassende, både fordi det mangler et matchet sett med data, og fordi en rad av beredskaps tabellen er fastsatt til 10 kontroll pellets spist.

Til tross for vår erfaring at denne analysemetoden gir bemerkelsesverdig klare resultater, likevel er avhengig den på en atferdsrespons. Hvis fisken er sultet for en tidsperiode før assayet, kan de spiser mer behandlede pellets enn de ville ha gjort dersom fisken ble godt matet, spesielt hvis en bane metabolitt er til stede i de behandlede pellets ved en nær-terskelkonsentrasjon av aktivitet. Av disse grunner bør resultatene av forings analysene ikke være over-tolket. For eksempel kan en forskjell mellom to vevsprøver på 1/10 vs 9/10 pellets spist indikerer den første prøven er avskrekkende og den andre ikke er det, men en forskjell på 3/10 vs 5/10 pellets spist kan skyldes atferds variasjon mellom assayer, og den første prøven er ikke nødvendigvis mer avskrekkende enn den andre.

En viktig application av denne bioanalyse er dens anvendelse i bioanalyse styrt fraksjonering, hvorved suksessive skillevegger av råekstraktet blir testet på fisken for å isolere de kjemiske forbindelser som er ansvarlige for mating hindrende aktivitet 29,32-33,35-38. Når nærværet av en kjemisk forsvar er blitt fastslått, blir det rå organiske ekstrakt fraksjoneres kromatografisk i mindre undergrupper av forbindelser som utgjør blandingen, og disse undergrupper blir matet til fisk i den samme foring assay. Igjen, bør dette gjøres på en volumetrisk basis, ved hjelp av "ml ekvivalenter" av vevsekstrakt snarere enn masseekvivalenter. Som separasjons skrider frem, blir beste fraksjoner analysert som en seriell fortynning i forhold til den naturlige volumetriske konsentrasjon: 4 x, 2 x, og 1 x. Dette span av konsentrasjoner tar hensyn til den sannsynlige reduksjon i avskrekkende aktivitet som kommer fra å splitte de aktive metabolitter over to eller flere kromatografiske fraksjoner eller fra tap av aktive metabolitter igjennomgh nedbryting, reaksjon, eller vedlegg til kromatografisk media. Når de aktive metabolitter er blitt isolert med bioassay styrt fraksjonering, kan etterforskeren identifisere dem ved hjelp av standard spektroskopiske teknikker og bør også gjøre det samme for inaktive fraksjoner som kan ha sekundære metabolitter. Det er like viktig å vite hvilke sekundære metabolitter er aktive i økologisk relevante eksperimenter som å vite hvilke metabolitter er ikke 8.

Elementer av denne fremgangsmåten kan også bli anvendt til å designe nye eksperimentelle teknikker. For eksempel ble denne bioassay tilpasset for virvelløse rovdyr (f.eks krabber 39 og seastars 40), for andre geografiske regioner 41, og til og med å ta opp andre problemstillinger (f.eks strukturelle forsvar 31,34,42 og Advarselsfarger 27). De fire kriteriene bør tjene som en guide til fremtidige tilpasninger av denne metoden. Oppsummert dette bioassay prosedyre provides en mer økologisk relevant metode for å vurdere antipredatory kjemiske forsvar fra vev av marine organismer. Studier ved hjelp av denne prosedyren har utvidet vår forståelse av de faktorene som styrer fordelingen og overflod av marine virvelløse dyr på karibiske korallrev (f.eks sist, Loh og Pawlik 26) og kan informere undersøkelser i ulike felt av henvendelse, inkludert farmakologi, bioteknologi og evolusjonær økologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dichloromethane Fisher Scientific D37-20
Methanol Fisher Scientific A41220
Anhydrous Calcium Chloride Fisher Scientific C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid Fisher Scientific 20-548-146 For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity MP Biomedicals 154723
Squid mantle rings N/A N/A Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate Aldrich D5765
50 ml graduated centrifuge tube Fisher Scientific 14-432-22
20 ml scintillation vial Fisher Scientific 03-337-7
Disposable Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets Fisher Scientific 03-448-24
Red bulbs for pellet delivery Fisher Scientific 03-448-27
250 ml round-bottom flask Fisher Scientific 10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap Fisher Scientific K747130-1324
Weightboats Fisher Scientific 02-202B
Microspatula Fisher Scientific 21-401-10
5 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-53
10 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-54
Razor blade Fisher Scientific S17302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paul, V. J., ed, Ecological roles of marine natural products. Comstock Publishing. Associates: Ithaca, N.Y. (1992).
  2. Pawlik, J. R. Marine invertebrate chemical defenses. Chemical Reviews. 93, (5), 1911 (1993).
  3. Hay, M. E. Marine chemical ecology: what's known and what's next. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 44, (5), 476-476 (1996).
  4. McClintock, J. B., Baker, B. J. Marine Chemical Ecology. CRC Press. Boca Raton, Fla. (2001).
  5. Amsler, C. D. Algal Chemical Ecology. Springer. New York. (2008).
  6. Hay, M. E. Marine chemical ecology: Chemical signals and cues structure marine populations, communities, and ecosystems. Annual Review of Marine Science. 1, 193-212 (2009).
  7. Pawlik, J. R. The chemical ecology of sponges on Caribbean reefs: Natural products shape natural systems. BioScience. 61, (11), 888 (2011).
  8. Pawlik, J. R. Antipredatory Defensive Roles of Natural Products from Marine Invertebrates. Handbook of Marine Natural Products. 677-710 (2012).
  9. Pawlik, J. R., Amsler, C. D., Ritson-Williams, R., McClintock, J. B., Baker, B. J., Paul, V. J. Marine Chemical Ecology: A Science Born of Scuba. Research and Discoveries: The Revolution of Science through Scuba. 39, 53-69 (2013).
  10. Randall, J. E., Hartman, W. D. Sponge-feeding fishes of the West Indies. Marine Biology. 1, 216-225 (1968).
  11. Bakus, G. J., Green, G. Toxicity in sponges and holothurians — geographic pattern. Science. 185, 951-953 (1974).
  12. Pawlik, J. R., Chanas, B., Toonen, R. J., Fenical, W. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish. 1. Chemical deterrency. Marine Ecology Progress Series. 127, 183-194 (1995).
  13. Schulte, B. A., Bakus, G. J. Predation deterrence in marine sponges — laboratory versus field studies. Bulletin of Marine Science. 50, 205-211 (1992).
  14. Jackson, J. B. C., Buss, L. Allelopathy and spatial competition among coral reef invertebrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72, 5160-5163 (1975).
  15. Bakus, G. J. Chemical defense mechanisms on the great barrier reef. Australia. Science. 211, 497-499 (1981).
  16. Gemballa, S., Schermutzki, F. Cytotoxic haplosclerid sponges preferred: a field study on the diet of the dotted sea slug Peltodoris atromaculata (doridoidea: nudibranchia). Marine Biology. 144, 1213-1222 (2004).
  17. Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. Relating species traits to environmental variables in Indonesian coral reef sponge assemblages. Marine and Freshwater Research. 58, 240-249 (2007).
  18. Mollo, E., et al. Factors promoting marine invasions: a chemolecological approach. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 4582-4586 (2008).
  19. Randall, J. E. Food habits of reef fishes of the West Indies. Studies in Tropical Oceanography. 5, 665-847 (1967).
  20. O'Neal, W., Pawlik, J. R. A reappraisal of the chemical and physical defenses of Caribbean gorgonian corals against predatory fishes. Marine Ecology Progress Series. 240, 117-126 (2002).
  21. Hines, D. E., Pawlik, J. R. Assessing the antipredatory defensive strategies of Caribbean non-scleractinian zoantharians (Cnidaria): is the sting the only thing. Marine Biology. 159, (2), 389-398 (2012).
  22. Walters, K. D., Pawlik, J. R. Is there a trade-off between wound-healing and chemical defenses among Caribbean reef sponges. Integrative and Comparative Biology. 45, (2), 352-358 (2005).
  23. Leong, W., Pawlik, J. R. Evidence of a resource trade-off between growth and chemical defenses among Caribbean coral reef sponges. Marine Ecology Progress Series. 406, 71-78 (2010).
  24. Leong, W., Pawlik, J. R. Comparison of reproductive patterns among 7 Caribbean sponge species does not reveal a resource trade-off with chemical defenses. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 401, (1-2), 80-84 (2011).
  25. Pawlik, J. R., Loh, T. -L., McMurray, S. E., Finelli, C. M. Sponge Communities on Caribbean Coral Reefs Are Structured by Factors That Are Top-Down, Not Bottom-Up. PLoS ONE. 8, (5), e62573 (2013).
  26. Loh, T. -L., Pawlik, J. R. Chemical defenses and resource trade-offs structure sponge communities on Caribbean coral reefs. Proceedings of the National Academy of Science. 111, 4151-4156 (2014).
  27. Miller, A. M., Pawlik, J. R. Do coral reef fish learn to avoid unpalatable prey using visual cues. Animal Behaviour. 85, 339-347 (2013).
  28. Pawlik, J. R., Fenical, W. A re-evaluation of the ichthyodeterrent role of prostaglandins in the Caribbean gorgonian coral, Plexaura homomalla. Marine Ecology Progress Series. 52, 95-98 (1989).
  29. Fenical, W., Pawlik, J. R. Defensive properties of secondary metabolites from the Caribbean gorgonian coral Erythropodium caribaeorum. Marine Ecology Progress Series. 75, 1-8 (1991).
  30. Pawlik, J. R., Fenical, W. Chemical defense of Pterogorgia anceps, a Caribbean gorgonian coral. Marine Ecology Progress Series. 87, 183-188 (1992).
  31. Chanas, B., Pawlik, J. R. Does the skeleton of a sponge provide a defense against predatory reef fish. Oecologia. 107, (2), 225-231 (1996).
  32. Chanas, B., Pawlik, J. R., Lindel, T., Fenical, W. Chemical defense of the Caribbean sponge Agelas clathrodes (Schmidt). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 208, (1-2), 185-196 (1997).
  33. Wilson, D. M., Puyana, M., Fenical, W., Pawlik, J. R. Chemical defense of the Caribbean reef sponge Axinella corrugata against predatory fishes. Journal of Chemical Ecology. 25, (12), 2811-2823 (1999).
  34. Chanas, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish II. Spicules, tissue toughness, and nutritional quality. Marine Ecology Progress Series. 127, (1), 195-211 (1995).
  35. Albrizio, S., Ciminiello, P., Fattorusso, E., Magno, S., Pawlik, J. R. Amphitoxin, a new high molecular weight antifeedant pyridinium salt from the Caribbean sponge Amphimedon compressa. Journal of Natural Products. 58, (5), 647-652 (1995).
  36. Assmann, M., Lichte, E., Pawlik, J. R., Köck, M. Chemical defenses of the Caribbean sponges Agelas wiedenmayeri and Agelas conifera. Marine Ecology Progress Series. 207, 255-262 (2000).
  37. Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus. Natural Product Letters. 15, (4), 275-285 (2001).
  38. Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators. Journal of Chemical Ecology. 28, (6), 1103-1115 (2002).
  39. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs. Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).
  40. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars. Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).
  41. Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense. Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).
  42. Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322, (1), 67 (2005).
A Fish-fôring Laboratory Bioassay å Vurdere Antipredatory aktivitet av sekundære metabolitter fra vev av marine organismer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).More

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter