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Biology

蛋白质的共表达了多方面的好处 Published: February 5, 2015 doi: 10.3791/52431

Introduction

表达技术的引入提高了低拷贝数酶或者生化研究和工业生产的药理学活性的蛋白质( 胰岛素)的。因为这些技术的出现,显著的进步已经实现,以增加重组蛋白的产量和质量。此外,原核1,2和真核3过表达系统被开发,多年来,将提供到蛋白质生物技术, 即,大肠杆菌的“工作马”有用的替代品。替代的平台,以大肠杆菌 ,特别是可获得大肠杆菌导致生产的重组肽或蛋白轴承翻译后修饰的。然而,应该指出的是,E。大肠杆菌仍然代表所选择的生物体为重组蛋白的生产。这是由于多种因素,其中最相关的可认为:I)的不少表达系统(表达载体和应变的可用性)的E.大肠杆菌 1,2; ⅱ)短的产生时间,和高生物质产量,E大肠杆菌中的各种丰富的和合成媒体; iii)所述浅显操纵或者在生物化学,并在该微生物的基因水平; ⅳ)能产生毒性蛋白4的菌株的分离; V)株具有均匀的感应在群体水平上5,6建设。另外,最近显示适合于生产在大肠杆菌中的表达系统翻译后修饰的蛋白质的大肠杆菌可以设计和构造2。

目前,蛋白质表达主要用来获得单体或同型寡聚蛋白质,其hypersynthesis可以与单个基因克隆到合适的质粒来进行。然而,关注的是最近支付给大肠杆菌的构建大肠杆菌蛋白的共表达系统,具有挑战性的生产, 在体内的杂寡聚复合物2。有趣的是,蛋白质共同表达的早期实验解决了蓝藻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧7,8的大,小亚基的种间组装,和HIV-1的截断和全长形式的关联逆转录9。这些开创性的研究表明,蛋白质的共表达代表了强大的替代传统的体外重组。此外,蛋白的共表达在大肠杆菌中的大肠杆菌是用于生产不同的蛋白质轴承的翻译后修饰2,得到含非天然氨基酸的蛋白质2,并增加过表达的膜蛋白2的产率。而且,蛋白的共表达的作为工具的电位以赋予大肠杆菌大肠杆菌竞争NCE蛋白质分泌正在积极调查2。

蛋白的共表达在大肠杆菌中的两种主要的策略大肠杆菌可以追求是:i)使用单个质粒来承载不同的基因的过表达; ⅱ)在单细胞中使用多个质粒共同表达靶蛋白。在第一种情况下,该标准的质粒的选择不与那些传统的单一蛋白质表达实验不同,虽然含有串联启动子/操纵元件特定的质粒用于共表达10构成。因此,这第一种方法是相当简单的。然而,应当提到的是,使用一个单一的质粒来共表达不同蛋白质面临两个主要的困难:i)的矢量随承载基因的数量,限制共表达蛋白的数量的分子质量; ⅱ)当多个基因的单个启动子的控制下克隆,极性可以增减E从启动子远端的基因的表达。单E.采用双重或多重质粒大肠杆菌细胞具有完成所选择的载体的相容性,因此,施加约束以质粒的合格组合。然而,该第二共表达策略设有含载体的分子质量的优点,并限制极性。我们最近建造设计,方便的共表达质粒11之间的基因的穿梭蛋白共表达系统。特别是,我们构建了PGOOD矢量系列,相关特征,其中是:i)复制的一个P15A原点,以提供PGOOD质粒与含有市售载体的ColE1原点( 例如,所述的pBAD系列12)的相容性; ⅱ)四环素抗性盒; III)LAC存在派生调控元件, 启动操作员(O 1)夫妇和的lacI Q基因。使用适当的pBAD-PGOOD夫妇,我们能够以过表达大肠杆菌的催化核心大肠杆菌 DNA聚合酶III,三种不同的亚单位组成, 即,α(5'-3'聚合酶),ε(3'-5'外切核酸酶)和θ(稳定ε)13。特别是,我们表明,共表达αεθ复杂的是严格依赖于除大肠杆菌两者的IPTG和阿拉伯糖的大肠杆菌培养液,从PGOOD和的pBAD,分别为( 图1A)触发过表达。

在本报告中,我们说明了如何蛋白共同表达可以有效地解决与蛋白复合物亚基的溶解性差的困难。此外,我们显示了如何在体内蛋白互补试验可以进行的,我们终于在大肠杆菌中使用的蛋白质共表达来调节突变频率报告关口我。为了这个目标,我们使用适合来说明每个案例研究相关的例子PGOOD-的pBAD夫妇。

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Protocol

1.隔离的E.大肠杆菌共转化

  1. 准备适当的大肠杆菌的电-感受态细胞大肠杆菌菌株进行改造。转移到1ml LB培养基(胰蛋白胨,酵母提取物,氯化钠10,第5和10克/升,分别地)选择的菌株的单菌落,并在37℃下孵育180 rpm振摇条件下进行。稀释预培养1:500中的新鲜LB培养基25毫升孵育的培养在37℃。
  2. 在对数相(0.6 OD)离心所述细胞悬浮液在5000×g离心20分钟),并悬浮颗粒中的10%,体积/体积的冰冷无菌甘油 - 水在一半原培养体积。重复此步骤4次,每次再悬浮体积减半。最后,重新悬浮在甘油/水的颗粒和除以细胞悬浮于50μl等分试样。存储等分在-80℃下长达6个月。
  3. 溶解补充有0.5mM EDTA的在无菌水中的所需质粒。解冻的ICê电感受态细胞的等分试样并混合以载体的合适量(2.5-5纳克)。分配所述混合物成适合于电穿孔0.1 1cm比色杯中,并应用​​1.8千伏。
  4. 紧接在电穿孔的细胞转移到1毫升SOC培养基(LB培养基补充有0.2%w / v的葡萄糖,10mM的MgCl 2的,2.5毫米氯化钾),孵育1小时下振荡,最后转移100μl的等分试样到培养皿含有LB琼脂用适当的抗生素。孵育O / N在37℃。
  5. 通过在培养皿裸奔单菌落净化转化。
  6. 准备主转化电感受态细胞,并重复步骤1.1至1.5进一步质粒进行改造。
  7. 制备的共转化体的甘油原种。转移在LB单菌落补充有合适的抗生素,孵育在37℃下振荡,并且在对数期(OD 0.6)离心所述细胞悬浮液在5000×g离心20分钟。 řesuspend在LB-抗生素培养基含有15%体积/体积甘油沉淀。在分装分装并储存在 - 80℃。

2.共表达大肠杆菌的α和ε亚基大肠杆菌 DNA聚合酶III

  1. 用无菌环传送少量的相应应变甘油( 例如,TOP10 / PGOOD-ε243和TOP10 / PGOOD-ε243-θ/pBADα1160,参见图1)到含有LB培养基和抗生素的培养皿。让细胞悬浮液干燥到培养皿,并且条纹细胞液滴。在37°CO / N。
  2. 转让,使用无菌牙签,单菌落到1ml的LB-抗生素培养基中。孵育8小时,在37℃。稀释预培养1:500在新鲜的培养基中孵育在30℃下15小时。
  3. 添加IPTG,阿拉伯糖,或阿拉伯糖和IPTG,每1毫米。孵育在30℃下2.5小时。收集细胞,并存储该粒料在-20℃。
  4. 解冻粒料在冰上,重悬在裂解缓冲液(50mM的Tris-HCl,50 mM氯化钠,1mM EDTA中,2.5毫摩尔二硫苏糖醇,1mM苯甲基磺酰氟(PMSF),pH 8)中。轻轻的均匀的细胞悬液与冷玻璃窑匠。
  5. 声处理,在15瓦下15秒,接着15秒冷却时间间隔(4个循环)。
  6. 离心的总蛋白提取物在10,000×g离心20分钟,在4℃以回收可溶组分。
  7. 通过SDS-PAGE(12.5%丙烯酰胺)的每个可溶性蛋白质提取物的等分试样进行分析。为此目的,传输20微升每种可溶性蛋白提取物含有60微升的H 2 O和20微升加样缓冲液(250mM的Tris-盐酸的pH Eppendorf管6.8,10mM的β巯基乙醇,10%(重量/体积) SDS,50%(体积/体积)甘油,0.25%(重量/体积)溴酚蓝),并煮沸5分钟。负载18微升各样品并进行电泳,在140 V为​​约1.5小时。

3.共表达Deinococ的α亚基对焦球菌DNA聚合酶III和εE.亚基大肠杆菌 DNA聚合酶III

  1. 制备E的预培养大肠杆菌菌株TOP10 /的pBAD-α 博士 / PGOOD-ε243在1ml LB-氨苄青霉素-四环素的培养基中孵育8小时,在37℃。稀释1:1000的新鲜培养基和培养O / N在37℃。
  2. 稀释1:100的入200ml新鲜的培养基,孵育在37℃下进行3小时,然后诱导3小时与阿拉伯糖和IPTG 1 mM的每种。收获细胞,并将沉淀储存于-20℃。
  3. 重悬沉淀在50mM的Tris-HCl pH为8,150 mM氯化钠,1mM EDTA中,1毫PMSF。均质并如2.4和2.5中所述破碎细胞。
  4. 立即离心细胞裂解物以10,000×g离心20分钟。弃沉淀。过滤用布氏漏斗装有3层纸过滤上清液。适用于温和的真空。为了避免过多的泡沫,保持真空锥形瓶冰过滤过程中。
  5. 根据布拉德福德14确定蛋白浓度。

4.凝胶过滤层析

  1. 平衡水夹套16x70(200)用50mM的Tris-HCl,150mM的氯化钠,1mM EDTA中,pH值8.加载至色谱柱上的可溶性蛋白提取物的凝胶过滤柱。为了获得最佳的分辨率,使用1毫升样品环。 0.6毫升/分钟下进行层析。保持柱温在4℃贯穿。
  2. 收集0.9毫升馏分并通过SDS-PAGE分析它们。转移20微升的每个相关部分,以含有60微升的H 2 O和20微升加样缓冲液(250mM的Tris-盐酸pH值为6.8,10mM的β巯基乙醇,10%(重量/体积)SDS,50%的Eppendorf管中(体积/体积)甘油,0.25%(重量/体积)溴酚蓝),并煮沸5分钟。负载18微升各样品并进行电泳,在140 V为​​约1.5小时。
  3. 确定的3'-5'核酸外切酶和每个级分在96我们的DNA聚合酶活性LL微孔板。使用胸苷-5'-单磷酸对硝基苯酯( NP-TMP)作为基板15测定的核酸外切酶的活性。估计使用PPX(焦磷酸酶,嘌呤核苷磷酸化酶,黄嘌呤氧化酶)酶偶联测定法16和DNA聚合酶活性的2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(INT)的作为电子受体16。

人群共同表达E.的野生型ε亚基5.突变分析大肠杆菌 DNA聚合酶III和诱变εD12A变

  1. 转移大肠杆菌的单个菌落大肠杆菌 TOP10含有的pBAD-ε和PGOOD1-εD12A11矢量到1ml的LB-抗生素培养基中。孵育O / N在37℃。
  2. 稀释预培养1:250在3瓶中含有新鲜培养基(10毫升)中,添加相应的诱导剂(阿拉伯糖,IPTG,或阿拉伯糖和IPTG 1 mM的每种)孵育在37℃下8小时。制备平行非诱导培养物。
  3. 收集1毫升的等分试样,然后稀释1:在含新鲜培养基(10毫升)中的新培养瓶中500补充或不使用适当的诱导剂。孵育O / N在37℃。
  4. 重复步骤5.2和5.3,并收集等分1毫升。
  5. 确定发生在各培养世代的数目。转移在LB板,100微升的接种和培养合适的连续稀释。孵育O / N在37℃。算在LB平板上的菌落,并计算细胞中存在的接种物(日志I)和在培养在生长(日志C)的端部的数目的对数。要确定代的数量,使用的公式:(日志ç -登录I)/0.301。
  6. 离心机在5000×g离心20分钟,重悬细胞于1ml的50mM的Tris-HCl pH 7.6的50 mM氯化钠。通透细胞,持续20秒添加2-3滴氯仿并涡旋。
  7. 确定β-在一个96孔微量每个等分试样的葡糖苷酶活性,使用 -硝基苯基β-D-吡喃葡糖苷(PNPGluc)作为底物。添加到每孔100μl透化细胞,并加入100μl底物(16毫克/毫升的储备溶液中的H 2 O)。请注意,以避免气泡孔中。读取吸光度在420nm处,用酶标仪及相应的过滤器。

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Representative Results

E.的ε亚基大肠杆菌 DNA聚合酶III由243个氨基酸,并设有溶解性差17,18,除非残留187-243删除17。然而,我们以前曾表明11的共表达的全长α,ε和θ亚基产生可溶的DNA聚合酶III催化核心( 图1)。特别是,使用的pBAD-PGOOD共表达系统,我们证明:ⅰ)α和ε亚基的过表达能够独立地通过阿拉伯糖和IPTG,分别为( 图1A)进 ​​行控制; II)全长ε亚基可以在可溶性蛋白提取物中分离E.检测大肠杆菌细胞过度α,ε和θ并进行凝胶过滤( 图1B)。在这种情况下,核酸外切酶的活性分布到3个主要的峰( 图1B,实心圆),而峰值中心在压裂灰23被示出为包含αεθ催化核心( 图1C1D)。 ε的稳定性在结合到α和θ被大大增加。当我们以前过度全长ε的E.大肠杆菌 ,游离ε的低量通过在可溶性蛋白免疫印迹检测中提取19( 图2A)。有趣的是,要注意的是,在相同的条件下,我们始终检测更高量的ε的免费的C-TER截短形式(ε-234,ε-228,ε-213,或ε-186),其中ε-186表现较好的19( 图2A)。我们并还表明,ε的C-末端结构域的蛋白水解防止由结合到α和θ亚基19。的影响,如果有的话,对ε的溶解度共表达可以容易地进行测试。据报道在图2B中,可溶性蛋白提取物从细胞过度分离α,ε,或α和ε,可以通过SDS-PAGE用总蛋白提取物进行比较分析,并方便。在这种情况下,电泳分析表明,当单独过度表达,ε亚基特征溶解性差(比较泳道1和2),而共表达α的大大增强ε的可溶性蛋白提取物的浓度(比较泳道3和4 )。

共表达也可用于执行跨物种互补试验。因此,我们认为它可能会感兴趣的评估属于兰氏阳性和革兰氏阴性的复制机器亚基之间的相互作用-细菌耐辐射奇球菌是一种革兰氏+细菌,设有一个大型的α亚单位(1335个氨基酸,150 kDa的)和推定的ε亚基含有197个氨基酸。有趣的是,D.球菌 ε亚基是缺乏C-末端结构域存在于它的大肠杆菌大肠杆菌 ,E之间的同一性和同源性大肠杆菌D.球菌 ε亚基分别等于29%和59%,(考虑区域1-178, 耐辐射球菌坐标)。为了测定D的能力球菌聚合酶IIIα亚基(α 博士 )的结合E.大肠杆菌 ε亚基,我们已经克隆到的pBAD载体的合成基因编码α 博士和我们共同转化的大肠杆菌大肠杆菌的pBAD-α 博士和PGOOD-ε。同时加入IPTG和阿拉伯糖的培养基中触发的共表达α 博士和ε( 图3A)的。这2个蛋白的相关性通过凝胶过滤进行测试。细胞共表达该DNA聚合酶IIIα 博士和ε亚基通过离心(5000×g离心,20分钟)收集,悬浮在裂解缓冲液中,超声波破碎,可溶性蛋白是即时LY装载于Superdex 200柱( 图3B)。作为图3C示出,当所收集的级分进行3'-5'核酸外切酶和至DNA聚合酶活性测定法,活性峰在显著检测移动的位置,这表明α 博士是不能胜任的结合大肠杆菌大肠杆菌 ε亚基。证实了这一点,当级分32,36,和52的等分试样,浓缩和分析通过SDS-PAGE。馏分36被发现含有α 博士并成为缺乏大肠杆菌大肠杆菌 ε亚单位,而部分52包含E.大肠杆菌 ε但缺乏α 博士图3D)的。

复制的保真度主要依赖于DNA聚合酶的DNA延伸过程中对错误基地配对辨别的能力。然而,不匹配的脱氧核苷酸可掺入在10 -4的频率20和动作的3'-5'核酸外切酶是必不可少的校对新合成的DNA链。此外,据估计,该DNA编辑行动20级3个数量增加复制的保真度。因此,突变株可以通过损害DNA校对, 例如,通过有条件地表达E.的突变变异构造大肠杆菌 DNA聚合酶IIIε亚基。这可以得到构造ε胜任的变体的结合α但不含其校对活性,并控制生产诱变ε的适当表达系统。使用这种策略,它表明, 大肠杆菌条件诱发ε11,21的致突变的变种大肠杆菌下的突变频率增加。然而,突变频率的无微调被完成通过这种手段。蛋白的共表达可用于获得更好的控制增变菌株。为此目的,我们共同转化大肠杆菌大肠杆菌PBAD-ε和PGOOD1-εD12A,以诱导野生型和ε的诱变D12A变种阿拉伯糖和IPTG,分别的表达。作为一个表型试验,我们确定β葡糖苷酶活性的外观,这是隐蔽-野生型大肠杆菌 (BGL) 大肠杆菌 22,23。能够利用β葡萄糖苷作为碳源(BGL +)自发突变体可以富集或使用液体23或固体介质24中 ,分别隔离。当细胞被诱导表达的D12A突变变体,β葡糖苷酶活性在约收购20代( 图4A)。应当注意的是,观察到在未诱导的细胞( 图4A),很可能是因为在PGOOD1转录控制施加了类似的趋势是相当漏11。然而,当与野生型ε亚基诱导,单独地或与该变体D12A的同时,β葡糖苷酶活动被收购的E.大肠杆菌在中等水平( 图4A)。的的Bgl +突变的β葡糖苷酶的活性被报道的范围40之间3和微米/分钟23。水平确定这里的E.经受εD12A表达大肠杆菌群体要低得多,但应考虑到,我们并没有试图以分离的Bgl +突变体在固体培养基上。

图1
图1.共表达的E.大肠杆菌 DNA聚合酶III催化核心(A)SDS-PAGEE.提取的总蛋白大肠杆菌 TOP10 /的pBAD-α1160/ PGOOD-ε243生长在不存在诱导剂,在只有阿拉伯糖存在下,IPTG的条件,或仅在培养基中补充有两个阿拉伯糖和IPTG(泳道1-4,分别地)。 (B馏分分离经受凝胶过滤从大肠杆菌中提取可溶性蛋白)吸光度(空圆圈)和核酸外切酶活性(实心圆) 大肠杆菌 TOP10过表达α,ε,及E的θ亚基大肠杆菌 DNA聚合酶-Ⅲ。 (C)的 SDS-PAGE上的级分6,12,23,31,以及41(泳道1-5,分别地)报告了在面板B.(D)中的SDS-PAGE分23的浓缩的等分试样,其核酸外切酶活性和电泳的图案记录于面板分别B和C,。转载自生物技术通讯 ,33,孔蒂等人的许可。“pGOODs:大肠杆菌共表达蛋白的新质粒”,1815年至1821年(2011年) 请点击这里查看此图的放大版本。

图2
E的图2.蛋白水解大肠杆菌 DNA聚合酶IIIε亚基。单体(A)降解所揭示的蛋白质印迹从提取E.大肠杆菌 TOP10过表达全长或ε的截短形式;箭头指示的25和19 kDa的预染分子标记的位置。转载自生物化学与生物物理学ACTA蛋白和蛋白组学 ,1794年 ,Bressanin 来自爱思唯尔的权限。“校对亚基蛋白水解控制大肠杆菌 DNA聚合酶III催化核心的集结号”,1606年至1615年(2009年)。 (B)的共表达大肠杆菌的α和ε亚基大肠杆菌 DNA聚合酶III催化核心。的SDS-PAGE共(泳道1和3)和可溶性(泳道2和4)的蛋白质的额外cts数从细胞过度ε亚基分离(泳道1和2),或α和ε亚基(泳道3和4)。

图3
图3.共表达的DNA聚合酶从耐辐射奇球菌大肠杆菌 ,分别IIIα和ε亚基(A)中的SDS-PAGE的总蛋白提取物不诱导(泳道1),或诱导的过表达α 博士 ,ε,或α 博士和ε(泳道2-4,分别地)的细胞中分离的。 (B)的色谱图(空圈,左轴)和级分的蛋白浓度(实心圆,右轴)洗脱,形成一个凝胶过滤柱(的Superdex 200)装载有来自大肠杆菌提取的可溶性蛋白大肠杆菌过量表达α一博士第二ε亚基。 (C)的校对(空圈,左轴)和DNA聚合酶(实心圆,右轴)报告面板B.(D)中的SDS-PAGE的级分32,36,和52的浓缩的等分试样的级分的活性。 请这里查看这个数字的放大版本。

图4
E.图4.突变频率大肠杆菌细胞进行或不共表达野生型和DNA聚合酶IIIε亚基的诱变变体D12A的 。也显示了新的质粒pFINE的地图。 E.( )β葡萄糖苷酶活性大肠杆菌 TOP10不诱导(无茚基)或经受的野生型ε亚基的过表达(ARA),诱变变体D12A(IPTG),或两者​​的野生型和D12Aε亚基(阿糖胞苷+ IPTG)。的β葡糖苷酶活性被报告为世代的函数。 (B)地图新的表达载体pFINE的。该质粒的多克隆位点(MCS)等同于那些存在于相容的pBAD和PGOOD载体,让其中的基因的简便穿梭。

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Discussion

蛋白质可以是内在无序,设有区域的三级结构不局限于构25的数量有限。这些无序的蛋白质通常容易发生聚集25,以及它们的分离和表征可能代表一个困难的任务。 E.的ε亚基大肠杆菌 DNA聚合酶III具有两个不同的结构域26,27,即:i)第N-TER域,轴承的3'-5'外切酶活性,并且在主管结合θ亚基; ⅱ)在C-之三结构域,负责结合到α(聚合酶)亚基。 ε的C之三结构域是已知的,赋予溶解性差到这种蛋白质,促进其聚集。它确实表明,ε-186,该蛋白质缺少的C之三结构域的截短形式,是可溶的,并且可以以高的产率17纯化。然而,当ε与α的相互作用已被定量研究( 例如,以确定αε络合物在K D)中 ,全长ε的纯化是必须的,这意味着一个困难的任务,生化。在该帧中,蛋白质的共表达提供ε到α的结合的定性估计。我们已经表明,αεθ复杂的高收率可以在体内通过共表达( 图1)来获得,绕过ε亚基的溶解性差。值得注意的是,过表达的αεθ复杂的纯化已经报道28,29。的共表达的策略也可用于测试的位点特异性突变的相互作用伙伴之一的插入是否削弱复合物形成。因此,蛋白质的共表达代表了方便和快速的工具来执行的蛋白质 - 蛋白质相互作用的定性测试。还应当指出的是我们的共表达系统依赖于2个不同的诱导物, 即,阿拉伯糖和IPTG。因此,适当的控制可以很容易地检测的蛋白质复合物的形成时, 例如,省略1诱导来自细菌生长培养基( 图1A)上进行。

我们在这里介绍了一个优化程序为共表达的α和E的ε亚基大肠杆菌 DNA聚合酶III。当这种协议被设计和测试,以下参数被确定为以共表达实验的成功是至关重要的:ⅰ)在该感应时的温度; ⅱ)诱导的时间长度;诱导剂(多个)ⅲ)的浓度。特别是,我们无法获得可溶αεθ络合物11从诱导,在37℃的细胞,独立的诱导时间。因此,我们建议,以测试不同的温度的诱导工序中,并且检查蛋白质的过度表达为时间的函数。此外,共表达中差异的并行评估erent E.当面对靶蛋白的中等产量的大肠杆菌菌株可以是帮助。

我们在这里已经报道以测试蛋白的结合来自不同物种的一个代表性实验,我们已经表明,以2异源蛋白的关联快速测试成的混合功能复杂蛋白质共表达是有用的。凝胶过滤色谱法在这里用于评估复合物的形成( 图3)。但是,适当的标签的交互合作伙伴之一的插入可以促进这种评价,让使用亲和捕获方法。以避免与蛋白质-蛋白质相互作用的标记的干扰,该基因编码的相互作用伙伴之一可以插入并联成的pBAD / His和的pBAD / Myc的 -His矢量,分别赋予一个六组氨酸基序在N-和C- -terminus靶蛋白。

大肠杆菌 mutato- [R株功能基因突变的频率比野生型的同行更高。突变菌株的生物技术30, 利息迅速 ​​发展对小说,所需,表型目标的压力。我们这里所提供的证据表明,共表达的野生型和E的诱变ε亚基大肠杆菌 DNA聚合酶III,细菌宿主的突变频率可以被调谐以足够的便利。为了进一步提高该技术的,紧密调节的表达载体所必需的压制尽可能ε亚基的强烈诱变D12A变体的表达。尤其是,这将是很有意思的测试在大肠杆菌中的突变频率大肠杆菌转化的的pBAD-εD12A和PGOOD1-ε,也就是说 ,在配置的替代的是,这里提出。该向量的pBAD确实已知严格的监管12,而这个功能可以保持εD12A的基础浓度帮助在较低水平。

蛋白共同表达的例子在这里报告证明这项技术的多面性。然而,值得注意的是,使用在单个大肠杆菌质粒相容的多个是重要大肠杆菌细胞可以极大地扩展,可采取由蛋白质的共表达所面临的挑战。在最近几年,紧张的工作专门讨论扩展到用于蛋白质共表达质粒相容的剧目。特别是,依靠兼容质粒轴承复制的ColE1,P15A,和pSC101起源的三元系统用于共表达两种细菌和哺乳动物蛋白31。最近,据报的季共表达系统。在这种情况下,13的异源基因的共表达在大肠杆菌中的大肠杆菌共转化4兼容的表达载体,含有该ColE1,P15A,CloDF13和复制32的RSF起源。这种共表达系统成功地用于生产中E.焦酚火球菌 32 大肠杆菌功能活跃的可溶性氢化我。放大我们的二元系统中,我们构建了一个新的表达载体,pFINE含有pSC101复制起点,一个新霉素抗性盒,并与lac调控元件( 图4B)。此质粒含有多接头中存在的pBAD和PGOOD矢量相同,从而有利于基因之间的共表达系统的3种成分的穿梭。虽然pFINE是低拷贝数质粒,其稳定性,发现当在丰富培养基测试是令人满意的。目前,我们正在从事我们的三元共表达系统进一步扩展。为了这个目标,我们构建了含有氯霉素抗性盒一个的pBAD衍生物,并且我们对与一个与ColE1,P15A和pSC101兼容交换复制ColE1起源的方式。这确实是我们认为在单E.使用多个质粒大肠杆菌细胞代表处不满一个强大的工具的蛋白质复合物多种不同的亚基组成的体内挑战的表达。

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Acknowledgments

由Springer和爱思唯尔的许可转载的数字大大确认。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma-Aldrich A1296
Ampicillin Sigma-Aldrich A9518
Chloroform Sigma-Aldrich 288306
EDTA Sigma-Aldrich EDS
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
INT Sigma-Aldrich I8377
IPTG Sigma-Aldrich I5502
KCl Sigma-Aldrich P9541
L-Arabinose Sigma-Aldrich A3256
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670
NaCl Sigma-Aldrich 31434
PMSF Sigma-Aldrich P7626
PNP-gluc Sigma-Aldrich N7006
pNP-TMP Sigma-Aldrich T0251
Tetracyclin Sigma-Aldrich 87128
Trizma base  Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Sigma-Aldrich 95039
Yeast extract Fluka 70161
Acrylamide solution 30% BioRad 161-0158 For gel electrophoresis
Ammonium persolphate BioRad 161-0700 For gel electrophoresis
Glycine BioRad 161-0718 For gel electrophoresis
SDS BioRad 161-0302 For gel electrophoresis
TEMED BioRad 161-0800 For gel electrophoresis
Tris BioRad 161-0719 For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm BioRad 1652089 For electroporation
Centrifuge 5415R Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation BioRad
Microplate Reader 550 Biorad
MiniProtean 3 cell BioRad
Power Supply BioRad
Sonicator 3000 Misonix

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References

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生物化学,第96,
蛋白质的共表达了多方面的好处<em&gt;大肠杆菌</em
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Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte,More

Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (96), e52431, doi:10.3791/52431 (2015).

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