Introduction
過剰発現技術の導入は、低コピー数の酵素の生化学的研究および薬理学的に活性なタンパク質（ 例えば、インスリン）の工業的製造のいずれかをブースト。これらの技術の出現以来、重要な進歩は、組み換えタンパク質の収量と品質を高めるために達成された。さらに、原核生物および真核1,2 3過剰発現システムは、タンパク質バイオテクノロジー、 すなわち、大腸菌の「作業馬」に有用な選択肢を提供し、長年にわたって開発された。 E.の代替プラットフォーム特に、可用性大腸菌は、翻訳後修飾を有する組換えペプチドまたはタンパク質の産生をもたらした。しかし、E.ことが言及されるべきである大腸菌は依然として組換えタンパク質生産のための選択の生物を表す。これは最も関連があることができ、その中のいくつかの要因によるものであると考えた：i）過剰発現システム（発現ベクターおよび菌株のかなりの数の可用性が）E.のために大腸菌 1,2。 ii）の短い世代時間を、高いバイオマス収量、E.の豊かで合成様々なメディアで大腸菌 。 ⅲ）生化学的で、その微生物の遺伝子レベルでのいずれかの容易な操作。 iv）の毒性タンパク質4の産生が可能な株の単離を、 v）が集団レベル5,6で均質誘導を搭載株の構築。また、最近E.生産に適した発現系が示された翻訳後修飾タンパク質の大腸菌が考案2を構成することができる。
現在では、タンパク質の過剰発現は、主にそのhypersynthesis適切なプラスミドにクローニングし、単一の遺伝子を用いて行うことができる単量体またはホモオリゴマータンパク質を得るために使用される。ただし、注意が最近だったEの建設に支払わヘテロオリゴマー複合体2の大腸菌タンパク質の共発現系、 インビボで 、生産に挑戦。興味深いことに、タンパク質の同時発現の初期の実験では、シアノバクテリアのリブロース-1,5-ビスリ ン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ7,8、及びHIV-1の切断型および全長型の関連性の大小サブユニットの種間組立体を取り上げ転写酵素9の逆。これらの先駆的な研究は、タンパク質の共発現は、in vitro再構成における伝統的に強力な代替手段を表していることを実証した。加えて、タンパク質の共発現E.で大腸菌は、非天然アミノ酸2を含有するタンパク質を得るために、翻訳後修飾2を有する異なるタンパク質を生成するために、及び過剰発現した膜タンパク質2の収量を増大させるために使用した。また、ツールとしてのタンパク質共発現の電位はEに付与するコリが競うタンパク質分泌におけるNCEは、アクティブな捜査2の下にある。
E.におけるタンパク質共発現の二つの主な戦略大腸菌を追求することができます：ⅰ）単一のプラスミドの使用が過剰発現されることが異なる遺伝子をホストする。 ii）は、単一セル内の複数のプラスミドの使用は、標的タンパク質を同時発現する。タンデムプロモーター/オペレーター要素を含む特定のプラスミドを共発現10のために構築されたが、最初のケースでは、プラスミドの選択の基準は、従来の単一のタンパク質の過剰発現実験のものと異ならない。この最初のアプローチは、したがって、非常に簡単です。しかし、異なるタンパク質を共発現する単一プラスミドの使用は、二つの主要な困難に直面していることが言及されるべきである：i）の共発現されたタンパク質の数を制限するホストされる遺伝子の数を有するベクトルが増加すると、分子量;複数の遺伝子は、単一プロモーターの制御下にクローニングされた場合ii）は、極性がdecreasできプロモーターから遠位の遺伝子の発現を電子。シングルE.でデュアルまたは複数のプラスミドの使用大腸菌細胞は、従って、プラスミドの適格な組み合わせに制約を課し、選択したベクターとの適合性を達成しなければならない。しかし、この第2の共発現戦略は、ベクターの分子量を含むという利点を備えており、極性が制限される。我々は最近、同時発現プラスミド11との間の遺伝子の往復を容易にするように設計されたタンパク質の共発現系を構築した。特に、我々はPGOODベクトルシリーズを構築し、関連する機能には、そのうちのは、i）p15A複製起点は、市販のベクター（ 例えば、のpBADシリーズ12）のColE1起点を含むとPGOODプラスミドの互換性を提供する。 ⅱ）テトラサイクリン耐性カセット。 ⅲ）LACの存在は調節エレメント、 すなわち、プロモーター-オペレーター（O 1）夫婦とのlacIの由来q遺伝子 。適切なのpBAD-PGOODのカップルを使用して、我々はEの触媒コアを過剰発現することができました三つの異なるサブユニット、 すなわち α（5'-3 'ポリメラーゼ）、ε（3'-5'エキソヌクレアーゼ）とθ（εを安定化する）13から構成される大腸菌 DNAポリメラーゼIII、。特に、我々はαεθ複合体の共発現はE.のほかに厳密に依存することを実証したIPTGおよびアラビノースの両方の大腸菌培養培地、PGOODとのpBAD、それぞれ（ 図1A）からトリガ過剰発現。
今回の報告では、タンパク質の共発現を効率的にタンパク質複合体のサブユニットの乏しい溶解性にリンクされて困難を解決することができる方法を示しています。さらに、我々は、in vivoでのタンパク質相補性試験を行うことができ、我々は最終的にE.で調整変異頻度のタンパク質の共発現の使用について報告する方法を示しコル私は。この目的のために、私たちはそれぞれのケーススタディの関連する例を説明するために、適切なPGOOD-のpBADのカップルを使用していました。
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Protocol
E.の単離大腸菌共同形質転換体
- 適切なE.のエレクトロコンピテント細胞を準備大腸菌株は形質転換される。選択した菌株の単一コロニーを1mlのLB培地（トリプトン、酵母エキス、10時のNaCl、5、および10gのそれぞれ/ L）に移し、180rpmでの条件を振盪しながら37℃でインキュベートする。新鮮なLB培地25ml中で500し、37℃で培養物をインキュベートする：前培養1希釈する。
- 対数期（OD 0.6）で20分間、5000×gで）で細胞懸濁液を遠心分離し、元の培養体積の半分に10％（v / v）の氷冷滅菌グリセロール、水にペレットを再懸濁する。たびに再懸濁体積を半分に、この手順を4回繰り返します。最後に、グリセロール/水にペレットを再懸濁し、50μlのアリコート中の細胞懸濁物を分割する。 6ヶ月までのCまで-80℃でアリコートに保管してください。
- 0.5 mMのEDTAを添加し、滅菌水で所望のプラスミドに溶解する。 IC上に解凍電子エレクトロコンピテント細胞のアリコートとベクトルの適切な量（2.5〜NG）と混合。エレクトロポレーションに適した0.1cmキュベットに混合物を分配し、1.8 kVのを適用します。
- 直ちに（w / vグルコース0.2％、10のMgCl 2、2.5mMのKClを補充したLB培地）を、振とうしながら1時間インキュベートSOC培地1ml中にエレクトロポレーションした細胞を転送し、最終的に含むペトリ皿に100μlのアリコートを転送する適切な抗生物質を含むLB寒天。 37℃でO / Nインキュベートします。
- ペトリ皿上で単一のコロニーをストリーキングによって形質転換体を精製する。
- 一次形質転換体のエレクトロコンピテント細胞を準備し、繰り返しをさらにプラスミドで形質転換するために1.1から1.5のステップ。
- 共同形質転換体のグリセロールストックを準備します。適切な抗生物質を添加したLBで単一コロニーを移し、振とうを37℃でインキュベートし、対数期（0.6 OD）遠心分離機20分間5000×gで細胞懸濁物で。 R培地を15％（v / v）のグリセロールを含むLB-抗生物質ペレットをesuspend。一定分量で分注し、で保存して - 80°C。
2. Eのαおよびεサブユニットの共発現大腸菌のDNAポリメラーゼIII
- 無菌ループで適切なストレイングリセロールストックを少量転送（ 例えば、TOP10 / PGOOD-ε243及びTOP10 / PGOOD-ε243-θ/pBADα1160、 図1を参照）LB培地と抗生物質を含むペトリ皿に。ペトリ皿に細胞懸濁液の乾燥をしましょう、とストリークは、細胞は、液滴。 37℃CO / Nでインキュベートする。
- 無菌の爪楊枝、LB-抗生物質培地1mlに単一コロニーを使用して転送、。 37℃で8時間インキュベートする。新鮮な培地に500と15時間30℃でインキュベート：前培養1希釈する。
- IPTG、アラビノース、またはアラビノースおよびIPTGを追加し、1 mMの各。 2.5時間30℃でインキュベートする。細胞を回収し、-20℃でのペレットを保存する。
- 溶解緩衝液（50mMトリス-HCl、50mMのNaCl、1mMのEDTA、2.5mMのジチオスレイトール、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、pH8）中で再懸濁し、氷上に解凍ペレット。静かに冷たいガラスポッターと細胞懸濁物を均質化する。
- 15秒の冷却間隔（4サイクル）、続いて15秒間15 W、で超音波処理。
- 可溶性画分を回収し、4℃で、20分間、10,000×gでの総タンパク質抽出物を集める。
- SDS-PAGE（12.5％アクリルアミド）各可溶性タンパク質抽出物のアリコートにより分析する。この目的のために、H 2 O60μlのローディングバッファー（250mMのトリス-HClを20μlを含むエッペンドルフチューブにそれぞれの可溶性タンパク質抽出物20μLを移す6.8、10 mMのβメルカプトエタノール、10％（w / v）のSDS、50％（v / v）グリセロール、0.25％ブロモフェノールブルー（w / vの））と、5分間沸騰させる。ロード各サンプルの18μlの約1.5時間、140 Vで電気泳動を行う。
3. Deinococのαサブユニットの同時発現デュランスDNAポリメラーゼIIIおよびεEのサブユニットCUS 大腸菌のDNAポリメラーゼIII
- Eの前培養を準備LB-アンピシリンテトラサイクリン培地の1ミリリットル中に大腸菌株TOP10 /のpBAD-αDR / PGOOD-ε243し、37℃で8時間インキュベートする。新鮮な培地中で千をし、37℃でO / Nインキュベート：1希釈する。
- アラビノース及びIPTG、1mMのそれぞれ3時間誘導した後、3時間37℃でインキュベート、新鮮な培地200mlに100：1に希釈する。細胞を採取し、-20℃でペレットを保存する。
- 50mMトリス - 塩酸pHが8、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのPMSFでペレットを再懸濁する。ホモジナイズし、2.4と2.5で説明したように、細胞を破壊。
- すぐに細胞が20分間万×gで溶解物遠心する。ペレットを捨てる。ペーパーフィルターの3層を装備したブフナー漏斗で上清をフィルタリングします。穏やかな真空を適用します。過剰な泡立ちを避けるために、濾過の間、氷上で真空三角フラスコに保つ。
- ブラッドフォード14に記載のタンパク質濃度を決定します。
4.ゲルろ過クロマトグラフィー
- 50mMトリス-HCl、150mMのNaCl、1mMのEDTA、pHをカラムに負荷8の可溶性タンパク質抽出物を有する水ジャケット付き16x70（200）ゲルろ過カラムを平衡化する。最適な解像度の場合は、1ミリリットルサンプルループを使用しています。 /分0.6ミリリットルでクロマトグラフィーを行います。全体で4℃でカラム温度を保つ。
- 0.9ミリリットル画分を回収し、SDS-PAGEによってそれらを分析する。ローディングバッファーのH 2 Oおよび20μlの（250mMのトリス-HCl pH6.8の、10mMのβメルカプトエタノール、（v）のSDS、50％（重量/ 10％の60μLを含むエッペンドルフチューブに移し、各関連する画分を20μl v / v）グリセロール、0.25％（w / v）のブロモフェノールブルー）で5分間沸騰。ロード各サンプルの18μlの約1.5時間、140 Vで電気泳動を行う。
- 3'-5 'エキソヌクレアーゼと96我々の各画分のDNAポリメラーゼ活性を決定するマイクロプレートLL。基板15としてチミジン5'-一リン酸p-ニトロフェニルエステル（p個の NP-TMP）を使用して、エキソヌクレアーゼ活性をアッセイする。 PPX（ピロホスファターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ）、酵素結合アッセイ16を使用して、DNAポリメラーゼ活性を推定し、2-（4-ヨードフェニル）-3-（4-ニトロフェニル）-5-フェニル-2H-テトラゾリウムクロリド（INT）電子受容体16として。
集団E.の共発現する野生型εサブユニットの5変異解析大腸菌 DNAポリメラーゼIIIおよび変異原εD12Aバリアント
- Eの単一コロニーを転送LB-抗生物質培地1mlにεをpBAD-とPGOOD1-εD12A11ベクターを含む大腸菌 TOP10。 37℃でO / Nインキュベートします。
- 、新鮮な培地を含む3フラスコ（10ミリリットル）で250適切な誘導物質（アラビノース、IPTG、またはアラビノース及びIPTG、1mMの各）を追加し、37℃でインキュベート：前培養1に希釈8時間。パラレル非誘導培養物中に準備します。
- 1ミリリットルのアリコートを収集し、その後1希薄：新鮮な培地（10ミリリットル）を含む新しいフラスコ中に500を適切な誘導物質を補給したりしない。 37℃でO / Nインキュベートします。
- 繰り返します5.2と5.3ステップと1ミリリットルのアリコートを収集します。
- 世代数は、各培養物で発生したかどうかを判別します。 LBプレート、接種材料と文化の適切な連続希釈液100μlに移す。 37℃でO / Nインキュベートします。 （Cを記録）の成長の終わりにLBプレート上のコロニーをカウントし、接種物中に存在する細胞の数の対数を計算する（ ログI）と文化。世代数 を決定するには、式を使用します。（Cログ- 私のログを）/0.301。
- 20分間5000×gで遠心分離し、50mMのTris-HCl pH7.6で、50mMのNaCl 1 mlに細胞を再懸濁。細胞を透過するために、20秒間クロロホルムと渦の2〜3滴を追加します。
- β-を決定基板としてのpニトロフェニルβ-D-グルコピラノシド（PNPGluc）を用いて96ウェルマイクロプレートの各アリコートのグルコシダーゼ活性、。各ウェルに透過性細胞を100μlおよび100μlの基質（16ミリグラム/ H 2 O中のmlストック溶液）を加える。ウェル内の気泡を避けるように注意してください。マイクロプレートリーダーおよび適切なフィルターを使用して、420nmで吸光度を読み取る。
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Representative Results
Eのεサブユニット大腸菌のDNAポリメラーゼIIIは、243個のアミノ酸からなり、残基187から243が17を削除しない限り、乏しい溶解17,18を備えています。しかし、我々は以前に、完全長のα、εおよびθサブユニットの共発現は、可溶性DNAポリメラーゼIII触媒コア（ 図1）が得られることを示している11。 （ 図1A）は、それぞれ、i）のαおよびεサブユニットの過剰発現は、独立して、アラビノース及びIPTGによって制御することができ、特に、次のpBAD-PGOOD共発現系を使用して、我々は以下のことを証明したii）の完全長のεサブユニットはE.から単離された可溶性タンパク質抽出物中で検出することができる大腸菌細胞はε、α、θ及びゲルろ過（ 図1B）にかけ過剰発現する。この場合、エキソヌクレアーゼ活性は、3つの主要なピーク（ 図1B、黒丸）に分配し、そしてピークはフラクショナルに中心ン23はαεθ触媒コア（ 図1Cおよび1D）を含むことが示された。 εの安定性は、αとθに結合すると大幅に増加している。我々は以前Eにフルレングスのεを過剰発現した場合大腸菌は 、自由ε低量の可溶性タンパク質をウェスタンブロッティングによって検出された19（ 図2A）を抽出する。同じ条件で、私たちは常にε-186をその中εの形（ε-234、ε-228、ε-213、またはε-186）を、切り捨て無料のC-TERの高い量を検出し、それを注意することは興味深いことです行って良い19（ 図2A）。また、εのC末端ドメインのタンパク質分解がαに結合し、θサブユニット19によって阻止されることを示した。 εの溶解性に共発現の効果は、もしあれば、容易に試験することができる。 図2Bに報告されているように、可溶性タンパク質抽出物を過剰発現する細胞から単離されたα、ε、またはαおよびεは、SDS-PAGEにより分析し、そして便利に、総タンパク質抽出物と比較することができる。この場合には、電気泳動分析は、αの共発現が大幅に可溶性タンパク質抽出物中のεの濃度を高めながら（レーン3および4を比較し（レーン1および2を比較されたい）を単独で過剰発現された場合、εサブユニットが乏しい溶解性を特徴としていることを示し）。
共発現はまた、種間の相補性試験を行うために使用することができる。したがって、我々はそれがグラム+およびグラムの複製機械に属するサブユニット間の相互作用を評価することは興味深いかもしれないと思った- 。細菌デイノコッカスラジオデュランスは、大きなαサブユニット（1335アミノ酸、150 kDaの）をフィーチャーし、 グラム陽性細菌であると197アミノ酸を含有する推定上のεサブユニット。興味深いことに、D.ラジオデュラン εサブユニットは、そのE.におけるC末端ドメインの存在を欠いている大腸菌の E.間のそれにもかかわらず、同一性および相同性大腸菌およびD.ラジオデュラン εサブユニットは、それぞれ29％及び59％に等しい（領域1~178を考慮すると、D.ラジオデュランス座標 ）。 Dの能力をアッセイするEを結合におけるデュランポリメラーゼ IIIαサブユニット（DR、α）大腸菌 εサブユニットは、我々はのpBADベクターに博士を αをコードする合成遺伝子をクローン化していると我々はE.同時形質転換しているのpBAD-αDrとPGOOD-εと大腸菌 。培養培地へのIPTGおよびアラビノースの同時添加は、Drとε（ 図3A）を αの共発現をトリガします。これらの2つのタンパク質の結合は、ゲル濾過することにより試験した。細胞は超音波処理によって破壊し、溶解緩衝液中に懸濁IIIαDrとεサブユニットは、遠心分離（5000×gで、20分間）によって回収したDNAポリメラーゼを、共発現し、可溶性タンパク質は、即時たlyがスーパーデックス200カラム（ 図3B）にロードした。 図3Cに示すように回収した画分は、3'-5 'エキソヌクレアーゼ及びDNAポリメラーゼ活性アッセイに供したときに、アクティビティのピークが著しくαDrはE.結合の管轄ではないことを示唆し、位置をずらしで検出された大腸菌 εサブユニット。画分32,36、および52のアリコートをSDS-PAGEにより濃縮し、分析したときにこれを確認した。フラクション36は、α 博士含むこととE.を欠いていることが判明した大腸菌 εサブユニットはフラクション52はE.を含有し 、一方ε 大腸菌しかし博士 （ 図3D）の αを欠いていた。
複製忠実度は、主にDNA伸長中に誤った塩基対を差別するDNAポリメラーゼの能力に依存している。それにもかかわらず、ミスマッチのデオキシヌクレオチドは10 -4周波数20、およびアクションに組み込むことができる3'-5 'エキソヌクレアーゼの新たに合成されたDNA鎖を校正することが不可欠である。さらに、このDNA編集アクションは大きさ20の3桁複製忠実度を増大することが推定された。したがって、突然変異誘発株は、条件付きでEの変異原性変異体を発現させることにより、例えば 、DNAの校正を損なうことによって構築することができる大腸菌のDNAポリメラーゼIIIεサブユニット。これは、αが、そのプルーフリーディング活性を欠く結合、および適切な発現系による変異原εの産生を制御するε有能の変異体を構築することができる。この戦略を使用して、それがあることが示されたE. ε11,21の変異原性変異体を誘導する条件下で、 大腸菌突然変異頻度が増加する。しかし、突然変異頻度のない微調整はこの手段によって達成されなかった。タンパク質の共発現は、突然変異誘発株のより良好な制御を得るために使用することができる。この目的のために、我々はE.同時形質転換と大腸菌をpBAD-εとPGOOD1-εD12A、それぞれ、野生型及びアラビノースおよびIPTGとεの変異原D12A変異体の発現を誘導するためである。野生型E.中- （のBgl）表現型のテストとして、我々は不可解であるβグルコシダーゼ活性の出現を、決定大腸菌 22,23。炭素源（のBgl +）としてβグルコシドを利用することができる自発的な変異体は、それぞれ、液体23または固体培地24を用いて、濃縮または単離することができる。細胞はD12A変異原性変異体を発現するように誘導したとき、βグルコシダーゼ活性を約において取得された20世代（ 図4A）。これは、同様の傾向が転写制御がPGOOD1に作用するので、ほとんどの場合、非誘導細胞（ 図4A）、観察されたことに留意すべきであることは11かなり漏出である。それにもかかわらず、野生型のεサブユニットを誘導し、単独で、またはD12A変異体と組み合わせて、βグルコシダーゼアクティビティは、Eに買収されました中程度のレベル（ 図4A）での大腸菌 。のBgl +突然変異体のβグルコシダーゼ活性は、3〜40μM/分の23の範囲であると報告された。レベルはEにここで決定εD12Aの発現に供大腸菌集団は非常に低いが、それは我々が固体培地上のBgl +突然変異体を単離することを試みていないことを考慮すべきである。
図1. E.の共発現大腸菌 DNAポリメラーゼIII触媒コア 。 （A） 大腸菌から抽出した全タンパク質のSDS-PAGEのみアラビノースの存在下で、誘導物質の非存在下で増殖させた大腸菌 TOP10 /のpBAD-α1160/ PGOOD-ε243、IPTGののみ、または培地中のアラビノース及びIPTG（それぞれレーン1-4、）の両方で補充。 （BE.から抽出されたゲル濾過可溶性タンパク質に付すことにより単離された画分の）吸光度（白丸）とエキソヌクレアーゼ活性（黒丸） 大腸菌 TOP10は、Eのε、α、θサブユニットを過剰発現大腸菌のDNAポルIII。 （それぞれレーン1-5）画分6、12、23、31の（C）SDS-PAGE、及び41エキソヌクレアーゼ活性及び電気泳動分画23の濃縮アリコートの（D）SDS-PAGEパネルBに報告パターンは、それぞれ、パネルBおよびCに報告されている。 「pGOODs： 大腸菌でのタンパク質の共発現のための新しいプラスミド」。バイオテクノロジーレターズ 、33、コンテらから許可を得て転載。、1815年から1821年（2011年） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
E.図2.タンパク質分解大腸菌 DNAポリメラーゼIIIεサブユニット。単量体の（A）分解E.から抽出したタンパク質のウエスタンブロット法によって明らかに大腸菌 TOP10はεの全長または切断型を過剰発現する。矢印は25と19 kDaの前染色分子マーカーの位置を示す。 。BiochimicaらBiophysicaアクタタンパク質およびプロテオミクス 、1794、Bressanin らからエルゼビアから許可を得て転載：「校正サブユニットのタンパク質分解は、 大腸菌 DNAポリメラーゼIII触媒コアの組立を制御」、1606から1615年（2009年）。 （B）Eのαおよびεサブユニットの共発現大腸菌 DNAポリメラーゼIII触媒コア。合計のSDS-PAGE（レーン1および3）および可溶性（レーン2および4）タンパク質エクストラεサブユニット（レーン1および2）、またはαおよびεサブユニット（レーン3および4）を過剰発現する細胞から単離されたカラット。
図それぞれ3. デイノコッカス·ラジオデュランと大腸菌由来のDNAポリメラーゼIIIαおよびεサブユニットの共発現、。 （レーン1）、誘導された、またはα 博士過剰発現するように誘導され、ε、またはDrとε（それぞれレーン2-4）αていない細胞から単離された全タンパク質抽出物の（A）SDS-PAGE。 （B）のクロマトグラム（白丸、左軸）、画分のタンパク質濃度（黒丸、右軸）ゲルろ過カラム（スーパーデックス200）を形成する溶出はE.から抽出された可溶性タンパク質をロード大腸菌は、α博士過剰発現NDεサブユニット。 （C）校正（白丸、左軸）およびDNAポリメラーゼ（黒丸、右軸）パネルB（D）のフラクション32、36の濃縮アリコートのSDS-PAGE、および52で報告された画分の活動。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
E.の図4.突然変異頻度大腸菌の細胞は、野生型とDNAポリメラーゼIIIεサブユニットの変異原性変異型D12Aの共発現を受けるかどうか 。新しいプラスミドpFINEのマップも示されている。 E.の（A）βグルコシダーゼ活性大腸菌 TOP10（いいえIND）誘発されないか、または野生型のεサブユニットの過剰発現（が施されていないARA）、変異原性、変異体D12A（IPTG）、または両方の野生型およびD12Aεサブユニット（ARA + IPTG）。 βグルコシダーゼ活性は、世代の関数として報告される。新しい発現ベクターpFINEの（B）地図。このプラスミドの多重クローニング部位（MCS）は、それらの間の遺伝子の容易なシャトル化させること、互換性のpBADおよびPGOODベクター中に存在するものと同じである。
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Discussion
タンパク質は、その三次構造の立体配座25の限られた数に制限されていない領域が特徴、本質的に無秩序であることができる。これらの無秩序のタンパク質は、通常、25を凝集する傾向があり、それらの単離および特徴付けは困難なタスクを表すこと。 Eのεサブユニット大腸菌 DNAポリメラーゼIIIの機能つの異なるドメイン、すなわち26,27、は、i）N-スタドメインを、3'-5 'エキソヌクレアーゼ活性を有する、およびθサブユニットの結合の管轄。 ⅱ）C-TERドメイン、α（ポリメラーゼ）サブユニットへの結合に関与。 εのC-スタドメインの凝集を促進し、このタンパク質に乏しい溶解性を付与することが知られている。これは、実際にε-186、C-スタドメインを欠くタンパク質の切断型は、可溶性であり、かつ高い収率17で精製することができることが実証された。しかし、αとεとの相互作用を定量的に検討する必要があるとき（ 例えば、αε複合体のK Dを決定するために）、完全長εの精製が困難な生化学的タスクを意味する、必要とされる。このフレームでは、タンパク質の共発現は、αするεの結合の定性的な推定を提供します。我々はαεθ複合体の高い収率がεサブユニットの乏しい溶解性をバイパスして、共発現（ 図1）によってインビボで得ることができることを示した。注目すべきことに、過剰発現αεθ複合体の精製は、28,29報告されている。共発現戦略は相互作用パートナーのいずれかの部位特異的変異の挿入が複合体形成を損なうかどうかを試験するために使用され得る。したがって、タンパク質の共発現は、タンパク質 - タンパク質相互作用の定性的なテストを実行するための便利で迅速なツールを表す。また、我々の同時発現系は2つの異なる誘導物質、 すなわち、アラビノース及びIPTGに依存していることに留意すべきである。 例えば、細菌増殖培地から（ 図1A）は、1インデューサーを省略し、タンパク質複合体の形成を試験する場合、したがって、適切なコントロールを容易に行うことができる。
私たちは、Eのαおよびεサブユニットの共発現のためにここに最適化された手順を提示大腸菌 DNAポリメラーゼIII。このプロトコルを設計し、試験したとき、以下のパラメータは、共発現実験の成功に重要であると同定された：誘導が行われる時のi）温度、 II）誘導の時間の長さ。誘導因子（単数または複数）のiii）の濃度。特に、我々は、独立して、誘導時間、37℃で誘導された細胞から複合体11αεθ可溶性得ることができなかった。そこで、誘導ステップの異なる温度をテストするために、時間の関数としてのタンパク質の過剰発現を確認することを示唆している。差分で共発現のほかに、並列評価erent E.標的タンパク質の中程度の収率に直面したときに、大腸菌株は助けになることができる。
我々は、代表的な実験は、異なる種からのタンパク質の結合を試験するために実施し、我々は、タンパク質の共発現は急速にハイブリッド機能的複合体に2異種タンパク質の会合を試験するのに有用であることが示されている、ここで報告している。ゲルろ過クロマトグラフィーは、複合体形成（ 図3）を評価するために、ここで使用された。しかし、相互作用パートナーのいずれかの適切なタグの挿入はアフィニティー捕捉法の使用をさせる、この評価を容易にすることができる。タンパク質-タンパク質相互作用を持つタグの干渉を避けるために、相互作用パートナーのいずれかをコードする遺伝子は、それぞれN末端 およびCにヘキサヒスチジンモチーフを付与する、のpBAD / HisおよびのpBAD / Mycの -Hisベクターに並列に挿入することができ標的タンパク質の末端。
大腸菌 mutatoR株はその野生型対応物よりも高い変異頻度を備えています。ミューテーター株は急速に小説、所望の表現型に向けて標的株を進化させるために、例えば 、バイオテクノロジー30において重要である。ここでは共発現する証拠野生型およびEの変異原εサブユニットを提供大腸菌 DNAポリメラーゼIII、細菌宿主の突然変異頻度は、十分な利便性を調整することができる。さらに、この技術を改善するために、しっかりと調節された発現ベクターは、εサブユニットの変異原性を強くD12A変異体の発現を可能な限り抑制するために必要である。特に、 大腸菌の突然変異頻度をテストするために興味深いものになるだろうのpBAD-εD12AとPGOOD1-εで形質転換した大腸菌は 、 すなわち、そのへの構成の選択肢はここに提示した。のpBADベクターは、実際にしっかりと12を調節することが知られており、この機能はεD12Aの基礎濃度を維持するのに役立つ可能性が低レベルで。
ここで報告されたタンパク質の共発現の例は、この技術の多面性を証言する。しかし、単一のEに互換性プラスミドの多数を使用していることに留意することが重要である大腸菌細胞が大幅にタンパク質の同時発現によって取り込まれ得る課題を拡張することができる。近年では、強烈な仕事は、タンパク質の同時発現のために使用される互換性のあるプラスミドのレパートリーを拡大するに専念した。具体的には、ColE1複製、p15A不、およびはpSC101起点を有するプラスミド互換頼る三成分系は、共発現のいずれかの細菌および哺乳動物のタンパク質31に使用した。最近、四級共発現系が報告された。この場合、13異種遺伝子を大腸菌内で共発現させた大腸菌複製32のColE1複製、p15A不、CloDF13、及びRSF起点を含む、4適合する発現ベクターで同時形質転換。この共発現系が正常で製造したE.は、パイロコッカスフリオサス 32から機能的に活性な水溶性ヒドロゲナーゼIを大腸菌 。私たちのバイナリシステムを拡大するために、我々は、レプリケーションのはpSC101起点、ネオマイシン耐性カセット、およびlac調節エレメント（ 図4B）を含む、新たな発現ベクター、pFINEを構築した。このプラスミドは、このように共発現システムの3つのコンポーネント間の往復遺伝子を促進する、のpBADとPGOODベクターにおいて同じポリリンカー存在が含まれています。 pFINEは、低コピー数のプラスミドであるが、富栄養培地中で試験した場合に、その安定性が良好であることが見出された。当社は、現在、私たちの三元共発現システムの更なる拡大に従事している。この目的のために、我々はクロラムフェニコール耐性カセットを含むのpBAD誘導体を構築し、私たちはのColE1、をp15A、とはpSC101と互換性のあるものにColE1複製起源を交換する方法である。これは、単一のE.で複数のプラスミドの使用することを確かに私たちの意見です。 大腸菌細胞の担当者異なるサブユニットの多数から構成されるタンパク質複合体の生体内で表現に挑戦するための強力なツールが憤慨。
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Acknowledgments
数字を再印刷するスプリンガーとエルゼビアの許可が大幅に認められている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
References
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