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Biology

단백질 공동 식의 다각적 인 장점에 Published: February 5, 2015 doi: 10.3791/52431

Introduction

과발현 기술의 도입은 낮은 카피 수 효소의 생화학 적 연구와 약리학 적 활성 단백질 (예를 들면, 인슐린)의 산업 생산를 부스팅. 이러한 기술의 출현 때문에 상당한 진보는 재조합 단백질의 수율 및 품질을 증가시키기 위해 달성되어왔다. 또한, 원핵 및 진핵 3 1,2- 과발현 시스템은 단백질 공학, 즉, 대장균 "일꾼"유용한 대안을 제공 년에 걸쳐 개발되었다. E. 대안 플랫폼 특히, 가용성 대장균 재조합 펩타이드 또는 번역 후 변형을 함유하는 단백질의 제조되었다. 그러나, 언급되어야 E. 대장균은 여전히 재조합 단백질 생산을위한 선택의 유기체를 나타냅니다. 이 가장 관련성이있을 수있는 여러 요소 중에서,에 기인고려 : ⅰ) 과발현 시스템 (발현 벡터 및 균주 확실히 다수의 가능 여부)을위한 E. 대장균 1,2; E. II의) 짧은 생성 시간 및 높은 수율의 바이오 매스, 풍부하고 합성 다양한 미디어에서 대장균; ⅲ) 생화학에서이 미생물의 유전자 수준에서 어느 손쉬운 조작; ⅳ) 4 독성 단백질의 생산이 가능한 균주의 분리; V) 인구 레벨 5,6에 균일 유도를 갖춘 균주의 건설. 또한, 최근에 E. 그 생산에 적합한 발현 시스템을 도시 한 번역 후 변형은 단백질의 대장균이 고안을 구성 할 수있다.

현재, 단백질의 과발현은 주로 그의 hypersynthesis 적절한 플라스미드에 클로닝 한 유전자와 함께 수행 될 수 단량체 또는 호모 올리고머 단백질을 얻기 위해 사용된다. 그러나 관심은 최근에 있었다E. 건설에게 지급 콜라이 단백질의 공동 발현 시스템, 헤테로 올리고머 성 복합체 (2)의 생체 내, 생산 도전. 흥미롭게도, 단백질의 공동 표현의 초기 실험은 시아 노 박테리아 리불 로스 -1,5- 비스 포스페이트 카르 복실 / 시게나 제 7,8의 크고 작은 소단위의 간 종 조립 및 HIV-1의 절단 및 전체 길이 형태의 관계를 해결 효소 구 역. 이러한 선구적인 연구는 단백질의 공동 발현이 체외 재구성 전통에 대한 강력한 대안을 나타낸다는 것을 보여 주었다. E.에서 또한, 단백질의 공동 발현 대장균은 천연 아미노산이 함유 단백질을 얻기 위해, 번역 후 변형이 담지 다른 단백질을 생산하고, 과발현 된 막 단백질 (2)의 수율을 증가시키기 위해 사용되었다. 또한, 단백질과 같은 공구의 공동 발현의 전위를 부여하는 E. 대장균 경쟁단백질 분비 후부 활성 조사 2 중입니다.

E. 단백질의 공동 표현의 두 가지 주요 전략 대장균 추구 할 수 있습니다 다른 유전자를 호스팅 할 하나의 플라스미드의 사용이 과발현되는 I); ⅱ) 단일 셀에서 여러 플라스미드를 사용하는 목적 단백질의 공동 발현한다. 탠덤 프로모터 / 운영자 특정 원소를 함유하는 플라스미드가 공동 - 식 (10)에 대해 구축되었다하더라도 첫 번째 경우, 플라스미드의 선택을위한 기준은, 전통적인 단일 단백질 과발현 실험의 것과 다르지 않다. 첫 번째 방법은 따라서 매우 간단합니다. 그러나, 다른 단백질을 공동 발현하는 하나의 플라스미드를 사용하는이 두 가지 문제에 직면 언급한다 : ⅰ) 공동 발현 된 단백질의 수를 제한 호스팅 유전자 수가 벡터 증가의 분자량; ⅱ) 다수의 단일 유전자 프로모터의 제어하에 복제 될 때, 극성을 수 decreas원위 프로모터 유전자 발현 전자. E. 이중에서 단일 또는 다수의 플라스미드를 사용 대장균 세포 따라서 플라스미드의 자격이 조합에 제약을 부과, 선택의 벡터의 호환성을 수행 할 수 있습니다. 그러나,이 두 번째 공동 발현 전략은 벡터의 분자량을 포함하는 장점을 특징으로하고, 극성을 제한한다. 우리는 최근 공동 발현 플라스미드 (11) 유전자의 셔틀 링을 용이하게하기위한 단백질의 공동 발현 시스템을 구축 하였다. 특히, 우리 PGOOD 벡터 시리즈 지어진 중요한 특징은 어느이다 : ⅰ) 복제 p15A 오리진, 상업적 벡터 (예, pBAD 시리즈 12) ColE1 기원을 함유 함께 PGOOD 플라스미드의 호환성을 제공하는 단계; ⅱ) 테트라 사이클린 내성 카세트; ⅲ) 락의 존재는 규제 요소, 즉, 프로모터 연산자 (O 1) 부부와의 lacI을 - 유래 Q 유전자. 적절한 pBAD-PGOOD 커플을 사용하여, 우리는 E.의 촉매 코어를 과발현 할 수 있었다 세 개의 다른 소단위으로 구성 대장균 DNA 폴리머 라제 III, 즉, α (5'-3 '중합 효소), ε (3'-5'엑소 뉴 클레아 제) 및 (안정화 ε) 13 θ. 특히, αεθ 복합체의 공동 발현 E.에 더하여에 엄격히 의존 시연 IPTG와 아라비 모두 대장균 배양액 PGOOD 및 pBAD 각각 (도 1a)에서 트리거링 과발현.

본 보고서에서, 우리는 단백질의 공동 발현이 효율적으로 단백질 복잡한 서브 유닛의 가난한 용해도에 연결된 어려움을 해결할 수있는 방법을 보여줍니다. 또한, 어떻게 생체 단백질 보완 테스트에서 행할 수 보여, 우리는 마침내 E. 튜닝 주파수 변이 단백질로 공동 발현의 사용에 대한 보고서 안부내가. 이를 위해, 우리는 각각의 사례 연구의 관련 사례를 설명하기에 적합 PGOOD-pBAD 커플을 사용했다.

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Protocol

E. 1. 분리 대장균 공동 형질 전환

  1. 해당 E.의 전기 유능한 세포를 준비 대장균 균주를 변환 할 수 있습니다. LB 배지 1 ㎖ (트립 톤, 효모 추출물, (10)에서의 NaCl, 5, 10g / 각각 L,) 선택의 변형의 단일 식민지, 그리고로 전송 180 rpm으로 진탕 조건에서 37 ° C에서 배양한다. 사전 문화 (1) 희석 : 500 신선한 LB 배지 m​​l의 25에서 37 ° C에서 문화를 품다.
  2. 로그 상 (0.6 OD)에서 20 분 동안 5,000 XG)에서 세포 현탁액을 원심 분리하고 원래 문화 볼륨의 절반에 10 %, v / V를 얼음처럼 차가운 멸균 글리세롤 물에 펠렛을 재현 탁. 마다 부유 양을 절반으로,이 단계를 4 회 반복한다. 마지막으로, 글리세롤 / 물에 펠렛을 재현 탁하고 50 ㎕의 분취 액에 세포 현탁액을 나눈다. 6개월에 -80 ° C 최대의 분량을 저장합니다.
  3. 0.5 mM의 EDTA 보충 멸균에서 원하는 플라스미드를 녹여. IC에 해동전자 전기 - 반응성 세포의 분취 량과 벡터의 적절한 양 (2.5-5 NG)와 혼합한다. 전기에 적합한 0.1 cm 큐벳에 혼합물을 분배하고, 1.8 kV의 적용.
  4. 즉시 SOC 배지 1 ㎖로 일렉트로 세포를 트랜스퍼 (LB 배지 w 0.2 % / V 포도당 된 10 mM의 MgCl 2, 2.5 mM의 KCl을 보충), 진탕하에 1 시간 동안 배양하고, 마지막으로 함유하는 페트리 접시에 100 μL 씩 전송 적절한 항생제 LB 한천. 37 ° C에서 O / N을 품어.
  5. 페트리 접시에 하나의 식민지를 질주하여 형질 전환 체를 정화.
  6. 기본 형질 전환 체의 전기 유능한 세포를 준비하고 반복 더 플라스미드로 변환하는 1.1-1.5 단계를 반복합니다.
  7. 공동 형질 전환 체의 글리세롤 주식을 준비합니다. 적절한 항생제로 보충 LB에서 하나의 식민지로 이동 진탕 37 ° C에서 배양하고, 로그 상 (0.6 OD) 원심 분리기 20 분 5,000 XG에 세포 현탁액에서. R중간 15 % v / V를 글리세롤을 포함하는 LB-항생제의 펠렛을 esuspend. 분량 씩 분배와에 저장 - 80 ° C.

E.의 α와 ε 소단위 2. 공동 식 대장균 DNA 중합 효소 III

  1. 멸균 된 루프 적절한 변형 글리세롤 스톡 소량 전송 LB 배지 및 항생제를 함유하는 페트리 접시에 (예 TOP10 / PGOOD-ε243 및 TOP10 / PGOOD-ε243-θ / pBADα1160를,도 1 참조). 세포가 방울 세포 현탁액 페트리 접시 위에 건조하고, 행진하자. 37 ° CO / N에 품어.
  2. 멸균 된 이쑤시개, LB-항생제 매체의 1 ml의 단일 콜로니를 사용하여 전송. 37 ° C에서 8 시간을 품어. 신선한 매체 (500)를 15 시간 동안 30 ° C에서 부화 : 사전 문화 (1) 희석.
  3. IPTG, 아라비 노스, 또는 아라비 노스와 IPTG, 1 mM의 각을 추가합니다. 2.5 시간 동안 30 ° C에서 품어. 세포를 수집하고, -20 ° C에서 알약을 저장합니다.
  4. 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, 50 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 2.5 mM의 디티 오 트레이 톨, 1​​mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), pH가 8)에 재현 탁하고 얼음에 녹여 펠릿. 조심스럽게 차가운 유리 포터와 세포 현탁액을 균질화.
  5. 15 초 냉각 간격 (4 사이클) 다음 15 초 15 W,에서 초음파 처리.
  6. 가용성 획분을 회수하는 4 ° C에서 20 분 동안 10,000 XG에서 전체 단백질 추출물을 원심 분리기.
  7. SDS-PAGE (아크릴 아미드 12.5 %) 각각의 가용성 단백질 추출물의 분액에 의해 분석한다. 이를 위해, H 2 O 60 ㎕의 로딩 완충액 (250 mM 트리스 - 염산 pH를 20 μl를 함유하는 에펜 도르프 튜브에 각각 가용성 단백질 추출물 20 μL를 전송 6.8, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 % (w / v)의 SDS, 50 % (v / v) 글리세롤, 0.25 % 청색 (w / v)의 브로 모 페놀)과 5 분 동안 끓인다. 로드 각 샘플의 18 μl의 약 1.5 시간 동안 140 V의 전기를 수행합니다.

Deinococ의 α 서브 유닛 3. 공동 식기분이야 radiodurans DNA 중합 효소 III와 ε E. 소단위 대장균 DNA 중합 효소 III

  1. E.의 사전 문화를 준비 대장균의 TOP10 / 박사를 pBAD-α / LB-암피실린 - 테트라 사이클린 배지 1 ㎖에 PGOOD-ε243 37 ° C에서 8 시간을 품어. 새로운 배지에서 1,000 37 ° C에서 O / N을 품어 : 1 희석.
  2. 1 희석 : 신선한 매체의 100 (200)에 ㎖를, 다음 아라비 노스와 IPTG, 1 mM의 각각 3 시간 동안 유도, 3 시간 동안 37 ° C에서 품어. 세포를 수확하고, -20 ° C에서 펠렛을 저장합니다.
  3. 50mM 트리스 - 염산 pH를 8, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 1mM의 PMSF에 펠렛을 재현 탁. 균질화 2.4 및 2.5에 기술 된 바와 같이 세포를 방해.
  4. 즉시 세포를 20 분 동안 10,000 XG에 원심 해물. 펠렛을 폐기하십시오. 종이 필터의 3 층을 구비 한 흡인 여과기와 상청액을 필터. 부드러운 진공을 적용합니다. 과도한 거품을 방지하기 위해 여과 동안 얼음에 진공 삼각 플라스크를 유지합니다.
  5. 브래드 포드 (14)에 따라 단백질 농도를 결정합니다.

4. 젤 여과 크로마토 그래피

  1. 50 mM 트리스 - 염산, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, pH를 컬럼으로 8로드 가용성 단백질 추출물과 물 재킷 16x70 (200) 겔 여과 열 평형. 최적 해상도를 들어, 1 ml의 시료 루프를 사용합니다. / 분 0.6 ml의에서 크로마토 그래피를 수행합니다. 에 걸쳐 4 ° C에서 열 온도를 유지합니다.
  2. 0.9 ml의 분수를 수집하고 SDS-PAGE에 의해을 분석 할 수 있습니다. 전송 H 2 O 60 μL 및 로딩 완충액 (250 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 % (/ V) SDS w, 50 %의 20 μl를 함유하는 에펜 도르프 튜브에 관련된 각 분획의 20 μL ( v / v)의 글리세롤, 0.25 % (파란색 w / v)의 브로 모 페놀) 및 5 분 동안 끓인다. 로드 각 샘플의 18 μl의 약 1.5 시간 동안 140 V의 전기를 수행합니다.
  3. 3'-5 '엑소 뉴 클레아 제 및 각 분획의 DNA 중합 효소의 활성을 96 우리하여 결정LL 마이크로. 기판 (15)로 티미 딘 5'- 모노 인산 (P) 니트로 에스테르 (p-TMP의 NP)을 이용하여 엑소 뉴 클레아 제 활성을 분석. PPX (Pyrophosphatase, 퓨린 뉴 클레오 사이드 포스 포 릴라 제, 크 산틴 옥시 다제), 효소 결합 분석 16을 사용하여 DNA 폴리머 라 아제 활성을 예측 2- (4- 요오도 페닐) -3- (4- 니트로 페닐) -5- 페닐 -2H-테트라 졸륨 클로라이드 (INT) 전자 수용체 16.

인구 E.의 야생 형 ε 서브 유닛을 공동 발현 5. 돌연변이 분석 대장균 DNA 중합 효소 III 및 변이원성 εD12A 변형

  1. E.의 단일 식민지로 이동 pBAD-ε과 LB-항생제 배지 1 ㎖에 pGOOD1-εD12A 11 벡터를 포함하는 대장균 TOP10. 37 ° C에서 O / N을 품어.
  2. (아라비 노스, IPTG, 또는 아라비 노스 및 IPTG, 1 mM의 각각)을 적당한 유도제를 추가 한 새로운 배지 (10 ㎖)을 함유하는 플라스크에 250 3 37 ° C에서 배양한다 : 예비 배양 한 희석8 시간 동안. 병렬이 아닌 유도 문화에서 준비합니다.
  3. 1 ml의 일정량을 수집 한 후 1 희석 : 신선한 매체 (10 ㎖)를 포함하는 새로운 플라스크에 500을 적절한 유도 보충 여부. 37 ° C에서 O / N을 품어.
  4. 반복은 1 ml의 5.2 및 5.3 및 수집 분량 씩 단계를 반복합니다.
  5. 세대의 수는 각 문화에서 발생 확인합니다. LB 플레이트, 접종 및 문화의 적절한 희석액 100 ㎕에 전송합니다. 37 ° C에서 O / N을 품어. LB 플레이트상에서 콜로니를 카운트하고, 성장 (C 로그)의 단부에 존재 균액 (I 로그)와 배양 세포 수의 로그를 계산한다. 세대의 수를 확인하려면 수식을 사용하십시오 (C 로그 - I 로그인) /0.301을.
  6. 20 분 동안 5,000 XG 원심 분리기 및 50 mM 트리스 - 염산 pH를 7.6, 50 mM의 NaCl을 1 ml의 세포를 재현 탁. 세포를 Permeabilize 하시려면하려면 20 초 동안 클로로포름과 소용돌이 ~ 3 방울을 추가합니다.
  7. β- 결정기판으로서 P 개의 -nitrophenyl-β-D 글루 코피 라노 사이드 (PNPGluc)를 사용하여 96- 웰 마이크로 플레이트의 각 분취 량 글루코시다 제 활성. 각 웰에 투과 가능 세포를 100 ㎕)과 기판 (100 ㎕ (16 ㎎ / H 2 O ㎖의 원액)를 추가합니다. 우물에 공기 방울을 피하기 위해주의하십시오. 마이크로 플레이트 리더 및 적절한 필터를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 읽는다.

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Representative Results

E.의 ε 소단위 대장균 DNA 중합 효소 III는 243 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 잔류 187-243 (17)을 삭제하지 않는 한, 용성 (17, 18)을 갖추고 있습니다. 그러나, 우리는 이전에 전체 길이 α, ε, 및 θ 서브 유니트의 공동 발현이 수용성 DNA 폴리머 라제를 촉매 III 코어 (도 1)을 수득 11 것을 보여 주었다. ⅰ) α와 ε 소단위의 과발현은 독립적 아라비 노스 및 IPTG 각각 (도 1a)에 의해 제어 될 수있다 : 특히, pBAD-PGOOD 공동 발현 시스템을 사용하여, 우리는 것을 증명 ⅱ) 전체 길이 ε 소단위는 E.로부터 단리 가용성 단백질 추출물에서 검출 될 수있다 대장균 세포는 ε, α의 과발현, 및 θ 및 겔 여과 (도 1b)을 실시. 이 경우, 엑소 뉴 클레아 제 활성은 크게 3 가지의 피크 (도 1b, 채워진 원)에 분산하고,이 피크를 중심으로 FRAC기 (23)는 αεθ 촉매 코어 (그림 1C1D)를 포함 나타났다. ε의 안정성은 크게 α 및 θ 바인딩시 증가된다. 우리는 이전에 E.에 전체 길이 ε를 과발현하는 경우 대장균, 무료 ε의 낮은 양의 수용성 단백질 서부 블로 팅에 의해 감지 된 것은 19 (그림 2A)를 추출한다. ε-186 그중 그것은 것을주의하는 것이 재미있다, 동일한 조건에서, 우리는 항상, ε의 무료 C-터 절단 된 형태 (ε-234, ε-228-ε (213), 또는 ε-186)를 더 많은 양을 감지 수행 더 나은 19 (그림 2A). 우리는 또한 ε의 C- 말단 도메인의 단백질 분해가 α에 결합하고 θ 서브 유닛 (19)에 의해 방지 보여 않았다. 효과가있는 경우, ε의 용해성에 협동 식으로 쉽게 테스트 될 수있다. 도 2b에보고 된 바와 같이, 가용성 단백질 추출물을 과발현하는 세포로부터 단리α, ε, 및 α 또는 ε는 전체 단백질 추출물에 비하여 편리 SDS-PAGE로 분석 될 수있다. 이 경우에, 전기 영동 분석 단독 과발현되면 ε 소단위 기능 불량한 용해도 (레인 1과 비교 및​​ 2) α의 공동 발현이 크게 가용성 단백질 추출물 ε의 농도를 강화하면서, (레인 3과 4를 비교 것을 나타낸다 ).

공동 발현은 종 (species) 간의 보완 테스트를 수행하는데 사용될 수있다. 따라서, 우리가 그람 + 및 그람의 복제 성 기계에 속하는 서브 유닛 사이의 상호 작용을 평가하는 데 관심이있을 거라고 생각 -. 박테리아 데이 노코 쿠스 라디오 두 란스 큰 α 서브 유닛에게 (1335 아미노산, 150 kDa의) 기능이 그람 + 세균이고, 197 개의 아미노산을 함유 추정 ε 소단위. 흥미롭게도, D. radiodurans ε 서브 유닛은 E.의 C- 말단 도메인 존재의 결여이다 대장균 E. 사이 그럼에도 불구하고, 정체성과 동성 대장균D. radiodurans ε 서브 유닛은 각각 29 % 및 59 %로 동일하다 (1-178 영역을 고려하여, D. radiodurans 좌표). D.의 역량을 분석하려면 E. 바인딩에 radiodurans 중합 효소 III α 서브 유닛 (박사를 α) 대장균 ε 서브 유닛은, 우리는 pBAD 벡터에 박사를 α 코딩하는 합성 유전자를 복제하고 우리는 E. 공동 변형 한 pBAD-α 박사와 PGOOD-ε와 대장균. 문화 매체에 동시 IPTG의 추가 및 아라비 노스 박사와 ε (그림 3A)를 α의 공동 발현을 트리거합니다. 이 두 단백질의 협회는 겔 여과하여 확인 시험을 실시하고 있습니다. 세포를 초음파에 의해 파쇄, 용해 완충액 III α 소단위 ε DR 및 원심 분리 (5,000 XG, 20 분)에 의해 회수하고, DNA 중합 효소, 공동 발현 및 가용성 단백질은 즉시이었다LY는 슈퍼 덱스 200 열 (그림 3B)에로드. 그림 3C와 같이 수집 된 분수가 3'-5 '엑소 뉴 클레아 제와 DNA 중합 효소의 활성 분석을 실시 할 때, 활동의 피크가 크게에서 검출되었다 박사를 α 것은 E. 바인딩 유능한 아니라는 것을 제안, 위치를 이동 대장균 ε 서브 유닛. 분획 32, 36 및 52의 분취 량을 SDS-PAGE에 의해 농축하고, 분석 한 결과이 확인되었다. 분획 (36)은 α 박사 포함하고 E.없는 것으로 밝혀졌다 대장균 ε 서브 유닛은 분수 (52)는 E.을 포함, 동안 대장균 ε하지만 박사 (그림 3D)를 α없는했다.

복제 충실도는 주로 DNA 확장하는 동안 잘못된 기본 짝을 차별하는 DNA 중합 효소의 능력에 의존한다. 그럼에도 불구하고, 부정합 옥시 뉴클레오티드는 10-4 주파수 20에서 인용 한 동작 할 수있다3'-5 '의 exonucleases의 새로 합성 된 DNA 가닥을 교정하는 것이 필수적이다. 또,이 DNA 편집 액션 (20)의 크기 순서에 의해 3 복제 충실도를 증가시키는 것으로 추정되었다. 따라서, 테이터 균주 E. 조건부의 변이체를 발현하는 돌연변이 유발에 의해, 예를 들면, DNA의 손상을 교정함으로써 구성 될 수있다 대장균 DNA 중합 효소 III ε 서브 유닛. 이것은 α 있지만 교정 결합 활성의 결여, 및 적절한 발현 시스템에 의한 변성 ε의 생산을 조절 ε 유능한의 변형 구성을 얻을 수있다. 이 전략을 이용하여, 그 도시 된 E. ε (11, 21)의 돌연변이 변종을 유도하는 조건 하에서 대장균 돌연변이 빈도가 증가합니다. 그러나, 돌연변이 주파수의 미세 조정은 전혀 이것에 의해 달성되지 않았다. 단백질의 공동 발현은 테이터 균주 나은 제어를 얻기 위해 사용될 수있다. 이를 위해, 우리는 E. 변환 된 공동 와 대장균pBAD-ε-및 pGOOD1 εD12A, 야생형 각각 아라비 노스 및 IPTG와 ε의 D12A 돌연변이 변이체의 발현을 유도하기 위해. 야생형 E.에서 - (을 BglII) 표현형 테스트로, 우리는 애매하다 β 글루코시다 아제 활성의 모양을 결정 대장균 (22, 23). 탄소원 (을 BglII +) - β 글루코 시드 등을 이용할 수 자발적인 돌연변이 또는 농후 각각 23 액체 또는 고체 배지 (24)를 사용하여 단리 할 수있다. 세포가 D12A 돌연변이 변종을 표현하도록 유도했을 때, β - 글루코시다 제 활성이 약에 인수되었다 20 세대 (그림 4A). 이것은 유사한 경향 전사 제어 pGOOD1에 작용 때문에 대부분 비 - 유도 된 세포 (도 4a)에서 관찰되었음을 주목해야 할 것은 11 오히려 누설이다. 그럼에도 불구하고, 야생형 ε 소단위가 유도하고, 단독 또는 D12A 변형과 함께, β 글루코활동 E. 인수 한 중간 수준 (그림 4A)에서 대장균. 을 BglII + 돌연변이 β 글루코시다 아제 활성은 3 내지 40 μM / 23 분 범위로보고되었다. 수준은 E. 여기에 결정 εD12A의 대장균 발현을 실시 개체군 훨씬 낮지 만 우리가 고체 배지에서을 BglII + 돌연변이 체를 분리하지 않는 것으로 생각되어야한다.

그림 1
그림 1. E.의 공동 발현 대장균 DNA 중합 효소 III 촉매 핵심. (A) E.에서 추출한 전체 단백질의 SDS-PAGE 대장균 TOP10 / pBAD-α1160 / PGOOD-ε243는 아라비 노스 만의 존재 하에서, 유도제의 부재하에 성장 매체는 아라비 노스 및 IPTG (각각 레인 1-4)이 보충 된 둘 IPTG 만, 또는이다. (B겔 여과 E.에서 추출 된 수용성 단백질을 처리하여 격리 분수의) 흡광도 (빈 원)와 엑소 뉴 클레아 제 활성 (채워진 원) 대장균 TOP10은 ε, α 과발현 및 E.의 θ 서브 유닛 대장균 DNA 폴-III. (각각 레인 1-5) 분획 6, 12, 23, 31의 (C) SDS-PAGE, 및 41 엑소 뉴 클레아 제 활성 및 전기 영동 분획 (23)의 농축 된 분취 량의 (D) SDS-PAGE에보고 패널 B. 패턴은 각각 패널 B와 C에보고됩니다. . 생명 공학 편지, 33, 콘테 등의 허가 재판 "pGOODs : 대장균에서 단백질의 공동 발현을위한 새로운 플라스미드"., 1815년부터 1821년까지 (2011) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
E. 그림 2. 단백질 분해 대장균 DNA 중합 효소 III ε 서브 유닛. E.에서 추출 된 단백질의 웨스턴 블로 팅에 의해 계시 된 모노머의 (A) 저하 대장균 TOP10은 전체 길이 또는 ε의 잘린 형태를 과발현; 화살촉 25 및 19 kDa의 사전 묻은 분자 마커의 위치를​​ 나타냅니다. . BIOCHIMICA 등 Biophysica 액타 단백질과 단백질 체학, 1794, Bressanin 등의 엘스 비어의 허가 재판 : "교정 서브 유닛의 단백질 분해는 대장균 DNA 중합 효소 III 촉매 코어의 어셈블리를 제어", 1606년에서 1615년까지 (2009). (B) E.의 α와 ε 소단위의 공동 발현 대장균 DNA 중합 효소 III 촉매 핵심. 전체의 SDS-PAGE (레인 1, 3)와, 수용성 (레인 2 및 4) 단백질 여분ε 소단위의 과발현 세포로부터 단리 CTS (레인 1 및 2), 및 α 또는 ε 소단위 (레인 3 및 4).

그림 3
DNA 중합 효소 각각 데이 노코 쿠스 라디오 두 란스대장균에서 III α 및 ε 소단위의 그림 3. 공동 식입니다. (레인 1) 유도, 또는 α 박사 과발현 유도, ε, 또는 박사와 ε (레인 각각 2-4,) α하지 세포에서 분리 된 총 단백질 추출물 (A) SDS-PAGE. (B) 크로마토 그램 (빈 원, 왼쪽 축) 분수의 단백질 농도 (채워진 원, 오른쪽 축) E.에서 추출 된 수용성 단백질과로드 (수퍼 덱스 200) 겔 여과 칼럼을 형성 용출 대장균은 α 박사를 과발현차 ε 소단위. (C) 교정 (빈 원, 왼쪽 축) 및 DNA 중합 효소 (채워진 원, 오른쪽 축) 패널 B. 분수 32, 36, 52의 집중 분량의 (D) SDS-PAGE에보고 된 분수의 활동은. 를 클릭하십시오 여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 4
E. 그림 4. 돌연변이 주파수 콜라이 세포 또는 실시 공동 발현하지 야생형 DNA 폴리머 라제 III ε 단위체의 돌연변이 유발의 변형을 D12A. 새로운 플라스미드 pFINE의지도도 표시됩니다. E.의 (A) β 글루코시다 아제 활성 대장균 TOP10 (단, 공업) 유도하거나 야생형 ε 서브 유닛의 과발현 (을받지 않는아), D12A 돌연변이 유발 변이체 (IPTG), 또는 둘 모두 야생형 D12A ε 소단위 (아라 + IPTG). β 글루코시다 아제 활성은 세대의 함수로서보고된다. 새로운 발현 벡터 pFINE의 (B)지도. 이 플라스미드의 여러 복제 사이트 (MCS)는 그 중 유전자의 손쉬운 셔틀 링을시키는, 호환 pBAD 및 PGOOD 벡터에 존재하는 것과 동일하다.

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Discussion

단백질은 그 차 구조 배좌 (25)의 제한된 수의 제한되지 않은 영역을 갖춘, 무질서 본질적 일 수있다. 이들 무질서 화 된 단백질은 통상 25 응집 경향이며, 그들의 분리 및 특성 규명은 어려운 작업을 나타낼 수도있다. E.의 ε 소단위 대장균 DNA 중합 효소 III는 두 가지 영역, 즉 (26, 27)를 특징 : I) N-터 도메인, θ 서브 유닛을 바인딩에 3'-5 '엑소 뉴 클레아 제 활성을 베어링, 유능한; ⅱ) C-터 도메인, α (중합 효소) 서브 유닛에 결합에 대한 책임. ε의 C-터 도메인은 그것의 응집을 촉진,이 단백질에 대한 난 용성을 부여하는 것으로 알려져있다. 이것은 실제로 ε-186, C-터 도메인이 결여 된 단백질의 절단 된 형태는 수용성이고, 높은 수율 17로 정제 할 수 있음을 입증 하였다. 그러나, 양적으로 공부 될 α와 ε의 상호 작용이 때(예 αε 복잡 K D를 결정하기 위해), 전장의 ε 정제 생화학 어려운 작업을 암시 요구된다. 이 프레임에서 단백질의 공동 발현은 α하기 ε의 결합의 질적 견적을 제공합니다. 우리 αεθ 복합체의 높은 수율이 ε 소단위의 난용 우회 공동 발현 (도 1)에 의해 생체 내에서 얻어 질 수 있다는 것을 보여 주었다. 놀랍게도, 과잉 발현 αεθ 복합체의 정제 (28, 29)를보고되었다. 공동 발현 전략은 또한 상호 작용하는 파트너들 중 하나에 의해 부위 특이적인 돌연변이의 삽입이 복합체 형성을 저해하는지 여부를 테스트하는 데 사용될 수있다. 따라서, 단백질의 공동 발현은 단백질 - 단백질 상호 작용의 정성을 수행하기 편리하고 신속한 공구를 나타낸다. 또한 우리의 공동 발현 시스템은 두 가지 유도 물질, 즉, 아라비 노스 및 IPTG에 의존하는 것을 주목해야한다. 예를 들면, 박테리아 성장 배지에서 (도 1a)에 하나의 유도를 생략 단백질 복합체의 형성을 테스트 할 때 따라서 적절한 관리를 쉽게 행할 수있다.

우리는 α의 공동 발현와 E의 ε 소단위 여기 최적화 된 절차를 제시 콜라이 DNA 폴리머 라제 III. 이 프로토콜 설계 및 시험 한 바, 다음과 같은 매개 변수의 공동 발현 실험의 성공에 중요한 것으로 확인되었다 : 유도가 수행되는 I) 온도; ⅱ) 유도의 시간 길이; 듀서 (들)의 Ⅲ) 농도. 특히, 우리는 독립적으로 유도 시간, 37 ℃에서 유도 된 세포에서 복잡한 11 αεθ 용해 얻을 수 없습니다. 따라서 우리는 유도 단계 다른 온도를 테스트하기 위해, 시간의 함수로서 단백질의 과발현을 확인 제안한다. 또한, DIFF의 동일 표현들의 병렬 평가erent E. 표적 단백질의 중간 수익률에 직면 할 때 대장균 균주는 도움이 될 수 있습니다.

우리는 여기에 다른 종에서 단백질의 결합을 테스트하기 위해 수행 대표적인 실험을보고 있고, 우리는 그 단백질의 공동 발현이 신속하게 하이브리드 기능성 복합에​​ 2 이종 단백질의 연결을 테스트하는 데 유용 보여 주었다. 겔 여과 크로마토 그래피의 복합체 형성 (도 3)을 평가하기 위해 여기에 사용 하였다. 그러나, 상호 작용하는 파트너들 중 하나에 대한 태그의 적절한 삽입 친화 캡쳐 방법의 사용을 보내는, 이러한 평가를 용이하게 할 수있다. 단백질 - 단백질 상호 작용이 태그의 간섭을 방지하기 위해, 상호 작용 파트너 중 하나를 코딩하는 유전자는 pBAD에 병렬로 삽입 될 수있다 / 그와 pBAD 각각 N-와 C에서 헥사 히스티딘 모티브을 부여 / Myc와 - 그의 벡터, 표적 단백질의 -terminus.

E.는 mutato 대장균R 균주는 야생형에 비해 더 높은 돌연변이 주파수를 갖추고 있습니다. 뮤 테이터 균주 빠르게 소설, 원하는, 표현형으로 대상의 피로를 진화하기 위해, 예를 들어 생명 공학 30 일에 관심입니다. 우리는 여기에 공동 발현 증거 야생형 및 E.의 돌연변이 ε 서브 유닛을 제공 콜라이 DNA 폴리머 라제 III, 박테리아 숙주의 돌연변이 빈도 충분한 편의성 조정될 수있다. 이 기술을 더욱 개선하기 위해 엄격하게 조절되는 발현 벡터 ε 단위체의 돌연변이 유발 강하게 D12A 변이체의 발현을 최대한 억제하는 것이 필요하다. 특히, E.에서 돌연변이 빈도를 테스트하는 것이 흥미로울 대장균, 즉 pBAD-εD12A 및 pGOOD1-ε, 여기에 제시된 것과 구성 대안으로 바꾸었다. pBAD 벡터는 실제로 12 밀접 조절되는 것으로 알려져 있으며,이 기능의 εD12A 기저 농도 유지에 도움이 될낮은 수준.

단백질의 공동 표현의 예는 여기에보고 된이 기술의다면적인 성격을 증언. 그러나, 단일 E. 호환 플라스미드의 다수를 사용하는 것이 중요하다 대장균 세포는 크게 단백질의 공동 발현에 의해 흡수 될 수있는 문제를 확장 할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 연구는 단백질 강렬한 공동 발현에 사용되는 플라스미드 호환 레퍼토리를 확장 헌신되었다. 특히, 복제의 ColE1, p15A 및 pSC101 기원 베어링 호환 플라스미드에 의존 삼원 시스템은 공동으로 표현 중 세균과 포유류 단백질 (31)에 사용되었다. 최근 급 공동 발현 시스템이보고되었다. 이 경우,도 13는 E. 이종 유전자의 동일 표현되었다 대장균 ColE1, p15A, CloDF13 및 복제 (32)의 RSF의 기원을 포함, 4 호환 발현 벡터와 공동으로이 변환 된. 이 공동 발현 시스템을 성공적으로 제조 하였다E.는 피로 코커스 퓨리 (32)로부터 기능적으로 활성 수용성 수소화에게 I 대장균. 우리의 바이너리 시스템을 확대하기 위해, 우리는 복제의 pSC101 기원, 네오 마이신 저항 카세트 및 규제 요소 (그림 4B)을 포함, 새로운 발현 벡터, pFINE를 건설했다. 이 플라스미드 따라서 공동 발현 시스템의 세 구성 요소간에 왕복 유전자를 용이하게 pBAD 및 PGOOD 벡터에서 동일한 폴리 링커 존재가 포함되어 있습니다. pFINE은 적은 카피 수의 플라스미드이지만, 그 안정성이 풍부한 배지에서 시험 하였을 때, 양호했다. 우리는 현재 우리의 삼원 공동 발현 시스템의 추가 확장에 종사하고 있습니다. 이를 위해, 우리는 클로람페니콜 저항 카세트를 포함하는 pBAD 유도체를 구축, 우리는 ColE1, p15A 및 pSC101와 호환 하나와 복제의 ColE1 기원를 교환하는 방법에 있습니다. 그것은 참으로 하나의 E. 여러 플라스미드를 사용하는 것이 우리의 의견이다 대장균 세포 담당자다른 서브 유닛의 다수로 구성된 단백질 복합체의 생체 내에서 발현에 도전 할 수있는 강력한 도구를 원망.

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Acknowledgments

수치를 다시 인쇄하는 스프링과 엘스 비어에 의한 권한은 크게 인정 받고 있습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma-Aldrich A1296
Ampicillin Sigma-Aldrich A9518
Chloroform Sigma-Aldrich 288306
EDTA Sigma-Aldrich EDS
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
INT Sigma-Aldrich I8377
IPTG Sigma-Aldrich I5502
KCl Sigma-Aldrich P9541
L-Arabinose Sigma-Aldrich A3256
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670
NaCl Sigma-Aldrich 31434
PMSF Sigma-Aldrich P7626
PNP-gluc Sigma-Aldrich N7006
pNP-TMP Sigma-Aldrich T0251
Tetracyclin Sigma-Aldrich 87128
Trizma base  Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Sigma-Aldrich 95039
Yeast extract Fluka 70161
Acrylamide solution 30% BioRad 161-0158 For gel electrophoresis
Ammonium persolphate BioRad 161-0700 For gel electrophoresis
Glycine BioRad 161-0718 For gel electrophoresis
SDS BioRad 161-0302 For gel electrophoresis
TEMED BioRad 161-0800 For gel electrophoresis
Tris BioRad 161-0719 For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm BioRad 1652089 For electroporation
Centrifuge 5415R Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation BioRad
Microplate Reader 550 Biorad
MiniProtean 3 cell BioRad
Power Supply BioRad
Sonicator 3000 Misonix

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References

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단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em
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Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte,More

Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (96), e52431, doi:10.3791/52431 (2015).

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