Introduction
Innføringen av overekspresjon teknologier styrket enten biokjemiske studier av lavt kopitall enzymer og industriell fremstilling av farmakologisk aktive proteiner (for eksempel insulin). Siden advent av disse teknologiene, har betydelige fremskritt er oppnådd å øke utbyttet og kvaliteten av rekombinante proteiner. I tillegg ble 1,2 prokaryote og eukaryote 3 høyekspresjonsystemer utviklet seg gjennom årene, som tilbyr nyttige alternativer til "arbeids hest" av protein bioteknologi, dvs. Escherichia coli. Spesielt tilgjengeligheten av alternative plattformer til E. coli førte til produksjon av rekombinante peptider eller proteiner som bærer post-translasjonelle modifikasjoner. Det bør imidlertid nevnes at E. coli representerer fortsatt organismen av valget for rekombinant proteinproduksjon. Dette er på grunn av flere faktorer, blant hvilke den mest relevante kan blibetraktet: i) tilgjengeligheten av ganske mange høyekspresjonsystemer (ekspresjons vektorer og stammer) for E. coli 1,2; ii) den korte generasjonstid, og høy biomasse gir, av E. coli i en rekke rik og syntetiske media; iii) den lette manipulering enten på biokjemiske og på genetisk nivå av denne mikroorganisme; iv) isolering av stammer som er i stand til produksjon av toksiske proteiner 4; v) bygging av stammer med homogen induksjon på befolkningsnivå 5,6. I tillegg ble det nylig vist at ekspresjon systemer som er egnet for produksjon i E. coli av etter translasjonelt modifiserte proteiner kan være utformet og konstruert to.
For tiden blir protein overekspresjon i hovedsak brukt for å oppnå monomere eller homo-oligomere proteiner, hvis hypersynthesis kan utføres med et enkelt gen klonet inn i en passende plasmid. Men oppmerksomhet var nyligutbetalt til bygging av E. coli-protein co-ekspresjonssystemer, utfordrende fremstilling, in vivo, av hetero-oligomere komplekser 2. Interessant, tidlige eksperimenter av protein co-uttrykk adressert inter-arter montering av store og små subenheter av cyanobacterial ribulose-1,5-bisfosfat karboksylase / oksygenase 7,8, og foreningen av avkortede og full-lengde former av HIV-1 revers transkriptase 9. Disse banebrytende studier viste at protein co-uttrykk representerer et kraftig alternativ til tradisjonell in vitro tilberedning. I tillegg protein ko-ekspresjon i E. coli ble brukt til å fremstille forskjellige proteiner som bærer post-translasjonelle modifikasjoner 2, for å oppnå proteiner som inneholder unaturlige aminosyrer 2, og for å øke utbyttet av overuttrykte membranproteiner 2. Videre til potensialet i protein co-uttrykk som et verktøy konferere til E. coli konkurrereNCE i protein sekresjon er under aktiv etterforskning to.
To hovedstrategier protein co-uttrykk i E. coli kan bli fulgt: i) bruk av et enkelt plasmid for å være vert for forskjellige gener som skal overuttrykt; ii) bruk av flere plasmider i enkeltceller til å ko-uttrykke de aktuelle proteinene. I det første tilfellet, må kriteriene for valg av plasmid ikke skiller seg fra tradisjonelle enkelt protein høyekspresjonsystemer eksperimenter, selv om bestemte plasmider inneholder tandem promoter / operatør elementer ble konstruert for co-uttrykk 10. Denne første metode er derfor ganske enkel. Imidlertid bør det nevnes at bruken av en enkelt plasmid med ko-uttrykke forskjellige proteiner står overfor to hovedproblemer: i) molekylvekt på vektor øker med antallet av verts gener, noe som begrenser antallet av co-uttrykte proteiner; ii) når flere gener er klonet under kontroll av en enkelt promotor, polaritet kan minske ekspresjonen av genene distale fra promotoren. Bruken av doble eller multiple-plasmidene i enkelt E. coli-celler har for å oppnå kompatibilitet av vektorene valg, derfor innføre begrensninger for de kvalifiserte kombinasjoner av plasmider. Men denne andre ko-ekspresjon strategi har den fordel inneholder den molekylære massen av vektorer, og begrenser polaritet. Vi har nylig bygget et protein co-uttrykk system designet for å forenkle skyt av gener mellom co-ekspresjonsplasmidene 11. Spesielt konstruerte vi pGOOD vektorer serie, de relevante egenskaper av disse er: i) en p15A replikasjonsorigo, for å være kompatibel med de pGOOD plasmider med de kommersielle vektorer inneholdende den ColE1 opprinnelse (f.eks pBAD-serien 12); ii) en tetracyklin-resistens kassett; iii) tilstedeværelse av lac-avledede regulatoriske elementer, dvs. arrangøren-Operatør (O 1) par og lacl q genet. Ved hjelp av en passende pBAD-pGOOD par, var vi i stand til å overuttrykker den katalytiske kjerne av E. coli DNA-polymerase III, som består av tre forskjellige underenheter, dvs. α (5'-3 'polymerase), ε (3'-5' eksonuklease) og θ (stabiliserende ε) 13. I særdeleshet har vi demonstrert at ko-ekspresjon av αεθ komplekset var strengt avhengig tillegg til E. coli dyrkingsmedium for både IPTG og arabinose, utløser overekspresjon fra pGOOD og pBAD, henholdsvis (figur 1A).
I den foreliggende rapporten, vi illustrere hvordan protein co-uttrykk kan effektivt løse problemer knyttet til de fattige løseligheten av et proteinkompleks subenhet. I tillegg viser vi hvordan in vivo protein komplemente testene kan utføres, og vi endelig rapportere om bruken av protein co-uttrykk for å tune mutasjonsfrekvensen i E. coli. Til dette målet, brukte vi pGOOD-pBAD par passende å illustrere relevante eksempler på hver case study.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av E. coli Co-transformanter
- Forbered elektro kompetente celler av den aktuelle E. coli-stamme som skal transformeres. Overføring til 1 ml LB-medium (Trypton, gjærekstrakt, NaCl ved 10, 5 og 10 g / l, henholdsvis) en enkelt koloni av stammen av valget, og inkuber ved 37 ° C under risting forhold på 180 rpm. Fortynn pre-kulturen 1: 500 i 25 ml frisk LB-medium og inkuberes kulturen ved 37 ° C.
- Ved log-fase (0,6 OD) Sentrifuger cellene suspensjonen ved 5000 xg i 20 min), og resuspender pelleten i 10%, vol / vol iskald steril glycerol-vann i halvparten av det opprinnelige kulturvolum. Gjenta dette trinnet 4 ganger, halvere hver gang resuspensjon volum. Til slutt, resuspender pelleten i glycerol / vann og dele cellene suspensjonen i 50 pl aliquoter. Lagre alikvotene ved -80 ° C i opptil 6 måneder.
- Oppløs det ønskede plasmid i sterilt vann supplert med 0,5 mM EDTA. Tine på ice en delmengde av elektrokompetente celler og blandes med en passende mengde (2,5-5 ng) av vektor. Tilsett blandingen i en 0,1 cm skål egnet for elektroporering, og bruke 1,8 kV.
- Umiddelbart overfører de elektroporerte celler i 1 ml SOC-medium (LB-medium supplementert med 0,2% w / v glukose, 10 mM MgCl2, 2,5 mM KCI), inkuberes i 1 timer under risting, og til slutt overføre 100 ul aliquoter til petriskåler innehold LB agar med det passende antibiotikum. Ruge O / N ved 37 ° C.
- Rense trans ved å stryke enkeltkolonier på petriskåler.
- Forbered elektro kompetente celler av de primære trans og gjenta trinn 1,1 til 1,5 for å forvandle med ytterligere plasmider.
- Forberede glyserol aksjer av co-trans. Overføre en enkelt koloni i LB supplert med de egnede antibiotika, inkuberes ved 37 ° C under risting, og ved log-fase (0,6 OD) sentrifuger cellene suspensjonen ved 5000 xg i 20 min. Resuspend pelleten i LB-medium inneholdende antibiotika, 15% v / v glycerol. Dispensere i porsjoner og oppbevar ved - 80 ° C.
2. Samtidig uttrykk for α og ε underenheter med E. coli DNA Polymerase III
- Overfør med en steril sløyfe en liten mengde av den aktuelle belastning glyserol lager (f.eks TOP10 / pGOOD-ε243 og TOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, se figur 1) inn i en petriskål med LB medium og antibiotika. La cellene suspensjon tørr på petriskål, og strek cellene dråpe. Inkuber ved 37 ° CO / N.
- Overføring ved hjelp av en steril tannpirker, en enkelt koloni i 1 ml LB-medium antibiotika. Inkuber i 8 timer ved 37 ° C. Fortynn pre-kulturen 1: 500 i friskt medium og inkuber ved 30 ° C i 15 timer.
- Legg IPTG, arabinose, eller arabinose og IPTG, 1 mM hver. Inkuber ved 30 ° C i 2,5 timer. Samle cellene, og lagre pellets ved -20 ° C.
- Tine-pellets på is og resuspendert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM ditiotreitol, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), pH 8). Forsiktig homogenisere celler suspensjon med et kaldt glass potter.
- Sonikere ved 15 V i 15 sekunder, etterfulgt av 15 sek avkjøling intervall (4 sykluser).
- Sentrifuger totale proteinekstrakter ved 10.000 xg i 20 min, ved 4 ° C for å gjenvinne den løselige fraksjon.
- Analyser ved hjelp av SDS-PAGE (12,5% akrylamid) aliquoter av hvert oppløselig proteinekstrakt. For å oppnå dette målet, overføre 20 ul av hvert oppløselig proteinekstrakt til Eppendorf-rør inneholdende 60 pl H2O og 20 pl av lastebuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-merkaptoetanol, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) glycerol, 0,25% (w / v) bromfenol blå) og koke i 5 minutter. Lasten 18 ul av hver prøve og utføre elektroforese ved 140 V i ca. 1,5 timer.
3. Co-uttrykk for α-subenheten av Deinococcus radiodurans DNA Polymerase III og ε subenhet av E. coli DNA Polymerase III
- Forberede en pre-kulturen i E. coli-stamme TOP10 / pBAD-α Dr / pGOOD-ε243 i 1 ml LB-ampicillin-tetracyklin medium og inkuber 8 timer ved 37 ° C. Fortynne 1: 1000 i friskt medium og ruge O / N ved 37 ° C.
- Fortynn 1: 100 i 200 ml friskt medium, inkubert ved 37 ° C i 3 timer, og deretter fremkalle i 3 timer med IPTG, og arabinose, 1 mM hver. Høste celler, og lagre pellet ved -20 ° C.
- Resuspender pelleten i 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF. Homogenisere og forstyrre cellene, som beskrevet i 2.4 og 2.5.
- Umiddelbart sentrifuger cellene lysat ved 10.000 xg i 20 min. Kast pelleten. Filtrere supernatanten med en Buchner-trakt utstyrt med tre lag av papirfilter. Bruke milde vakuum. For å unngå overdreven skumming, holde vakuum erlenmeyerkolben på is under filtrering.
- Bestemme proteinkonsentrasjonen i henhold til Bradford 14.
4. Gelfiltreringskromatografi
- Ekvilibrere en vannkappe 16x70 (200) gelfiltreringskolonne med 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. Last på kolonnen det oppløselige proteinekstrakt. For optimal oppløsning, kan du bruke en 1 ml prøve loop. Utføre kromatografi på 0,6 ml / min. Hold kolonne temperatur ved 4 ° C i hele.
- Samle 0,9 ml fraksjoner og analysere dem ved hjelp av SDS-PAGE. Overføring 20 ul av hver relevante fraksjon til Eppendorf-rør inneholdende 60 pl H2O og 20 pl av lastebuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-merkaptoetanol, 10% (w / v) SDS, 50% ( v / v) glycerol, 0,25% (w / v) bromfenol blå) og koke i 5 minutter. Lasten 18 ul av hver prøve og utføre elektroforese ved 140 V i ca. 1,5 timer.
- Bestem 3'-5 'eksonuklease og DNA-polymerase-aktivitet til hver fraksjon i 96-vill mikroplater. Analysen av eksonuklease-aktivitet ved hjelp av tymidin-5'-monofosfat-p-nitrofenylester (p NP-TMP) som substrat 15. Estimer DNA-polymerase-aktivitet ved hjelp av PPX (Pyrophosphatase, purinnukleosidfosforylase, Xantinoksidase) enzym-koblet assay 16 og 2- (4-iodfenvl) -3- (4-nitrofenyl) -5-fenyl-2H-tetrazoliumklorid (INT) som elektronakseptor 16.
5. Mutasjon Analyse av Co-populasjoner som uttrykker vill-type ε subenheten av E. coli DNA Polymerase III og det mutagene εD12A Variant
- Overføre en enkelt koloni av E. coli TOP10 inneholder pBAD-ε og pGOOD1-εD12A 11 vektorer til en ml LB-antibiotika medium. Ruge O / N ved 37 ° C.
- Fortynn pre-kulturen 1: 250 i tre kolber inneholdende friskt medium (10 ml), tilsett de aktuelle indusere (arabinose, IPTG, og arabinose og IPTG, 1 mM hver) og inkuberes ved 37 ° Ci 8 timer. Forberede i parallelle ikke-indusert kulturer.
- Samle aliquoter av 1 ml, og deretter fortynnet 1: 500 i nye kolber inneholdende friskt medium (10 ml) supplementert eller ikke med egnede induktorer. Ruge O / N ved 37 ° C.
- Gjenta trinn 5.2 og 5.3 og samle prøver av en ml.
- Bestemme antall generasjoner skjedde i hver kultur. Overfør på LB-plater, 100 ul av passende serielle fortynninger av inokulum og kultur. Ruge O / N ved 37 ° C. Tell antall kolonier på LB-plater, og beregne logaritmen av antall celler som er tilstede i inokulum (log I) og i kulturen i slutten av veksten (log C). For å bestemme antall generasjoner, bruke formelen: (log C - logger jeg) /0.301.
- Sentrifuger ved 5000 xg i 20 min, og resuspender cellene i 1 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM NaCl. Å permeabilize cellene, tilsett 2-3 dråper kloroform og vortex i 20 sek.
- Bestem β-glukosidase aktivitet av hver prøve i et 96-brønns mikroplate, under anvendelse av p-nitrofenyl-β-D-glukopyranosid (PNPGluc) som substrat. Legg til hver brønn 100 pl av permeabiliserte celler og 100 ul substrat (16 mg / ml stamløsning i H2O). Ta vare for å unngå luftbobler i brønnene. Les av absorbansen ved 420 nm, ved anvendelse av en mikroplateavleser og det passende filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ε subenhet av E. coli DNA polymerase III består av 243 aminosyrer og har dårlig oppløselighet 17,18, hvis restene 187-243 slettes 17. Imidlertid har vi tidligere vist 11 at co-uttrykk for helaftens α, ε, og θ subenheter gir løselig DNA polymerase III katalytisk kjerne (figur 1). Spesielt ved bruk av pBAD-pGOOD co-ekspresjonssystem, demonstrerte vi at: i) kan overekspresjon av α og ε subenheter være uavhengig styrt av arabinose og IPTG, henholdsvis (figur 1A); ii) full-lengde ε subenheten kan påvises i oppløselige proteinekstrakter isolert fra E. coli-celler som overuttrykker α, ε, og θ og utsatt for gel-filtrering (figur 1B). I dette tilfelle ble eksonukleaseaktivitet fordelt i tre hovedtoppene (figur 1B, fylte sirkler), og topp sentrert ved fracsjon 23 ble vist å inneholde den αεθ katalytisk kjerne (figurene 1C og 1D). Stabiliteten av ε øker kraftig ved binding til α og θ. Når vi tidligere overexpressed helaftens ε i E. coli, en liten mengde fritt ε ble påvist ved western blotting i løselig protein ekstrakter 19 (figur 2A). Det er interessant å merke seg at, under samme forhold, vi alltid oppdaget større mengder av gratis C-ter forkortede former av ε (ε-234, ε-228, ε-213, eller ε-186), hvorav ε-186 utføres bedre 19 (Figur 2A). Vi har også viser at proteolyse av ε C-terminale domene blir forhindret ved binding til α og θ subenheter 19. Virkningen, om noen, av co-ekspresjonen på løseligheten av ε kan lett testes. Som rapportert i figur 2B, løselige proteinekstrakter isolert fra celler som overuttrykkerα, ε, eller α og ε kan analyseres ved SDS-PAGE, og praktisk sammenlignet med totale proteinekstrakter. I dette tilfellet er den elektroforetiske analyse viser at når overuttrykt alene, ε subenhet har dårlig oppløselighet (sammenlign felt 1 og 2), mens ko-ekspresjon av α forbedrer konsentrasjonen av ε i oppløselige proteinekstrakter (sammenlign kolonnene 3 og 4 ).
Co-ekspresjon kan også bli brukt for å utføre interartskomplemente tester. Følgelig, vi trodde det kunne være av interesse å vurdere samspillet mellom subenheter tilhører de replikative machineries av Gram + og Gram -. Bakterier Deinococcus radiodurans er en Gram + bakterier, med en stor α-subenheten (1335 aminosyrer, 150 kDa) og en antatt ε subenhet som inneholder 197 aminosyrer. Interessant, D. radiodurans ε subenheten er fri for det C-terminale domene tilstede i E. coli E. coli og D. radiodurans ε subenheter er lik 29% og 59%, henholdsvis (vurderer regionen 1-178, D. radiodurans koordinater). For å analysere kompetansen til D. radiodurans polymerase III α-subenheten (α Dr) i bindende E. coli ε subenhet, har vi klonet inn i vektoren pBAD et syntetisk gen som koder for α Dr, og vi har ko-transformert E. coli med pBAD-α Dr og pGOOD-ε. Den samtidige tilsetning av IPTG og arabinose til kulturmediet utløser ko-ekspresjon av α Dr og ε (figur 3A). Sammenhengen mellom disse to proteinene ble testet ved gelfiltrering. Celler ko-ekspresjon av DNA-polymerase III α Dr og ε subenheter ble oppsamlet ved sentrifugering (5000 xg, 20 min), suspendert i lyseringsbuffer, avbrutt ved ultralydbehandling, og de oppløselige proteiner ble øyeblikkeligly applisert på en Superdex 200-kolonne (figur 3B). Som figur 3C viser, når de oppsamlede fraksjoner ble underkastet 3'-5 'eksonuklease og til DNA-polymerase aktivitetsanalyser ble aktivitetstopper detektert ved betydelig forskjøvet stilling, noe som tyder på at α Dr ikke er kompetente i binding E. coli ε subenhet. Dette ble bekreftet når aliquoter av fraksjonene 32, 36 og 52 ble konsentrert og analysert ved hjelp av SDS-PAGE. Fraksjon 36 ble funnet å inneholde α Dr og for å være blottet for E. coli ε subenhet, mens fraksjon 52 inneholdt E. coli ε men var blottet for α Dr (Figur 3D).
Replication fidelity primært er avhengig av evnen til DNA-polymeraser til å diskriminere mot feilaktige baseparing i DNA forlengelse. Ikke desto mindre, kan feilaktige deoksynukleotider inkorporeres ved 10 -4 frekvens 20, og virkningenav 3'-5 'eksonukleaser er viktig å korrektur den nysyntetiserte DNA-tråden. Videre ble det anslått at dette DNA redigering handling øker replikering troskap av tre størrelsesordener 20. Følgelig kan Mutator stammer konstrueres ved å svekke DNA korrekturlesing, for eksempel ved betinget uttrykker en mutagene variant av E. coli DNA polymerase III ε subenheten. Dette kan oppnås konstruere en variant av ε vedkommende i bindingen α men fri for dens korrektur aktivitet, og å styre produksjonen av mutagene ε ved egnede ekspresjonssystemer. Ved hjelp av denne strategien, ble det vist at E. coli-mutasjon frekvens øker under forhold som induserer mutagene varianter av ε 11,21. Imidlertid ble ingen finjustering av mutasjonsfrekvens oppnås ved dette betyr. Protein ko-ekspresjon kan bli anvendt for å oppnå en bedre kontroll av mutasjonsstammer. Til dette målet, vi co-transformert E. coli medpBAD-ε og pGOOD1-εD12A, for å indusere uttrykk for villtype og mutagene D12A variant av ε med arabinose og IPTG, henholdsvis. Som et fenotypisk test, vi bestemt utseende av β-glukosidase-aktivitet, som er kryptisk (Bgl -) i villtype E. coli 22,23. Spontane mutanter stand til å utnytte β-glukosider som karbonkilder (Bgl +) kan være anriket eller isoleres ved hjelp av flytende 23 eller faste medier 24, henholdsvis. Når cellene ble overtalt til å uttrykke D12A mutagene variant, ble β-glukosidase aktivitet ervervet i ca. 20 generasjoner (Figur 4A). Det bør bemerkes at en lignende tendens ble observert i ikke-induserte celler (figur 4A), mest sannsynlig fordi transkripsjonen kontroll utøves på pGOOD1 er heller 11 utett. Likevel, når villtype ε subenheten ble indusert, alene eller i forbindelse med D12A variant, β-glukosidaseaktivitet ble kjøpt opp av E. coli ved moderate nivåer (Figur 4A). Den β-glukosidase aktivitet av Bgl + mutanter ble rapportert å være i området mellom 3 og 40 uM / min 23. Nivået bestemmes her i E. coli populasjoner utsatt til uttrykk av εD12A er mye lavere, men det bør tas i betraktning at vi ikke forsøke å isolere BGL + mutanter på faste medier.
Figur 1. Co-uttrykk for E. coli DNA polymerase III katalytisk kjerne. (A) SDS-PAGE av totale proteiner utvunnet fra E. coli TOP10 / pBAD-α1160 / pGOOD-ε243 dyrket i fravær av induktorer, i nærvær av bare arabinose, av IPTG bare, eller i medium supplementert med både arabinose og IPTG (sporene 1-4, henholdsvis). (B) Absorbans (tomme sirkler) og eksonukleaseaktivitet (fylte sirkler) av fraksjoner isolert ved å utsette for gel-filtrering oppløselige proteiner ekstrahert fra E. coli TOP10 overekspresjon α, ε, og θ subenheter av E. coli DNA Pol-III. (C) SDS-PAGE av fraksjoner 6, 12, 23, 31, og 41 (søyle 1-5, henholdsvis) som ble rapportert i panel B. (D) SDS-PAGE av en konsentrert prøve av fraksjon 23, som har eksonukleaseaktivitet og elektrofore Mønsteret er rapportert i paneler B og C, respektivt. Gjengitt med tillatelse fra Biotechnology Letters, 33, Conte et al.: "PGOODs: nye plasmider for co-uttrykk av proteiner i Escherichia coli.", 1815-1821 (2011) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Proteolyse av E. coli DNA polymerase III ε subenhet. (A) Nedbrytning av monomerisk som avslørt av western blotting av proteiner hentet fra E. coli TOP10 overekspresjon full lengde eller forkortede former av ε; pilspisser indikere posisjonen 25 og 19 kDa pre-farget molekylære markører. Gjengitt med tillatelse fra Elsevier fra Biochimica et Biophysica Actas Proteiner og proteomikk, 1794, Bressanin et al. "Proteolyse av korrekturlesing subenheten styrer montering av Escherichia coli DNA polymerase III katalytisk kjerne", 1606-1615 (2009). (B) Samtidig uttrykk for α og ε subenheter av E. coli DNA polymerase III katalytisk kjerne. SDS-PAGE av totale (kolonnene 1 og 3), og oppløselige (kolonnene 2 og 4) protein ekstracts isolert fra celler som overuttrykker ε subenhet (felt 1 og 2), eller α og ε subenheter (banene 3 og 4).
Figur 3. Co-ekspresjon av DNA-polymerase III α og ε subenheter fra Deinococcus radiodurans og Escherichia coli, henholdsvis. (A) SDS-PAGE av totale proteinekstrakter isolert fra celler som ikke indusert (spor 1), eller indusert til å overuttrykke α Dr, ε eller α Dr og ε (søyle 2-4, henholdsvis). (B) kromatogram (tomme sirkler, venstre akse), og proteinkonsentrasjonen av fraksjoner (fylte sirkler, høyre akse) eluert danne en gelfiltreringskolonne (Superdex 200) lastet med oppløselige proteiner ekstrahert fra E. coli overekspresjon α Dr ennd ε subenheter. (C) korrekturlesing (tom sirkler, venstre akse) og DNA polymerase (fylte sirkler, høyre akse) aktiviteter av fraksjonene rapportert i Panel B. (D) SDS-PAGE av konsentrerte porsjoner av fraksjoner 32, 36 og 52. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Mutasjon hyppigheten av E. coli-celler underkastet eller ikke ko-ekspresjon av vill-type, og den mutagene D12A variant av DNA-polymerase III ε subenhet. Kartet av det nye plasmid pFINE er også vist. (A) β-glukosidase aktivitet av E. coli TOP10 ikke indusert (No Ind) eller utsatt for overekspresjon av vill-type ε subenhet (Ara), den mutagene variant D12A (IPTG), eller både villtype og D12A ε subenheter (Ara + IPTG). Den β-glukosidase-aktivitet er rapportert som en funksjon av generasjoner. (B) Kart over den nye ekspressjonsvektor pFINE. Det multiple kloningssete (MCS) av dette plasmid er identisk med dem som er tilstede i de kompatible pBAD og pGOOD vektorer, slik at lettvint skyt av gener mellom dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteiner kan være egentlig uordnede, med regioner som tertiær struktur er ikke begrenset til et begrenset antall conformations 25. Disse uordnede proteiner er vanligvis utsatt for aggregering 25, og deres isolering og karakterisering kan representere en vanskelig oppgave. Den ε subenhet av E. coli DNA polymerase III har to distinkte domener 26,27, nemlig: i) N-ter domene, som bærer 3'-5 'eksonukleaseaktivitet og vedkommende i bindingen av θ subenhet; ii) C-ter domene, som er ansvarlig for binding til α (polymerase) subenhet. Den C-ter domenet av ε er kjent for å gi dårlig oppløselighet til dette proteinet, fremme dens aggregering. Det ble faktisk vist at ε-186, en avkortet form av proteinet blottet for C-ter domene, er oppløselig, og kan renses med høyt utbytte 17. Imidlertid, når interaksjonen av ε med α må være kvantitativt undersøkt(For eksempel, for å bestemme K D i αε kompleks), er rensing av full-lengde ε kreves, noe som tyder på en biokjemisk vanskelig oppgave. I denne rammen, gir protein co-uttrykk kvalitative beregninger av bindingen av ε til α. Vi har vist at høye utbytter av det αεθ komplekset kan oppnås in vivo ved ko-ekspresjon (figur 1), utenom den dårlige oppløselighet av ε subenhet. Bemerkelsesverdig er rensingen av overuttrykt αεθ kompleks blitt rapportert 28,29. Den ko-ekspresjon strategi kan også brukes til å teste hvorvidt innsetting av stedspesifikke mutasjoner i en av de samvirkende partnere svekker kompleksdannelse. Følgelig representerer protein koekspresjon en enkel og rask verktøy for å utføre kvalitative tester av protein-protein-interaksjon. Det skal også bemerkes at vår koekspresjon systemet baserer seg på to forskjellige induktorer, det vil si, arabinose og IPTG. Derfor kan passende kontroller lett utføres ved testing dannelse av et proteinkompleks, for eksempel, å utelate en induser av bakterievekstmedium (figur 1A).
Vi presenterte her en optimalisert prosedyre for co-uttrykk for α og ε subenheter av E. coli DNA polymerase III. Når denne protokollen ble utviklet og testet, ble de følgende parametere identifisert som kritisk for suksess for koekspresjon eksperimenter: i) den temperatur ved hvilken induksjon blir utført; ii) tidslengde induksjon; iii) at konsentrasjonen av inducer (e). Spesielt var vi ikke i stand til å skaffe løselig αεθ kompleks 11 fra celler indusert ved 37 ° C, uavhengig av induksjonstiden. Vi foreslår derfor å teste forskjellige temperaturer for induksjonstrinnet, og for å kontrollere overekspresjon av proteinene som en funksjon av tid. I tillegg er den parallelle evaluering av ko-ekspresjon i different E. coli-stammer kan være til hjelp når du møter moderat avkastning av målproteinene.
Vi har rapportert her et representativt eksperiment utført for å teste bindingen av proteiner fra forskjellige arter, og vi har vist at protein ko-ekspresjon er nyttig for å teste hurtig foreningen av to heterologe proteiner inn i en hybrid funksjonelt kompleks. Gelfiltreringskromatografi ble her brukt for å evaluere kompleksdannelse (figur 3). Imidlertid kan innsetting av en passende kode til en av de samvirkende partnere forenkle denne evaluering, slik bruk av affinitet fangst metoder. For å unngå forstyrrelser av merkelappen med protein-protein-interaksjoner, kan genet som koder for en av de samvirkende partnere settes inn parallelt inn pBAD / His og pBAD / myc -his vektorer, henholdsvis en overdragelse hexahistidine motiv ved N- og C- terminus av målproteinet.
E. coli mutator stammer har mutasjonsfrekvenser høyere enn deres villtype kolleger. Mutator stammer er av interesse for bioteknologi 30, for eksempel, for å raskt utvikle seg et mål belastning mot nye, ønskede, fenotyper. Vi gitt her bevis for at ko-ekspresjon av villtype og et mutagen ε subenhet av E. coli DNA-polymerase III, mutasjonsfrekvensen for bakteriell vert kan være innstilt med tilstrekkelig praktisk. For ytterligere å forbedre denne teknologien, tett-regulerte ekspresjonsvektorer er nødvendig for å undertrykke så mye som mulig ekspresjon av sterkt mutagen D12A variant av ε subenhet. Spesielt ville det være av interesse å teste mutasjonsfrekvens i E. coli transformert med pBAD-εD12A og pGOOD1-ε, dvs. konfigurasjonen alternativ til det som presenteres her. De pBAD vektorer er faktisk kjent for å være strengt regulert 12, og denne funksjonen kan hjelpe på å holde den basale konsentrasjon av εD12Aved lave nivåer.
Eksemplene på protein co-uttrykk rapportert her vitner om det mangefasetterte natur av denne teknikken. Det er imidlertid viktig å bemerke at ved bruk av et mangfold av kompatible plasmider i E. enkelt coli-celler kan i stor grad utvide de utfordringene som kan tas opp av protein co-uttrykk. I de senere år ble intenst arbeid viet til å utvide repertoaret av kompatible plasmider som skal brukes for protein ko-ekspresjon. Spesielt ble en trefoldig system stole på kompatible plasmider bærer ColE1, p15A, og pSC101 replikasjons brukes til co-uttrykke enten bakterier og pattedyr proteiner 31. Nylig ble et kvaternært co-ekspresjonssystem rapportert. I dette tilfellet, 13 heterologe gener ble co-uttrykt i E. coli co-transformert med 4 kompatible ekspresjonsvektorene, som inneholder ColE1, p15A, CloDF13, og RSF replikasjons 32. Dette co-uttrykk systemet ble brukt til å produsere iE. coli funksjonelt aktiv løselig hydrogenase jeg fra Pyrococcus furiosus 32. For å øke vår binært system, bygget vi en ny ekspresjonsvektor, pFINE, som inneholder pSC101 replikasjonsorigo, et neomycin-resistens kassett, og Lac regulatoriske elementer (figur 4b). Dette plasmidet inneholder det samme polylinker tilstede i pBAD og pGOOD vektorer, noe som letter genet skyt blant de tre komponentene av co-ekspresjonssystem. Selv pFINE er et lavt kopitall plasmid, ble dens stabilitet funnet å være tilfredsstillende når de ble testet i rikt medium. Vi er for tiden engasjert i ytterligere utvidelse av vår trefoldig co-uttrykk system. Til dette målet, bygget vi en pBAD derivat som inneholder en kloramfenikol-motstand kassett, og vi er på vei til å bytte ColE1 replikasjons med én kompatibel med ColE1, p15A, og pSC101. Det er faktisk vår oppfatning at bruk av flere plasmider i single E. coli celler represents et kraftig verktøy for å utfordre uttrykket in vivo av protein komplekser sammensatt av en rekke ulike subenheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Den tillatelse av Springer og Elsevier til å trykke tallene er sterkt anerkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
References
- Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
- Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
- Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
- Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
- Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
- Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
- Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
- Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
- Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43 (2007).
- Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
- Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).
- Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
- DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).
- Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
- Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
- Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
- Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
- Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
- Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, Suppl 2. (2008).
- Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
- Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).
- Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
- Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
- Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E. Jr, McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).
