Abstract
Kriptokokkozis cinsi, Cryptococcus patojenik mantarların neden olduğu bir yaşamı tehdit edici hastalıktır. Enfeksiyon akciğerin derinlerine içinde replike olan sporların, teneffüs sırasında görülür. Makrofajlar tarafından Cryptococcus fagositozu hastalığı, ölümcül meningoensefalit neden merkezi sinir sistemi içine yayabilen yollarından biridir. Bu nedenle, Cryptococcus ve makrofajlar arasındaki ilişkinin incelenmesi enfeksiyonun ilerlemesinin anlamak önemlidir. Bu çalışmada C. makrofaj enfektivitesini incelemek için bir adım-adım protokolü açıklanır in vitro neoformans. Bu protokolü kullanarak, konak-patojen etkileşimleri ev sahibi steroller rolü incelenmiştir. Metil farklı konsantrasyonları - siklodekstrin (MCD), sıçangil sarkomu retikulum makrofaj benzeri hücre hattı J774A.1 kolesterol tüketmek için kullanılmıştır. Kolesterol tükenmesi doğrulandı ve ticari availabl kullanarak hem kantifıyeE kolesterol ölçümü kiti ve ince tabaka kromatografisi. Kolesterol tükenmiş hücreleri lipopolisakkarittir (LPS) ve interferon gamma (IFNy) ile aktive edilir ve 1 arasında bir efektör-hedef oranında antikor opsonize Cryptococcus neoformans, vahşi tip H99 hücreleri ile enfekte edilmiştir: 1 arasındadır. Enfekte hücreler, C ile inkübasyon 2 saat sonra izlenmiştir neoformans ve fagositik indeksi hesaplandı. Kolesterol tükenmesi fagositik indeksinde önemli bir azalma ile sonuçlandı. sunulan protokoller laboratuar ortamında enfeksiyon sürecinin başlatılmasını taklit ve enfekte ev sahibi lipit kompozisyonu rolünü incelemek için uygun bir yöntem sunuyoruz.
Introduction
Fagositoz hücre dışı kişiler konakçı hücreler tarafından olan bir süreçtir. Bu patojenlere karşı savunmak için bağışıklık sisteminin cephanelik önemli bir silahtır, ama süreç genellikle içselleştirme ve vücutta 1 yayılan sağlamak için patojenler tarafından yıkılabilir olabilir. Fagositoz konukçu hücrenin hücre iskeletinin yeniden düzenlemeler yoluyla bağlanması ve yutulma neden olan bazı sinyal olayları aracılık eder. "Profesyonel" fagositler bağlanması ve patojen yutmak ve phagosome 2 oluşturan lamellipodia oluşması için sinyal istilacı patojenin yüzeyinde opsonins ayırt eden ve bağlanan edebiliyoruz. Sözde 'profesyonel' fagositler arasında makrofajlar. Makrofajlar çoğu, arayan ve hastalığa neden olan ajanlar ortadan kaldırarak, hasarlı dokuların onarımı ve inflamasyon aracılık dahil koruyucu fonksiyonlarını yürütmek son derece uzmanlaşmış hücrelerdirfagositoz 1,2 sürecinde bu.
Cryptococcus neoformans cryptococcosis olarak bilinen ciddi bir hastalığa neden patojenik maya türüdür. Cryptococcus sporlar ev sahibi tarafından inhale ve genellikle asemptomatik bir akciğer enfeksiyonu neden vardır. Bu poz son derece yaygın olduğu düşünülmektedir; Ankete tüm bu kriptokok polisakkarit glucuronoxylomannan ve diğer çalışmalara antikor olduğunu Kliniği Bronx-Lübnan Hastanesi Merkezi'nde bulunan Çocuk Enfeksiyon Hastalıkları 61 çocuklu bir örnek, hem insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfekte olmayan ve enfekte yetişkinlerin 3 prevalansı göstermiştir 4. Alveoler makrofajlar başarıyla net patojen akciğer enfeksiyonuna ve çoğu durumda yanıtın ilk satırı vardır. Ancak, bağışıklığı baskılanmış kişilerde (örneğin, HIV ve AIDS hastaları) maya makrofajlar içinde hayatta yapabiliyor. Bunlardadavalar, makrofajlar patojenin çoğalması için bir niş olarak hizmet verebilir ve hastalık ölümcül hale 5 santral sinir sistemi (MSS) onun yayılmasını kolaylaştırabilir - 8. 11 - Bu makrofajlar hatta "Truva atı" modeli 3,9 yoluyla kan beyin bariyerini geçmeye maya yardımcı meninkslerde doğrudan maya teslim düşünülmektedir. Böylece, bu fagositoz sürecini ve özellikle kriptokoksik enfeksiyonlarda, bunu etkileyen faktörleri anlamak önemlidir.
15 - Diğer patojen sistemlerinde Önceki çalışma fagositozu 12 oynamak için önemli bir role sahip olduğu kolesterol oluşturduğu kolesterol ve lipid sallar işaret. Kolesterol, memeli hücrelerde en fazla lipit türdür ve 25 ihtiva eder - memeli hücre zarı 16, 50%. Bu BIOP modüle bir rol oynadığı tespit edilmiştirrijiditelerini 17 değiştirerek zarların hysical özellikleri. Kolesterol ve sfingolipitler birlikte lipid sallarının olarak bilinen membran lipit mikro bölgelerini oluştururlar. 18 - lipid sallarının kaveolanın oluşumu, hem de 16 sinyal belirli tipleri için, izole edilmiş bir etki sağlayan ilgili olduğu tespit edilmiştir. Nedeniyle, küçük boyutları nedeniyle, in vivo olarak, lipid sallar çalışmak zordur. Lipid sallar rolünü incelemek için yararlı bir yolu, onların bileşenleri değiştirmek için. Metil-β-siklodekstrin (MβCD) memeli zarlarda kolesterol tüketen bulunmuştur ve yaygın olarak lipid sallarının 18 rolünü araştırmak için kullanılan bir bileşimdir.
Bu protokol, konakçı hücre zarlarından kolesterol tüketen ve C fagosite konakçı hücrelerin yeteneği üzerindeki tükenmesi etkisinin belirlenmesi için bir yöntem sunmak in vitro neoformans. Bu prosedür, hücre kültürü techniq kullanırenfeksiyonu için bir model olarak hücre hattı (J774A.1) gibi ölümsüzleştirilmiş makrofaj üzerinde daah. Kolesterol tükenmesi sterol büyüklüğüne özel bir hidrofobik bir çekirdeğe sahiptir ve kolesterol zar 19 dışarı çekmek için bir havza olarak etki edebilir MβCD, maruz bırakılarak gerçekleştirilmiştir. Kolesterol tükenmesi kantitatif olarak ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak ve niteliksel olarak ince tabaka kromatografisi (TLC), daha sonra da 20 modifiye edilmiş bir Bligh-Dyer lipid ekstraksiyonu kullanılarak ölçülmüştür. . 23 - fagositoz makrofajları aktive edilmesi için, interferon-γ ve lipopolisakkarit bir kokteyl ile karıştırılır opsonize bir maya kültürünün hücre hattı enfekte ölçülmüştür Cryptococcus bir glucuronoxylomannan (GXM) antikor ya 21 ile opsonize edilmiştir. Boyama ve mikroskopi deneyleri fagositoz derecesini değerlendirmek için hücrelerin görselleştirme ve fagositik endeksinin hesaplanmasında izin verdi. Bu protokol d birlikte ele alındığındafizyolojik bir süreç ile, lipid bileşimin değiştirilmesini entegre temel bir metodu escribes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MβCD ile J774A.1 Hücreleri 1. Kolesterol tükenmesi
- Steril bir biyo-güvenlik kabini, tohum 10 5 J774A.1 makrofaj-benzeri hücreler, göz başına,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde 200 ul% 1, 96-iyi hücre kültür plakası üzerine penisilin / streptomisin (P / S). 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5 CO2 O / N.
- Hücre mono tabakasının ortamı çıkarın ve süzüldü otoklave edilmiş 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez yıkama hücreleri.
- Bir kontrol olarak, istenen konsantrasyonda (10, PBS içinde mM ya da 30 nM) ya da 1x PBS'den MβCD çözeltisi 200 ul ilave edin ve çalkalanarak 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir. Hemen prosedürü izleyerek piyasada mevcut kiti ile kantitatif analiz için oda sıcaklığında yüzer ve rezerv çıkarın.
- 1x PBS veya serum ücretsiz DMEM ile hücreler 2-3 kez yıkayın ve pipetti tarafından enfeksiyon veya lize hücreleri ile devamince tabaka kromatografisi ile ya da bir kit ile analiz için deiyonize H2O ile 2-3 kez ng.
NOT: Bir piyasada mevcut kolesterol ölçümü kiti kullanılabilir kolesterol tükenmesi sonrasında. Ayrıntılar için malzeme bölümüne bakın. Yazılı olarak üreticinin talimatlarını izleyin.
İnce Tabaka Kromatografisi ile kolesterol içeriğinin 2. Gözlem (TLC),
- Petrol eter çözeltisi ile, iki kez aseton ile ve bir kez bir TLC tankı yıkayın: dietil eter: asetik asit (65: 30: 1 hacım bazında). (Hacme göre 1 65: 30) solüsyonu ve / N O bırakmak asetik asit: dietil eter: petrol eteri ile tankı Doymuş.
Not: Organik çözücü, her zaman Buhar, önlemek için bir davlumbaz altında kullanılmalıdır. Eldiven ve laboratuvar önlüğü her zaman giyilmelidir. Asetik asit güçlü bir asittir ve dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. - 6-çukurlu ce üzerinde oyuk başına steril biyo-güvenlik kabini, tohum 10 6 J774A.1 makrofaj benzeri hücre% 10 FBS ve% 1 P / S ilave edilmiş, sıcak DMEM, 5 ml lik bir hacim içinde ll kültür plakası. % 5, 37 ° C'de inkübe CO2 göre O / N.
- 1.4 büyük kuyu boyutu hesaba uygulanan 200 ul için 1 ml ikame - adımları 1.2 izleyerek kolesterol makrofajlar tüketmek.
- Her bir oyuğa Tripsin-EDTA, 500 ul ekle 37 ° C 'de 3 dakika süre ile inkübe edilir ve yavaşça bir hücre kazıyıcı ile hücrelerin kazıyın.
- Bir mikrofüj tüpü içine transferi ve% 10 FBS ve% 1 P / S ilave edilmiş, sıcak DMEM ek bir 500 ul ilave edin.
- 300 x g'de 5 dakika boyunca hücreleri Spin ve süpernatant kaldırmak.
- Hücre pelet% 10 FBS ve% 1 P / S ile takviye sıcak DMEM ek 500 ul ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme dikkatlice tekrar süspansiyon.
- Hücrelerin 10 ul çıkarın ve bir hemasitometre hücreleri saymak. Her bir örnek hücre konsantrasyonları normalize ve cam tüplere hücrelerin eşit sayısı ekleyin.
NOT: Bu aşamada, bir mayısBir daha konsantre son lipid özü elde etmek için aynı tedavi grupları hücreleri birleştirmek için seçin. - Santrifüj hücreleri ortam oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de çıkarın.
- Metanol ve vorteks 2 ml ekleyin. Daha sonra, kloroform ve girdap 1 ml. Monofazik emin çözüm yapmak için faz durumunu kontrol edin.
Not: tüpler 4 ° de CO / N saklanabilir. - Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1700 x g'de santrifüj ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın
- DH 2 O, 1 ml, ardından kloroform ilave edilmiş, 1 ml ilave edilir Iki kez 30 saniye vorteksleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1700 x g'de santrifüjleyin.
- Hassas bir denge üzerinde bir cam tüp tartılır ve ağırlığı bilinen cam tüp içine alt faz aktarmak için bir cam Pasteur pipet kullanın.
- Kuru (yaklaşık 2 saat) kadar bir santrifüj buharlaştırıcı içinde lipitleri kurutun. Kurutuldu lipidler ile tüp tartılır ve kuru lipit ağırlığı hesaplamak.
Not: Kuru lipid TLC gerçekleştirmek için hazır olana kadar, -20 ° C de muhafaza edilebilir. - (- 50 ul genelde 20) ve bir silis TLC plakası üzerindeki seyreltilmiş lipid yükü 20 ul lipid konsantrasyonunun normalleştirmek için yeterli kloroform içinde tutularak kurutulmuş lipitlerin seyreltin. Yük 20, bir standart olarak kloroform 20 ul seyreltilmiş kolesterol ug.
- Doymuş TLC tankına kurutulmuş TLC plakası ekleyin ve plaka kenar önce 1 cm kadar göç solvent sağlar. Tanktan TLC plakasını çıkarın ve yaklaşık 5 dakika kurumasını bekleyin.
- Göçü kontrol etmek için bir iyodin buhar tankında yerleştirerek lipit görselleştirmek. Çıkarın ve lekeler yaklaşık 10 solmaya izin - kaputun altında 15 dakika.
NOT: İyot bir inhalasyon tehlikesi. Her bir davlumbaz altında kullanın. - Deiyonize H2O 60 ml, sülfürik asit, 4 ml ve mangan klorür 630 mg 60 ml metanol un birleştirilmesi ile nötral bir lipid boyama için bir çözelti hazırlayın.
- Dikkatle ve yavaş yavaş bir tepsiye nötral lipid boyama çözeltisi içine TLC plakası daldırma ve silis l kapalı sloughing olmadan kaldırmakAyer.
Not: nötral lipid boyama çözeltisi bir kaç kez tekrar edilebilir ve bu tepsinin alınabilir ve daha sonraki kullanım için bir şişe içinde geri bırakılır. - Tüm kabarcıklar kaybolana kadar plaka oda sıcaklığında kaputun altında kurumaya bırakın. Istenilen renkte bir ısıtma bloğu 160 ° C'ye set ve karakter üzerinde TLC plakası ısıtın.
NOT: Böyle Vizyon İşleri LS gibi bir dansitometri programı lipit örnekleri karşılaştırmak için kömürleşmiş bantları ölçmek için kullanılabilir.
C ile Makrofagların 3. Enfeksiyon neoformans (H99)
- Steril bir biyo-güvenlik kabininde, DMEM 200 ul, 96 gözlü bir hücre kültürü plakasında tane 10 5 makrofaj-benzeri hücreler,% 10 FBS ve% 1 P / S ile takviye edilmiştir. 37 ° C,% 5 CO2,% 5 CO2 göre O / N inkübe edin.
Not: Enfeksiyon cam yapılabilir kolay görüntüleme için konfokal yemekler dipli; Tüm tutarlar aynı kalır. - C'lik bir kültür büyütün neoformans (H99)Çakılmış plaka elde edilen bir koloni ile YNB 10 ml aşılama ve çalkalanarak 30 ° C'de g / Ç N inkübe edilerek.
- Yıkayın ve C sayısı neoformans (H99) hücreleri.
- Santrifüj C. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1,700 x g hızında neoformans O / N kültürü.
- Ortamı çıkarın ve atın. 1x PBS, 5 ml hücreleri yıkayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1700 x g'de santrifüjleyin.
- PBS çıkarın ve süzüldü 1x 5 ml PBS ile yıkayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1700 x g'de santrifüjleyin. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın.
- PBS çıkarın ve 1 x PBS, 5 ml olarak yeniden süspanse edin.
- Yıkandı, kültür: 500 oranında seyreltilmiş PBS'de bir seri seyreltme, 1 elde etmek üzere olun.
- 1:10 seyreltme elde etmek için 1x PBS 900 ul orijinal numune 100 ul ekle.
- 100 seyreltme: 1 elde etmek için 1x PBS 900 ul 1:10 seyreltilmiş numune, 100 ul ekle.
- 500 diluti bir 1: elde etmek için 1x PBS 800 ul seyreltilmiş örnek, 100: 1 200 ul ekleüzerinde
- 1 10 ul alın: 500 seyreltme ve hücrelerin sayısını hesaplamak için hemasitometre saymak.
- C makrofajlar aktive ve opsonizasyon için çalışma çözeltisi hazırlayın neoformans.
- 990 ul 10 ul ekleyerek stok çözümleri LPS ve IFNy 100x seyreltin.
Not: LPS IFNy fagositik alımını güçlendirmek üzere kullanılır ancak fagositosis için gerekli değildir. Makrofaj fungisit aktivite, bir ilgi ise, enfeksiyondan önce çalkalama ile 37 ° C'de etkinleştirme O / N gerçekleştirin. - Numune başına seyreltilmiş LPS 7.5 ul, seyreltilmiş IFNy 1.25 ul, GXM antikor 1.25 ul ve C hacmini birleştirmek 1.25 x 10 5 hücre verir neoformans kültürü. % 10 FBS ve% 1 P / S ile desteklenmiş DMEM ile numune sayısı ile çarpılır 250 ul kadar hacmi getirin.
- Vorteks ve çalkalanarak 37 ° C'de 20 dakika boyunca çözelti inkübe edin.
NOT:Opsonizasyon adım ile eş zamanlı olarak yapılabilir - Kolesterol tükenmesi (1.4 1.2 adımları). Opsonize edilmiş hücreler optimum adım 3.4.3 inkübasyon aşağıdaki 20 dakika daha uzun kullanılması gerektiğini gibi, çalışma çözümü birleştirerek önce makrofajlar tedavi emin olun.
- 990 ul 10 ul ekleyerek stok çözümleri LPS ve IFNy 100x seyreltin.
- Makrofajları enfekte
- Yıkama makrofajlar iki kez serum serbest DMEM ile ve opsonize C 200 ul ekleyin neoformans her iyi çözüm çalışıyor.
- 37 ° C'de 2 saat süreyle inkübe edin.
- Düzeltme ve Leke Hücreler
- Ortamı çıkarın ve DMEM ile hücreler 2 kez yıkayın.
- Hava, 10 dakika boyunca, hücre tekli tabakası kuru ve hücreleri düzeltmek için buz gibi soğuk metanol 200 ul ilave edin.
- 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin ve kalan metanolü uzaklaştırmak.
- 10x Giemsa 200 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
- Kapalı kapaklı iyonu giderilmiş su ve kuru O / N ile 3 kez 2 - yıkayın.
NOT: Görüntüleme haftada followi ertesi gün yapılması veya yukarı olabilirng boyama.
- Görselleştirmek ve Kont
- Bir mikroskop (oyuk başına 150 sayısı, aynı tedavi 2 varsa) veri alanına 300 hücrelerin sayısı ve saran, Cryptococcus hücrelerinin enfekte olmuş makrofaj sayısı ve sayısı not edin.
NOT: durumun başına veri noktası kullanım başına 2 tabak örnekleme bile emin plaka başına 3 örtüşmeyen alanları seçmek ve alan başına 50 hücreleri saymak için. - C ortalama sayısına göre enfekte makrofajlar yüzdesini çarpılarak fagositik indeksi hesaplamak makrofaj başına neoformans. 1x PBS yüzde kontrolünü ele gibi değerleri ifade ederek fagositik indeksi Normale. Birkaç denemeden sonra ortalama değeri ve fagositik indeksi eğilimleri belirlemek için ortalama standart sapmayı hesaplamak. Önemini belirlemek için Student t-testi kullanın.
- 1,000X veya 400X büyütmede hücrelerin mikrograflanm alın.
- Bir mikroskop (oyuk başına 150 sayısı, aynı tedavi 2 varsa) veri alanına 300 hücrelerin sayısı ve saran, Cryptococcus hücrelerinin enfekte olmuş makrofaj sayısı ve sayısı not edin.
4. Tripan Mavisi Deneyi
- Steril bir biyo-güvenlik kabini, tohum 10 6, makrofaj-benzeri hücreler, göz başına bir hacimde bir 6-yuvalı hücre kültürü plakasının üzerindeki 5% 10 fetal büyükbaş hayvan serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco minimal esas ortamı (DMEM) içinde mi . % 5, 37 ° C'de inkübe CO2 göre O / N.
- Daha büyük kuyu boyutu hesaba uygulanan 200 ul için 2 ml ikame 1.4 - 1.2 adımları takip ederek kolesterol makrofajlar tüketmek.
NOT: 1x PBS yanı sıra herhangi bir tedavi öncesinde kazınarak bir kumanda ile tedavi edilen bir kontrolü de emin olun. - Iyi her 1x PBS 500 ul ekleyin ve hafifçe bir hücre kazıyıcı ile hücreler kazıyın. Bir mikrofuge'de tüp içine aktarın ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri askıya.
- % 4 Tripan mavi 1 ul hücre ve leke, 10 ul çıkarın.
- Bir hemasitometre hücre sayımı ve aşağıdaki denklem kullanılarak sağ kalabilirliğinin hesaplanması:% canlılığı = [1 - (Mavi hücre / toplam hücre)]Tedavi edilmeyen oldu kontrolü x 100 Normale değerleri. Birkaç denemeden sonra ortalama değeri ve canlılığı eğilimleri belirlemek için standart sapmayı hesaplar. Önemini belirlemek için Student t-testi kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kolesterol tükenmesi
1x PBS kontrol ile karşılaştırıldığında Amplex Red Kolesterol Test kitinde, üretici talimatlarına göre protokol aşama 1.3 ayrılmış yüzer analizi MβCD ile muamele edilen numune kolesterolün yüksek bir konsantrasyonu elde edilir. Hücre tipine ve MβCD konsantrasyonu, kullanılan kolesterol azaltımı bağlı olarak değişebilir. 10 mM MβCD ile muamele J774 için, yaklaşık% 50 oranında bir azalması görülmektedir. Boşaltma 1.4 adım (Şekil 1) toplanan süpernatan ve hücre lizatı elde edilen değerleri kullanılarak hesaplanabilir.
TLC ile analiz Hücre lizatı MβCD (Şekil 2A) artan konsantrasyonu ile muamele edilmiş hücreler içinde kolesterol boyama belirgin bir azalma göstermektedir. TLC Dansitometrisi analizi kantitatif analizde (Şekil 2B) benzer bir eğilim göstermektedir. Bligh-Dyer yöntemi ham ext verirtoplam lipidlerin ract ve kolesterol standart kullanan doğru bandını belirlemek üzere lipitlerin yeterli ayrılması için izin vermek için gereklidir.
Enfeksiyon
Enfeksiyon prosedürü izleyerek sonra, hücreler yapışmış ve bozulmamış kalır. Hücre morfolojisi, tedavi grupları arasında değişmeden kalır. C'ye maruz kalmamış bir kontrol grubu neoformans bir kontrol noktasında (Şekil 3) olarak hizmet vermektedir. Bu optimal sonuçlar elde etmek mümkündür ve hücreleri ve diğer anormal morfolojilerin parçalanması olarak tezahür edebilir. En muhtemel nedeni, prosedürde kullanılan hücre hattı veya reaktiflerin kirliliktir. En iyi şekilde enfekte olmuş hücrelerde mikrograflar açıkça C göstermektedir neoformans, memeli hücreleri içinde içine aldı. Fagosite maya sayısındaki farklılıklar tedavi grupları arasında gözlem (Şekil 4) ile tesbit edilebilir. Tedavi grubu a başına 300 makrofaj hücrelerinden fagositik indeksi hesaplandıktan sonrafagositik indeksi azalma kolesterol tükenmiş hücrelerde (Şekil 5) bulunur. Onlar oluşabilir rağmen fagositik indeks azalma, makrofaj aktivasyon potansiyel farklılıklara bağlı olarak görünmüyor. Makrofaj etkinleştiriciler yokluğunda enfeksiyon gerçekleştirme, ancak fagositik indeksi benzer bir azalma MCD sonuçları ile muamele edildikten sonra (veriler gösterilmemiştir).
Tripan Mavi
Tripan Mavi boyama kolesterol tükenmesi sonrasında hücrelerin canlılığını değerlendirmek için kullanılır. PBS tedavi ve 10 mM MCD hücrelerini tedavi arasındaki canlılığı herhangi bir değişiklik görülmektedir. Canlılık, dansitometre analizi (Şekil 6 ve Şekil 2B) gözlenen kolesterol yaklaşık% 75 azalması nedeniyle beklenebilir 30 mM MCD, (esansiyel yağ) ile muamele edildikten sonra bir miktar bırakmak için açılır.
PBS 1x göre tedavi sonrası. Muamele hücrelerden toplanan süpernatant kolesterol Niceleme süpernatantının Şekil 1. Kolesterol içeriği MCD olarak zenginleşme göstermektedir. Kolesterol inceltme 1x PBS (süpernatan + hücre lisatı) toplam kolesterol hesaplandı 50 ±% 5'tir. Hata çubukları, standart sapmayı gösterir (n = 5).
Lizatının ve dansitometri. MnCİ2 kömürleşmesine ile görüntülendi geliştirilen TLC plakası resmi kolesterol 2. TLC Şekil. Kolesterol belirgin bir azalma MβCD işlem (A), sonra görülür. PBS (% 100 olarak gösterildiği gibi) tedavi kontrolü ile karşılaştırıldığında bantların, dansitometre analizi (B kolesterol ölçümü deneyde bulunan eğilimi teyit Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil tedavi J774 makrofajlar 3. Enfekte olmamış kontrol mikrograflan. 200X büyütmede çekilen bulaşmamış J774 hücreleri görüntüleri. Ölçek çubuğu 50 mm. 1x PBS (A), 10 mM MβCD (B), ve 30 mM MβCD (C) tedavi hücreler hiçbir değişiklik gösteriyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
J774 Şekil 4. Enfeksiyon ile makrofajlarC. neoformans 400X alınan enfekte J774 hücreleri görüntüleri (üst satır A.1 - C.1). Ve 1,000X (alt sıra A.2 - C.2) büyütme gösterilmiştir. Içsel C neoformans hücreleri onları çevreleyen hafif bir halka ile mavi-mor küre şeklinde görünür. 1x PBS (A), 10 mM MβCD (B) ve 30 mM MβCD (C), C. farklılık göstermektedir ile muamele edilmiş hücreler, neoformans çekmesi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Fagositik dizini. Fagositik göstergesi (karşılaştırma için 100 ° C'de işaretlendi) PBS ile muamele edilmiş kontrol grubu ile ilgili olarak gösterilmiştir. Fagositik indeksi 10 ile% 25 oranında düşürülmüştürmM, 30 mM tedavisi ile tedavi ve neredeyse% 55 oranında MβCD. Hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir (n = 4).
Her üç tedavi grupları karşılaştırırken Şekil 6. Hücre canlılığı. Tripan mavisi analizi ile hücre canlılığı varyasyonlar az bir değişiklik gösterirler. Membran böyle önemli bir bileşeni tükenmesi beklenen olabilir 30 mM MβCD tedavi grubunda canlılığı kapalı hafif bir düşüş var. Hata çubukları, standart sapmayı gösterir (n = 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol ile çalışırken bu C memeli hücreleri kaplama ve opsonizasyon zaman doğru hücre sayılarını elde etmek önemlidir neoformans hücreleri. Bu çalışmalar arasındaki varyasyon en aza indirir ve doğru 1 sağlar: çalışma boyunca efektör oranı 1 hedef. Ayrıca prosedürler arasında oda sıcaklığında istirahat opsonize maya hücreleri ya da muamele edilmiş makrofaj hücreleri önlemek için kolesterol azaltımı ve enfeksiyon zamanlamasını koordine edecek tarzda önemlidir. Enfeksiyon başlamadan önce uzun bekleme süreleri antikor opsonitasyonunu kaybı veya tükenmiş kolesterol tazelenmesi yol açabilir. Deneyler hassasiyetle yapılır Eğer sonuçlar fagositoz kolesterol rolü hakkında ayırt edilmesi için veri analizi sağlar.
teknik sınırlamaları kolesterol azalması hücreleri gibi makrofaj fagositik indeksi düşürür belirli bir mekanizma konusunda herhangi bir sonuç önlemek ve ef olup olmadığı açık değildirfect nedeniyle kolesterol veya bağlı ikincil bir mekanizmaya doğrudan. Bu ven boyunca daha fazla çalışma örneğin Fcy reseptörü ve kompleman reseptörü olarak fagositozda işlevine bilinen sfingolipidler veya proteinler gibi lipit sallar diğer bileşenleri inceler 3 2. Bir rol ayırt yardımcı olabilir antikor opsonizasyonunu kullanabilirsiniz ya da tek başına tamamlayacak bu tekniği değiştirme Bu bilinen yolların biri veya her ikisi de kolesterol. Bu MβCD hidrofobikliği ve büyüklüğü, dolayısıyla benzer büyüklükteki steroller de tükenmiş olabilir ve bir TLC üzerinde kolesterol gibi benzer bir oranda göç edecek dayalı kolesterol özler olduğunu hatırlamak da önemlidir. Aynı zamanda, kısmen, makrofaj aktivasyonunu etkileyebilen kolesterol tükenmesi dikkat etmek önemlidir, bu IFN-y ve LPS yokluğunda enfeksiyon gerçekleştirmek gibi alımında gözlenen farkın sorumlu olduğu C alımında aynı azaltma mümkün gösteriyorsa, neoformans (veriler gösterilmemiştir), buBu ilgi t makrofajların anti-mantar aktiviteleri ve aktivasyon rolünü araştırmak için bu tekniği değiştirirken. Bu yöntem aynı zamanda bize kolesterol tükenmesi mantar enfeksiyonu herhangi bir terapötik etkileri olup olmadığını ayırt etmek izin vermez. Kolesterol düşürücü ilaçlar ve ayrıca hastalığın tedavisinde kolesterol azaltımı için bir rol aydınlatmak olabilir ve kolesterol birikmesini inhibe etmek için daha seçici bir yol olarak kolesterol düşürücü ilaçlar kullanan hastaların epidemiyolojik çalışmalar ile in vivo olarak daha fazla çalışma.
Bu işlem kolay bir şekilde diğer patojenler veya katı parçacıkların alımının etüd edilmesi için kullanılabilir (yani, cam boncuklar) fagosite ve fagositoz temel biyoloji çalışmaları için izin edilir. Değişiklikler seçici diğer membran bileşenleri veya bazı ilaçlar ve inter olabilir inhibitörleri indirgeme enzimleri ile makrofaj hücreleri tedavi fagositozun diğer yönleri çalışma için izin verebilirKur. Ayrıca akış sitometrisi fagositoz karakterize etmek için daha doğru ve niceliksel bir şekilde ortaya çıkabilir ve doğrudan mikroskobik sayımı 24 yerine kullanılabilir olduğunu belirtmek gerekir. Tamamen, bu lipidler enfeksiyon ve bağışıklık yanıtında önemli bir rol oynayabileceğini nasıl sorulara cevap derinlik çalışmalarında daha bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir oldukça basit bir tekniktir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe MDP için AI56168, AI71142, AI87541 ve AI100631 tarafından desteklenmiştir. Maurizio Del Poeta Enfeksiyon Hastalıkları Burroughs Wellcome Araştırmacı olduğunu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations |
| Orbital shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S meaures down to 0.1 mg | |
| Glass Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass bottom confocal dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/ml | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 °C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
References
- Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
- Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173 (2012).
- Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
- Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
- Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
- Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
- Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
- Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
- García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
- Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).
- Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
- Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
- Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
- Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
- Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
- Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
- Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187 (2012).
- Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).
