Abstract
Aşağıdaki protokol bozulmuş kardiyak işlev veya miyokard çarpıcı şu ılımlı iskemik hakaret değerlendirmek kullanımı gereksizdir. tekniği Kardiyoplejik tutuklama ve kardiyopulmoner bypass, off-pump KABG, nakli, anjin, kısa iskemi, vb kardiyak cerrahi de dahil olmak üzere çok sayıda klinik açıdan fenomen ile ilişkili iskemik yaralanma modelleme için yararlıdır. protokol miyokard kasılma fonksiyonu ölçümü odaklanan kemirgen kalplerinde hipotermik hiperkalemik kardioplejik tutuklama ve reperfüzyon modeli genel bir yöntem sunar. Kısaca, bir fare, kalp, Langendorff modda perfüze bir intraventriküler balonuyla Araçlı ve temel kardiyak fonksiyonel parametreler kaydedilir. Stabilizasyon sonrasında kalp diyastolik tutuklama başlatmak için kardiyo hipotermik kardiyopleji çözeltisi infüzyonu bilgilendirmek maruz bırakılır. Kardiyopleji 2 saat boyunca aralıklı teslim edilir. Bundan sonra, kalp reperfüzyon ve warme olduğuNormotermik sıcaklık ve miyokard fonksiyon geri d izlenir. Kemirgenlerde brüt miyokardiyal doku hasan serbest güvenilir bir depresif kardiyak kontraktil fonksiyon bu protokol sonuçlanır.
Introduction
Çarpıcı miyokard iskemi veya kardiyo 1,2,3,4,5 ile iskemik hakaret uzun süreli kısa bir süre izleyen yeterli kan akımının restorasyon rağmen geri dönüşümlü azaltılmış kontraktil aktivite olarak tanımlanır. sunulan yöntem, özellikle kasılma fonksiyonunda geri dönüşümlü bozukluklar neden olabilir klinik olarak anlamlı iskemik hakaret modellemek için kullanılır (örneğin, kalp cerrahisi kardiyoplejik arrest, iskemi, anjin, vb kısa dönemleri kullanan ilişkili iskemik hakaret). Şiddetli iskemi çalışmaları (miyokard infarktüsü, nekroz) aksine bu protokol doku hasarı, yeniden ve hücre ölümüne olmadan miyokard fonksiyonel iyileşmeyi ve kardiyo değerlendirmek için geliştirilmiştir. Kağıdın çoğunluğu hipotermi ve aralıklı kardiyopleji teslim kullanarak kalp cerrahisi benzer unsurları ile standart bir kardiyopleji tutuklama protokolünü anlatılır.
Miyokard protKalp ameliyatları çoğunluğu sırasında ection kardiyoplejisinin ve kardiyopulmoner bypass dayanır. Kardiyoplejisi (CP) çözümleri ve stratejileri (kan, kristaloit, soğuk, sıcak, vs.) yaygın olarak farklılık gösterse de en sık görülen unsurlar, 1) hiperkalemi ve / veya dolayısıyla miyokard kasılması kaynaklanan enerji kullanımını sınırlayan, diyastol kalp tutuklama diğer stratejiler ve 2) hipotermi metabolizmasını yavaşlatır ve tutuklanan iken ATP ve diğer enerji rezervlerini korumaya yardımcı olmak için. Güncel kardiyopleji çözümleri, aksi takdirde ölümcül olduğunu kanıtlayacak iskemik hakaret karşı kalbe koruma sağlar. Ancak cerrahi iskemik hakaret sırasında kalbi koruyucu stratejiler mükemmel değildir ve elde edilen hafif iskemik hasar yeterli kan akımı olmasına rağmen geri dönüşümlü kalp kasılma bozukluğuna neden olabilir (çarpıcı miyokard), asidoz, kardiyomiyosit hasar ve azalmış koroner perfüzyon ve vazospazm gibi vasküler etkiler.
Bu protokol farklılıkkısa iskemi veya kardiyoplejik arrest ile ilişkili iskemik hakaret aşağıdaki bozulmuş kardiyak fonksiyon neden olabilir miyokard enfarktüsü ve hafif iskemik hakaret değerlendirir şiddetli iskemi değerlendiren standart izole kalp iskemi modelleri. (- 8 Langendorff perfüzyon teknikleri ve I inceleme için / R çalışmaları 6 bakınız). Genel kurallar ve fare izole perfüze kalpleri ile ilişkili deneysel parametrelerin ayrıntılı bir analizi için Sutherland e t al bkz. 2003 Burada sunulan tekniğin güvenilir fare kalplerinde çarpıcı ikna etmek için gerekli ekipman, reaktifler, adımları, stratejileri ve ipuçları ayrıntıları 9. Küçük değişiklikler sıçanlara tekniği uygulamak için gereklidir.
Kısaca izole fare Langendorff bir hiperkalemik hipotermiye teslim üzerinden soğuk korunan kardiyak arrest, fizyolojik Krebs-Henseleit tamponu (KHB) yaklaşık 30 dakika boyunca perfüze izlenmektediric Kardiyoplejisi çözüm. Tutuklanmasının ardından, kardiyak fonksiyonel iyileşme, yeniden ısıtmadan ve KHB ile kalbin reperfüzyon sırasında izlenir. Kalp kasılma fonksiyonu iyileşme derecesi değişiklikler kalbi koruyucu maddeler ve farklı kardiyo stratejileri değerlendirmek için değerlendirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm Prosedürler ömrü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve 10 Kullanımı için Ulusal Araştırma Konseyi Kılavuzu'na göre tüm hayvanlar ve prosedürler ile kabul edildi.
Devre İzleme 1. Balon İmalat ve Sol Ventrikül Basıncı
- Bir karıştırma çubuğu ile bir çanak içinde. Miller ve arkadaşlarına göre 11 LV balon Construct sıcak bir levha üzerinde 9.5 ml damıtılmış su, ışık mısır şurubu ve 14.2 ml sükroz 33.8 g, ve ısı karışımı, şeker eriyene kadar karıştırın . Yaklaşık 150 ºC ulaşana kadar ısıtma çözümü devam edin.
NOT: Çok sayıda yöntemler kondom ipuçları ve sarılmak film yapım 9,12 değişiklik de dahil olmak üzere AG balonları oluşturmak için vardır. Ancak sarılmak film balonları bir avantaj uygun FREKAN önceki karakterizasyonu içerir, yukarıdaki yöntem kaçak serbest balonları oluşturmak için nispeten kolay bulmakCY-cevap ilişkileri, 9. - Uzunluğunda parçalara yaklaşık 5 cm kuru spagetti ipliklerini kırın ve şeker çözeltisi içine yaklaşık 1 cm derin her parçanın bir tarafını batırın ve yavaşça çıkarın.
- Bir polistiren köpük bloğa makarna telin kuru ucunu yerleştirin ve şeker karışımı aşağı damlar ve bir gözyaşı şekli kalıp oluşturur, böylece askıya. Kalıp sertleşir yani bir desikatörde O / N bırakın.
- Ertesi gün, silikon jel içine dağılma kalıpları batırın. 2 saat boyunca veya kuruyana kadar aa 37 ºC fırında geri polistiren köpük bloğu ve yerine makarna ipliklerini yerleştirin. Bir kez daha, böylece silikon, iki kat tatbik edilir yineleyin.
- Kuruduktan sonra, birkaç saat süre ile su içinde bir yer kalıptan balonun çıkarılmasına yardımcı olmak için. % 0.02 sodyum azid çözeltisi saklayın balon.
- Künt ucu oluşturmak için bir iğne kesme ve iğne çentikler yerleştirerek özelleştirilmiş bir balon kanül üretmek için ayarlanmış bir 23 G kan toplama kullanın.
- Trans bir basınca boru bağlayınredüktörüdür ve boru ve kanül tutarken suyla yıkayın tamamen sisteme hava girmesini önlemek için batık. Kanül üzerine suyla dolu olan bir balon yerleştirin ve kanül üzerine kravat 2-0 ipek sütür kullanın. Basıncı muhafaza yeteneği ile test balonu (en az 1 saat boyunca ~ 100 mmHg)
İzole edilmiş kalp Perfüzyon Sistemi 2. Hazırlık
- Başlangıçta, yıkama ve sistem sıcak. Langendorff cihazına bağlı olan bir 37 ºC sıcak su banyosu sirkülatör açın ve distile su ile tampon deposunu doldurun. Aparat akan boru ve sistemi temizlemek için pompa açmak için yeni bir cam elyaf filtre takın. Hazırlık sırasında, bir sıcaklık probu kullanılarak Langendorff bloğu kovulan suyun sıcaklığını izlemek o su banyosu doğru ayarlanmış olduğundan emin olmak için. Ayrıca, bir buzdolabında sirkülasyon pompası açmak ve kalbin Kardiyoplejik tutuklama sırasında kullanılacak 20 ºC ayarlanır.
- BENn Bu arada aşağıdaki çözümleri hazırlamak. 1 kardiyopleji çözeltisinin L (110 mM NaCI, 16 mM KCI, 16 mM MgCI2, 1.5 mM CaCl2, 10 mM NaHCO 3) ve filtre hazırlayın. Ayrıca, KHB (118 mM NaCI, 4.8 mM KCI, 1.2 mM KH 2 PO 4, 1.7 mM MgSO 4, 2 mM Na-piruvat, 6 mM dekstroz, 2 L 'nin Hazırlanması 24.9 mM NaHCO 3 (ön-gazlı CO2 ile) , 1.4 mM CaCl2 (son eklenen). Bir kez hunisi sırlı bir 5 mikron camını kullanarak bir balona filtreleyerek çökeltiler kaldırın. Buz üzerinde küçük bir çanak içine bazı cerrahi ve izolasyonu sırasında kullanılmak üzere koyun, çözünmüş.
- Kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca% 95 O 05/02% CO2 ile perfüzat (KHB) oksijen. KHB ile perfuse Langendorff sistemi sisteminden kalan suyu çıkarmak ve rezervuar tampon. Fare için, ~ 2.0 ml / dakika için ilk pompa hızını ayarlayın. Perfüzyon kanül yakın 2-0 ve 4-0 ipek sütür yerleştirin. Boru ve aparat zekâ dolana kadar pompayı çalıştırınH Perfüzat ve kabarcık Strup temin perfüzat ile doldurulur.
NOT: şiddetle tavsiye edilir perfüzyon ve istikrarlı fonksiyonu uzun süreler için kalbinde pıhtı oluşturan herhangi bir çökeltilerin toplamak için perfüzyon devresinde bir in-line cam elyaf filtre (~ 1 mikron) yüklemek için
3. Fare Cerrahisi
3.1) Fare Anestezi ve Taşıma
- 80 mg / kg ketamin ve 5 mg / ml ksilazin karışımı anestezi dozu ile şırınga hazırlayın ve 0.2 ml hacmi getirmek için steril% 0.9 tuzlu su ekleyin. Heparin IP (1000 U / ml çözeltisinin 50 ul) enjekte edilir.
- Taşıma kabı (~ 10-20 dk) geri fare yerleştirin ve heparin yürürlüğe gibi bilincini kaybetmek için bekleyin. Periyodik ağrı refleks izlemek için bir ayak tutam yapmak.
3.2) Kalp kaldır
- Fare tamamen bilinçsiz ve ayak tutam yanıt işaretçilerine veya 25 G kullanılarak uygun bir ameliyat masasına sabitleyin değil kez ekstremitelerde yoluyla şırınga ipuçları. Kalbi ortaya çıkarmak için bir torakotomi gerçekleştirin. Sadece sternum altında küçük bir delik kesin ve diyaframı kaçınarak fare kenarlarına kesim uzatmak.
- Hızla diyaframı kesti ve sonra hızla göğüs kafesinin yanlarını yukarı kesti. Göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için bir istiridye kabuk gibi göğüs kafesini geri çevirin. Yavaşça, kalp tutun altına makas yerleştirin ve kalp kaldırmak.
NOT: O göğüs boşluğunda maruz kalan ve akciğerler olmayan fonksiyonel bir kez hızlı bir şekilde kalp kaldırmak esastır.
3.3) Kalp temizleyin
- Çanak içeren buz gibi soğuk KHB içine kalbini yerleştirin ve bağlı akciğer dokusunda herhangi bir büyük parçalarını keserek. Kalbini alıp aorta bulmak için forseps kullanabilir. Yavaşça kalbi sıkmak ve bu aortun açık ucu olması gerektiği gibi, görünen herhangi bir kan arayın. Aortun açık sonuna kadar kalbini tutmaya ince uçlu cımbız kullanın.
4.1) Montaj ve Kalp cannulating
- Langendorff aparat kalp taşımadan önce, perfüzyon basıncı düşük olmasını sağlamak pompası (~ 20 mmHg) açın. Sadece kanül altında aort kalbi tutun. Ince uçlu cımbız başka bir set kullanarak dikkatlice aort açın ve kanül üzerine kalbi yukarı kaydırın. Cımbız seti ile yerde tutun ve daha sonra geçici kanül sabitlemek için yumuşak kenarlı klibi kullanın.
NOT: Hızla perfüzyon kanül kalbi montaj iyi bir hazırlık için kritik öneme sahiptir. Tecrübesi ile, kalbi montaj kadar göğüs boşluğu açmasını prosedürler 1 ila 2 dk almalıdır. - Doğrudan klibi altında kanül 4-0 ipek dikiş güvenli aort kullanarak, kravat ve aşağıdaki gibi perfüzyon başlatmak. Sıkarken aort bağladı almaz böylece kravat, metal aort kanül etrafında da olduğundan emin olundüğüm. Tek kravat sıkıca yerleştirildikten sonra, klibi silmek.
- Aort geliyor olabilecek damar dalları aşağıda kapalı kravat emin kanül güvenli aort tutturmak için ek ipek sütür kullanın. Bunlar genellikle Perfüzat sızıntı veya aort dışarı vurarak lekeli olabilir.
NOT: perfüzyon ilk aşamalarında kan kalpten yıkama yapılmalıdır ve tüm kalp yumuşak pembe renk görünmelidir. Yıkayın yok Karanlık renklenme kullanılmamalıdır nedeniyle hava embolisi veya pıhtıları ve kalbe iskemik alanlar büyük olasılıkla gösterir.
4.2) kurulması Perfüzyon ve LVP Ölçümü
- Yavaş yavaş perfüzyon basıncını arttırır ve perfüzyon basıncı 70 mmHg ulaşıncaya kadar pompa hızını artırmak.
NOT: Fare perfüzyon için standart perfüzyon basınçları 70-90 mmHg olabilir, ancak bir deney içinde hayvandan hayvana sabit tutulmalıdır. - Kalan doku (akciğer temizleyin, tiroid vb) Hala kalbe bağlı olabilir. Sol ventrikül içine bir açıklık oluşturmak amacıyla sol atrial kesmek için makas kullanın.
- Tutucuya balon yerleştirin ve Söndür. Doğrudan sol ventrikül içine açılması üzerine, aort kanül yakın balon kanül yerleştirin. Aort gözyaşı değil bu yüzden yerinde kalbi tutarken dikkatli sol ventrikül içine aşağı balonu yerleştirin.
- Yerinde olduğunu bir kez yavaş yavaş LVEDP ulaşıncaya kadar ~ 8 mmHg balon şişmeye başlar. Bu atık sıcaklığını ölçen böylece kalbimin derinliklerinden karşı sıcaklık probu yerleştirin.
4.3) Bazal ölçüm
- Bir su ceketli perfüzyon odasında kalbi mühür. Bu süre zarfında sürekli olarak KHB ile kalbi serpmek ve sıcaklık artmaya devam etmesini sağlamak. Sıcaklığını izlemek ve yaklaşık ~ 37 ºC ulaşıncaya kadar buna göre su banyosu ayarlayın.
NOT: İzleme temperatSıcaklık kalpten kalbe değişebilir koroner akışları olarak ve daha sonra perfüzyon başlangıç aşamalarında ure önemlidir. Atık Perfüzat sıcaklığı kalbin üst tarafından yerleştirilen bir sıcaklık probu yoluyla istenen miyokardiyal sıcaklığı izlenir. Buna ek olarak, diğer Langendorff perfüzyon protokollerine göre, kalp perfüzyon veya tutuklama sırasında CP veya KHB batık değil, bu esas çabuk sıcaklığını ayarlamak yanı sıra difüzyon olmadan verimli CP teslim sağlamak için yapılır. - Sürekli perfüzyon basıncı, sol ventrikül basıncı (LVP balona bağlı basınç dönüştürücü), sıcaklık, ve elektrofizyolojik parametreler (EKG, eğer varsa MAP) dahil olmak üzere uygun sensörlere bağlı bir veri toplama sistemi, fonksiyonel ölçüm kaydetmek için başlayın (ek olacak üreticilerine göre ve tek tek sensörler ve veri toplama sistemi) özgüdür. Atık su KHB en az 15 için ~ 37 ºC ulaştığında dk ve kardiyak fonksiyonel parametreler stabil, bazal ölçümleri için zaman unutmayın.
NOT: Kaynaştırma / dışlama kriterleri her kalbe uygulanır. Başlangıçta 60 mmHg <A LVDP analizi kaldırılması gerektiğini bir kalp gösterir. Buna ek olarak, başlangıçta perfüzyon basıncını korumak için koroner akım> 4,5 ml / dk veya yetersizlik muhtemel bir sızıntı ya da yırtık aort gösterir. Ayrıca kalp fonksiyonunda (yani, son derece aritmik LVEDP artan) görsel teyit edilebilir net iskemik alanlar (yani, pıhtı) ya da sergi iskemi ile ilişkili azalmalar herhangi bir kalpleri analiz kaldırılır. - 1 dakika süre ile bir silindire koroner çıkış maddesinin toplanması yoluyla koroner akışı ölçülür. Odasına kapatın ve sıcaklığı sağlamak ve temel değerlere dönmek için çalışır. Alternatif basınç tahliye devresi sonrasında yerleştirilen bir akış probu vasıtasıyla perfüzyon hattına sürekli koroner akışını ölçmek.
- Başka bir hazne içine soğuk Kardiyoplejisi tamponu 100 ml yerleştirin ve. kardiyopleji haznesine KHB haznesi kanül transfer.
- Sıcak su banyosu su ceketli konut ve perfüzyon ısınma devresi ayırın ve hızlı keser hortumu kullanarak buzdolabında sirkülatörün bağlanın. Kalp ve perfüzat hızlı sıcaklık değişimlerine izin ayrı ısıtma ve soğutma sirkülatörler kullanın.
- Değişikliği sırasında boru içine alır hava kabarcığı izleyin ve izole kalp yakın ulaştığında kardiyoplejisinin için zamanlamayı başlar. 2 dakika süreyle kardiyoplejisine sunun. İlk dozdan sonra pompayı durdurun. Diyastolde kalbi tutuklama ve istenilen CP sıcaklığına yakın olmak emin olun.
NOT: Yeterli kabarcık kapanı göbeğinde hava emboli önlemek için gereklidir. Alternatif bir musluk ile açık hem rezervuarlar için iletim sistemi kolaylıkla inşa edilebilir, ancak biz takip bulmakrezervuarlar arasındaki kanül takas yaparken tanıtıldı küçük hava kabarcığı, deneyler arasında potansiyel olarak farklı pompa hızları verilen zamanlama CP teslim kolay bir yöntem ing (nedeniyle fare / sıçan, perfüzyon basıncı, filtre direnci, vb yani.) - ~ 20 ºC 2 saat kardiyoplejisine kalbi tutun. Başka bir doz uygulanır, böylece CP sırasında her yarım saatte 1 dakika geri pompa açın.
NOT: doku nekrozu olmaksızın CP kalbin fonksiyonel bozukluğu her 30 dakikada sonuçları aralıklı doz. CP (örneğin,> 45 dakika) dozlar arasında daha uzun süreler nekroz ve iskemik kontraktürü neden olabilir ve korumasız iskemi ile ilişkili nekrotik hasarı modeli için daha uygun olacaktır.
6. reperfüzyon
- CP sonunda, oksijenli KHB geri rezervuar kanül transfer. Isıtma sirkülasyon pompasına sıcaklık kontrol devrelerini bağlayın ve pompayı açmaküzerinde reperfüzyon başlatın. Kardiyoplejisi dışarı yıkar Bu noktada, sıcaklık artışı gözlemlemek ve kalp reperfüzyon 2-4 dakika sonra tekrar dayak başlar. Kalp başladığında kalp atışları yavaş ve çoğu kez aritmik olduğunu.
Not: Genellikle, genelde saf iskemi modellerinde özelliğidir diastolik LVP (yani, ≤10 mmHg artış) büyük bir artış yoktur. Aritmiler reperfüzyon içine iyice sürebilir ve bazen kalp defibrile gerekecektir. Bu, kalbin tabanı ve tepesi yerleştirilen yüksek gerilimler (~ 10-50 V) ve elektrotlara bir stimülatörü kümesinin kullanımı ile elde edilebilir. - Kalp 30 dakika süreyle reperfüzyonunu izin verin ve bu süre içinde gerekli koroner akım ölçümleri almak. 30-60 saniye boyunca bir silindire sahip çıkış maddesinin toplayarak koroner akım ölçün.
7. Doku Toplama
- Balon Deflate ve sol ventrikül çıkarın. Kapalı kalbi alkanül ve tartın. İlk deneylerde, kalbin en azından bir enine kesit alınmış ve TTC, kalp bir nekrotik hasarı serbest olmasını sağlamak için nekroz değerlendirmek için boyanmış olmalıdır.
- Vb kalanı veya tüm kalp mikroskopisi çalışmaları, ıslak / kuru ağırlıkları, kalp dilimleri toplayın hızla sıvı azot içine koyarak dondurulmuş olmalıdır. -80 ºC derin dondurucuda saklayın dondurulmuş kalpler.
Not: yüksek enerjili fosfat bileşikleri (yani ATP, kreatin fosfat) ölçümü için, kalpler hemen dondurulmuştur edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, bir fare deney gelen tipik sonuçlar verilmektedir. LVP (kırmızı çizgi), dP / dt (yeşil hat) ve sıcaklık (mor hat) continusouly ~ 3 saat boyunca kaydedildi. Mektuplar bir işaret - bazal ölçüm, b, c, d, e - reperfüzyon, g başlangıcında, h, i, j - - reperfüzyon sırasında Koroner akış ölçümü kardiyopleji solüsyonu, f teslim. Not depresif LVDP ve başlangıca kıyasla reperfüzyon üzerine dP / dt. Şekil 1B A üzerine kaydedilmiş ~ 2 sn veri içerir. Not LVP azalma ve A benzer dt dP / LVEDP İK ve hafif artışlar hafif azalmalar. Genellikle reperfüzyon 30 dakika sonra Şekil 1C'de gösterilen sol ventrikül geliştirilen basınç LVDP ile kanıtlandığı gibi kalp fonksiyonunda ~% 40 bir azalma vardır.
Şekil 1. Temsilcisi sonuçBütün deney s. (A) kayıt ventriküler basıncı (üst), sol ventrikül basıncı, sıcaklık ve ilk türevi yaptı. (B) Kısa süre kayıtları iz detay ve birden fazla deneyler için sol ventrikül geliştirilen basınç (LVDP) (C) kantitatif görmek için (n = 6). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
önceki protokol ayrıntıları yöntemler kardiyoplejik arrest ile ilişkili global iskemi miyokard çarpıcı ikincil değerlendirmek için. Bizim ellerde bu protokol kalp fonksiyonunda bir ~ yaklaşık% 40 azalma meydana (LVDP, +/- dP / dt) 30 dakika sonrası reperfüzyon zaman noktasında kalp hızında küçük değişikliklerle. Kalp reperfüzyon ve rewarmed gibi kardiyak fonksiyon tüm parametreleri en az 20 ila 30 stabilize önce büyük oranda azaltılmış kalp hızı ile ilk zaman noktalarında azalır. Koroner akış 30 dakika iskemi sonrası reperfüzyon kontrol seviyelerinin% 20-30 daha az ~, genel olarak büyük ölçüde bağlı olarak hiperemi erken reperfüzyon esnasında artmış ve daha sonra düşer.
Bu tanım gereği çarpıcı miyokard saf iskemi karakteristik hücre ölümü ve nekroz ücretsiz kalbini terk gerektiğini hatırlamak önemlidir / MI modelleri (yani> 20 dakika akış bölgesel iskemi). İlk çalışmalar doku HİSTOLOJİSİ değerlendirmek gerekirlojisi nekrotik yaralanma eksikliği sağlamak. Büyük olasılıkla bu protokol nedeniyle tümüyle kontrol kalp fonksiyonunda reductons ile ilişkili ex vivo Langendorff perfüzyon işlevi kurtarıldı işlemini göstermektedir olmaz Buna ek olarak, miyokard çarpıcı olsa da tanım gereği uzun süreli reperfüzyon (gün saat) aşağıdaki normal işlevini yol açmalıdır, bu bir zamanla perfüze kalpler. Yine de bir kardiyo stratejisi kullanımı olarak, / nekroz bu protokol vs klasik hiçbir akış iskemi protokolleri çarpıcı büyük farkın şiddeti endeksleri olarak kullanılabilir hücre ölümü yokluğunda kalp fonksiyonu akut kurtarma olduğunu değiştirir Bu durumda hiperkalemik kardiyopleji olmak. Hiperkalemik kardiyopleji çözümleri diyastolik kardiyak arrest neden olarak nekrotik yaralanma ve hücre ölümüne karşı koruma sağlamaktadır. Kalbin diyastolik tutuklama enerji rezervlerinin korunması teşvik etmektedir. Buna ek olarak, klinik olarak en kullanılan kardiyo protokolleri ileri li için hipotermi kullanınMetabolik talebi azaltarak mit miyokard hasarı. Yukarıdaki protokol sırasında modüle edilebilir diğer faktörler farklı kardiyopleji çözümleri formülasyonları (hiperpolarizan formülasyonlar, Mg ++, K + düzeyleri, vb), stratejiler (sıcak vs soğuk 'sıcak çekim', vs.), ve çeşitli ilaçlar bulunmaktadır (kinaz inhibitörleri, iyon kanalı modülatörleri, kardiyo koruyucu maddeler, vs).
Kalp nispeten iyi korunmuş durumda olduğundan bu model mutlaka uzun iskemi süreleri (yani, daha fazla 2 saat) gerektirirken, tekrarlanabilir fonksiyonel bozukluklar olsun. Biz güvenilir çok daha kısa bir süre (örneğin 30 dakika) içinde sersemleyen myokard görüntülenen büyük hayvanlar (domuz, insan) ile karşılaştırıldığında, kemirgen kalpler, özellikle, bu modelde, yaralanma nispeten dirençli olduğunu bulduk. Biz de aralıklı teslimat 45-60 dk aralığı Follo gibi ciddi iskemik hasardan kalbi korumak için gerekli olduğunu buldukkanat CP teslim brüt diyastolik disfonksiyon, iskemik kontraktürü ve reperfüzyon üzerine doku yaralanmalara neden olabilir. Protokolün diğer kolaylıkla adapte parçalar K + değil güvenen CP bileşenlerin ve hipo / normotermik tutuklama rolü yanı sıra farklı tutuklama stratejileri (Na kanal blokerleri, hiperpolarizan ajanlar) 3 ile ilgili soruşturmalar içerebilir.
Klinik kalp cerrahisi ile ilişkili çarpıcı modellemek için kullanılan bu tekniğin önemli sınırlamalar da vardır. İlk olarak, klinik CP çözeltilerin büyük çoğunluğu kan (1: CP oranı ~ 4 kan) ile karıştırılır. Bunun nedeni, perfüzyon devre hacmi olarak kabul boru ve elyaf oksijenatörlerinin ihtiyaç genellikle farelerde mümkün değildir. Genellikle daha büyük hayvanlar için (kobaylar / tavşan) verici hayvanlar da gerekli olacaktır. Buna ek olarak, tüm izole organ modellerde olduğu gibi, periferal faktörlerin (yani, inflamatuar sinyalleri, kan yeniden etkisiperfüzyon, vs.) tamamen göz ardı edilmektedir. Yine de farmakolojik katkı maddeleri ve farklı bir kardiyo koruma stratejileri test etmek için, ön çalışmalar için, amaca uygun, etkili ve ekonomik bir modeldir.
Protokol daha büyük bir balon aort kanülü 13,14 hariç olmak üzere, esas olarak fare kalplerinde de aynıdır. Buna ek olarak, sıçan kalbi hazırlığı önemli ölçüde daha büyük akış oranları (12-20 ml / dk) gerektirir. Büyüklüğü nedeniyle, sıçan kalp hazırlık yapmak çoğaltılabilir öğrenmek ve oldukça kolaydır. Miyokardiyal çarpıcı bir protokolde ortaya çıkan yaralanmanın diğer türleri değerlendirmek için kolayca değiştirilebilir. Geri dönüşümlü iskemik yaralanma taklit için, sadece kısa dönemler için perfüzyon pompayı durdurun. Sıçanlarda ~ 20 dakika global iskemi, hücre ölümü ve enfarktüs brüt etkiler olmadan azaltılmış kontraktil fonksiyonun neden olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardioplegia Solution (St Thomas II) | Symbol / Concentrations (mM) | ||
| Sodium Chloride | NaCl; 110 | ||
| Potassium chloride | KCl; 16 | ||
| Calcium Chloride | CaCL2; 1.5 | ||
| Magnesium Chloride | MgCL2; 16 | ||
| Sodium Bicarbonate | NaHCO3; 10 | ||
| Krebs-Heinslet Buffer | |||
| Sodium Chloride | NaCl; 118 | ||
| Potassium Chloride | KCl; 4.8 | ||
| Magnesium Sulfate | MgSO4; 1.7 | ||
| Sodium Bicarbonate | NaHCO3; 24.9 | ||
| Potassium Phosphate (monobasic) | KH2PO4; 1.2 | ||
| Calcium Chloride | CaCL2; 1.4 | ||
| Sodium Pyruvate | Na pyruvate; 2 | ||
| Glucose | C6H12O6; 6 | ||
| Balloon reagents | |||
| Corn Syrup | |||
| Spaghetti | |||
| Silicon Dispersion Gel | |||
| styrofoam block | |||
| lab oven/incubator ( 50C) | |||
| Langendorff Perfusion equipment | |||
| Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent) | |||
| Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent) | |||
| Heated water circulator | |||
| Cooling water circulator | |||
| Perfusion pump capable of 2-30 ml/min | |||
| Inline perfusion filters - 1 um glass fiber | |||
| Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure | |||
| Small graduated cylinder (~10 mL) | |||
| Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent) | |||
| perfusion resevoir (1L) | |||
| cardioplegia resevoir (~200 mL) | |||
| gas bubbler | |||
| 95/5 O2/CO2 mix | |||
| Surgical tools and reagents | |||
| Metzenbaum and Potz surgical scissors | |||
| two Dumont size 5 forceps | |||
| ketamine | |||
| xylazine | |||
| heparin | |||
| small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends) | |||
| Silk 2-0 and 4-0 sutures |
References
- Kloner, R. a, Jennings, R. B. Consequences of Brief Ischemia: Stunning, Preconditioning, and Their Clinical Implications: Part 1. Circulation. 104 (24), 2981-2989 (2001).
- Mentzer, R. M. Myocardial protection in heart surgery. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 290-297 (2011).
- Chambers, D. J., Fallouh, H. B. Cardioplegia and cardiac surgery: pharmacological arrest and cardioprotection during global ischemia and reperfusion. Pharmacol Ther. 127 (1), 41-52 (2010).
- Bolli, R., Marbán, E. Molecular and cellular mechanisms of myocardial stunning. Physiol Rev. 79 (2), 609-634 (1999).
- Kloner, R. a, Bolli, R., Marban, E., Reinlib, L., Braunwald, E. Medical and Cellular Implications of Stunning, Hibernation, and Preconditioning An NHLBI Workshop. Circulation. 97 (18), 1848-1867 (1998).
- Mersmann, J., Latsch, K., Habeck, K., Zacharowski, K. Measure for measure-determination of infarct size in murine models of myocardial ischemia and reperfusion: a systematic review. Shock (Augusta, Ga). 35 (5), 449-455 (2011).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion). J Mol Cell Cardiol. 50 (6), 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart characteristics and cautions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (11), 867-878 (2003).
- Guide for the Care and Use of Laboratory AnimalsSource. , National Research Council. Available from: http://grants.nih.gov/grants/olaw/Guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Miller, A., Wright, G. L. Fabrication of Murine Ventricular Balloons for the Langendorff Heart Preparation. J Biotecnol Biomater. 1 (101), 1-4 (2011).
- Curtis, M. J. Characterisation, utilisation and clinical relevance of isolated perfused heart models of ischaemia-induced ventricular fibrillation. Cardiovasc Res. 39 (1), 194-215 (1998).
- Clements, R. T., Feng, J., Cordeiro, B., Bianchi, C., Sellke, F. W. p38 MAPK-dependent small HSP27 and αB-crystallin phosphorylation in regulation of myocardial function following cardioplegic arrest. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 300 (5), H1669-H1677 (2011).
- Clements, R. T., Cordeiro, B., Feng, J., Bianchi, C., Sellke, F. W. Rottlerin increases cardiac contractile performance and coronary perfusion through BKCa++ channel activation after cold cardioplegic arrest in isolated hearts. Circulation. 124 (11 Suppl), S55-S61 (2011).
