Abstract
بروتوكول التالي من استخدام لتقييم وظيفة القلب ضعف أو مذهل يلي الشتائم الدماغية المعتدلة عضلة القلب. هذه التقنية مفيدة للنمذجة الإصابة الدماغية المرتبطة مع العديد من ظاهرة ذات الصلة سريريا بما في ذلك جراحة القلب بالاعتقال شلل القلب وشرايين القلب، بعيدا عن مضخة تحويل مسار الشريان التاجي، زرع، والذبحة الصدرية، نقص التروية وجيزة، وما إلى ذلك. يعرض بروتوكول طريقة عامة لنموذج تبريدي اعتقال شلل القلب فرط بوتاسيوم الدم وضخه في قلوب القوارض التركيز على قياس وظيفة مقلص عضلة القلب. باختصار، هو perfused لقلب الفأر في وضع langendorff، المجهزة مع بالون داخل البطينات، ويتم تسجيل المعلمات الأساسية وظيفية القلب. في أعقاب الاستقرار، والقلب هو بعد ذلك يخضع لاطلاع التسريب من الواقية للقلب حل شلل القلب تبريدي لبدء اعتقال الانبساطي. يتم تسليم شلل القلب بشكل متقطع أكثر من 2 ساعة. ثم يتم إشباعها القلب وWARMEويتم رصد د لدرجات حرارة سوي الحرارة واستعادة وظيفة عضلة القلب. استخدام هذه النتائج في بروتوكول موثوقة الاكتئاب وظيفة مقلص القلب خالية من الإجمالي تلف الأنسجة عضلة القلب في القوارض.
Introduction
عضلة القلب مذهلة يعرف بأنه انعكاس انخفاض النشاط مقلص على الرغم من استعادة تدفق الدم الكافي بعد فترة وجيزة من نقص التروية أو فترات طويلة من الشتائم الدماغية مع كارديوبروتيكتيون 1،2،3،4،5. يتم استخدام الطريقة المعروضة خصيصا لنموذج الشتائم الدماغية ذات الصلة سريريا والتي يمكن أن تؤدي إلى عاهات عكسها في وظيفة مقلص (أي إهانات الدماغية المرتبطة جراحة القلب باستخدام اعتقال شلل القلب، فترات قصيرة من نقص التروية، والذبحة الصدرية، وما إلى ذلك). وعلى النقيض من الدراسات نقص التروية الحاد (احتشاء عضلة القلب، نخر) تم تطوير هذا البروتوكول لتقييم الانتعاش وظيفية عضلة القلب وكارديوبروتيكتيون دون وقوع إصابات الأنسجة، وإعادة عرض، وموت الخلايا. الغالبية العظمى من ورقة تتناول معيار شلل القلب بروتوكول القبض مع عناصر مشابهة لجراحة القلب باستخدام حرارة الجسم ومتقطعة تسليم شلل القلب.
بروت عضلة القلبection خلال معظم جراحات القلب يعتمد على شلل القلب وشرايين القلب. على الرغم من شلل القلب (CP) الحلول والاستراتيجيات تختلف على نطاق واسع (الدم، بلوراني والبرد، الخ دافئ) العناصر الأكثر شيوعا هي 1) فرط بوتاسيوم الدم و / أو غيرها من الاستراتيجيات للقبض على القلب في انبساط، مما يحد من استخدام الطاقة الناتجة من تقلص عضلة القلب، و2) انخفاض حرارة الجسم لإبطاء عملية التمثيل الغذائي وتساعد على الحفاظ على ATP واحتياطيات الطاقة الأخرى أثناء القبض عليه. حلول شلل القلب الحالية توفر الحماية للقلب ضد الشتائم الدماغية التي من شأنها أن يثبت خلاف ذلك قاتلة. ومع ذلك، استراتيجيات الوقاية من أمراض القلب خلال الشتائم الدماغية الجراحية ليست مثالية، وإصابة الدماغية الخفيفة الناتجة يمكن أن يؤدي إلى عكسها القلب ضعف مقلص على الرغم من تدفق الدم الكافي (عضلة القلب مذهلة)، الحماض، والضرر cardiomyocyte، وآثار الأوعية الدموية بما في ذلك انخفاض التروية التاجية وبالتشنج.
هذا يختلف البروتوكولمن النماذج القياسية نقص تروية القلب معزولة تقييم احتشاء عضلة القلب ونقص التروية الحاد في أنه يقيم الشتائم الدماغية أكثر اعتدالا مما يمكن أن يؤدي إلى اختلال وظائف القلب بعد نقص التروية وجيزة أو الشتائم الدماغية المرتبطة اعتقال شلل القلب. (للمراجعة على تقنيات نضح Langendorff وI / دراسات R ترى 6-8). لمبادئ توجيهية عامة وتحليلا شاملا لالمعلمات التجريبية المرتبطة الماوس معزولة قلوب perfused لرؤية ساذرلاند ه ر ال. 2003 9 التقنية المقدمة هنا تفاصيل ما يلزم من معدات والكواشف، خطوات واستراتيجيات ونصائح للحث موثوق مذهلة في قلوب الماوس. تعديلات طفيفة ضرورية لتطبيق هذه التقنية على الفئران.
لفترة وجيزة قلوب الماوس معزولة وLangendorff perfused للحوالي 30 دقيقة مع فيزيولوجي كريبس-هنسلايت العازلة (جسر الملك حسين)، تليها البارد السكتة القلبية محمية عن طريق تسليم hypotherm فرط بوتاسيوم الدمجيم حل شلل القلب. بعد الاعتقال، ويتم رصد الانتعاش وظيفية قلبية خلال إعادة التدفئة وضخه من القلب مع جسر الملك حسين. يمكن تقييم التغيرات في درجة استعادة وظيفة القلب مقلص لتقييم وكلاء الواقية للقلب واستراتيجيات كارديوبروتيكتيون مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة عمر المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام وجميع الحيوانات والإجراءات وفقا لدليل مجلس البحوث الوطني للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية 10.
1. تصنيع البالون والبطين الأيسر مراقبة ضغط الدائرة
- بناء البالونات LV وفقا لميلر وآخرون. (11) وفي دورق مع بقضيب، خلط 9.5 مل من الماء المقطر، 14.2 مل من شراب الذرة الخفيف و33،8 غرام من السكروز، والحرارة على طبق ساخن، تخلط حتى يذوب السكر . مواصلة الحل التسخين حتى تصل تقريبا إلى 150 درجة مئوية.
ملاحظة: توجد طرق عديدة لبناء البالونات LV بما في ذلك تعديل نصائح الواقي الذكري والتشبث البناء فيلم 9،12. نجد الأسلوب أعلاه ليكون من السهل نسبيا لبناء البالونات حرة للتسرب، ولكن ميزة من البالونات تتشبث فيلم تتضمن توصيف السابق لfrequen المناسبالعلاقات قبرصي استجابة 9. - كسر خيوط المعكرونة الجافة إلى قطع حوالي 5 سم في الطول وتراجع جانب واحد من كل قطعة حوالي 1 سم في عمق محلول السكر وإزالة ببطء.
- وضع نهاية الجافة من حبلا المعكرونة إلى كتلة من البوليستيرين وتعليق ذلك المزيج السكر يقطر ويشكل قالب شكل دمعة. ترك O / N في مجفف حتى يصلب القالب.
- في اليوم التالي، وتراجع القوالب إلى هلام السيليكون التشتت. وضع خيوط المعكرونة العودة الى البوليسترين رغوة كتلة ووضعه في الفرن درجة مئوية أأ 37 لمدة 2 ساعة أو حتى تجف. كرر هذه الخطوة مرة أخرى حتى يتم تطبيق طبقتين من السيليكون.
- الجاف مرة واحدة، ومكان في الماء لعدة ساعات للمساعدة في إزالة البالون من القالب. متجر البالونات في 0.02٪ محلول أزيد الصوديوم.
- استخدام جمع الدم 23 G المقرر أن تنتج بالون قنية مخصصة عن طريق خفض إبرة لخلق تلميح حادة ووضع الشقوق في الإبرة.
- توصيل الأنابيب إلى الضغط العابرducer والاحمرار مع الماء مع الحفاظ أنابيب وقنية مغمورة تماما لمنع الهواء من الدخول إلى النظام. وضع البالون الذي تم مملوء بالماء على قنية واستخدام خيوط الحرير 2-0 لادراك التعادل على قنية. اختبار البالون القدرة على الحفاظ على ضغط (~ 100 مم زئبق لا يقل عن 1 ساعة)
2. إعداد معزولة القلب نظام الإرواء
- في البداية، وغسل وتدفئة النظام. بدوره على 37 درجة مئوية الماء الدافئ دائري الحمام الذي تم توصيله إلى جهاز Langendorff، وملء عازلة الخزان بالماء المقطر. اتصال جديد فلتر الألياف الزجاجية لأنابيب تتدفق إلى أجهزة وبدوره على مضخة لاخراج النظام. خلال فترة والإعدادية، ومراقبة درجة حرارة الماء يطرد من كتلة Langendorff باستخدام مسبار درجة الحرارة، لضمان أن يتم تعيين حمام الماء بدقة. أيضا، بدوره على مضخة شكل دائري المبردة وتعيين إلى 20 درجة مئوية التي سيتم استخدامها أثناء القبض شلل القلب للقلب.
- أنان هذه الأثناء إعداد الحلول التالية. إعداد 1 لتر من حل شلل القلب (110 ملي كلوريد الصوديوم، و 16 ملي بوكل، 16 ملي MgCl 2، 1.5 ملي CaCl 2، 10 ملي NaHCO 3) والتصفية. أيضا، إعداد 2 لتر من جسر الملك حسين (118 ملي كلوريد الصوديوم، 4.8 ملي بوكل، 1.2 ملي KH 2 PO 4، 1.7 ملي MgSO 4، 2 مم نا البيروفات، 6 مم سكر العنب، 24.9 ملي NaHCO 3 (ما قبل الغازي مع CO 2) ، 1.4 ملي CaCl 2 (أضيفت الماضي). وبمجرد حله، وإزالة رواسب من خلال تصفية في قارورة باستخدام الزجاج 5 ميكرون fritted قمع ضع بعض في طبق صغير على الجليد لاستخدامها أثناء الجراحة والعزلة.
- الأوكسجين في الإرواء (جسر الملك حسين) مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. نظام يروي Langendorff مع جسر الملك حسين لإزالة أي المياه المتبقية من النظام والعازلة الخزان. بالنسبة للفئران، ضبط سرعة مضخة الأولية إلى ~ 2.0 مل / دقيقة. وضع 2-0 و4-0 خيوط الحرير قرب نضح قنية. تشغيل المضخة حتى يتم شغل الأنابيب وأجهزة الطرافةشغل ح الإرواء وضمان strup فقاعة مع الإرواء.
ملاحظة: لفترات طويلة من نضح وظيفة مستقرة ينصح بشدة لتثبيت الألياف الزجاجية عامل تصفية في خط (~ 1 ميكرون) في الدائرة نضح لجمع أي رواسب التي يمكن أن تشكل جلطات في القلب
3. جراحة ماوس
3.1) الفأر التخدير والمناولة
- تحضير حقنة مع جرعة التخدير من 80 ملغم / كغم من الكيتامين و 5 ملغ / مل خليط زيلازين، وإضافة عقيمة 0.9٪ المالحة لإظهار حجم 0.2 مل. حقن الهيبارين IP (50 ميكرولتر من 1000 U / مل حل).
- ضع الماوس مرة أخرى في حاوية النقل (~ 10-20 دقيقة) وانتظر حتى يفقد وعيه كما الهيبارين ساري المفعول. القيام دوريا قرصة أخمص القدمين إلى مراقبة الألم المنعكس.
3.2) إزالة القلب
- مرة واحدة الفأر هو فاقد الوعي تماما ولا يستجيب لقرصة أخمص قدميه، ضمان الحصول عليها إلى جدول التشغيل المناسب باستخدام دبابيس أو 25 G نصائح حقنة عن طريق الأطراف. أداء بضع الصدر للكشف عن القلب. قطع ثقب صغير أسفل عظمة القص وتمديد خفض على الجانبين من الفأرة تجنب الحجاب الحاجز.
- قطع بسرعة الحجاب الحاجز ومن ثم قطع بسرعة تصل جانبي القفص الصدري. الوجه الخلفي للقفص الصدري مثل قذيفة البطلينوس لفضح تجويف الصدر. بلطف اتخاذ اجراء من القلب، ضع المقص تحت وإزالة القلب.
ملاحظة: من الضروري لإزالة بسرعة القلب مرة واحدة يتعرض لها في التجويف الصدري والرئتين وغير وظيفية.
3.3) تنظيف القلب
- وضع القلب في طبق يحتوي على الجليد جسر الملك حسين البارد وتقليم قبالة أي قطع كبيرة من أنسجة الرئة المرفقة. استخدام ملقط لالتقاط القلب وتحديد الشريان الأورطي. بلطف ضغط على القلب وابحث عن أي الدم الذي يظهر، كما ينبغي أن يكون هذا نهاية مفتوحة من الشريان الأورطي. استخدام ملاقط غيض غرامة لعقد القلب بحلول نهاية مفتوحة من الشريان الأورطي.
4.1) تصاعد وCannulating القلب
- قبل نقل القلب إلى جهاز Langendorff، بدوره على مضخة التأكد من أن ضغط التروية منخفض (~ 20 مم زئبق). عقد القلب عن طريق الشريان الأورطي فقط تحت قنية. باستخدام مجموعة أخرى من ملاقط غيض غرامة، فتح بعناية الشريان الأورطي، وحرك القلب حتى على قنية. يثبت في مكانه مع مجموعة واحدة من الملقط ومن ثم استخدام مقطع فوز ينة لضمان الحصول عليها مؤقتا للقنية.
ملاحظة: بسرعة متزايدة القلب إلى قنية التروية هو أمر حاسم لالتحضير الجيد. مع الخبرة، ويجب على إجراءات من فتح التجويف الصدري حتى تصاعد قلب يستغرق ما بين 1 و 2 دقيقة. - ربط والشروع في نضح على النحو التالي، وذلك باستخدام 4-0 خياطة الحرير الشريان الأورطي آمن لقنية مباشرة تحت كليب. ضمان التعادل هو أيضا حول قنية الأبهر المعادن، لذلك لا يحصل ربط الشريان الأورطي قبالة عندما شدعقدة. مرة واحدة يتم وضع ربطة عنق واحدة بحزم، إزالة مقطع.
- استخدام خيوط الحرير إضافية لربط الشريان الأورطي آمن للقنية التأكد من ادراك التعادل من دون أي فروع السفينة التي قد تكون قادمة من الشريان الأورطي. هذه كثيرا ما يمكن رصدت من قبل تسرب سائل الإرواء أو اطلاق النار الخروج من الشريان الأورطي.
ملاحظة: خلال المراحل الأولى من نضح الدم يجب غسل من القلب ويجب أن تظهر قلب كامل اللون الوردي الناعم. وتشير تغيير الألوان الداكنة التي لا تغسل المناطق الدماغية على الأرجح بسبب الصمات الهواء أو الجلطات والقلب لا ينبغي أن تستخدم.
4.2) إنشاء الإرواء وLVP القياس
- زيادة ببطء ضغط التروية وزيادة سرعة المضخة حتى يصل الضغط نضح 70 مم زئبق.
ملاحظة: الضغوط نضح القياسية لالماوس نضح يمكن أن يكون 70-90 مم زئبق، ولكن يجب أن تبقى ثابتة من الحيوان الى الحيوان داخل التجربة. - تنظيف ما تبقى من النسيج (الرئة والغدة الدرقية الخ) التي قد تكون لا تزال تعلق على القلب. استخدام مقص لقطع الأذين الأيسر من أجل خلق فرصة إلى البطين الأيسر.
- وضع البالون على حامل وفرغ. وضع قنية البالون بالقرب من قنية الأورطي، مباشرة عبر فتح في البطين الأيسر. إدراج بعناية أسفل البالون إلى البطين الأيسر في حين عقد القلب في المكان حتى الشريان الأورطي لا المسيل للدموع.
- مرة واحدة هو في مكان تبدأ ببطء لتضخيم بالون حتى تصل إلى LVEDP ~ 8 مم زئبق. وضع التحقيق في درجة الحرارة على الجزء السفلي من القلب حتى أنه يقيس درجة الحرارة من النفايات السائلة.
4.3) قياس القاعدية
- ختم القلب في المياه تغلف غرفة التروية. خلال هذا الوقت باستمرار يروي القلب مع جسر الملك حسين، والتأكد من أن درجة الحرارة في ارتفاع مستمر. رصد درجات الحرارة وضبط حمام الماء وفقا لذلك حتى يصل إلى ما يقرب من 37 درجة مئوية ~.
ملاحظة: temperat رصدلدى عودتهم في المراحل الأولية من نضح أمر بالغ الأهمية كما التدفقات التاجية وبعد ذلك درجة الحرارة يمكن أن تختلف من القلب الى القلب. ويتم رصد درجة حرارة سائل الإرواء النفايات السائلة لدرجة الحرارة المطلوبة عضلة القلب عن طريق التحقيق في درجة الحرارة وضعت في قمة القلب. بالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات نضح Langendorff، لا المغمورة القلب في CP أو جسر الملك حسين خلال نضح أو إلقاء القبض عليهم، ويتم ذلك بشكل رئيسي لضبط درجة الحرارة بسرعة فضلا عن توفير كفاءة تسليم CP دون نشرها. - البدء في تسجيل مستمر قياس الوظيفي باستخدام نظام الحصول على البيانات التي تعلق على أجهزة استشعار المناسبة، بما في ذلك ضغط التروية، البطين الأيسر الضغط (محول الضغط تعلق على LVP بالون)، ودرجة الحرارة، والمعلمات الكهربية (رسم القلب، MAP إذا مجهزة لذلك) (مرفق سيكون وفقا لمصنعي ومحددة لأجهزة الاستشعار الفردية ونظام الحصول على البيانات). مرة واحدة تصل إلى جسر الملك حسين النفايات السائلة ~ 37 درجة مئوية لمدة 15 على الأقل دقيقة والمعلمات الوظيفية القلب مستقرة، لاحظ الوقت لقياس خط الأساس.
ملاحظة: يتم تطبيق معايير إدراج / استبعاد لكل قلب. A LVDP من <60 مم زئبق في بداية الدراسة إلى وجود القلب التي يجب إزالتها من التحليل. وبالإضافة إلى ذلك، من المرجح أن يشير إلى تدفق التاجي> 4.5 مل / دقيقة، أو عدم القدرة على الحفاظ على ضغط التروية في الأساس على تسريب أو الشريان الأورطي الممزقة. كما تتم إزالة أي القلوب التي لديها مناطق واضحة الدماغية التي يمكن التأكد بصريا (أي جلطة) أو تخفيضات المرتبطة نقص التروية المعرض في وظيفة القلب (أي زيادة LVeDP، عدم اتساق نبضات القلب للغاية) من التحليل. - قياس تدفق التاجية عن طريق جمع النفايات السائلة التاجي في الاسطوانة لمدة 1 دقيقة. إغلاق الغرفة وتسمح درجة الحرارة ويعمل على العودة إلى القيم الأساسية. بدلا من قياس تدفق التاجية بشكل مستمر في خط نضح عبر مسبار التدفق وضعت بعد الدائرة تخفيف الضغط.
- وضع 100 مل من العازلة شلل القلب البارد في خزان آخر و. نقل الخزان قنية جسر الملك حسين إلى الخزان شلل القلب.
- فصل تغلف الإسكان والمياه الدائرة الاحترار نضح من حمام الماء الدافئ والاتصال دائري المبردة باستخدام أنابيب قطع سريعة. استخدام التدفئة والتبريد المروجون منفصل للسماح التغيرات في درجات الحرارة السريع للقلب وسائل الإرواء.
- اتبع فقاعة الهواء التي يحصل إدخالها في أنابيب أثناء التبديل، وبمجرد وصولها بالقرب من القلب معزولة بدء التوقيت لشلل القلب. تقديم شلل القلب لمدة 2 دقيقة. بعد الجرعة الأولى وقف ضخ. ضمان للقبض على القلب في انبساط وتكون قريبة من درجة حرارة CP المطلوب.
ملاحظة: A فخ فقاعة كافية ضروري لتجنب الصمات الهواء في القلب. بدلا من نظام التسليم لمكامن تحولت كتبها محبس يمكن بناؤها بسهولة، ومع ذلك نجد اتبعجي فقاعة الهواء الصغيرة التي يتم تقديمها عند مبادلة قنية بين الخزانات، طريقة سهلة للتوقيت تسليم CP نظرا بسرعة المضخة قد تكون مختلفة بين التجارب (أي بسبب الماوس / الفئران، ضغط التروية، ومقاومة التصفية، الخ.) - الحفاظ على القلب في شلل القلب لمدة 2 ساعة في ~ 20 درجة مئوية. كل نصف ساعة خلال CP تتحول المضخة مرة أخرى لمدة 1 دقيقة حتى يدار جرعة أخرى.
ملاحظة: جرعات متقطعة من CP كل 30 دقيقة النتائج في اضطراب وظيفي في القلب دون تنخر الأنسجة. فترات أطول بين جرعة من CP (أي،> 45 دقيقة) يمكن أن يؤدي إلى نخر وانكماش الدماغية وسيكون أكثر ملاءمة للنموذجا للإصابة الميتة المرتبطة نقص التروية دون وقاية.
6. ضخه
- في نهاية CP، نقل قنية الخزان إلى جسر الملك حسين الاوكسيجين. ربط دوائر التحكم في درجة الحرارة إلى شكل دائري التدفئة وتشغيل مضخةعلى أن يبدأ ضخه. عند هذه النقطة شلل القلب يغسل بها، ومراقبة ارتفاع درجة الحرارة والقلب يبدأ الضرب مرة أخرى بعد 2-4 دقائق من ضخه. عندما يبدأ القلب في ضربات القلب بطيئة وغالبا عدم اتساق نبضات القلب.
ملاحظة: عادة ليست هناك ارتفاع كبير في الانبساطي LVP (أي ≤10 ارتفاع مم زئبق) التي غالبا ما تكون مميزة في نماذج نقص التروية نقية. يمكن عدم انتظام ضربات القلب تستمر بشكل جيد في ضخه وأحيانا سوف يحتاج القلب إلى أن defibrillated. ويمكن تحقيق ذلك مع استخدام مجموعة مشجعا لارتفاع الفولتية (~ 10-50 V) وأقطاب كهربية وضعت في القاعدة وقمة القلب. - تسمح القلب إلى reperfuse لمدة 30 دقيقة، وخلال هذه الفترة الزمنية أخذ قياسات التدفق التاجية عند الضرورة. قياس تدفق التاجية عن طريق جمع النفايات السائلة مع الاسطوانة لمدة 30-60 ثانية.
7. جمع الأنسجة
- فرغ البالون وإزالته من البطين الأيسر. أنزع قلب قبالةقنية وتزن عليه. في التجارب الأولية، ينبغي أن تؤخذ شريحة عرضية واحدة على الأقل من القلب وTTC الملون لتقييم نخر لضمان أن القلب هو خال من أي إصابة الميتة.
- جمع شرائح القلب للدراسات المجهر، والرطب / الوزن الجاف، وما إلى ذلك تبقى أو القلب كله ينبغي تجميدها بسرعة عن طريق وضع في النيتروجين السائل. مخزن القلوب المجمدة في -80 درجة مئوية الثلاجة.
ملاحظة: للحصول على قياس مركبات الفوسفات عالي الطاقة (أي، ATP، فوسفات الكرياتين)، يجب تجميد قلوب فورا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 يعرض نتائج نموذجية من التجربة الماوس واحد. LVP (خط أحمر)، DP / دينارا (الخط الأخضر)، ودرجة الحرارة (الخط البنفسجي) سجلت continusouly على ~ 3 ساعة. رسائل تشير إلى وجود - قياس خط الأساس، ب، ج، د، ه - تقديم حل شلل القلب، و - بدء ضخه، ز، ح، ط، ي - قياس تدفق cornary خلال ضخه. ملاحظة، LVDP الاكتئاب و DP / دينارا على ضخه بالمقارنة مع خط الأساس. ويتضمن الشكل 1B البيانات من A سجلت أكثر من ~ 2 ثانية. نلاحظ، فإن الانخفاض في LVP و DP / DT مماثلة لA، تخفيضات طفيفة في مجال الموارد البشرية وزيادة طفيفة LVEDP. عادة بعد 30 دقيقة من ضخه هناك انخفاضا ~ 40٪ في وظيفة القلب كما يتضح من البطين الأيسر الضغط المتقدمة LVDP هو مبين في الشكل 1C.
الشكل 1. نتيجة التمثيليةالصورة من التجربة برمتها. (A) تسجيل يقم الضغط البطيني (أعلى)، المشتقة الأولى من LV الضغط، ودرجة الحرارة. (B) التسجيلات فترة قصيرة لمعرفة التفاصيل التتبع و (C) الكميات من البطين الأيسر الضغط المتقدمة (LVDP) لتجارب متعددة (ن = 6). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تفاصيل بروتوكول السابقة أساليب لتقييم عضلة القلب مذهلة الثانوية لنقص التروية العالمية المرتبطة اعتقال شلل القلب. في أيدينا ينتج هذا البروتوكول تقريبي ~ تخفيض 40٪ في وظيفة القلب (LVDP، +/- موانئ دبي / دينارا) مع تغيرات طفيفة في معدل ضربات القلب في 30 دقيقة بعد ضخه نقطة في الوقت. كما يتم إشباعها القلب وrewarmed يتم تخفيض جميع المعلمات من وظيفة القلب في نقاط زمنية أولية مع معدل ضربات القلب تقلص إلى حد كبير قبل أن يستقر بين 20 و 30 دقيقة. عموما يتم زيادة تدفق التاجية بشكل كبير خلال ضخه في وقت مبكر بسبب احتقان، ثم يسقط إلى ~ 20-30٪ أقل من مستويات الرقابة التالية 30 دقيقة ضخه.
من المهم أن نتذكر أن عضلة القلب مذهلة من حيث التعريف يجب أن يترك قلب خال من موت الخلايا ونخر الذي هو سمة من نقص التروية نقي / نماذج MI (أي،> 20 دقيقة لا نقص التروية الإقليمي تدفق). يجب أن الدراسات الأولية تقييم histol الأنسجةتتبناها لضمان عدم الإصابة الميتة. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من عضلة القلب مذهلة من حيث التعريف ينبغي أن يؤدي إلى وظيفة عادية التالية ضخه لفترات طويلة (ساعة إلى أيام)، ومن المرجح أن هذا البروتوكول لا سيظهر تعافى تماما وظيفة بسبب فيفو السابقين Langendorff نضح الذي يرتبط مع reductons في وظيفة القلب في السيطرة قلوب perfused لمع مرور الوقت. يتغير مع ذلك في انتعاش حاد في وظيفة القلب في غياب موت الخلايا / نخر يمكن أن تستخدم الأرقام القياسية لشدة مذهلة والفرق الرئيسي في هذا البروتوكول مقابل بروتوكولات نقص التروية أي تدفق الكلاسيكية هو استخدام استراتيجية كارديوبروتيكتيون، في هذه الحالة يجري شلل القلب فرط بوتاسيوم الدم. حلول شلل القلب فرط بوتاسيوم الدم وتوفر الحماية من الإصابة الميتة وموت الخلايا عن طريق التسبب في توقف القلب الانبساطي. اعتقال الانبساطي للقلب يعزز الحفاظ على احتياطيات الطاقة. بالإضافة إلى ذلك، بروتوكولات كارديوبروتيكتيون الأكثر استخداما طبيا تستخدم حرارة الجسم إلى مزيد من لىإصابة عضلة القلب معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا عن طريق الحد من الطلب على التمثيل الغذائي. العوامل الأخرى التي يمكن التضمين خلال البروتوكول أعلاه تشمل تركيبات مختلفة من الحلول شلل القلب (تركيبات hyperpolarizing، والمغنيسيوم ++، K + المستويات، وما إلى ذلك)، واستراتيجيات (مقابل الدافئة الباردة، "ساخنة بالرصاص"، وما إلى ذلك)، ومختلف انواع المخدرات (كيناز مثبطات، جهري أيون قناة، وكلاء الواقية للقلب، وما إلى ذلك).
منذ القلب في حالة نسبيا محمية بشكل جيد، للحصول على ضعف وظيفية قابلة للتكرار في هذا النموذج يتطلب بالضرورة الأوقات نقص التروية أطول (أي أكثر من 2 ساعة). لقد وجدنا أن قلوب القوارض مقاومة نسبيا لإصابة في هذا النموذج، لا سيما بالمقارنة مع الحيوانات الكبيرة (الخنازير، والبشر) التي تعرض موثوق عضلة القلب الذهول أثناء فترات أقصر من ذلك بكثير (أي 30 دقيقة). لقد وجدنا أيضا أن تسليم المتقطع ضروري لحماية القلب من التلف الدماغية شديد باعتباره 45-60 دقيقة فاصل FOLLOالجناح تسليم CP يمكن أن يؤدي إلى خلل وظيفي الإجمالي الانبساطي، انكماش الدماغية، وإصابات الأنسجة عند ضخه. يمكن مكونات قابلة للتكيف بسهولة أخرى من بروتوكول تشمل التحقيقات ذات الصلة إلى الهيئات المكونة CP ودور نقص سكر الدم / اعتقال سوي الحرارة وكذلك استراتيجيات اعتقال مختلفة لا تعتمد على K + (حاصرات قناة نا، وكلاء hyperpolarizing) 3.
وهناك أيضا عدد من القيود الهامة لهذه التقنية عندما تستخدم لنموذج مذهل المرتبطة جراحة القلب السريرية. أولا، فإن الغالبية الجسيمة لحلول CP السريرية تختلط مع الدم (~ 4 في الدم: 1 نسبة CP). هذا هو عموما ليس من الممكن في الفئران نظرا لحجم الدوائر نضح فضلا عن الحاجة إلى تعامل الأنابيب والألياف الأوكسجين. سوف تكون هناك حاجة أيضا في كثير من الأحيان للحيوانات الكبيرة (خنازير غينيا / الأرانب) الحيوانات المانحة. بالإضافة إلى ذلك، كما هو الحال في كافة طرازات الجهاز معزولة، وتأثير العوامل المحيطية (أي إشارات التهابات، وإعادة الدمنضح، الخ) يتم تجاهل تماما. على الرغم من ذلك بل هو نموذج عملي وفعال، واقتصادا للدراسات الأولية لاختبار المواد المضافة الدوائية واستراتيجيات كارديوبروتيكتيون مختلفة.
البروتوكول هو في الأساس نفسه في قلوب الفئران، باستثناء بالون أكبر والأبهر قنية 13،14. بالإضافة إلى ذلك، إعداد قلب فأر يتطلب أكبر بكثير معدلات تدفق (12-20 مل / دقيقة). نظرا لحجمه، وإعداد قلب فأر هو أسهل بكثير للتعلم وبتكاثر أداء. لتقييم أنواع أخرى من الإصابات الناتجة في عضلة القلب المذهل بروتوكول يمكن تعديلها بسهولة. لمحاكاة الإصابة الدماغية عكسها، ببساطة إيقاف مضخة نضح لفترات وجيزة. في الفئران ~ و20 دقيقة نقص التروية العالمي يؤدي إلى انخفاض وظيفة مقلص من دون آثار جسيمة على موت الخلايا واحتشاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardioplegia Solution (St Thomas II) | Symbol / Concentrations (mM) | ||
| Sodium Chloride | NaCl; 110 | ||
| Potassium chloride | KCl; 16 | ||
| Calcium Chloride | CaCL2; 1.5 | ||
| Magnesium Chloride | MgCL2; 16 | ||
| Sodium Bicarbonate | NaHCO3; 10 | ||
| Krebs-Heinslet Buffer | |||
| Sodium Chloride | NaCl; 118 | ||
| Potassium Chloride | KCl; 4.8 | ||
| Magnesium Sulfate | MgSO4; 1.7 | ||
| Sodium Bicarbonate | NaHCO3; 24.9 | ||
| Potassium Phosphate (monobasic) | KH2PO4; 1.2 | ||
| Calcium Chloride | CaCL2; 1.4 | ||
| Sodium Pyruvate | Na pyruvate; 2 | ||
| Glucose | C6H12O6; 6 | ||
| Balloon reagents | |||
| Corn Syrup | |||
| Spaghetti | |||
| Silicon Dispersion Gel | |||
| styrofoam block | |||
| lab oven/incubator ( 50C) | |||
| Langendorff Perfusion equipment | |||
| Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent) | |||
| Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent) | |||
| Heated water circulator | |||
| Cooling water circulator | |||
| Perfusion pump capable of 2-30 ml/min | |||
| Inline perfusion filters - 1 um glass fiber | |||
| Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure | |||
| Small graduated cylinder (~10 mL) | |||
| Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent) | |||
| perfusion resevoir (1L) | |||
| cardioplegia resevoir (~200 mL) | |||
| gas bubbler | |||
| 95/5 O2/CO2 mix | |||
| Surgical tools and reagents | |||
| Metzenbaum and Potz surgical scissors | |||
| two Dumont size 5 forceps | |||
| ketamine | |||
| xylazine | |||
| heparin | |||
| small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends) | |||
| Silk 2-0 and 4-0 sutures |
References
- Kloner, R. a, Jennings, R. B. Consequences of Brief Ischemia: Stunning, Preconditioning, and Their Clinical Implications: Part 1. Circulation. 104 (24), 2981-2989 (2001).
- Mentzer, R. M. Myocardial protection in heart surgery. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 290-297 (2011).
- Chambers, D. J., Fallouh, H. B. Cardioplegia and cardiac surgery: pharmacological arrest and cardioprotection during global ischemia and reperfusion. Pharmacol Ther. 127 (1), 41-52 (2010).
- Bolli, R., Marbán, E. Molecular and cellular mechanisms of myocardial stunning. Physiol Rev. 79 (2), 609-634 (1999).
- Kloner, R. a, Bolli, R., Marban, E., Reinlib, L., Braunwald, E. Medical and Cellular Implications of Stunning, Hibernation, and Preconditioning An NHLBI Workshop. Circulation. 97 (18), 1848-1867 (1998).
- Mersmann, J., Latsch, K., Habeck, K., Zacharowski, K. Measure for measure-determination of infarct size in murine models of myocardial ischemia and reperfusion: a systematic review. Shock (Augusta, Ga). 35 (5), 449-455 (2011).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion). J Mol Cell Cardiol. 50 (6), 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart characteristics and cautions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (11), 867-878 (2003).
- Guide for the Care and Use of Laboratory AnimalsSource. , National Research Council. Available from: http://grants.nih.gov/grants/olaw/Guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Miller, A., Wright, G. L. Fabrication of Murine Ventricular Balloons for the Langendorff Heart Preparation. J Biotecnol Biomater. 1 (101), 1-4 (2011).
- Curtis, M. J. Characterisation, utilisation and clinical relevance of isolated perfused heart models of ischaemia-induced ventricular fibrillation. Cardiovasc Res. 39 (1), 194-215 (1998).
- Clements, R. T., Feng, J., Cordeiro, B., Bianchi, C., Sellke, F. W. p38 MAPK-dependent small HSP27 and αB-crystallin phosphorylation in regulation of myocardial function following cardioplegic arrest. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 300 (5), H1669-H1677 (2011).
- Clements, R. T., Cordeiro, B., Feng, J., Bianchi, C., Sellke, F. W. Rottlerin increases cardiac contractile performance and coronary perfusion through BKCa++ channel activation after cold cardioplegic arrest in isolated hearts. Circulation. 124 (11 Suppl), S55-S61 (2011).
