Abstract
Følgende protokoll er til nytte for å vurdere nedsatt hjertefunksjon eller hjerteinfarkt fantastisk følgende moderate iskemiske fornærmelser. Teknikken er nyttig for modellering iskemisk skade i forbindelse med en rekke klinisk relevant fenomen inkludert hjertekirurgi med kardioplegiske arrest og hjerte-bypass, off-pumpe CABG, transplantasjon, angina, kort iskemi, etc. Protokollen presenterer en generell metode for å modellere hypotermisk hyperkalemic kardioplegiske arrest og reperfusjon i gnager hjerter med fokus på måling av hjerteinfarkt kontraktile funksjon. I korte trekk, er en mus hjerte perfusert i Langendorff modus, instrumentert med et intraventrikulært ballong, og baseline hjerte funksjonelle parametre er registrert. Etter stabilisering, er hjertet så lagt orientere infusjon av en kardio hypotermisk kardioplegi løsning for å initiere diastolisk arrest. Kardioplegi leveres periodisk i løpet av 2 timer. Hjertet blir så reperfunderes og warmed å normotermisk temperaturer og utvinning av myokardfunksjon overvåkes. Bruk av denne protokollen resulterer i pålitelig deprimert hjerte kontraktile funksjon fri fra brutto hjerteinfarkt vevsskade hos gnagere.
Introduction
Hjerteinfarkt imponerende er definert som reversible redusert kontraktile aktivitet til tross for restaurering av tilstrekkelig blodstrømmen etter en kort periode med iskemi eller lengre perioder iskemiske fornærmelser med kardio 1,2,3,4,5. Metoden som presenteres er spesielt brukt til å modellere klinisk relevante iskemiske fornærmelser som kan resultere i reversible svekkelser i kontraktile funksjon (dvs. iskemiske fornærmelser forbundet med hjertekirurgi utnytte kardioplegiske arrest, korte perioder med iskemi, angina, etc.). I motsetning til alvorlig iskemi studier (hjerteinfarkt, nekrose) denne protokollen ble utviklet for å evaluere myocardial funksjonell bedring og kardio uten vevsskade, ombygging, og celledød. Flertallet av papiret diskuterer en standard kardioplegiske arrest protokoll med elementer som ligner på en hjertekirurgi ved hjelp hypotermi og periodisk kardioplegi levering.
Hjerteinfarkt protection under mesteparten av hjertekirurgi er avhengig kardioplegi og hjerte-bypass. Selv kardioplegi (CP) løsninger og strategier varierer mye (blod, krystalloid, kulde, varme etc.) de felles elementer 1) hyperkalemi og / eller andre strategier for å stanse hjertet i diastole og dermed begrense energiutnyttelse som følge av myokardial sammentrekning, og 2) hypotermi å bremse stoffskiftet og hjelpe opprettholde ATP og andre energireserver mens arrestert. Nåværende kardioplegi løsninger gir beskyttelse til hjertet mot iskemiske fornærmelser som ellers ville bevise dødelige. Men kardio strategier under kirurgiske iskemiske fornærmelser er ikke perfekt, og den resulterende mild iskemisk skade kan føre til reversible hjerte kontraktile dysfunksjon tross tilstrekkelig blodstrøm (myocardial imponerende), acidose, cardiomyocyte skade, og vaskulære effekter inkludert redusert koronar perfusjon og vasospasme.
Denne protokollen er forskjelligfra standard isolerte hjertet ischemi modeller evaluere myokardinfarkt og alvorlig ischemia ved at den evaluerer mildere iskemiske fornærmelser noe som kan resultere i nedsatt hjertefunksjon etter iskemi kort eller ischemiske fornærmelser forbundet med kardioplegiske arrest. (For gjennomgang på Langendorff perfusjon teknikker og I / R studier se 6 - 8). For generelle retningslinjer og en grundig analyse av eksperimentelle parametre assosiert med muse isolerte perfuserte hjerter se Sutherland e t al. 2003 9 Teknikken som presenteres her beskriver nødvendig utstyr, reagenser, trinn, strategier og tips til pålitelig indusere imponerende i muse hjerter. Mindre modifikasjoner er nødvendig for å bruke teknikken til rotter.
I korte trekk isolert muse hjerter Langendorff dynket i ca. 30 min med fysiologisk Krebs-Henseleit buffer (KHB), etterfulgt av kulde beskyttet hjertestans via levering av et hyperkalemic hypothermic kardioplegi løsning. Etter pågripelsen, er hjerte funksjonell bedring overvåkes under gjenoppvarming og reperfusjon av hjertet med KHB. Endringer i graden av utvinning av hjerte kontraktile funksjon kan evalueres for å vurdere kardiobeskyttende midler og forskjellige strategier for kardioproteksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle prosedyrer ble godkjent av Livsløp Institutional Animal Care og bruk komité og alle dyr og prosedyrer i henhold til National Research Council Guide for Pleie og bruk av forsøksdyr 10.
1. Balloon Fabrication og venstre ventrikkels Pressure Monitoring Circuit
- Konstruer LV ballonger ifølge Miller et al. 11 I et begerglass med en rørestav, bland 9,5 ml destillert vann, 14,2 ml av lys sirup og 33,8 g sukrose, og varme på en varm plate, blandes til sukkeret oppløses . Fortsett oppvarmingsløsning til den når ca 150 ºC.
MERK: Mange metoder finnes for å konstruere LV ballonger inkludert ombygging av kondom tips og plastfolie bygging 9,12. Vi finner over metoden å være relativt lett å konstruere lekkasje-frie ballonger, men en fordel med plastfolie ballonger inkluderer forrige karakterisering for hensiktsmessig frekvenCY-responsforhold 9. - Bryt tørre spaghetti strengene i stykker ca. 5 cm i lengde, og dyppe den ene side av hvert stykke omtrent 1 cm dypt inn i sukkerløsningen og langsomt fjerne.
- Plasser den tørre enden av pastastrengen inn i et polystyrenskum blokk og suspendere så sukkerblanding drypper ned, og danner en dråpeform mold. La O / N i en eksikator slik at formen stivner.
- Dagen etter, dyppe formene i silikon spredning gel. Plasser pasta tråder tilbake i isopor blokk og plasser i aa 37 ºC ovnen i 2 timer eller til den er tørr. Gjenta dette trinnet en gang så to lag med silikon er brukt.
- Når det er tørt, for å plassere i vann i flere timer hjelpe til ved fjerning av ballongen fra formen. Oppbevar ballonger i 0,02% natriumazid løsning.
- Bruke en 23 G blodoppsamlings satt til å produsere et tilpasset ballong kanyle ved å skjære en nål for å lage en butt spiss og plassere hakkene i nålen.
- Koble røret til et trykk transprodusent og skyll med vann mens du holder slangen og kanylen helt under vann, slik at luft kommer inn i systemet. Plasser en ballong som er fylt med vann på kanylen og bruke 2-0 silkesuturer å binde på kanylen. Test ballong med evne til å opprettholde trykket (~ 100 mmHg i minst 1 time)
2. Fremstilling av de isolerte hjerte perfusjon System
- Til å begynne med, vaske og varme system. Slå på et 37 ° C varmt vannbad sirkulator som er koplet til Langendorff-apparat, og fylle bufferreservoaret med destillert vann. Kobler til en ny glassfiberfilter til tubing strømmer inn apparatet og slå på pumpen for å skylle ut systemet. I løpet av prep tiden overvåke temperaturen av vannet slynges ut fra Langendorff blokken ved hjelp av en temperaturføler, for å sikre at vannbadet er innstilt nøyaktig. Slå også på en nedkjølt sirkulasjonspumpen og satt til 20 ºC som skal brukes under kardioplegiske arrestasjonen av hjertet.
- Jegn mellomtiden forberede følgende løsninger. Tilbered en L av kardioplegi-oppløsning (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2, 10 mM NaHCO3) og filtrer. Også fremstille 2 liter KHB (118 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH 2PO 4, 1,7 mM MgSO4, 2 mM Na-pyruvat, 6 mM dekstrose, 24,9 mM NaHCO3 (pre-gjennomluftet med CO 2) og 1,4 mM CaCl2 (tilsatt sist). Etter oppløst, fjerner bunnfall ved filtrering i en kolbe ved bruk av et 5 mikrometer frittet glasstrakt. Plasser noe inn i en liten skål på is til bruk under kirurgiske inngrep og isolasjon.
- Oksygenere perfusatet (KHB) med 95% O2 / 5% CO2 i minst 30 min før bruk. Perfuse Langendorff system med KHB å fjerne eventuelle gjenværende vann fra systemet og buffertanken. For mus, sett den første pumpehastigheten til ~ 2,0 ml / min. Plasser 2-0 og 4-0 silkesuturer nærheten perfusjonskanyle. Kjør pumpen til røret og apparatet er fylt with perfusatet og sikre boblen strup er fylt med perfusatet.
MERK: For lange perioder av perfusjon og stabil funksjon er det sterkt anbefalt å installere en in-line glassfiberfilter (~ 1 mikrometer) i perfusjon kretsen å samle eventuelle utfellinger som kan danne blodpropp i hjertet
3. Mouse Surgery
3.1) Mouse Anestesi og håndtering
- Forbered sprøyte med bedøvelse dose på 80 mg / kg ketamin og 5 mg / ml xylazin blanding, og legge steril 0,9% saltvann for å få opp volumet til 0,2 ml. Injiser Heparin IP (50 ul av 1000 U / ml oppløsning).
- Plasser musen tilbake i transportbeholder (~ 10-20 min) og vente på det å miste bevisstheten som heparin trer i kraft. Med jevne mellomrom gjøre en tå klype for å overvåke smerte refleks.
3.2) Fjern the Heart
- Når musen er fullt bevisstløs og ikke reagerer på tå klype, fest den til en passende operasjonsbordet ved hjelp av pinner eller 25 G sprøyte tips gjennom ekstremiteter. Utfør en torakotomi å avsløre hjertet. Skjære et lite hull like nedenfor sternum og strekker kuttet til sidene av mus unngå membranen.
- Raskt skjære membranen og deretter raskt skjære opp sidene av brystkassen. Vend tilbake brystkassen som en musling shell å avsløre brysthula. Forsiktig ta tak i hjertet, plasserer saks under og fjern hjerte.
MERK: Det er viktig å raskt fjerne hjertet når den er eksponert i brysthulen og lungene er ikke-fungerende.
3.3) Rengjør Hjerte
- Plassere hjertet i formen inneholder iskald KHB og klippe av noen store biter av lungevev vedlagt. Bruk pinsett til å plukke opp hjertet og finne aorta. Klem forsiktig på hjertet og se etter en hvilken som helst blod som vises, da dette må være den åpne enden av aorta. Bruk fin spiss pinsett til å holde hjertet av den åpne enden av aorta.
4.1) Montering og kanylerør hjertet
- Før transport hjertet til Langendorff apparatet, slå på pumpen sikre at perfusjonstrykk er lav (~ 20 mmHg). Hold hjertet ved aorta like under kanyle. Ved hjelp av et annet sett med fin spiss pinsett, åpne forsiktig aorta og skyv hjerte opp på kanylen. Hold den på plass med ett sett med pinsett og deretter bruke en myk kantet klipp for å midlertidig feste den til kanyle.
MERK: Raskt montering hjertet til perfusjonskanyle er avgjørende for en god forberedelse. Med erfaring, bør fremgangsmåten i å åpne brystkassen til montering av hjertet ta mellom 1 og 2 min. - Slips og initiere perfusjon som følger, bruker 4-0 silke sutur sikker aorta til kanylen rett under klippet. Sørg for at uavgjort er også rundt metall aortic kanyle, så aorta ikke blir bundet av når innstrammingknuten. Når én uavgjort er godt plassert, fjerne klippet.
- Bruk ekstra silkesuturer å feste aorta sikkert til kanylen og pass på å feste under noen fartøy grener som kan kommer av aorta. Disse kan ofte bli oppdaget av perfusatet lekker eller skyte ut fra hovedpulsåren.
MERK: Under den innledende fasen av perfusjon blodet bør vaske fra hjertet og hele hjertet skal vises en myk rosa farge. Mørke misfarginger som ikke vasker ut indikere iskemiske områder sannsynlig på grunn av luft emboli eller propper og hjertet skal ikke brukes.
4.2) Etablering Perfusjons og LVP Measurement
- Langsomt øke perfusjonstrykk og øke pumpehastigheten inntil perfusjonstrykk når 70 mmHg.
MERK: Standard perfusjon press for mus perfusjon kan være 70-90 mmHg, men må holdes konstant fra dyr til dyr innenfor et eksperiment. - Rengjør værende vev (lunge, skjoldbrusk etc.) Som kan fortsatt være festet til hjertet. Bruk saks til å klippe av venstre atrium for å skape en åpning inn i venstre hjertekammer.
- Plasser ballongen på holderen og deflate. Plasser ballongen kanylen nær den aortiske kanylen, rett over åpningen inn i venstre ventrikkel. Sett forsiktig ballong nedover inn i venstre hjertekammer mens du holder hjertet på plass så aorta ikke rive.
- Når den er på plass sakte begynne å blåse opp ballongen til LVEDP når ~ 8 mmHg. Plasser temperatursonden mot bunnen av hjertet, slik det måler temperaturen i utstrømningen.
4.3) Basal Measurement
- Tett hjerte i en vannkappe perfusjon kammer. I løpet av denne tiden kontinuerlig perfuse hjertet med KHB, og sikre at temperaturen fortsetter å stige. Overvåke temperaturen og justerer vannbad i henhold til den når omtrent ~ 37 ° C.
MERK: Overvåking Temperature i de innledende fasene av perfusjon er kritisk som koronar strømmer og deretter temperaturen kan variere fra hjerte til hjerte. Temperatur av avløpet perfusatet overvåkes for ønsket myocardial temperatur via en temperaturføler plassert ved spissen av hjertet. I tillegg, i forhold til andre Langendorff-perfusjon protokoller, hjertet ikke er neddykket i CP- eller KHB under perfusjon eller stansing, er dette i hovedsak gjort det enkelt å justere temperatur, samt gi effektiv CP levering uten diffusjon. - Begynn å kontinuerlig registrere funksjonell måling ved hjelp av en datainnsamling system knyttet til de aktuelle sensorene, inkludert perfusjonstrykket, venstre ventrikkel (trykket svinger, montert LVP ballong), temperatur og elektrofysiologiske parametre (EKG, MAP hvis montert) (vedlegg vil være henhold til produsenter og spesifikke for de enkelte sensorer og datainnsamlingssystem). Når avløpsvannet KHB når ~ 37 ºC i minst 15 min og hjerte funksjonelle parametre er stabile, merk tidspunktet for basismålinger.
MERK: Inkludering / eksklusjonskriteriene er anvendt på hvert hjerte. En LVDP av <60 mmHg ved baseline indikerer et hjerte som bør fjernes fra analysen. I tillegg sannsynlig indikerer koronar flyt> 4,5 ml / min, eller manglende evne til å opprettholde perfusjonstrykket ved baseline en lekker eller revet aorta. Også noen hjerter som har klare iskemiske områder som kan bekreftes visuelt (dvs. blodpropp) eller utstilling iskemi-forbundet reduksjoner i hjertefunksjon (dvs. økende LVeDP, ekstremt arytmisk) er fjernet fra analysen. - Måle hjertestrømmen via samling av koronar avløpet i en målesylinder i 1 min. Lukk kammeret og tillate temperatur og virke til å gå tilbake til utgangsverdien. Alternativt kan måling av den koronare strømning kontinuerlig i perfusjonslinjen via en strømningssonde plassert etter trykkavlastningskrets.
- Plasser 100 ml kaldt kardioplegi buffer i et annet reservoar og. overføre KHB reservoaret kanyle til kardioplegi reservoaret.
- Ta av vannkappe bolig og perfusjon oppvarmingen kretsen fra varmt vannbad og koble til kjølesirkulasjonspumpe bruker tubing hurtigkoblinger. Bruk separate oppvarming og kjøling sirkulatorer å tillate raske temperaturendringer i hjertet og perfusatet.
- Flg luftboblen som blir innført i røret i løpet av bryteren, og når den har nådd nær den isolerte hjertet starte tidspunktet for kardioplegi. Lever kardioplegi i 2 min. Etter den første dosen stoppe pumpen. Sørg for å arrestere hjertet i diastolen og være nær den ønskede CP temperatur.
MERK: Et tilstrekkelig boble felle er nødvendig for å unngå luft emboli i hjertet. Alternativt en levering system for begge reservoarer slått av en stoppekran kan enkelt konstruert, men vi finner følging liten luftboble som innføres når bytte kanyle mellom reservoarene, en enkel metode for timing CP levering gitt potensielt forskjellige pumpe hastigheter mellom eksperimenter (dvs. på grunn av mus / rotte, perfusjonstrykket, filter motstand, osv.) - Holde hjertet i kardioplegi for 2 timer ved -20 ºC. Hver halve time i løpet CP slå pumpen på igjen for 1 min så en ny dose gis.
MERK: Vendende doser av CP hvert 30 min resulterer i funksjonssvikt av hjertet uten nekrose i vevet. Lengre perioder mellom doser av CP (dvs.> 45 min) kan føre til nekrose og iskemisk kontraktur og vil være mer passende for en modell av nekrotisk skade forbundet med iskemi ubeskyttet.
6. Reperfusjon
- Ved slutten av CP, overføre reservoaret kanylen tilbake til oksygenert KHB. Koble temperaturkontrollkretser til varmesirkulasjonspumpe og vri pumpepå å starte reperfusjon. På dette punktet kardioplegi skyller ut, observere temperaturen stige og hjertet begynner å slå igjen etter 2-4 min av reperfusjon. Når hjertet begynner hjerteslag er treg og ofte arytmisk.
MERK: Det er vanligvis ikke en stor økning i diastolisk LVP (dvs. ≤10 mmHg økning) som ofte er karakteristisk i rene ischemi modeller. Arytmier kan vedvare godt inn reperfusjon og noen ganger hjertet må defibrillert. Dette kan oppnås ved bruk av en stimulator satt til høyere spenninger (~ 10-50 V) og elektroder plassert på bunnen og toppen av hjertet. - Tillat hjertet til å reperfuse i 30 minutter, og i løpet av denne tidsperioden tar koronare strømningsmålinger som er nødvendig. Mål hjertestrømmen ved å samle avløpet med en målesylinder i 30-60 sek.
7. Samle Tissue
- Deflatere ballongen og ta den ut av venstre hjertekammer. Ta hjertet avkanyle og veie det. I innledende forsøk, bør minst ett tverrgående bit av hjertet bli tatt og TTC farget for å evaluere nekrose å sikre at hjertet er fri for nekrotisk skade.
- Samle hjerte skiver for mikroskopi studier, våt / tørr vekter osv Resten eller hele sitt hjerte bør raskt frosset ved å plassere i flytende nitrogen. Oppbevar frosne hjerter i en -80 ºC fryser.
MERK: For måling av høye energifosfatforbindelser (dvs. ATP, kreatinfosfat), hjerter bør fryses umiddelbart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser typiske resultater fra en mus eksperiment. LVP (rød linje), ble dP / dt (grønn linje) og temperatur (lilla linje) continusouly registrert over ~ 3 timer. Bokstaver angir en - utgangsmålinger, b, c, d, e - levering av kardioplegi løsning, f - starten av reperfusjon, g, h, i, j - måling av cornary strømmen under reperfusjon. Note, deprimert LVDP og dP / dt ved reperfusjon sammenlignet med utgangspunktet. Figur 1B inneholder data fra A registrert over ~ 2 sek. Legg merke til nedgangen i LVP og dP / dt lik A, små reduksjoner i HR og små økninger i LVEDP. Vanligvis etter 30 minutter av reperfusjon er det en ~ 40% reduksjon i hjertefunksjon som gjenspeiles av venstre ventrikkel utviklet press LVDP avbildet i figur 1C.
Figur 1. Representant resultats av en hel eksperiment. (A) opptak venstre ventrikulære trykk (øverst), første derivatet av LV trykk og temperatur. (B) kort intervall opptak for å se spor detaljer og (C) Kvantifisering av venstre ventrikkel utviklet trykk (LVDP) for flere eksperimenter (n = 6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De foregående protokolldetaljer metoder for å evaluere hjerteinfarkt fantastisk sekundært til global iskemi forbundet med kardioplegiske arrest. I våre hender denne protokollen gir en tilnærmet ~ 40% reduksjon i hjertefunksjon (LVDP, +/- dP / dt) med minimale endringer i hjertefrekvensen på 30 min post-reperfusjon tidspunkt. Når hjertet er reperfusert og gjenoppvarmes alle parametere av hjertefunksjonen er redusert ved utgangs tidspunkter med en sterkt redusert hjertefrekvens før stabilisering mellom 20 og 30 min. Koronar flyt er generelt sterkt økt i løpet av tidlig reperfusjon grunn hyperemia, og deretter faller til ~ 20-30% mindre enn kontrollnivåer etter 30 minutter reperfusjon.
Det er viktig å huske at myokardial slående per definisjon skal forlate hjertet fri for celledød og nekrose, som er karakteristisk for ren ischemi / MI-modeller (dvs.> 20 min ingen flyt regional ischemi). Innledende studier bør vurdere vev histollogi for å sikre en mangel på nekrotisk skade. I tillegg, selv om hjerteinfarkt imponerende per definisjon skal resultere i normal funksjon etter langvarig reperfusjon (hr til dager), er det sannsynlig denne protokollen vil ikke demonstrere fullt restituert funksjon på grunn av ex vivo Langendorff perfusjon som er assosiert med reductons i hjertefunksjonen i kontroll perfuserte hjerter over tid. Ikke desto mindre endringer i den akutte utvinning av hjertefunksjonen i fravær av celledød / nekrose kan anvendes som indeksene til alvorlighetsgraden av slående Hovedforskjellen i denne protokollen vs. klassiske no-flow iskemi protokoller er bruken av en kardio strategi, i dette tilfellet være hyperkalemic kardioplegi. Hyperkalemic kardioplegi løsninger gir beskyttelse mot nekrotisk skade og celledød ved å forårsake diastolisk hjertestans. Diastolisk arrestasjonen av hjertet fremmer bevaring av energireserver. I tillegg er de fleste klinisk anvendt kardioproteksjon protokoller bruke nedkjøling til ytterligere limit skade på hjertet ved å redusere metabolsk etterspørsel. Andre faktorer som kan moduleres under ovennevnte protokoll omfatte forskjellige formuleringer av kardioplegi-løsninger (som hyperpolariserer formuleringer, Mg ++, K + nivåer, etc.), strategier (varm vs. kald, "hot shot", etc.), og forskjellige medikamenter (kinase hemmere, ionekanal modulatorer, kardiobeskyttende midler, etc.).
Siden hjertet er i en relativt godt beskyttet tilstand, for å få reproduserbare funksjonssvikt i denne modellen krever nødvendigvis lengre iskemi ganger (dvs. større enn 2 timer). Vi har funnet ut at gnagere hjerter er relativt motstandsdyktig mot skade i denne modellen, spesielt sammenlignet med større dyr (griser, mennesker) som sikkert vise lamslått hjertemuskelen under mye kortere perioder (dvs. 30 min). Vi har også funnet at periodisk levering er nødvendig for å beskytte hjertet av alvorlig iskemisk skade som 45-60 min intervall follofløyen CP levering kan resultere i brutto diastolisk dysfunksjon, iskemisk kontraktur, og vevsskader ved reperfusjon. Andre lett tilpasningsdyktige komponenter i protokollen kan omfatte undersøkelser knyttet til CP bestanddeler og rollen som hypo / normotermisk arrestere samt ulike arrest strategier ikke avhengig av K + (NA kanalblokkere, hyperpolariserer agenter) 3.
Det finnes også en rekke viktige begrensninger i denne teknikk når det brukes til å modellere slående forbundet med klinisk hjertekirurgi. Først blir bruttoparten av kliniske CP oppløsninger blandet med blod (~ 4-blod: 1 CP-forhold). Dette er generelt ikke mulig hos mus som følge av perfusjon kretsen volum så vel som behovet for behandlede rør og fiber oksygenat. Ofte for større dyr (marsvin / kaniner) donordyr vil også være nødvendig. I tillegg, som i alle isolerte organ modeller, påvirkning av ytre faktorer (dvs. inflammatoriske signaler, blod reperfusjon, etc.) blir fullstendig ignorert. Likevel er det en praktisk, effektiv og økonomisk modell for å teste forstudier farmakologiske additiver og forskjellige strategier for kardioproteksjon.
Protokollen er hovedsakelig den samme i rottehjerter, med unntak av en større ballong og aortiske kanylen 13,14. I tillegg krever rottehjerte forberedelse betydelig større strømningsrater (12-20 ml / min). På grunn av sin størrelse, er rottehjerte forberedelse betydelig lettere å lære og reproduserbart utføre. For å vurdere andre typer skader som resulterer i hjerteinfarkt fantastisk protokollen kan enkelt endres. Å etterligne reversibel iskemisk skade, rett og slett slutte perfusjonspumpeanordningen for korte perioder. Hos rotter ~ 20 min global iskemi vil resultere i redusert kontraktile funksjon uten brutto effekter på celledød og infarkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardioplegia Solution (St Thomas II) | Symbol / Concentrations (mM) | ||
| Sodium Chloride | NaCl; 110 | ||
| Potassium chloride | KCl; 16 | ||
| Calcium Chloride | CaCL2; 1.5 | ||
| Magnesium Chloride | MgCL2; 16 | ||
| Sodium Bicarbonate | NaHCO3; 10 | ||
| Krebs-Heinslet Buffer | |||
| Sodium Chloride | NaCl; 118 | ||
| Potassium Chloride | KCl; 4.8 | ||
| Magnesium Sulfate | MgSO4; 1.7 | ||
| Sodium Bicarbonate | NaHCO3; 24.9 | ||
| Potassium Phosphate (monobasic) | KH2PO4; 1.2 | ||
| Calcium Chloride | CaCL2; 1.4 | ||
| Sodium Pyruvate | Na pyruvate; 2 | ||
| Glucose | C6H12O6; 6 | ||
| Balloon reagents | |||
| Corn Syrup | |||
| Spaghetti | |||
| Silicon Dispersion Gel | |||
| styrofoam block | |||
| lab oven/incubator ( 50C) | |||
| Langendorff Perfusion equipment | |||
| Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent) | |||
| Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent) | |||
| Heated water circulator | |||
| Cooling water circulator | |||
| Perfusion pump capable of 2-30 ml/min | |||
| Inline perfusion filters - 1 um glass fiber | |||
| Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure | |||
| Small graduated cylinder (~10 mL) | |||
| Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent) | |||
| perfusion resevoir (1L) | |||
| cardioplegia resevoir (~200 mL) | |||
| gas bubbler | |||
| 95/5 O2/CO2 mix | |||
| Surgical tools and reagents | |||
| Metzenbaum and Potz surgical scissors | |||
| two Dumont size 5 forceps | |||
| ketamine | |||
| xylazine | |||
| heparin | |||
| small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends) | |||
| Silk 2-0 and 4-0 sutures |
References
- Kloner, R. a, Jennings, R. B. Consequences of Brief Ischemia: Stunning, Preconditioning, and Their Clinical Implications: Part 1. Circulation. 104 (24), 2981-2989 (2001).
- Mentzer, R. M. Myocardial protection in heart surgery. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 290-297 (2011).
- Chambers, D. J., Fallouh, H. B. Cardioplegia and cardiac surgery: pharmacological arrest and cardioprotection during global ischemia and reperfusion. Pharmacol Ther. 127 (1), 41-52 (2010).
- Bolli, R., Marbán, E. Molecular and cellular mechanisms of myocardial stunning. Physiol Rev. 79 (2), 609-634 (1999).
- Kloner, R. a, Bolli, R., Marban, E., Reinlib, L., Braunwald, E. Medical and Cellular Implications of Stunning, Hibernation, and Preconditioning An NHLBI Workshop. Circulation. 97 (18), 1848-1867 (1998).
- Mersmann, J., Latsch, K., Habeck, K., Zacharowski, K. Measure for measure-determination of infarct size in murine models of myocardial ischemia and reperfusion: a systematic review. Shock (Augusta, Ga). 35 (5), 449-455 (2011).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion). J Mol Cell Cardiol. 50 (6), 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart characteristics and cautions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (11), 867-878 (2003).
- Guide for the Care and Use of Laboratory AnimalsSource. , National Research Council. Available from: http://grants.nih.gov/grants/olaw/Guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Miller, A., Wright, G. L. Fabrication of Murine Ventricular Balloons for the Langendorff Heart Preparation. J Biotecnol Biomater. 1 (101), 1-4 (2011).
- Curtis, M. J. Characterisation, utilisation and clinical relevance of isolated perfused heart models of ischaemia-induced ventricular fibrillation. Cardiovasc Res. 39 (1), 194-215 (1998).
- Clements, R. T., Feng, J., Cordeiro, B., Bianchi, C., Sellke, F. W. p38 MAPK-dependent small HSP27 and αB-crystallin phosphorylation in regulation of myocardial function following cardioplegic arrest. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 300 (5), H1669-H1677 (2011).
- Clements, R. T., Cordeiro, B., Feng, J., Bianchi, C., Sellke, F. W. Rottlerin increases cardiac contractile performance and coronary perfusion through BKCa++ channel activation after cold cardioplegic arrest in isolated hearts. Circulation. 124 (11 Suppl), S55-S61 (2011).
