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तरल और ठोस ट्यूमर से निकाली गई कैंसर सेल Proteomes के मात्रात्मक मास Spectrometric रूपरेखा

Published: February 27, 2015 doi: 10.3791/52435
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2, 3,4, 3,4, 2,5,6, 2,5,6
1Institute of Pathology, University Medical Center, Göttingen, 2Department of Hematology/Oncology, Goethe University of Frankfurt, 3Bioanalytical Mass Spectrometry Group, Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, 4Bioanalytics, Institute of Clinical Chemistry, University Medical Center, Göttingen, 5German Cancer Consortium, 6German Cancer Research Center

Abstract

में गहराई से कैंसर सेल proteomes का विश्लेषण करती है oncogenic pathomechanisms स्पष्ट करने के लिए, साथ ही संभावित दवा लक्ष्य और नैदानिक ​​बायोमार्कर की पहचान करने की जरूरत है। हालांकि, मरीज व्युत्पन्न ट्यूमर की और विशेष रूप से उनके सेलुलर उप-जनसंख्या में मात्रात्मक प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन के लिए तरीकों में काफी हद तक कमी कर रहे हैं। यहाँ हम तरल या ठोस ट्यूमर या तो से निकाली गई कैंसर कोशिका उप-जनसंख्या का proteomes के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है कि एक प्रयोगात्मक सेट अप का वर्णन है। यह पहले से पंजीकृत डेटा विश्लेषण द्वारा पीछा मात्रात्मक सुपर SILAC आधारित मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ सेलुलर संवर्धन रणनीतियों के संयोजन के द्वारा हासिल की है। FACS-छँटाई द्वारा पीछा cytometry के विशिष्ट सेलुलर सबसेट को समृद्ध करने के लिए, तरल ट्यूमर पहले प्रवाह से immunophenotyped कर रहे हैं; ठोस ट्यूमर के लिए, लेजर कब्जा microdissection के विशिष्ट सेलुलर उप-जनसंख्या को शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है। चरण में एक दूसरे, प्रोटीन शुद्ध कोशिकाओं से निकाले जाते हैं और बाद में एक ट्यूमर विशेष के साथ संयुक्त,प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए सक्षम बनाता है कि कील में मानक SILAC लेबल। जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन मिश्रण जेल वैद्युतकणसंचलन या tryptic पाचन द्वारा पीछा फ़िल्टर एडेड नमूना तैयार (FASP) या तो के अधीन है। अंत में, tryptic पेप्टाइड्स एक संकर quadrupole-Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं, और प्राप्त आंकड़ों MaxQuant सहित पहले से पंजीकृत सॉफ्टवेयर सूट के साथ कार्रवाई कर रहे हैं। 8000 प्रोटीन अप करने के लिए, यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रवाह के माध्यम से पहचाना जा सकता है और मरीज व्युत्पन्न नमूनों में मात्रा निर्धारित है, और जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल नैदानिक ​​प्रोटिओमिक हस्ताक्षर या संभावित दवा लक्ष्यों की पहचान करने के लिए मरीजों के बीच तुलना की जा सकती।

Introduction

मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटिओमिक्स में उभरा है और कोशिका जीव विज्ञान और translational जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल अनुशासन अब है। प्रोटीन के हजारों एक भी बड़े पैमाने पर Spectrometric प्रयोग 1,2 में पहचाना जा सकता है के रूप में क्षेत्र में तकनीकी प्रगति, सेल लाइनों और पशु मॉडल में जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए यह संभव बना दिया है। यह आमतौर पर संशोधन 2,3 के प्रत्येक प्रकार के संवर्धन और डेटा विश्लेषण के लिए bespoke वर्कफ़्लोज़ की आवश्यकता है, हालांकि इसी प्रकार प्रगति, इस तरह के फास्फारिलीकरण या ubiquitination के रूप में कई posttranslational संशोधनों के विश्लेषण के लिए किया गया है। इसके अलावा, SILAC सहित रासायनिक और चयापचय लेबलिंग रणनीतियों, की भागीदारी मानव कैंसर चार में बुनियादी सेलुलर प्रक्रियाओं, नैदानिक ​​बायोमार्कर और संभावित दवा लक्ष्यों की खोज के लिए इस पद्धति का विशेष रूप से आकर्षक बना रही है, प्रोटीन और PTMs की सटीक सापेक्ष मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है।

हालांकि,कई चुनौतियों का प्राथमिक मानव के कैंसर 5 की प्रोटिओमिक विश्लेषण के संबंध में दूर किया जा करने के लिए है। सबसे पहले, मानव कैंसर के नमूने अक्सर प्रतिरक्षा कोशिकाओं और fibroblasts सहित ट्यूमर microenvironment, से संबंधित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की उपस्थिति की वजह से है कि सेलुलर विविधता के एक उच्च स्तर दिखा। दूसरे, क्लोनल विकास विशिष्ट कार्यात्मक गुणों के साथ कई सेलुलर उप-जनसंख्या के अस्तित्व में है, जिसके परिणामस्वरूप खुद को ट्यूमर के भीतर आनुवंशिक विविधता की ओर जाता है। कैंसर के विकास और प्रगति, इस तरह के (कार्यात्मक अत्यधिक प्रासंगिक) सेलुलर उप-जनसंख्या का प्रोटिओमिक विश्लेषण के पीछे चला बलों जा रहा है कुछ कैंसर स्टेम कोशिकाओं की वर्तमान अवधारणा के अनुसार नैदानिक ​​आवेदन के लिए प्रासंगिक oncogenic तंत्र की एक बेहतर समझ के लिए बड़े महत्व का होने की उम्मीद है 6। तीसरा, नमूने के बड़े सेट की मात्रात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल अक्सर मजबूत नैदानिक ​​BIOMAR की पहचान के लिए आवश्यक हैंkers; भरोसा है कि वे कर के रूप में सेलुलर प्रसार 4 पर, - - वैसे ही अयोग्य हैं चयापचय लेबलिंग रणनीतियों, जबकि इस तरह के iTRAQ 7 के रूप में रासायनिक लेबलिंग के द्वारा पूरा नहीं किया जा सकता। चौथे, सबसे उपलब्ध ठोस ट्यूमर के नमूने formalin तय की वजह से प्रोटीन crosslinks 8 के गठन के लिए बड़े पैमाने पर Spectrometric proteome विश्लेषण पेचीदा जो कर रहे हैं। अंत में, सबसे मौजूदा प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लोज़ मुश्किल नैदानिक ​​अनुसंधान के लिए प्रासंगिक नमूना संख्या के विश्लेषण के प्रतिपादन नमूना प्रसंस्करण और डाटा अधिग्रहण के महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है, और नए कार्यप्रवाह के लिए बुला 9,10 लद।

इन बाधाओं को संबोधित करने के लिए हम व्यापक बड़े पैमाने पर Spectrometric विश्लेषण के लिए एक वैश्विक आंतरिक मानक लागू करने के लिए एक सुपर SILAC 14 रणनीति के साथ सेलुलर संवर्धन के लिए 11 या लेजर कब्जा microdissection के 12,13 छँटाई या तो प्रवाह cytometric सेल को जोड़ती है कि एक प्रयोगात्मक सेटअप विकसित। यहाँ वर्णित विधि का उपयोग करके, यह तरल या ठोस तरह के कैंसर या तो से ली गई एक मानव ट्यूमर के नमूनों में 8000 प्रोटीन अप करने के लिए यों तो संभव है।

Protocol

मानव ऊतक या रक्त के नमूने पर सभी प्रयोगों नैतिकता मतदान में दिए गए किसी भी दिशा निर्देशों के अनुसार एक आचार समिति ने मंजूरी दे दी है और आयोजित किया जाना चाहिए।

1. सेलुलर संवर्धन

  1. लिक्विड ट्यूमर / प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई।
    1. अमोनियम क्लोराइड का उपयोग कर एरिथ्रोसाइट lysis के प्रदर्शन से या Ficoll घनत्व-ढाल centrifugation द्वारा अस्थि मज्जा या रक्त के नमूने से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग।
      1. एरिथ्रोसाइट lysis के लिए, अमोनियम क्लोराइड समाधान के 4 मिलीलीटर के साथ नमूना के 1 मिलीलीटर गठबंधन। 10 मिनट - 5 के लिए बर्फ पर समाधान सेते हैं। 400 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) + 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) और अपकेंद्रित्र के 40 मिलीलीटर जोड़ें।
      2. Ficoll ढाल centrifugation, परत दो अलग परतों के लिए फार्म Ficoll-Hypaque की 15 मिलीलीटर पर नमूना के 10 एमएल के लिए (परतों को परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना)। आरटी पर 30 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र - ध्यान (15 से 25 डिग्री सेल्सियस) और मोनोन्यूक्लियर फसलinterphase में इकट्ठा कि कोशिकाओं।
      3. कोशिकाओं नीचे स्पिन और पीबीएस + 2% एफसीएस में उन्हें ऊपर ले लो। 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र और 1 मिलीलीटर पीबीएस + 2% एफसीएस में ले। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक विभाज्य और अंतिम दाग में इस्तेमाल प्रत्येक फ्लोरोसेंट डाई के लिए एक विभाज्य ले लो।
    2. 30 मिनट के लिए बर्फ पर निर्माता के निर्देशों के अनुसार कमजोर पड़ने में लुकेमिक सेल की आबादी को अलग-थलग करने के लिए उपयोगी प्रतिदीप्ति लेबल एंटीबॉडी के साथ सेते हैं। इसके अलावा व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक एंटीबॉडी के साथ मुआवजे के लिए इस्तेमाल किया aliquots के दाग। पीबीएस + 2% एफसीएस के साथ दो बार धोएं।
      नोट: इस्तेमाल किया एंटीबॉडी CD117-पीई (क्लोन 95C3), CD34-FITC (क्लोन 8G12) और CD33 पीई (क्लोन P67.6) के खिलाफ माउस मानव विरोधी थे।
    3. 35 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फ़िल्टर सेल, सेल झरनी के साथ आदर्श का उपयोग कर ट्यूब की टोपी में एकीकृत।
    4. (उदाहरण के लिए, 7 AAD) सेल व्यवहार्यता दाग जोड़ें। एक उपयुक्त सेल सॉर्टर 11 (चित्रा 2) का उपयोग क्रमबद्ध कोशिकाओं। Isc में कोशिकाओं को ले लीजिए 10% एफसीएस युक्त ove के संशोधित है Dulbecco मध्यम (IMDM)।
  2. ठोस ट्यूमर / लेजर कब्जा microdissection के।
    1. वर्णित प्रयोगों के लिए, फेफड़ों के कैंसर नमूना से FFPE नमूनों का इस्तेमाल कर रहे थे। इस उद्देश्य के फेफड़ों के कैंसर के ऊतकों को तुरंत शल्य लकीर और के बारे में 3 एक्स 2 एक्स 1 सेमी के टुकड़े के बाद 4% बफर formalin में तय किया गया था के लिए आगे के विश्लेषण के लिए आयल में एम्बेडेड है।
    2. एक सूक्ष्म साथ formalin तय आयल एम्बेडेड (FFPE) नमूना से 10 माइक्रोन मोटाई - 5 वर्गों में कटौती। फिल्म से ढके झिल्ली स्लाइड और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर शुष्क पर माउंट वर्गों। Deparaffinize और 1 मिनट के लिए, xylene में लगातार ऊष्मायन, निरपेक्ष इथेनॉल, 70% और पानी से प्रत्येक घुड़सवार वर्गों rehydrate।
    3. 20 सेकंड के लिए hematoxylin के साथ वर्गों दाग और फिर नल के पानी से कुल्ला। एक लेजर कब्जा microdissection के सिस्टम का उपयोग करके ब्याज की सेल की आबादी लीजिए (भी 12 देखें)।
शीर्षक "> 2। प्रोटीन निष्कर्षण

  1. लिक्विड ट्यूमर।
    1. 400 XG, 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कदम 1.1.5 से सेल निलंबन अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 400 XG पर 5 मिनट के लिए 500 ठंड पीबीएस के μl और centrifugation के साथ दो बार धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस
    2. 10 6 कोशिकाओं प्रति 40 μl lysis बफर जोड़ें और (न्यूनतम सेल नंबर होना चाहिए 10 5 कोशिकाओं (लगभग। 10 माइक्रोग्राम प्रति कुल प्रोटीन)) बर्फ पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। 14,000 XG, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर lysate अपकेंद्रित्र और एक नया प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए सतह पर तैरनेवाला (मंजूरी दे दी सेलुलर lysate) हस्तांतरण। गोली त्यागें।
  2. ठोस ट्यूमर।
    1. Microdissected ऊतक के लिए ऊतक lysis बफर के 60 μl जोड़ें और बर्फ पर 15 मिनट के लिए सेते हैं, कम centrifugation द्वारा तरल पदार्थ इकट्ठा करने और एक नया प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण। तीन मिनट के लिए बर्फ पर lysate Sonicate।
    2. एक अंतिम एसडीएस सह तक पहुंचने के लिए एक 20% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के 15 μl जोड़ें4% की ncentration। 1 घंटे के लिए एक हीटिंग ब्लॉक में 99 डिग्री सेल्सियस पर microdissected ऊतक सेते हैं और 600 rpm पर उत्तेजित। 16,000 XG, 10 मिनट के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर lysate अपकेंद्रित्र और एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।

एक SILAC कील में मात्रा मानक से 3. स्थापना (सुपर SILAC मानक)

नोट: मात्रा का ठहराव मानक 4 से ली गई एक SILAC लेबल प्रोटीन मिश्रण के होते हैं - हित के ट्यूमर के प्रकार है कि मैच 6 कोशिकाओं लाइनों। SILAC लेबल संदर्भ proteome और ट्यूमर व्युत्पन्न proteome के बीच अधिकतम ओवरलैप को प्राप्त करने के लिए, एक प्रमुख घटक विश्लेषण सेल लाइनों मात्रा का ठहराव मानक 14 के लिए चयन कर रहे हैं इससे पहले प्रदर्शन करने की जरूरत है।

  1. प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए)।
    1. सेल लाइनों के प्रोटीन की अभिव्यक्ति पैटर्न का निर्धारण करने के लिए, उपयुक्त सेल संस्कृति मीडिया में लगभग दस अलग सेल लाइनों खेती। Lyse कोशिकाओं के रूप में वर्णित2.1 कदम में। कदम 6.1 में वर्णित के रूप में मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए सेलुलर lysates तैयार करें।
    2. एक उच्च संकल्प पर प्रत्येक कोशिका लाइन के प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करें, तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर मास स्पेक्ट्रोमीटर (nanoLC-एमएस / एमएस)।
    3. एक नि: शुल्क बर्तन MaxQuant का उपयोग करते हुए, जिसके परिणामस्वरूप कच्चे डेटा का विश्लेषण और पर्सेउस 16,17 के रूप में ऐसे जुड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक प्रमुख घटक विश्लेषण करते हैं।
    4. उनके प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल के बीच सबसे बड़ी विविधता दिखाने के लिए और सुपर-SILAC कील में मानक उत्पन्न करने के लिए उन्हें का उपयोग करने वाले 6 सेल लाइनों - 4 का चयन करें।
  2. SILAC-लेबलिंग और लेबल की जाँच करें।
    1. Arginine और लाइसिन कार्बन और नाइट्रोजन (SILAC मध्यम) 4 के स्थिर आइसोटोप के साथ चिह्नित कर रहे हैं, जिसमें उचित SILAC सेल संस्कृति माध्यम में कम से कम पांच सेल चक्र के लिए चुना सेल लाइनों खेती।
    2. Lyse कदम 6.1 में वर्णित के रूप में 3.1 कदम में वर्णित है और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए सेलुलर lysates तैयार करने के रूप में कोशिकाओं।NanoLC-एमएस / एमएस द्वारा SILAC लेबलिंग का समावेश क्षमता को मापने। MaxQuant के साथ जिसके परिणामस्वरूप कच्चे एमएस डेटा का विश्लेषण और SILAC लेबलिंग की क्षमता का निर्धारण। यह उनके लेबल वाले (भारी) में पहचान पेप्टाइड्स और उनके अंतर्जात रूपों (प्रकाश) की संख्या की गिनती, और अनुपात (भारी) / (भारी + प्रकाश) की गणना के द्वारा हासिल की है। लेबलिंग दक्षता 98% से अधिक होना चाहिए।
  3. SILAC proteomes और सत्यापन का संयोजन।
    1. खेती और उपयुक्त SILAC मध्यम निर्देश विनिर्माण के अनुसार चयनित सेल लाइनों का विस्तार। Lyse ठोस ट्यूमर के लिए 3.2 कदम में वर्णित है और प्रत्येक सेलुलर lysate के लिए प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण के रूप में तरल ट्यूमर के लिए कदम 2.1 में वर्णित के रूप में या कोशिकाओं।
    2. प्रत्येक कोशिका लाइन की equimolar प्रोटीन की मात्रा मिलाई और विभाज्य में मिश्रण विभाजित करते हैं। माप जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर aliquots और दुकान स्नैप-फ्रीज। सुपर SILAC मानक के 50 माइक्रोग्राम प्रति - एक प्रयोग के लिए आप 20 की जरूरत है। स्टेन तैयार करने के लिए ध्यान रखनाप्रयोगों की एक श्रृंखला के भीतर मानक बदलने के रूप में अधिक दर्द से बचा जाना चाहिए।

प्रोटीन एकाग्रता और कील में 4. मापन

  1. लिक्विड ट्यूमर।
    1. प्रोटीन quantitation के परख का उपयोग संबंधित सेलुलर lysates और सुपर-SILAC मानक के प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करते हैं।
    2. मंजूरी दे दी सेलुलर lysate और सुपर-SILAC मानक के बराबर मात्रा में मिलाएं और बाद में लिथियम dodecyl सल्फेट (एलडीएस) बफर (नमूना मात्रा का 25%) और कम करने एजेंट (नमूना मात्रा का 10%) जोड़ें।
    3. 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक में जिसके परिणामस्वरूप समाधान हीट। वैकल्पिक रूप से, -80 डिग्री सेल्सियस पर जिसके परिणामस्वरूप विकृत प्रोटीन की दुकान।
  2. ठोस ट्यूमर।
    1. एक प्लेट रीडर पर प्रोटीन एकाग्रता माप के लिए, (बीएसए) कमजोर पड़ने समाधान श्रृंखला, lysate और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन एक साथ उचित सुपर SILAC मानक एक मानक गोजातीय सीरम albumin मिश्रणएक 96 अच्छी तरह से थाली में ssay, और 1 मिनट के लिए हिला, संकेत समय के लिए सेते हैं और निर्माता द्वारा संकेत के रूप में absorbance के उपाय।
      नोट: lysate में उच्च एसडीएस की एकाग्रता और dithiothreitol (डीटीटी) प्रोटीन एकाग्रता निर्धारण के लिए सबसे उपलब्ध assays के लिए एक समस्या है।
    2. स्पष्ट lysate और 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर यूनिट और अपकेंद्रित्र में यूरिया के 200 μl के साथ सुपर SILAC मानक के बराबर मात्रा में मिलाएं। 50 से अधिक स्पष्ट lysate के μl और सुपर-SILAC मानक का प्रयोग न करें। कि यूरिया बाहर मणिभ नहीं करता है तो, 15 डिग्री सेल्सियस नीचे तापमान से बचें।

5. नमूना पृथक्करण और प्रोटीन को पचाने

  1. लिक्विड ट्यूमर।
    1. 12% ढाल एसडीएस पृष्ठ जेल - अलग - 30 एक 4 पर लेन प्रति 100 माइक्रोग्राम प्रति कुल प्रोटीन। Coomassie ब्लू ओ / एन के साथ दाग प्रोटीन। पानी के साथ दो बाद washes के द्वारा अतिरिक्त Coomassie दाग निकालें।
    2. जेल से प्रत्येक लेन कट और यह विभाजनभले ही जेल धुंधला के पैटर्न के 23 बराबर आकार के स्लाइस में। 0.6 मिलीलीटर polypropylene शीशी में अलग से एक में प्रत्येक जेल स्लाइस की प्रक्रिया।
    3. पानी और मेथनॉल / पानी (50:50, वी / वी), 56 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए incubating द्वारा 10 मिमी डीटीटी के साथ कम करने के साथ जेल स्लाइस धो लें। अंधेरे में आरटी पर 60 मिनट पर incubating द्वारा iodoacetamide 55 मिमी (आई ए ए) के साथ जेल स्लाइस alkylate।
    4. नमूना-संभाल कदम के बीच, अतिरिक्त विलायक को हटाने और अभिकर्मक समाधान के तेज सुधार करने के लिए एक speedvac में 15 मिनट के लिए acetonitrile और सूखे के साथ स्लाइस धो लें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए (0.025 एम जलीय अमोनियम बाइकार्बोनेट में 12.5 एनजी / μl) सुअर का trypsin समाधान की न्यूनतम राशि के साथ सूखे जेल स्लाइस rehydrating द्वारा प्रोटीज दरार प्रदर्शन करते हैं।
    6. जेल टुकड़ा करने के लिए 10 μl पानी जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। 80 μl acetonitrile जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। एक मिनट के लिए, 15,800 XG पर अपकेंद्रित्र। एक अलग 0.6 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और दुकान लीजिएटूबे।
    7. 5% चींटी एसिड समाधान, भंवर के 65 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। 65 μl acetonitrile जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। 1 मिनट के लिए 15,800 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला लीजिए और पिछले चरण से सतह पर तैरनेवाला में जोड़ें। एक शून्य concentrator में सूखापन के लिए संयुक्त सतह पर तैरनेवाला लुप्त हो जाना।
  2. ठोस ट्यूमर।
    1. ऊतक lysate से एसडीएस निकालने के लिए भी संदर्भ में 15 के रूप में वर्णित निम्नलिखित FASP प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
    2. कदम 5.2.3 में वर्णित पहले centrifugation के बाद 20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 14,000 XG पर एक फिल्टर पर 8 एम यूरिया के आगे 200 μl, और आगे अपकेंद्रित्र जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से छानना त्यागें।
    3. 100 μl आई ए ए जोड़ें और एक मिनट के लिए 600 rpm पर एक thermomixer में मिश्रण। अंधेरे में 20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए फिल्टर सेते हैं। 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर अपकेंद्रित्र।
    4. फिल्टर और केंद्रों को यूरिया के 100 μl जोड़ें20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर trifuge,। इस कदम एक बार और दोहराएँ।
    5. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर और सेंट्रीफ्यूज को एनएच 4 HCO 3 के 100 μl जोड़ें। दो बार इस चरण को दोहराएँ।
    6. 40 μl एनएच 4 HCO 3 1 μl (= 0.4 माइक्रोग्राम प्रति) trypsin जोड़ें और 600 आरपीएम, एक मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर thermomixer में मिश्रण। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गीला कक्ष में फिल्टर हे / एन सेते हैं। नया संग्रह ट्यूबों के लिए फिल्टर स्थानांतरण।
    7. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिल्टर अपकेंद्रित्र। 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 14,000 ग्राम पर एनएच 4 HCO 3 और अपकेंद्रित्र के 50 μl फिल्टर जोड़ें। बड़े पैमाने पर Spectrometric माप जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर जिसके परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स स्टोर।
    8. पेप्टाइड एकाग्रता माप के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली में जिसके परिणामस्वरूप प्रवाह के माध्यम से और साफ tryptophan के उपयुक्त dilutions की एक श्रृंखला के 50 μl बांटना। Tryptophan प्रतिदीप्ति उपाय। के परिणामस्वरूप एकाग्रता कन्वर्टtryptophan के 0.1 माइक्रोग्राम प्रति के रूप में पेप्टाइड एकाग्रता के लिए नियासिन, 9 माइक्रोग्राम प्रति प्रोटीन से मेल खाती है।

6. तरल क्रोमैटोग्राफी और बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण

  1. एक sonication स्नान में 5 मिनट के लिए 30 μl लोड हो रहा है बफर में पेप्टाइड्स Redissolve। 1 मिनट के लिए 15,800 XG पर एक अपकेंद्रित्र में स्पिन और एक एमएस autosampler शीशी में स्पष्ट समाधान विंदुक।
  2. NanoLC-एमएस / एमएस प्रणाली के autosampler का उपयोग कर विश्लेषण के अनुसार नमूने के 5 μl इंजेक्षन। C18 पूर्व स्तंभ (5 माइक्रोन रोमकूप आकार C18 सामग्री के साथ 0.15 मिमी आईडी x 20 मिमी) एक दिए स्तंभ स्थापना या एक precolumn स्विचन सेटअप या तो में रखा एक उलट चरण पर ऑनलाइन ध्यान लगाओ और फीका बनाना पेप्टाइड्स।
  3. एक उलट चरण C18 microcolumn पर अलग पेप्टाइड्स (0.075 मिमी आईडी X 200 मिमी आत्म-पैक 5> 35% acetonitrile की एक 90 मिनट ढाल बनाम का उपयोग करते हुए, इस तरह के PicoFrit के रूप में एक आत्म-पैक nanospray स्तंभ में 3 माइक्रोन या छोटे छेद के आकार C18 सामग्री के साथ 300 nl पर। 0.1% जलीय फार्मिक एसिड /मि। एक nanospray आयन स्रोत के माध्यम से एक संकर quadrupole / Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर में ट्रांसफर eluent।
  4. एक Top15 डेटा निर्भर अधिग्रहण विधि (एमएस मी / z रेंज 350 का उपयोग कर पेप्टाइड्स विश्लेषण -। 1600, संकल्प लक्ष्य 70.000 FWHM, एजीसी लक्ष्य 1 एक्स 10 6, मैक्स भरने के समय 60 मिसे एमएस / एमएस द्रव्यमान 100 शुरू, संकल्प लक्ष्य 17.500 FWHM, एजीसी ।, एमएस / एमएस दहलीज 3 एक्स 10 4 2 एक्स 10 5, मैक्स भरने के समय 60 मिसे को लक्षित चार्ज राज्यों 2 में शामिल हैं - 5, सामान्यीकृत टकराव की ऊर्जा एनसीई 25%, गतिशील अपवर्जन 15 सेकंड)।

7. डेटा विश्लेषण

  1. डेटा विश्लेषण के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध MaxQuant 16 सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। पहले से पंजीकृत डेटा विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल 16,17 में वर्णित है। विश्लेषण के लिए, एक ही प्रयोग 17 में एक एसडीएस पृष्ठ लेन से सभी स्लाइस से कच्चे डेटा फ़ाइलों गठबंधन।

Representative Results

रोगियों से तरल और ठोस ट्यूमर के प्रोटिओमिक रूपरेखा नई नैदानिक ​​और भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर की खोज के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है। हालांकि, नमूना तैयार करने की प्रक्रिया और बड़े पैमाने पर Spectrometric विश्लेषण नमूनों की जटिलता और नमूने के बड़े सेट में सटीक प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए की जरूरत के कारण चुनौती दे रहे हैं। ऊपर वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई द्वारा या लेजर कब्जा microdissection के द्वारा, या तो ब्याज की कोशिकाओं के अलगाव के साथ शुरू होता है।

इस प्रयोजन के लिए, रोगी व्युत्पन्न अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस या रक्त के नमूने से कोशिकाओं FACS आधारित छँटाई और सेल से पहले ब्याज की परिभाषित सतह मार्कर के खिलाफ प्रतिदीप्ति लेबल एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं।

ऊतक वर्गों से सेलुलर सबसेट को समृद्ध करने के लिए, ये पहली लेजर कब्जा microdissection के लिए अनुमति देने के लिए उपयुक्त स्लाइड पर रखा जा करने के लिए है। इस उद्देश्य के लिए T माउंटवह उपयुक्त झिल्ली स्लाइड पर ऊतक वर्गों और निर्माता के निर्देशों के एक लेजर कब्जा microdissector अनुसार उपयोग करें। क्षेत्रों और ब्याज की कोशिकाओं का चयन स्वस्थ और नियोप्लास्टिक ऊतक के histomorphology के बारे में उचित ज्ञान की आवश्यकता है। निकाली गई कोशिकाओं तो एक उपयुक्त संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित कर रहे हैं। प्रारंभिक प्रयोगों ब्याज के हर नए ऊतक के लिए प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में (कम से कम 10 माइक्रोग्राम प्रति कुल प्रोटीन) की निकासी के लिए आवश्यक ऊतक की राशि को परिभाषित करने के क्रम में किया जाना चाहिए। प्रत्येक microdissected नमूना ऊतक lysis बफर के 60 μl के साथ व्यवहार किया जाता है। कुशल सेल के लिए, ऊतकों के नमूनों से कोशिकाओं formalin प्रेरित प्रोटीन crosslinks दूर करने के लिए 1 घंटे के लिए 99 डिग्री सेल्सियस पर एक thermomixer में incubated हैं 3 मिनट के लिए और एसडीएस नमूने के 15 μl के अलावा के बाद sonicated किया जाना है। केन्द्रापसारण अंत में मंजूरी दे दी सेलुलर lysate के संग्रह की सुविधा होगी।

मैं की हर बीमारी के लिएnterest (तरल और ठोस ट्यूमर) एक उपयुक्त सुपर SILAC मात्रा का ठहराव मानक है 14 स्थापित किया जाना है। एक उपयुक्त मानक ब्याज के नमूने में व्यक्त प्रोटीन की अधिक से अधिक 90% का प्रतिनिधित्व करना चाहिए। एक मात्रा का ठहराव मानक की तैयारी के लिए ब्याज की कैंसर के प्रकार से संबंधित सेल लाइनों पहले उनके प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल निर्धारित करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए और बाद में प्रमुख घटक विश्लेषण किया जाना चाहिए। 4 - अंतर प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ 6 अलग सेल लाइनों को चुना और "भारी" arginine और लाइसिन साथ SILAC-लेबल किया जाना चाहिए। लेबलिंग दक्षता nanoLC-एमएस / एमएस द्वारा जाँच की जानी चाहिए और 98% से अधिक होना चाहिए। बाद में, सेल लाइनों बाद में, प्रत्येक नमूना और SILAC कील में मानक की equimolar प्रोटीन मात्रा में मिलाया जाना चाहिए संबंधित रोगी व्युत्पन्न नमूना और, उसी तरह के रूप में lysed किया जाना चाहिए। ओ नैदानिक ​​नमूनों की सटीक प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए एक महत्वपूर्ण कदमएफ ब्याज रोगी व्युत्पन्न नमूने और SILAC कील में मात्रा का ठहराव मानक की equimolar प्रोटीन की मात्रा का सही मिश्रण है। सॉर्ट किया गया कोशिकाओं से व्युत्पन्न lysates के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, विभिन्न प्रोटीन मात्रा का ठहराव assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऊतक व्युत्पन्न कोशिकाओं से सेलुलर lysates लिए एक परख lysate में एसडीएस और डीटीटी की उच्च सांद्रता के साथ सौदा कर सकते हैं कि जरूरत है। रोगी व्युत्पन्न नमूने और SILAC कील में मानक के प्रोटीन सांद्रता भी तुलनीय नमूने के सैकड़ों बनाने में महत्वपूर्ण है जो सही मिश्रण है, यह सुनिश्चित करने के क्रम में संबंधित नैदानिक ​​नमूनों के साथ पूर्व संयोजन करने के लिए हर बार मापा जाना चाहिए।

अलग कर की -1 डी-पृष्ठ पर 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक thermomixer में गर्म एलडीएस के साथ मिश्रित कर रहे हैं तरल ट्यूमर, से प्राप्त की और बाद में अधीन, मानक और lysate नमूनों में कील और में जेल पाचन के बराबर मात्रा के मिश्रण के बाद trypsin के साथ प्रोटीन। नमूनों से प्राप्तऊतक Wisniewski एट अल द्वारा स्थापित के रूप में FASP दृष्टिकोण का उपयोग करके एसडीएस से मुक्त कर दिया और trypsin साथ पच जाता है। 15

प्राप्त tryptic पेप्टाइड्स फिल्टर से रिहा पेप्टाइड्स की राशि शुरू में फिल्टर पर लादा प्रोटीन की मात्रा की तुलना में 15% और 75% के बीच अलग रूप में ऊतकों के नमूनों के लिए विशेष ब्याज की है जो tryptophan प्रतिदीप्ति, को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए हम tryptophan के प्रतिदीप्ति उपाय। Tryptophan के 1.1 माइक्रोग्राम प्रति लगभग 100 माइक्रोग्राम प्रति पेप्टाइड से मेल खाती है के रूप में एक उपयुक्त tryptophan के कमजोर पड़ने श्रृंखला के साथ तुलना, पेप्टाइड्स की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। यदि आवश्यक हो, FASP प्रसंस्करण से विशेष रूप से व्युत्पन्न नमूने nanoLC / एमएस / एमएस प्रणाली 18 पर लोड करने से पहले उलट चरण-C18 (आरपी-C18) सामग्री के साथ पैक वाणिज्यिक या घर का बना मंच सुझावों पर या तो पूर्व शुद्ध किया जा सकता है।

मास-Spectrometric विश्लेषण एक उच्च पर किया जाता हैसंकल्प, उच्च संवेदनशीलता जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रणाली। संक्षेप में, पेप्टाइड नमूने desalted कर रहे हैं और एक आर.पी.-C18 precolumn पर preconcentrated, और मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए सीधे युग्मित एक आर.पी.-C18 विश्लेषणात्मक स्तंभ पर अलग कर दिया। FASP द्वारा संसाधित ठोस ट्यूमर के लिए (3 घंटा आरपी-C18 ढ़ाल - विश्लेषण के लिए पर्याप्त गहराई को प्राप्त करने के लिए, हम लंबे समय 2 के साथ 40 मिनट आरपी-C18 (तरल ट्यूमर के लिए) ढ़ाल या एकल इंजेक्शन के साथ एसडीएस पृष्ठ प्रोटीन prefractionation का एक संयोजन या तो रोजगार )। एमएस स्पेक्ट्रा chromatographic शिखर प्रोफाइल के एकीकरण से SILAC जोड़े की सही मात्रा का ठहराव अनुमति देने के लिए, 70,000 FWHM या बेहतर के एक प्रस्ताव पर अर्जित कर रहे हैं। प्रोटीन की पहचान के लिए, एक Top15 डेटा पर निर्भर अधिग्रहण विधि पेप्टाइड और प्रोटीन की पहचान के लिए पेप्टाइड एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा की एक बड़ी संख्या उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

जिसके परिणामस्वरूप कच्चे डेटा से, प्रोटीन की पहचान और मात्रा का ठहराव एक UniProt Knowledgebas के खिलाफ MaxQuant सॉफ्टवेयर के साथ खोज डेटाबेस से प्राप्त कर रहे हैंई मानव पूरा Proteome अनुक्रम डेटाबेस 17। MaxQuant सॉफ्टवेयर (वर्तमान संस्करण 1.5.0.25) में पेप्टाइड्स प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस से सिलिको में निकाली गई स्पेक्ट्रा के खिलाफ पेप्टाइड टुकड़ा मिलान द्वारा अधिग्रहीत एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा से पहचाने जाते हैं। इसी समय, समस्थानिक प्रोफाइल के आयन अग्रदूत उनके chromatographic प्रतिधारण बार के आसपास निकाले जाते हैं, और उनके एकीकृत शिखर क्षेत्रों प्रकाश के रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं: SILAC लेबलिंग द्वारा उत्पन्न भारी पेप्टाइड जोड़े। पेप्टाइड पहचान और रिश्तेदार तीव्रता फिर इसी प्रोटीन के गुणों को सौंपा है। पर्सेउस सॉफ्टवेयर (वर्तमान संस्करण 1.5.0.15) तो नमूना नमूना तुलना, पीसीए और पदानुक्रमित क्लस्टरिंग सहित MaxQuant प्रसंस्करण परिणामों के आगे डाउनस्ट्रीम सांख्यिकीय मूल्यांकन, प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

प्रयोगात्मक सेटअप हम पहचान की है और वर्णित के रूप में छोटे कुल प्रोटीन की माइक्रोग्राम प्रति के रूप में 30 से 8000 प्रोटीन अप करने के लिए मात्रा निर्धारित का उपयोग करनातरल ट्यूमर से निकाली गई।

ठोस ट्यूमर के नमूनों से ऊपर 2,500 के प्रोटीन की पहचान की है और एक अपेक्षाकृत कम समय में नैदानिक ​​नमूनों के सैकड़ों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, केवल दो घंटे की एक नियंत्रण रेखा ढाल के साथ एक बन्दूक प्रोटिओमिक दृष्टिकोण में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1. प्रायोगिक कार्यप्रवाह। सेलुलर-सबसेट संवर्धन, प्रोटीन अलगाव की मुख्य चरणों, कील में तरल और ठोस ट्यूमर के लिए दिखाए जाते हैं मात्रा का ठहराव मानक और बड़े पैमाने पर Spectrometric विश्लेषण की। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. सेलुलर संवर्धन रणनीतितों। FACS छँटाई और एलसीएम। (ए) अनुकरणीय gating रणनीति एक सेल सॉर्टर द्वारा अधिग्रहीत एक CD117 से सना हुआ लुकेमिक सेल की आबादी पर gating चित्रण। ठोस ट्यूमर के ऊतक (बी) लेजर कब्जा microdissection के। 5 के ऊतक वर्गों - 10 माइक्रोन मोटाई धुंधला से पहले इस फिल्म से ढके झिल्ली स्लाइड्स पर घुड़सवार थे। रुचि के क्षेत्र लेजर कब्जा microdissection के लिए मैन्युअल रूप से चुना गया था। ब्याज के क्षेत्र के साथ microdissection के पीले और microdissection के बाद चिह्नित पहले वर्गों रहे हैं दिखाया गया है। 50 माइक्रोन के पैमाने बार आंकड़ा में शामिल है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
मानव कैंसर सेल proteomes चित्रा 3. गुच्छ विश्लेषण। जनसंपर्क के unsupervised क्लस्टर विश्लेषणतरल और ठोस ट्यूमर के otein अभिव्यक्ति प्रोफाइल कम्प्यूटेशनल मंच पर्सेउस उपयोग किया गया था। एसी - Adenocarcinoma, एससीसी - स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा, एस सी सी-मेट - तकनीकी दोहराने - सिर और गर्दन के कैंसर, आर से स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा मेटास्टेसिस।

Discussion

रोगी व्युत्पन्न कैंसर सेल proteomes के मास Spectrometric रूपरेखा नई नैदानिक ​​/ भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर की खोज के लिए भी आवश्यक है और साथ ही कैंसर कोशिका जीव विज्ञान की एक बेहतर समझ देने के लिए जो हो सकता है नए संभावित दवा लक्ष्यों की पहचान करने के लिए बारी के नेतृत्व में। विभिन्न पूर्व विश्लेषणात्मक मुद्दों में से एक मजबूत और जैविक रूप से प्रासंगिक परिणाम प्राप्त करने के लिए है, तो हल कर सकता है, क्योंकि हालांकि, इस तरह बड़े पैमाने पर Spectrometric विश्लेषण, विशेष रूप से अत्यधिक चुनौती दे रहे हैं।

यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह तरल और ठोस ट्यूमर दोनों के सेलुलर उप-जनसंख्या से निकाली गई proteomes की मात्रात्मक प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है। या तो FACS आधारित सेल sortingor microdissection के द्वारा ट्यूमर कोशिकाओं के प्रारंभिक संवर्धन ट्यूमर microenvironment की कोशिकाओं द्वारा संक्रमण से बचने की जरूरत है। इसके अलावा, इन तकनीकों का एक ब्याज के सेलुलर उप-जनसंख्या को अलग करने की अनुमति देते हैं। हाल ही में सेल जैविक अध्ययन दानव हैकुछ सेलुलर उप-जनसंख्या ट्यूमर की शुरुआत गुण होते हैं और इस तरह के कैंसर रोगजनन 19,20 के लिए बेहद प्रासंगिक हैं strated। मास स्पेक्ट्रोमेट्री हाल के वर्षों में और अधिक संवेदनशील बन गया है, मात्रात्मक प्रोटिओमिक विश्लेषण, कुछ हजार कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है कि प्रोटीन की छोटी मात्रा के लिए संभव है कि यह संभव कार्यात्मक प्रासंगिक सेल आबादी पर ध्यान केंद्रित करने के लिए कर रही है।

यहाँ प्रस्तुत सेट अप FFPE नमूनों में उपन्यास नैदानिक ​​बायोमार्कर की पहचान करने और मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, यह अभी भी कई प्रकार के कैंसर के लिए पर्याप्त संख्या और गुणवत्ता में आणविक बायोमार्कर की कमी है तिथि करने के लिए, के रूप में नैदानिक ​​निदान के सुधार के लिए उपयोगी उपकरण बिया का वादा किया। बायोमार्कर कमी कर रहे हैं, जिसके लिए मुश्किल अंतर निदान के महत्वपूर्ण उदाहरण, फेफड़ों में मेटास्टेसिस, intrapancreatic cholangiocellular कार्सिनोमा और अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता से प्राथमिक फेफड़ों के कैंसर के बीच भेदभाव कर रहे हैं, साथ ही अलग-अलगअत्यधिक घातक परिधीय तंत्रिका-म्यान ट्यूमर से सौम्य neurofibroma की entiation। इसके अलावा, हम और दूसरों प्रोटिओमिक हस्ताक्षरों में से मात्रात्मक व्याख्या, सामान्य रूप में कैंसर कोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन करने में और कैंसर रोगियों के 21 में चिकित्सीय प्रतिक्रिया का भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर खुलासा करने के लिए उपयोगी हो सकता है कि पता चला है।

यहाँ प्रस्तुत विधि के दो वर्तमान कमियां व्यापक मैनुअल नमूना प्रसंस्करण के लिए आवश्यकता और nanoLC-एमएस / एमएस अधिग्रहण के समय पर मांग कर रहे हैं। पूर्व उदाहरण के लिए, 96 अच्छी तरह से प्रारूपों के लिए नमूना तैयार करने जा रहा है और रोबोट संसाधन का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है, बाद में बड़े पैमाने पर Spectrometric अधिग्रहण रणनीति में बदलाव की आवश्यकता होगी। लक्ष्य प्रोटीन के सबसेट जैसे, ट्यूमर वर्गीकरण के साथ संबद्ध किया जा सकता है कि पहचान की गई है एक बार, हम एक बहुत कम जुदाई प्रयास के साथ इन कैंपेन्स के लिए मात्रात्मक readouts प्रदान करते हैं कि लक्षित मास स्पेक्ट्रोमेट्री के तरीकों की डिजाइन की परिकल्पना की गई है, औरइसलिए एक तदनुसार कम अधिग्रहण के समय के साथ। 24 से कम किया जा सकता है आवश्यक आवश्यक अधिग्रहण के समय तो - 36 घंटे (तरल ट्यूमर) या 3 घंटा (ठोस ट्यूमर) उदाहरण के लिए, एक घंटा तो मास स्पेक्ट्रोमेट्री और पेप्टाइड्स के एक सरल एक आयामी जुदाई, throughput में जिसके परिणामस्वरूप लाभ लक्षित का उपयोग मात्रा का ठहराव परिणामों के महत्व के क्षेत्र में सुधार के लिए इसी के साथ जांच की, जैविक और तकनीकी प्रतिकृति की काफी संख्या को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। लक्षित जन के Spectrometric दृष्टिकोण पहले से ही कैंसर से जुड़े प्रोटीन बायोमार्कर-उम्मीदवारों में 22 के सत्यापन के लिए एक उपयुक्त उपकरण होने का प्रदर्शन किया गया है, और वे सत्यापन के लिए या यहां तक कि नियमित नैदानिक ​​उपयोग 23 के लिए एक संभावित उपकरण के रूप में वादा शो जहां एक बिंदु के लिए विकसित किया गया है 24।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए ब्याज या अन्य मुद्दों की कोई विवाद नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
660 nm Kit Thermo scientific 22662
Cell culture medium depleted of arginine and lysine Thermo Scientific 88421
Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution Bio Rad 161-0436
Dialyzed fetal calf serum (FCS) PAA A15-107
Diffuser caps for microdissection MMI 50202
FACS-sorter BD FACSAria III
Ionic Detergent Compatibility Reagent Thermo scientific 22663
Laser-capture microdissector MMI  cell cut plus
LDS buffer  Life Technologies NP0009
Membrane slides for microdissection MMI 50103
Microcon YM-30 Millipore MRCF0R030
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels Life Technologies NP0335PK2
Picofrit Self-Pack Columns New Objective PF360-75-15-N-5 Mass Spectrometry Column/Emitter
Reducing agent Life Technologies NP0007
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase Dr. Maisch 120 C18-AQ, 3 µm
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase Dr. Maisch 120 C18-AQ, 5 µm
SILAC-labeled arginine Eurisotop CLM-2265-H-0.1
SILAC-labeled lysine Eurisotop DLM-2640-0.25
Trypsin, NB Sequencing Grade Serva 3728301 for in-gel digests
Trypsin, Sequencing Grade Promega V5111 for in-solution digests
Buffer and solutions
Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5 mM NaF,  0.5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4
Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT 
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 for FASP-protocoll
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 for FASP-protocoll
0.05 M NH4HCO3
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate for in-gel digest
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate for in-gel digest
 5% aqueous formic acid.

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References

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चिकित्सा अंक 96 प्रोटिओमिक्स ठोस ट्यूमर ल्यूकेमिया formalin-तय की और आयल एम्बेडेड ऊतक (FFPE) लेजर कब्जा microdissection कील में SILAC मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री
तरल और ठोस ट्यूमर से निकाली गई कैंसर सेल Proteomes के मात्रात्मक मास Spectrometric रूपरेखा
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Bohnenberger, H., Ströbel, P.,… More

Bohnenberger, H., Ströbel, P., Mohr, S., Corso, J., Berg, T., Urlaub, H., Lenz, C., Serve, H., Oellerich, T. Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors. J. Vis. Exp. (96), e52435, doi:10.3791/52435 (2015).

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