Abstract
Dybdeanalyser av kreft celle proteom er nødvendig for å belyse onkogene pathomechanisms, samt å identifisere potensielle narkotika mål og diagnostiske biomarkører. Imidlertid er metoder for kvantitativ karakterisering av proteomikk pasient-avledede tumorer og spesielt deres cellulære underpopulasjoner i stor grad mangler. Her beskriver vi et eksperimentelt oppsett som tillater kvantitativ analyse av proteom av cancercellepopulasjoner avledet fra enten flytende eller faste tumorer. Dette oppnås ved å kombinere cellulære berikelse strategier med kvantitativ Super-SILAC basert massespektrometri fulgt av bioinformatiske dataanalyse. Å berike spesifikke cellulære undergrupper, er flytende svulster først immunophenotyped av flowcytometri fulgt av FACS-sortering; for solide tumorer, er laser-fangst mikrodisseksjon brukes til å rense bestemte cellulære subpopulasjoner. I et andre trinn blir proteinene ekstrahert fra de rensede celler, og deretter kombinert med et tumorspesifikt,SILAC-merket spike-in standard som gjør det mulig protein kvantifisering. Den resulterende proteinblanding underkastes enten gelelektroforese eller Filter Aided Prøvepreparering (FASP) etterfulgt av tryptisk fordøyelse. Endelig er tryptiske peptider analysert ved hjelp av en hybrid quadrupole-orbitrap massespektrometer, og data innhentet behandles med bioinformatiske programvare suiter inkludert MaxQuant. Ved hjelp av arbeidsflyt presenteres her, opp til 8.000 proteiner kan bli identifisert og kvantifisert i pasient avledet prøver, og de resulterende protein expression profiler kan sammenlignes blant pasienter for å identifisere diagnostiske proteomikk signaturer eller potensielle narkotika mål.
Introduction
Massespektrometri-baserte proteomikk har dukket opp, og er nå en mye brukt disiplin i cellebiologi og translasjonell biomedisinsk forskning. Tekniske fremskritt på området har gjort det mulig å studere komplekse cellulære prosessene i cellelinjer og dyremodeller, som tusenvis av proteiner kan bli identifisert i en enkel massespektrometrisk eksperiment 1,2. Lignende fremgang har blitt gjort for analyse av mange posttranslational modifikasjoner som fosforylering eller ubikineringsinhibitor, selv om dette krever vanligvis skreddersydde arbeidsflyter for berikelse og dataanalyse for hver type modifikasjon 2,3. Videre involvering av kjemiske og metabolske merking strategier, inkludert SILAC, muliggjør nøyaktig relativ kvantifisering av proteiner og PTMs, noe som gjør denne metoden spesielt attraktivt for oppdagelsen av grunnleggende cellulære prosesser, diagnostiske biomarkører og potensielle narkotika mål i menneskelig kreft 4.
Imidlertidflere utfordringer må overvinnes med hensyn til proteomikk analyse av primære humane kreftformer 5. Først av alt, humane kreftprøvene viser ofte en høy grad av cellulær heterogenitet som skyldes nærvær av forskjellige celletyper som tilhører tumor mikromiljøet, inkludert immunceller og fibroblaster. For det andre fører klonal evolusjon til genetisk mangfold innenfor svulstene seg selv, noe som resulterer i at det finnes flere cellulære subpopulasjoner med distinkte funksjonelle egenskaper. Ifølge den nåværende konseptet av noen få kreftstamceller være drivkreftene bak kreftutvikling og progresjon, proteomikk analyse av slike (funksjonelt svært relevante) cellulære subpopulasjoner forventes å være av stor betydning for en bedre forståelse av onkogene mekanismer relevant for klinisk anvendelse 6. For det tredje er kvantitative protein expression profiler av store sett av prøver ofte nødvendig for identifikasjon av robust klinisk BioMarKERS; Dette kan ikke oppnås ved kjemisk merking som iTRAQ 7, mens metabolske merkings strategier - stole, som de gjør, på cellulær proliferasjon 4 - er likeledes uanvendelig. For det fjerde er de fleste tilgjengelige faste tumorprøver er formalinfiksert, noe som kompliserer massespektrometrisk analyse proteom- på grunn av dannelsen av protein-tverrbindinger 8. Til slutt, de fleste eksisterende proteomikk arbeidsflyt krever betydelige mengder av utvalgets behandling og datainnsamling, rende analyse av prøvenummer relevante for klinisk forskning vanskelig, og ringer for ny arbeidsflyt paradigmer 9,10.
For å møte disse hindringene vi utviklet et eksperimentelt oppsett som kombinerer enten flow-cytometrisk celle sortering 11 eller laser-fangst mikrodisseksjon 12,13 for cellulær berikelse med en Super-SILAC 14 strategi for å innføre en global intern standard for omfattende massespektrometrisk analyse. Ved å anvende fremgangsmåten beskrevet her, er det mulig å kvantifisere opp til 8000 proteiner i enkle humane tumorprøver avledet fra enten flytende eller faste kreftformer.
Protocol
Alle forsøk på menneskelig vev eller blodprøver må være godkjent av en etisk komité og gjennomført i henhold til eventuelle retningslinjer gitt i etikk stemme.
1. Cellular Enrichment
- Likvide svulster / fluorescens-aktivert celle sortering.
- Isolere mononukleære celler fra benmarg eller blod prøve ved å utføre erytrocytt lysis ved hjelp av ammoniumklorid eller ved Ficoll densitet-gradientsentrifugering.
- For erytrocytt lyse, kombinere 1 ml av prøven med 4 ml ammoniumkloridoppløsning. Inkuber oppløsningen på is i 5 - 10 min. Legg 40 ml fosfatbufret saltvann (PBS) + 2% føtalt kalveserum (FCS) og sentrifuger i 5 minutter ved 400 xg og 4 ° C.
- For Ficoll gradientsentrifugering, lag 10 ml av prøven på 15 ml Ficoll-Hypaque å danne to forskjellige lag (være forsiktig for ikke å forstyrre lagene). Sentrifuger ved 400 xg i 30 minutter ved romtemperatur (15 - 25 ° C) forsiktig og høste mononukleæreceller som samler på inter.
- Spinn ned celler og ta dem opp i PBS + 2% FCS. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter og ta opp i 1 ml PBS + 2% FCS. Ta en porsjon som negativ kontroll, og en alikvot for hvert fluorescerende fargestoff som brukes i den endelige flekken.
- Inkuber med fluorescens-merkede antistoffer er nyttige for å isolere den leukemicellepopulasjonen i fortynning i henhold til produsentens instruksjoner på is i 30 min. Også beis alikvotene brukes til kompensasjon med hver antistoff individuelt. Vask to ganger med PBS + 2% FCS.
MERK: Antistoffene som ble brukt var mus anti-human mot CD117-PE (Clone 95C3), CD34-FITC (Clone 8G12) og CD33-PE (Clone P67.6). - Filterceller gjennom 35 mikrometer celle sil, ideelt sett bruker rør med celle sil integrert i lokket.
- Legg celleviabilitet flekk (f.eks, 7-AAD). Sorter celler ved hjelp av en passende cellesorterer 11 (figur 2). Samle celler i Isc ove modifiserte Dulbeccos Medium (IMDM) inneholder 10% FCS.
- Isolere mononukleære celler fra benmarg eller blod prøve ved å utføre erytrocytt lysis ved hjelp av ammoniumklorid eller ved Ficoll densitet-gradientsentrifugering.
- Solide tumorer / Laser-fangst mikrodisseksjon.
- For de beskrevne forsøk ble FFPE- prøver fra lungekreft prøven brukes. For dette formål lungekreft vev ble umiddelbart fiksert i 4% bufret formalin etter kirurgisk reseksjon og stykker av omtrent 3 x 2 x 1 cm hvor innstøpt i parafin for videre analyse.
- Snitt på 5 - 10 mm tykkelse fra formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) prøve med en mikrotom. Mount seksjoner på film dekket membran lysbilder og tørr ved 37 ° C i 1 time. Deparaffinize og rehydrere de monterte seksjoner ved suksessiv inkubering i xylen, absolutt etanol, 70% og vann, hver på 1 min.
- Flekken seksjoner med hematoxylin for 20 sek og skyll med vann fra springen. Samle cellepopulasjonen av interesse ved hjelp av en laser-fangst mikrodisseksjon system (se også 12).
- Flytende svulster.
- Sentrifugere cellesuspensjonen fra trinn 1.1.5 ved 400 x g, 4 ° C i 4 minutter, og supernatanten kastes. Vask to ganger med 500 ul kald PBS og sentrifugering i 5 min ved 400 x g og 4 ° C
- Legg 40 ul lyseringsbuffer per 10 6 celler og inkuberes i 15 min på is (10 5 celler (ca. 10 ug totalt protein) bør være den minste cellenummer). Sentrifugere lysatet ved 14.000 x g, 4 ° C i 10 minutter og overfør supernatanten (erte cellulære lysatet) til en ny reaksjonsrøret. Kast pelleten.
- Solide tumorer.
- Legg 60 pl av lyseringsbuffer vev til vev microdissected og inkuberes i 15 min på is, samle væsken ved kort sentrifugering og overfører suspensjonen til en ny reaksjonsrøret. Sonikere lysat på is i 3 min.
- Tilsett 15 pl av 20% natriumdodecylsulfat (SDS) til en nå en endelig SDS concentration på 4%. Inkuber microdissected vev ved 99 ° C i en varmeblokk i 1 time og omrørt ved 600 rpm. Sentrifugere lysatet ved 16 000 xg, 18 ° C i 10 minutter, og supernatanten overføres til et nytt rør.
3. Etablering av en SILAC Spike-in Kvantifisering Standard (Super-SILAC Standard)
MERK: Kvantifisering standard består av en SILAC-merket protein blanding avledet 4-6 cellelinjer som samsvarer med svulst type interesse. For å oppnå den maksimale overlapping mellom SILAC-merkede referanse proteom- og tumor-avledet proteom-, trenger en prinsipal komponent analyse som skal utføres før cellelinjene blir valgt for kvantifisering standard 14.
- Prinsipal komponent analyse (PCA).
- For å bestemme protein uttrykk mønstre av cellelinjer, dyrke et titalls ulike cellelinjer i passende cellekulturmedier. Lyse av cellene som beskreveti trinn 2.1. Forbered cellulære lysater for massespektrometri som beskrevet i trinn 6.1.
- Analyser protein uttrykk mønster av hver cellelinje på en høy oppløsning, væskekromatografi-kombinert massespektrometer (nanoLC-MS / MS).
- Analysere de resulterende rådata bruke en gratis ware MaxQuant og utføre en prinsipal-komponent analyse med tilhørende programvare som Perseus 16,17.
- Velg 4 - 6 cellelinjer som viser størst mangfold mellom deres protein-uttrykk profiler og bruke dem til å generere Super-SILAC spike-in standard.
- SILAC-merking og etikett sjekk.
- Dyrke de valgte cellelinjene i minst fem cellesykluser i passende SILAC cellekulturmedium, i hvilke arginin og lysin er merket med stabile isotoper av karbon og nitrogen (SILAC medium) 4.
- Lyse av cellene som er beskrevet i trinn 3.1 og forberede cellulære lysater av massespektrometri som beskrevet i trinn 6.1.Måle inkorporering effektiviteten av SILAC merking av nanoLC-MS / MS. Analysere de resulterende rå MS data med MaxQuant og bestemme effektiviteten av SILAC-merking. Dette blir oppnådd ved å telle antallet peptider identifisert i deres merket (tung) og deres endogene former (lys), og beregning av forholdet (tung) / (tung + lys). Merking effektivitet bør overstige 98%.
- Kombinasjon av SILAC proteom og validering.
- Dyrke og utvide utvalgte cellelinjer i henhold til produsentens anvisninger i passende SILAC medium. Lyse av cellene som er beskrevet i trinn 2.1 for flytende tumorer, eller som beskrevet i trinn 3.2 til faste tumorer og bestemme proteinkonsentrasjon for hver celledelt lysat.
- Bland ekvimolare mengder protein for hver cellelinje og del blandingen i alikvoten. Snap-fryse alikvotene og oppbevar ved -80 ° C inntil måling. For ett eksperiment trenger du 20 - 50 mikrogram av Super-SILAC standard. Vær nøye med å forberede standard i overskudd som å endre standarden innen en serie eksperimenter bør unngås.
4. Måling av proteinkonsentrasjon og Spike-i
- Flytende svulster.
- Ved hjelp av protein quantitation assay bestemme proteinkonsentrasjonen av de respektive cellulære lysater og Super-SILAC standard.
- Bland like mengder erte cellulære lysatet og Super-SILAC standard og deretter å tilsette litium-dodecyl-sulfat (LDS) buffer (25% av prøvevolumet) og reduksjonsmidlet (10% av prøvevolumet).
- Oppvarm den resulterende oppløsning i en varmeblokk ved 72 ° C i 10 min. Eventuelt lagre de resulterende denaturert proteiner ved -80 ° C.
- Solide tumorer.
- For måling av proteinkonsentrasjonen på en plate-leser, blande en standard bovint serumalbumin (BSA) fortynning løsning serie, lysatet og det passende super-SILAC standard med et kommersielt tilgjengelig protein enssay i en 96-brønners plate, og rist i 1 min, inkuberes i angitt tid og måle absorbansen som angitt av produsenten.
NB: Den høye konsentrasjonen av SDS og ditiotreitol (DTT) i lysatet er et problem for de fleste tilgjengelige analyser for bestemmelse av proteinkonsentrasjonen. - Bland like mengder av klaret lysat og Super-SILAC standard med 200 ul av urea i filterenheten og sentrifuger ved 14 000 xg i 30 min ved 20 ° C. Ikke bruk mer enn 50 ul avklart lysat og Super-SILAC standard. Unngå temperaturer under 15 ° C, slik at urea ikke krystallisere ut.
- For måling av proteinkonsentrasjonen på en plate-leser, blande en standard bovint serumalbumin (BSA) fortynning løsning serie, lysatet og det passende super-SILAC standard med et kommersielt tilgjengelig protein enssay i en 96-brønners plate, og rist i 1 min, inkuberes i angitt tid og måle absorbansen som angitt av produsenten.
5. Prøve Separasjon og Protein Digest
- Flytende svulster.
- Separat 30-100 mikrogram total protein per kjørefelt på en 4-12% stigning SDS-PAGE Gel. Flekk proteiner med Coomassie Blå O / N. Fjern overflødig Coomassie flekken ved to påfølgende vasker med vann.
- Skjær hver kjørefelt fra gelen og dele deti 23 like store skiver uavhengig av mønsteret av flekker gel. Behandle gel skiver hver for seg, hver på en i 0,6 ml polypropylenampulle.
- Vask gel skiver med vann og metanol / vann (50:50, v / v), for å redusere med 10 mM DTT ved inkubering i 30 minutter ved 56 ° C. Alkylere gel skiver med 55 mm iodoacetamide (IAA) ved inkubasjon ved 60 min ved RT i mørket.
- Mellom prøvehåndteringstrinn, vasker skiver med acetonitril i 15 minutter og tørk i en speedvac å fjerne overskudd av løsningsmiddel og forbedre opptaket av reagensoppløsning.
- Utføre proteasespaltningsstillingen ved å rehydrere tørkede gel skiver med det minimum av svine-trypsin-løsning (12,5 ng / mL i 0,025 M vandig ammoniumbikarbonat) i 16 timer ved 37 ° C.
- Tilsett 10 mL vann for å gelskive og inkuberes i 15 min ved 37 ° C. Legg 80 mL acetonitril og inkuberes i 15 min ved 37 ° C. Sentrifuger ved 15800 x g i 1 min. Samle supernatanten og lagre i en egen 0,6 mlrør.
- Legg 65 ul av 5% maursyreløsning, vortex og inkuberes i 15 min ved 37 ° C. Legg 65 mL acetonitril og inkuberes i 15 min ved 37 ° C. Sentrifuger ved 15800 x g i 1 min. Samle supernatanten og legge den til supernatanten fra forrige trinn. Fordamp det kombinerte supernatant til tørrhet i et vakuum-konsentrator.
- Solide tumorer.
- Å fjerne SDS fra vev lysat bruke følgende FASP protokollen, også beskrevet som i referanse 15.
- Etter den første sentrifugeringen beskrevet under punkt 5.2.3 legge til en ytterligere 200 ul av 8 M urea på filteret, og videre sentrifuger ved 14 000 xg i 20 min ved 20 ° C. Kast gjennomstrømnings filtratet.
- Tilsett 100 ul IAA og bland i en termomikser ved 600 opm i 1 min. Inkuber filteret i 20 minutter ved 20 ° C i mørket. Sentrifuger ved 14.000 xg filteret i 10 min ved 20 ° C.
- Tilsett 100 ul av urea til filteret og CENtrifuge ved 14.000 x g, i 15 min ved 20 ° C. Gjenta dette trinnet en gang til.
- Tilsett 100 ul av NH 4 HCO 3 til filteret og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min ved 20 ° C. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Legg 40 ul NH 4 HCO 3 + 1 pl (= 0,4 ug) trypsin og bland i termomikser ved 20 ° C i 600 rpm, 1 min. Inkuber filter O / N i en fuktig kammer ved 37 ° C. Overfør filteret til nye samling rør.
- Sentrifuger ved 14.000 xg filteret i 10 min ved 20 ° C. Tilsett 50 pl av NH 4 HCO 3 og sentrifuger ved 14.000 g filteret i 10 minutter ved 20 ° C. Lagre de resulterende peptider ved -20 ° C inntil massespektrometrisk måling.
- For peptid konsentrasjonsmåling, dispensere 50 ul av den resulterende gjennomstrømning og en rekke hensiktsmessige fortynninger av ren tryptofan i en 96-brønns plate. Mål tryptofanfluorescens. Konvertere den resulterende konsentrasjon avtryptofan til peptidkonsentrasjonen, som 0,1 ug av tryptofan svarer til 9 ug protein.
6. væskekromatografi og Massespektrometrisk analyse
- Gjenoppløse peptider i 30 pl ladningsbuffer i 5 min i en ultralydbadet. Spinne ned i en sentrifuge ved 15 800 xg i 1 min og pipettere den klare løsning inn i en autosampler MS ampulle.
- Injiser 5 ul prøve per analyse ved hjelp av autosampler av nanoLC-MS / MS-system. Konsentrer og avsalte peptider online på en omvendt fase C18 pre-kolonne (0,15 mm ID x 20 mm med 5 mikrometer porestørrelse C18 materiale) monteres enten en ventilert kolonne oppsett eller en forkolonne bytter oppsett i.
- Separate peptider på en reversert fase C18 mikrokolonne (0,075 mm ID x 200 mm selv pakket med 3-pm eller mindre porestørrelse C18 materiale i en selv-pack kolonne nanospray som PicoFrit, ved anvendelse av en 90 min gradient på 5> 35% acetonitril vs. . 0,1% vandig maursyre ved 300 nl /min. Overføring elueringsmiddel inn en hybrid quadrupole / orbitrap massespektrometer via en nanospray ion kilde.
- Analyser peptider ved hjelp av en Top15 dataavhengig anskaffelses metode (MS m / z området 350 -. 1600, oppløsning target 70.000 FWHM, AGC target 1 x 10 6, maks fylletiden 60 msek MS / MS begynner massen 100, oppløsning target 17.500 FWHM, AGC målrette 2 x 10 5, maks fylle tids 60 msek MS / MS terskel 3 x 10 4, inkluderer belaste stater 2 -. 5, Normalisert Kollisjon Energy NCE 25%, dynamisk utelukkelse 15 sek).
7. Data Analysis
- For dataanalyse bruke den fritt tilgjengelige MaxQuant 16 programvare. En detaljert protokoll for bioinformatiske dataanalyse er beskrevet i 16,17. For analyse, kombinere rådatafiler fra alle skiver fra en SDS-PAGE kjørefelt i en enkelt eksperiment 17.
Representative Results
Proteomikk profilering av flytende og faste svulster fra pasienter er en lovende metode for oppdagelsen av nye diagnostiske og prediktive biomarkører. Imidlertid, prøveprepareringsprosedyren og massespektrometrisk analyse er vanskelig, på grunn av kompleksiteten av prøvene og behovet for nøyaktig kvantifisering protein i store sett av prøver. Den eksperimentelle fremgangsmåten beskrevet ovenfor starter med isolering av celler av interesse, enten ved fluorescens-aktivert cellesortering eller ved laser-capture mikrodisseksjon.
For dette formål blir celler fra pasient-avledet benmarg aspirater eller blodprøver farget med fluorescens-merkede antistoffer mot definerte overflatemarkører av interesse før FACS-baserte sortering og cellelyse.
Å berike cellulære undergrupper fra vevssnitt, disse først må monteres på riktig lysbilder for å tillate laser-fangst mikrodisseksjon. For dette formålet montere than vevssnitt på passende membran lysbilder og bruke en laser-fangst microdissector henhold til produsentens instruksjoner. Velge områder og celler av interesse, kreves det kunnskap om histomorphology av sunn og neoplastisk vev. De ekstraherte celler blir deretter overført inn i en passende samling rør. Innledende eksperimenter må utføres for å definere mengden av vev som er nødvendig for ekstraksjon av tilstrekkelige mengder av proteinet (minst 10 ug totalt protein) for hvert nytt vev av interesse. Hver microdissected prøve blir behandlet med 60 pl av lyseringsbuffer vev. For effektiv lysering, celler fra vevsprøver må ultralydbehandlet i 3 minutter, og etter tilsetning av 15 ul SDS Prøvene inkuberes i en termomikser ved 99 ° C i 1 time for å fjerne formalininduserte protein-tverrbindinger. Sentrifugering vil til slutt rette for innsamling av ryddet mobil lysatet.
For hver sykdom interest (flytende og faste tumorer) en passende super-SILAC kvantifisering standard må etableres 14. En passende standard bør utgjøre mer enn 90% av proteinene uttrykt i prøvene av interesse. For fremstilling av en kvantifisering standarden, bør cellelinjer relatert til krefttype av interesse først bli analysert ved hjelp av massespektroskopi for å bestemme deres protein expression profiler og deretter prinsipal komponent analyse skal utføres. 4 - 6 forskjellige cellelinjer med differensial protein uttrykk mønstre bør velges og SILAC-merket med "tunge" arginin og lysin. Merking effektivitet bør sjekkes av nanoLC-MS / MS og bør være større enn 98%. Deretter bør cellelinjer bli lysert på samme måte som den respektive pasient-avledet prøven, og senere, bør protein ekvimolare mengder av hver prøve og den SILAC pigg i standard blandes. Et kritisk punkt for nøyaktig protein kvantifisering av kliniske prøver of interesse er det nøyaktig blanding av ekvimolære protein mengder av pasient avledet prøvene og SILAC spike-in kvantifisering standard. For å bestemme proteinkonsentrasjonen av lysater avledet fra sorterte cellene, kan forskjellige protein kvantifisering analyser anvendes. For cellulære lysater fra vev-avledede celler en bestemmelse er nødvendig som kan håndtere høye konsentrasjoner av SDS og DTT i lysatet. Proteinkonsentrasjonene av pasientavledet prøvene og SILAC pigg i standarden skal måles hver gang før kombinasjon med de respektive kliniske prøver for å sikre riktig blanding, noe som er avgjørende for å lage selv hundrevis av prøver sammenlignbare.
Etter blanding av like mengder av pigg-i standard- og lysat prøver oppnådd fra flytende tumorer er blandet med LDS, oppvarmet i et termomikser ved 72 ° C i 10 minutter og deretter utsatt for 1D-PAGE og in-gel fordøyelse av den separerte proteiner med trypsin. Prøver hentet fravev er frigjort fra SDS og fordøyd med trypsin ved hjelp av FASP tilnærming som er fastsatt av Wisniewski et al. 15
De tryptiske peptider ble oppnådd kan kvantifiseres ved å måle fluorescens tryptofan, noe som er av spesiell interesse for vevsprøver som mengden av peptider som frigjøres fra filter varierer mellom 15% og 75% sammenlignet med proteinmengder i utgangspunktet anbrakt på filteret. For dette formålet måler vi fluorescens av tryptofan. Sammenligning med en passende tryptofan fortynningsserie muliggjør kvantifisering av peptider, som 1,1 ug av tryptofan tilsvarer ca 100 ug peptid. Om nødvendig, prøver stammer spesielt fra FASP behandling kan forhånds renset på enten kommersielle eller hjemmelagde scene tips pakket med omvendt fase-C18 (RP-C18) materialet før du legger ut på nanoLC / MS / MS system 18.
Mass-spektrometriske Analysen er utført på et høyt-Oppløsning høy følsomhet massespektrometri system. Kort sagt, blir peptid prøvene avsaltet og preconcentrated på en RP-C18-forkolonne og separert på en RP-C18 analytisk kolonne koplet direkte til massespektrometeret. For å oppnå tilstrekkelig dybde på analyse, ansetter vi enten en kombinasjon av SDS-PAGE protein prefraksjonering med 40 min RP-C18 gradienter (for flytende svulster) eller enkelt injeksjoner med lange 2-3 timers RP-C18 gradienter (for solide tumorer behandlet av FASP ). MS spektra er kjøpt til en oppløsning på 70.000 FWHM eller bedre, slik at nøyaktig kvantifisering av SILAC par ved integrering av kromatografiske peak profiler. For protein identifikasjon, blir en Top15 dataavhengig anskaffelses metode som brukes til å generere et stort antall peptid MS / MS-spektra for peptid og protein identifikasjon.
Fra de resulterende rådata, er protein identifisering og kvantifisering oppnås ved databasesøk med MaxQuant programvare mot en Uniprot Knowledgebase Menneskelig Komplett Proteome sekvens database 17. I MaxQuant programvare (gjeldende versjon 1.5.0.25) peptider er identifisert fra den oppkjøpte MS / MS spektra av peptidfragment-matching mot spektra utledet i silico fra proteinsekvensen database. Samtidig blir forløperion isotopiske profiler ekstrahert rundt deres kromatografiske retensjonstider, og deres integrerte topparealer benyttes for relativ kvantifisering av lys: tunge peptid parene generert av SILAC merking. Peptid-identiteter og relative intensiteter blir så tilordnet de tilsvarende proteinegenskaper. Perseus programvare (gjeldende versjon 1.5.0.15) blir så brukt til å utføre ytterligere nedstrøms statistisk evaluering av de MaxQuant behandlingsresultater, inkludert sample-til-sample sammenligninger, PCA og hierarkisk gruppering.
Ved hjelp av den eksperimentelle oppsettet beskrevet vi har identifisert og kvantifisert opp til 8.000 proteiner fra så lite som 30 mikrogram total proteinavledet fra flytende svulster.
Opp til 2500-proteiner fra faststoff-tumorprøver kan identifiseres og kvantifiseres i en hagle proteomikk tilnærming med en LC-gradient på bare 2 timer, slik at analysen av hundrevis av kliniske prøver på relativt kort tid.
Figur 1. Experimental arbeidsflyt. De viktigste trinnene i cellular-undergruppe berikelse, protein isolasjon, spike-in for kvantifisering standard og masse spektrofotometrisk analyse er vist for flytende og faste svulster. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Cellular berikelse strategies. FACS sortering og LCM. (A) Eksemplarisk gating strategi skildrer gating på en CD117-farget leukemicellepopulasjon kjøpt opp av en celle sorter. (B) Laser fangst mikrodisseksjon av solid svulstvev. Vevssnitt på 5 - 10 mm tykkelse ble montert på film dekket membran lysbilder før farging. Region av interesser ble valgt manuelt for laser capture mikrodisseksjon. Vist er seksjoner før mikrodisseksjon med regionen av interesse merket med gult og etter mikrodisseksjon. En skala bar på 50 mikrometer er inkludert i figuren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Cluster analyse av menneskelige kreftcelle proteom. Unsupervised klyngeanalyse av protein uttrykk profiler av flytende og faste svulster ble utført ved hjelp av beregnings plattform Perseus. AC - Adenocarcinoma, SCC - Plateepitelcarcinom, SCC-Met - plateepitelkarsinom metastaser fra hode og nakke kreft, R - teknisk replikere.
Discussion
Massespektrometrisk profilering av pasient-avledet kreft-celle proteom er nødvendig for oppdagelsen av nye diagnostiske / prediktive biomarkører samt å gi en bedre forståelse av kreft-cellebiologi, som kan i sin tur føre til identifisering av nye potensielle narkotika mål. Imidlertid er slike massespektrometriske analyser er svært krevende, særlig fordi forskjellige pre-analytiske problemer som må løses, hvis man skal få robuste og biologisk relevante resultater.
Den eksperimentelle arbeidsflyt beskrevet her gjør for kvantitativ proteomikk karakterisering av proteom avledet fra cellulære subpopulasjoner av både flytende og faste svulster. Den innledende anrikning av tumorceller enten ved FACS-baserte celle sortingor mikrodisseksjon er nødvendig for å unngå forurensning av celler i tumormikromiljøet. Videre disse teknikkene tillater en å isolere cellulære subpopulasjoner av interesse. Nye cellebiologiske studier har demonstrated at visse cellulære subpopulasjoner har tumor initiere egenskaper og er derfor svært relevant for kreft patogenesen 19,20. Som massespektrometri er blitt mer følsom i de senere år, kvantitative proteomic analyser er mulig for de små mengder protein som kan utledes fra noen få tusen celler, noe som gjør det mulig å fokusere på funksjonelt relevante cellepopulasjoner.
Opplegget presenteres her kan brukes til å identifisere og validere nye diagnostiske biomarkører i FFPE- prøver. Derfor, det lover å bea nyttig verktøy for forbedring av klinisk diagnostikk, som til dags dato er det fortsatt mangel på molekylære biomarkører i tilstrekkelig antall og kvalitet for mange krefttyper. Viktige eksempler på vanskelige differensialdiagnoser, som biomarkører mangler, er det diskriminering mellom primær lungekreft fra metastaser i lungene, intrapancreatic cholangiocellular karsinom og bukspyttkjertelen adenokarsinom, samt forskjelligentiation av benign neurofibroma fra svært maligne perifere nerve-kappe svulster. Dessuten har vi og andre vist at kvantitativ belysning av proteomikk signaturer kan være nyttig i å studere kreftcellebiologi generelt, og for å avsløre prediktive biomarkører av terapeutisk respons hos kreftpasienter 21.
To aktuelle ulempene med metoden som presenteres her er kravet for omfattende manuell utvalgets behandling og etterspørselen på nanoLC-MS / MS fangsten. Mens det tidligere, kan løses ved å bevege prøvepreparering til f.eks, 96-brønners format og ved hjelp av robot behandling, vil den sistnevnte krever en endring i massespektrometrisk anskaffelsesstrategi. Når undergrupper av target-proteiner har blitt identifisert som kan være forbundet med for eksempel tumor klassifisering, ser vi for oss at utformingen av målrettede massespektrometri metoder som gir kvantitative avlesninger for disse undergrupper med en sterkt redusert innsats separasjon, ogderfor med en tilsvarende redusert fangsten. Hvis den nødvendige oppkjøpet tiden som kreves kan reduseres 24-36 hr (flytende svulster) eller tre timer (solide svulster) til f.eks, 1 time ved hjelp av målrettet massespektrometri og en enkel endimensjonal separasjon av peptider, så den resulterende gevinst i gjennomstrømningen kan brukes til å øke betydelig antall av biologiske og tekniske replikater ble undersøkt, med tilsvarende forbedringer i betydningen av kvantifisering resultater. Målrettede massespektrometri tilnærminger har allerede vist seg å være et egnet verktøy for verifikasjon av kreft-assosiert protein biomarkør-kandidater 22, og har blitt utviklet til et punkt der de viser lovende for validering eller selv som en potensiell verktøy for rutinemessig klinisk bruk 23 24.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt eller andre problemer å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
| Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
| Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
| Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
| FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
| Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
| Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
| LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
| Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
| Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
| Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
| Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
| Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
| Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
| SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
| SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
| Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
| Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
| Buffer and solutions | |||
| Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5 mM NaF, 0.5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
| Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
| Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
| IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
| 0.05 M NH4HCO3 | |||
| 10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
| 55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
| 5% aqueous formic acid. |
References
- Walther, T. C., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics in cell biology. J Cell Biol. 190 (4), 491-500 (2010).
- Lenz, C., Urlaub, H. Separation methodology to improve proteome coverage depth. Expert Rev Proteomics. 11 (4), 409-414 (2014).
- Olsen, J. V., Mann, M. Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3444-3452 (2013).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Jimenez, C. R., Verheul, H. M. Mass spectrometry-based proteomics: from cancer biology to protein biomarkers, drug targets, and clinical applications. Am Soc Clin Oncol Educ Book. , e504-e510 (2014).
- Tang, D. G. Understanding cancer stem cell heterogeneity and plasticity. Cell Res. 22 (3), 457-472 (2012).
- Evans, C., et al. An insight into iTRAQ: where do we stand now. Anal Bioanal Chem. 404 (4), 1011-1027 (2012).
- Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wisniewski, J. R. Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).
- Malmström, J., Picotti, P., Aebersold, R. Perspectives of targeted mass spectrometry for protein biomarker verification. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 518-525 (2009).
- Gillet, L. C., et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. 41, (2010).
- Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. 8, 309 (2007).
- Liu, N. Q., et al. Proteomics pipeline for biomarker discovery of laser capture microdissected breast cancer tissue. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 155-164 (2012).
- Geiger, T., et al. Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture as a spike-in standard in quantitative proteomics. Nat Protoc. 6 (2), 147-157 (2011).
- Wisniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. J Vis Exp. (79), (2013).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics. Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Sarvi, S., et al. CD133+ cancer stem-like cells in small cell lung cancer are highly tumorigenic and chemoresistant but sensitive to a novel neuropeptide antagonist. Cancer Res. 74 (5), 1554-1565 (2014).
- Shlush, L. I., et al. Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia. Nature. 506 (7488), 328-333 (2014).
- Schaab, C., et al. Global phosphoproteome analysis of human bone marrow reveals predictive phosphorylation markers for the treatment of acute myeloid leukemia with quizartinib. Leukemia. 28 (3), 716-719 (2014).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Sci Transl Med. 4 (142), 142ra94 (2012).
- Burgess, M. W., et al. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Boja, E. S., et al. Analytical Validation Considerations of Multiplex Mass Spectrometry-based Proteomic Platforms for Measuring Protein Biomarkers. J Proteome Res. , (2014).
