Abstract
Fördjupade analyser av cancerceller proteom behövs för att klarlägga onkogena pathomechanisms, samt att identifiera potentiella läkemedelsmål och diagnostiska biomarkörer. Men metoder för kvantitativ proteomik karakterisering av patientgenererade tumörer och i synnerhet deras cellulära subpopulationer i stort sett saknas. Här beskriver vi en experimentell uppställning som möjliggör kvantitativ analys av proteom av cancercellpopulationer härledda från antingen flytande eller fasta tumörer. Detta uppnås genom att kombinera cellulära Beriknings med kvantitativ Super SILAC Baserade masspektrometri följt av bioinformatikdataanalys. Att berika specifika cellulära delmängder, är flytande tumörer först immunophenotyped med flödescytometri följt av FACS-sortering; för solida tumörer, är laser-capture microdissection används för att rena specifika cellulära subpopulationer. I ett andra steg, är proteiner som extraherats från de renade cellerna och därefter kombineras med en tumörspecifik,SILAC-märkt spik-in standard som möjliggör protein kvantifiering. Det resulterande proteinet blandningen utsattes för antingen gelelektrofores eller Filtrerings Aided Provberedning (FASP) följt av tryptisk digestion. Slutligen tryptiska peptider analyseras med en hybrid quadrupol-Orbitrap masspektrometer, och de data som erhållits behandlas med bioinformatiska programvara sviter inklusive MaxQuant. Med hjälp av arbetsflödet presenteras här, upp till 8.000 proteiner kan identifieras och kvantifieras i patientgenererade prover, och de resulterande proteinuttrycksprofiler kan jämföras bland patienter att identifiera diagnostiska proteomik signaturer eller potentiella läkemedelsmål.
Introduction
Masspektrometri-baserade proteomik har vuxit och är nu en allmänt använd disciplin i cellbiologi och translationell biomedicinsk forskning. Tekniska framsteg inom området har gjort det möjligt att studera komplexa cellulära processer i cellinjer och djurmodeller, som tusentals proteiner kan identifieras i ett enda masspektrometrisk experiment 1,2. Liknande framsteg har gjorts för att analysera många posttranslationella modifieringar såsom fosforylering eller ubiquitinering, även om detta kräver oftast skräddarsydda arbetsflöden för anrikning och dataanalys för varje typ av modifiering 2,3. Dessutom medverkan av kemiska och metabola märkningsstrategier, inklusive SILAC, möjliggör noggrann relativ kvantifiering av proteiner och PTMs, vilket gör denna metod särskilt attraktiv för upptäckten av grundläggande cellulära processer, diagnostiska biomarkörer och potentiella läkemedelsmål i human cancer 4.
Emellertidflera utmaningar måste övervinnas med hänsyn till proteomik analys av primära humana cancer 5. Först av allt, humana cancerprover visar ofta en hög grad av cellulär heterogenitet som beror på närvaron av olika celltyper som hör till tumörens mikromiljö, inklusive immunceller och fibroblaster. För det andra leder klonal evolution till genetisk mångfald inom tumörerna själva, vilket resulterar i att det finns flera cellulära subpopulationer med olika funktionella egenskaper. Enligt den nuvarande konceptet några cancerstamceller vara drivkrafterna bakom cancerutveckling och progression, proteomik analys av sådana (funktionellt mycket relevanta) cellulära subpopulationer förväntas vara av stor betydelse för en bättre förståelse av onkogena mekanismer relevanta för klinisk tillämpning 6. För det tredje, är kvantitativa proteinuttrycks profiler av stora uppsättningar prover ofta krävs för att identifiera robusta kliniska BioMarskers; Detta kan inte åstadkommas genom kemisk märkning som iTRAQ 7, medan metaboliska märkningsstrategier - förlita, som de gör, på cellulär proliferation 4 - är likaså tillämpliga. För det fjärde, de flesta tillgängliga solida tumörprover är formalinfixerade, vilket komplicerar masspektrometrisk analys proteom grund av bildning av proteintvärbindningar 8. Slutligen flesta befintliga proteomik arbetsflöden kräver stora mängder provbearbetning och datainsamling, vilket gör analysen av provnummer relevanta för klinisk forskning svår, och kräver nya arbetsflödet paradigm 9,10.
För att hantera dessa hinder vi utvecklat en experimentuppställning som kombinerar antingen flödes cytometrisk cellsortering 11 eller laser-capture microdissection 12,13 för cellulär berikning med en Super-SILAC 14 strategi för att införa en global intern standard för omfattande analys masspektrometrisk. Genom att använda den här beskrivna metoden är det möjligt att kvantifiera upp till 8000 proteiner i enstaka humana tumörprover härrörande från antingen flytande eller fasta cancrar.
Protocol
Alla experiment på vävnads eller blodprover mänskliga måste godkännas av en etisk kommitté och utföras enligt eventuella riktlinjer som ges i etik omröstningen.
1. Cellulär Anrikning
- Flytande tumörer / fluorescens-aktiverad cellsortering.
- Isolera mononukleära celler från benmärg eller blodprov genom att utföra erytrocytlys använder ammoniumklorid eller av Ficoll densitetscentrifugering.
- För erytrocytlys, kombinera en ml av provet med 4 ml ammoniumkloridlösning. Inkubera lösningen på is under 5-10 min. Tillsätt 40 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 2% fetalt kalvserum (FCS) och centrifugera under 5 min vid 400 xg och 4 ° C.
- För Ficoll gradientcentrifugering, lager 10 ml prov på 15 ml Ficoll-Hypaque att bilda två distinkta skikt (tänk på att inte störa lagren). Centrifugera vid 400 xg under 30 min vid RT (15-25 ° C) försiktigt och skörda det mononukleäraceller som samlar vid interfasen.
- Centrifugera ner cellerna och ta upp dem i PBS + 2% FCS. Centrifugera vid 400 xg under 5 min och ta upp i 1 ml PBS + 2% FCS. Tag ut en alikvot som negativ kontroll och en alikvot för varje fluorescerande färgämne som används i slut fläcken.
- Inkubera med fluorescensmärkta antikroppar som är användbara för att isolera leukemicellpopulationen i utspädning enligt tillverkarens instruktioner på is under 30 min. Också färga portioner som används för ersättning med varje antikropp för sig. Tvätta två gånger med PBS + 2% FCS.
OBS: Antikropparna som användes var mus-anti-människa mot CD117-PE (klon 95C3), CD34-FITC (klon 8G12) och CD33-PE (klon P67.6). - Filter celler genom 35 ìm cell sil, helst med hjälp av rör med cell sil integrerad i locket.
- Lägg cellviabilitet färgämne (t.ex., 7-AAD). Sortera celler med användning av en lämplig cellsorterare 11 (figur 2). Samla cellerna i Isc ove modifierade Dulbeccos medium (IMDM) innehållande 10% FCS.
- Isolera mononukleära celler från benmärg eller blodprov genom att utföra erytrocytlys använder ammoniumklorid eller av Ficoll densitetscentrifugering.
- Solida tumörer / Laser-capture microdissection.
- För de beskrivna experimenten var FFPE prover från lungcancer exemplar används. För detta ändamål lungcancer vävnad omedelbart fixeras i 4% formalin efter kirurgisk resektion och bitar av ca 3 x 2 x 1 cm där inbäddad i paraffin för vidare analys.
- Skär delar av 5-10 um tjocklek från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) prov med en mikrotom. Montera avsnitten om film täckta membran diabilder och torrt vid 37 ° C under 1 timme. Avparaffinera och rehydrera monterade sektioner genom successiv inkubering i xylen, absolut etanol, 70% och vatten, var och en för en minut.
- Färga sektioner med hematoxylin för 20 sekunder och skölj sedan med kranvatten. Samla cellpopulationen av intresse genom att använda en laser capture microdissection systemet (se även 12).
- Flytande tumörer.
- Centrifugera cellsuspensionen från steg 1.1.5 vid 400 xg, 4 ° C under 4 min och kasta bort supernatanten. Tvätta två gånger med 500 | il kall PBS och centrifugering under 5 min vid 400 xg och 4 ° C
- Lägg 40 pl lysbuffert per 10 6 celler och inkubera under 15 minuter på is (10 5 celler (ca. 10 ug totalt protein) bör vara det minsta antal celler). Centrifugera lysatet vid 14000 xg, 4 ° C under 10 min och överför supernatanten (rensas cellulärt lysat) till ett nytt reaktionsrör. Kassera pelleten.
- Fasta tumörer.
- Lägg 60 | il vävnads lysbuffert till microdissected vävnaden och inkubera i 15 minuter på is, samla upp vätskan genom kort centrifugering och överför suspensionen till ett nytt reaktionsrör. Sonikera lysat på is under 3 min.
- Lägg 15 pl av 20% natriumdodecylsulfat (SDS) till en nå en slutlig SDS concentration på 4%. Inkubera microdissected vävnaden vid 99 ° C i ett värmeblock i 1 h och omrördes vid 600 varv per minut. Centrifugera lysatet vid 16.000 xg, 18 ° C under 10 min och överför supernatanten till ett nytt rör.
3. Upprättande av en SILAC Spike-in Kvantifiering Standard (Super-SILAC Standard)
OBS: Kvantifieringen standarden består av en SILAC-märkt protein blandning som härletts 4-6 cellinjer som matchar tumörtyp av intresse. För att uppnå maximal överlappning mellan SILAC-märkt referens proteom och tumörhärledd proteom, behöver en huvudkomponentanalys som ska utföras innan cellinjer selekteras för kvantifiering standarden 14.
- Principalkomponentanalys (PCA).
- För att bestämma de proteinuttrycksmönster av cellinjer, odla ungefär tio olika cellinjer i lämpliga cellodlingsmedia. Lysera cellerna såsom beskrivitsi steg 2.1. Förbered cellulära lysat för masspektrometri, såsom beskrivs i steg 6,1.
- Analysera proteinuttrycksmönstret för varje cellinje på en högupplösande, vätskekromatografi-kopplad masspektrometer (nanoLC-MS / MS).
- Analysera de resulterande rådata med hjälp av en fri ware MaxQuant och utföra en principal-komponent analys med hjälp av tillhörande programvara som Perseus 16,17.
- Välj 4 - 6 cellinjer som visar den största mångfalden mellan deras proteinuttrycksprofiler och använda dem för att skapa Super-SILAC spik-in standard.
- SILAC-märkning och etikettkontroll.
- Odla de valda cellinjer i minst fem cellcykler i lämplig SILAC cellodlingsmedium, där arginin och lysin är märkta med stabila isotoper av kol och kväve (SILAC medium) 4.
- Lysera cellerna som beskrivits i steg 3.1 och förbereda cellulära lysat för masspektrometri, såsom beskrivs i steg 6,1.Mät införlivandet effektivitet SILAC märkning av nanoLC-MS / MS. Analysera de resulterande obehandlade MS-data med MaxQuant och bestämma effektiviteten av SILAC-märkning. Detta uppnås genom att räkna antalet peptider identifieras i deras märkta (tung) och deras endogena former (ljus), och beräkna förhållandet (tunga) / (heavy + ljus). Märkning effektivitet bör överstiga 98%.
- Kombination av SILAC proteom och validering.
- Odla och expandera utvalda cellinjer enligt tillverkarens anvisningar i lämplig SILAC medium. Lysera cellerna som beskrivits i steg 2.1 för flytande tumörer eller såsom beskrivs i steg 3.2 för solida tumörer och bestämma proteinkoncentrationen för varje cellulärt lysat.
- Blanda ekvimolära protein mängder av varje cellinje och dela blandningen i portionen. Snap-frysa portioner och förvara vid -80 ° C tills mätning. För ett experiment du behöver 20-50 pg av Super-SILAC standard. Var noga med att förbereda standard i överskott som att ändra standard inom en serie experiment bör undvikas.
4. Mätning av proteinkoncentration och Spike-in
- Flytande tumörer.
- Använda protein kvantifiering analys bestämma proteinkoncentrationer av respektive cellulära lysaten och Super-SILAC standard.
- Blanda lika stora mängder av rensas cellulära lysat och Super-SILAC standard och därefter tillsätta litium-dodecylsulfat (LDS) buffert (25% av provvolymen) och reduktionsmedel (10% av provvolymen).
- Värm den resulterande lösningen i ett värmeblock vid 72 ° C under 10 min. Eventuellt lagra de erhållna denaturerade proteiner vid -80 ° C.
- Fasta tumörer.
- För proteinkoncentrationsmätning på en plattläsare, blanda en standard av bovint serumalbumin (BSA) utspädningslösning serien, lysatet och den lämpliga super SILAC standard med ett kommersiellt tillgängligt protein Assay i en 96-brunnar, och skaka i 1 minut, inkubera i angiven tid och mät absorbansen som anges av tillverkaren.
OBS: Den höga koncentrationen av SDS och ditiotreitol (DTT) i lysatet är ett problem för de flesta tillgängliga analyser för proteinkoncentrationsbestämning. - Blanda lika mängder av klarnat lysat och Super-SILAC standard med 200 ul av urea i filterenheten och centrifugera vid 14.000 xg under 30 minuter vid 20 ° C. Använd inte mer än 50 fil klar lysat och Super-SILAC standard. Undvik temperaturer under 15 ° C, så att urea inte utkristallisera.
- För proteinkoncentrationsmätning på en plattläsare, blanda en standard av bovint serumalbumin (BSA) utspädningslösning serien, lysatet och den lämpliga super SILAC standard med ett kommersiellt tillgängligt protein Assay i en 96-brunnar, och skaka i 1 minut, inkubera i angiven tid och mät absorbansen som anges av tillverkaren.
5. Prov Separation och Protein Digest
- Flytande tumörer.
- Separat 30-100 ug totalt protein per bana på en 4-12% gradient SDS-PAGE-gel. Stain proteiner med Coomassie Blue O / N. Ta bort överflödig Coomassie fläcken med två efterföljande tvättar med vatten.
- Skär varje bana från gelén och dela denin i 23 lika stora skivor oavsett mönstret gel färgning. Behandla gelskivorna separat, var och en i en i 0,6 ml polypropylen flaska.
- Tvätta gelskivorna med vatten och metanol / vatten (50:50, v / v), minska med 10 mM DTT genom inkubering under 30 min vid 56 ° C. Alkylatbensin gelskivorna med 55 mM jodacetamid (IAA) genom inkubation vid 60 min vid RT i mörker.
- Mellan provhantering steg, tvätta skivor med acetonitril i 15 min och torka i en SpeedVac att avlägsna överflödigt lösningsmedel och förbättra upptaget av reagenslösning.
- Utför proteasklyvning genom rehydratisering torkade gelskivor med den minimala mängden av porcint trypsinlösning (12,5 ng / ul i 0,025 M vattenlösning av ammoniumbikarbonat) under 16 timmar vid 37 ° C.
- Lägg 10 | il vatten till gelskiva och inkubera under 15 minuter vid 37 ° C. Lägg 80 | il acetonitril och inkubera i 15 minuter vid 37 ° C. Centrifugera vid 15800 xg, 1 min. Samla supernatanten och förvara i en separat 0,6 mlrör.
- Lägg 65 pl av 5% myrsyralösning, virvel och inkubera under 15 minuter vid 37 ° C. Lägg 65 | il acetonitril och inkubera i 15 minuter vid 37 ° C. Centrifugera vid 15.800 xg under 1 minut. Samla supernatanten och lägga till den i supernatanten från föregående steg. Indunsta kombinerade supernatanten till torrhet i en vakuum koncentrator.
- Fasta tumörer.
- För att ta bort SDS från vävnads lysat använda följande FASP protokollet, beskrivs också som i referens 15.
- Efter den första centrifugeringen beskrivs i steg 5.2.3 lägga till en ytterligare 200 pl av 8 M urea på filtret, och vidare centrifugera vid 14.000 xg under 20 minuter vid 20 ° C. Kassera genomströmning genom filtratet.
- Lägg 100 pl lAA och blanda i en Thermomixer vid 600 rpm under 1 minut. Inkubera filtret under 20 min vid 20 ° C i mörker. Centrifugera filtret vid 14.000 xg under 10 minuter vid 20 ° C.
- Lägg 100 | il av karbamid till filtret och CENtrifuge vid 14.000 x g, under 15 min vid 20 ° C. Upprepa detta steg en gång till.
- Lägg 100 pl av NH 4 HCO 3 till filtret och centrifugera vid 14.000 xg under 10 minuter vid 20 ° C. Upprepa detta steg två gånger.
- Lägg 40 il NH 4 HCO 3 + 1 ^ il (= 0,4 | ig) trypsin och blanda i Thermomixer vid 20 ° C under 600 rpm, 1 min. Inkubera filtret O / N i en våt kammare vid 37 ° C. Överför filtret till nya insamlingsrören.
- Centrifugera filtret vid 14.000 xg under 10 minuter vid 20 ° C. Lägg 50 pl av NH 4 HCO 3 och centrifugera filtret vid 14000 g under 10 min vid 20 ° C. Förvara de resulterande peptiderna vid -20 ° C tills masspektrometrisk mätning.
- För mätning peptidkoncentration, dispensera 50 | il av den resulterande genomströmning och en serie av lämpliga utspädningar av ren tryptofan till en 96-brunnsplatta. Mät tryptofanfluorescensen. Konvertera den resulterande koncentrationen avtryptofan till peptidkoncentration, som 0,1 ug av tryptofan motsvarar 9 ig protein.
6. vätskekromatografi och Masspektrometrisk analys
- Lös åter peptider i 30 ^ il laddningsbuffert i 5 minuter i en sonikering bad. Centrifugera ner i en centrifug vid 15800 xg i 1 min och pipet den klara lösningen till en MS autosampler flaskan.
- Injicera 5 il prov per analys med användning av autosampler av nanoLC-MS / MS-systemet. Koncentrera och avsalta peptider nätet på en omvänd fas C18 förkolonn (0,15 mm ID x 20 mm med 5 pm porstorlek C18 material) monteras i antingen en ventilerad kolumninställningar eller en förkolonn byta inställning.
- Separata peptider på en omvänd fas C18 mikrokolonn (0,075 mm ID x 200 mm själv packad med 3 pm eller mindre porstorlek C18 material i en själv pack nanospray kolonn som PicoFrit, med hjälp av en 90 min gradient av 5> 35% acetonitril vs . 0,1% vatten myrsyra vid 300 nl /min. Överför eluent i en hybrid quadrupol / Orbitrap masspektrometer via en nanospray jonkälla.
- Analysera peptider med en dekorera15 databeroende förvärvsmetoden (MS m / z intervall 350 -. 1600, upplösning målet 70.000 FWHM, AGC mål 1 x 10 6, max fyllningstiden 60 ms MS / MS börja mass 100, upplösning målet 17.500 FWHM, AGC rikta 2 x 10 5, max fyll tid 60 ms MS / MS tröskel 3 x 10 4, inkluderar debitera stater 2 -. 5, Normaliserad Collision Energi NCE 25%, dynamisk uteslutning 15 sek).
7. Data Analysis
- För dataanalys använder fritt tillgänglig MaxQuant 16 program. En detaljerat protokoll för bioinformatisk dataanalys beskrivs i 16,17. För analys, kombinera rå datafiler från alla skivor från en SDS-PAGE lane i ett enda experiment 17.
Representative Results
Proteomik profilering av flytande och fasta tumörer från patienter är en lovande metod för upptäckten av nya diagnostiska och prediktiva biomarkörer. Men provberedning förfarandet och analysen masspektrometrisk är utmanande på grund av komplexiteten i de prover och behovet av noggrann protein kvantifiering i stora uppsättningar provexemplar. Den experimentella proceduren som beskrivits ovan börjar med isolering av celler av intresse, antingen genom fluorescens-aktiverad cellsortering eller genom laserinfångnings mikrodissektion.
För detta ändamål är celler från patientgenererade benmärgsaspirat eller blodprov färgades med fluorescensmärkta antikroppar mot definierade ytmarkörer av intresse före FACS-baserade sortering och cell-lys.
Att berika cellulära delmängder från vävnadssnitt, dessa först måste monteras på lämpliga bilder för att möjliggöra laser capture microdissection. För detta ändamål monterar tHan vävnadssnitt på lämpliga membran diabilder och använder en laser-capture microdissector enligt tillverkarens anvisningar. Välja de områden och celler av intresse kräver lämplig kunskap om histomorphology av frisk och neoplastisk vävnad. De extraherade cellerna överförs därefter till en lämplig provröret. Inledande undersökningar bör utföras för att definiera mängden vävnad som behövs för extraktion av tillräckliga mängder av protein (minst 10 ug totalt protein) för varje ny vävnad av intresse. Varje microdissected provet behandlas med 60 | il vävnads lysbuffert. För effektiv lys, celler från vävnadsprover måste sonikerades under 3 min och efter tillsats av 15 | il SDS Proverna inkuberas i en Thermomixer vid 99 ° C under 1 h för att avlägsna formalin-inducerad proteintvärbindningar. Centrifugering kommer äntligen lätta insamlingen av den rensas cellulära lysat.
För varje sjukdom av intresset (flytande och solida tumörer) en lämplig super SILAC kvantifiering standarden måste upprättas 14. En lämplig standard bör utgöra mer än 90% av de proteiner som uttrycks i proverna av intresse. För beredning av en kvantifiering standard, bör cellinjer relaterade till cancertypen av intresse först analyseras med masspektrometri för att bestämma deras proteinuttrycksprofiler och därefter principalkomponentanalys bör utföras. 4-6 olika cellinjer med differentiell proteinuttrycksmönster bör väljas och SILAC märktes med "tunga" arginin och lysin. Märkningseffektivitet bör kontrolleras av nanoLC-MS / MS och bör vara större än 98%. Efteråt bör cellinjer lyseras på samma sätt som den respektive patienten härledda prov och därefter bör ekvimolära protein mängder av varje prov och den SILAC spike-in standard blandas. Ett kritiskt steg för noggrann protein kvantifiering av kliniska prover of intresse är korrekt blandning av ekvimolära protein mängder av patientgenererade prover och SILAC spik-in kvantifiering standard. För att bestämma proteinkoncentrationen av lysat härledda från sorterade celler kan olika protein kvantifiering analyser användas. För cellulära lysat från vävnadshärledda celler behövs en analys som kan hantera höga koncentrationer av SDS och DTT i lysatet. Proteinkoncentrationer av patienthärledda prov och den SILAC spike-in standard bör mätas varje gång före kombination med de respektive kliniska prover för att säkerställa korrekt blandning, vilket är avgörande för att göra även hundratals prover jämförbara.
Efter blandning av lika stora mängder av spike-i standard och lysat, prover erhållna från flytande tumörer blandas med LDS, värmdes i en Thermomixer vid 72 ° C under 10 min och utsattes därefter för 1D-PAGE och in-gel digestion av den separerade proteiner med trypsin. Prover som erhållits frånvävnad befrias från SDS och klövs med trypsin genom att använda FASP tillvägagångssätt som fastställts av Wisniewski et al. 15
De tryptiska peptider erhållna kan kvantifieras genom mätning tryptofan fluorescens, som är av särskilt intresse för vävnadsprover som mängden peptider frisatta från filtret skiljer mellan 15% och 75% jämfört med de proteinmängder som ursprungligen lastas på filtret. För detta ändamål mäter vi fluorescens av tryptofan. Jämförelse med en lämplig tryptofan utspädningsserie möjliggör för kvantifiering av peptider, såsom 1,1 pg av tryptofan motsvarar cirka 100 | ig av peptid. Om det behövs, prover som härrör framför allt från FASP bearbetning kan förinställas renas på antingen kommersiella eller hemgjorda scen tips packade med omvänd fas-C18 (RP-C18) materialet innan du lägger på nanoLC / MS / MS-system 18.
Masspektrometrisk analys utförs på en hög-resolution, högkänslig masspektrometri systemet. Kort sagt, är peptidprover avsaltas och förkoncentreras på en RP-C18 förkolonn, och separerades på en RP-C18-analytisk kolonn kopplad direkt till masspektrometern. För att uppnå tillräckligt djup för analys, vi anställer antingen en kombination av SDS-PAGE protein prefraktionering med 40 min RP-C18 gradienter (för flytande tumörer) eller av enstaka injektioner med långa 2-3 tim RP-C18 gradienter (för solida tumörer behandlas av FASP ). MS-spektra förvärvas med en upplösning på 70.000 FWHM eller bättre, för att möjliggöra noggrann kvantifiering av SILAC par genom integration av kromatografiska topp profiler. För proteinidentifiering, är en dekorera15 databeroende förvärvsmetod som används för att generera ett stort antal peptid MS / MS-spektra för peptid och proteinidentifiering.
Från de resulterande rådata, är identifiering och kvantifiering protein uppnås genom databasen söka med MaxQuant programvara mot en UniProt Knowledgebase Human Komplett Proteome sekvensdatabas 17. I MaxQuant programvara (nuvarande version 1.5.0.25) peptider identifieras från den förvärvade MS / MS-spektra av peptidfragment-matchning mot spektra härrörande in silico från proteinsekvensdatabasen. Samtidigt är moderjon isotop profiler utvinns runt sina kromatografiska uppehållstider, och deras integrerade toppytorna används för relativ kvantifiering av ljuset: tunga peptidparen som genereras av SILAC märkning. Peptid identiteter och relativa intensiteter delas sedan till motsvarande proteinegenskaperna. Perseus programvara (nuvarande version 1.5.0.15) används sedan för att utföra längre nedströms statistisk utvärdering av MaxQuant behandlingsresultat, inklusive prov-till-prov jämförelser, PCA och hierarkisk klustring.
Använda experimentella uppställningen beskriven vi har identifierat och kvantifieras upp till 8000-proteiner från så lite som 30 ^ g av totalt proteinhärstammar från flytande tumörer.
Upp till 2.500 proteiner från solida tumörprover kan identifieras och kvantifieras på hagelgevär proteomik förhållningssätt med en LC lutning på bara 2 timmar, vilket gör att analysen av hundratals kliniska prover på relativt kort tid.
Figur 1. Experimentell arbetsflöde. De viktigaste stegen i cellulär-delmängd anrikning, proteinisolering, spik-in för kvantifiering standard och masspektrometrisk analys visas för flytande och solida tumörer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Cellulär anrikning Strategies. FACS sortering och LCM. (A) Exemplarisk gating strategi föreställande gating på en CD117-färgade leukemicellpopulationen förvärvats av en cellsorterare. (B) Laser fånga microdissection av fast tumörvävnad. Vävnadssnitt på 5 - 10 um tjocklek monterades på film täckta membran glider före färgning. Region intresse valdes manuellt för laser capture microdissection. Visas är sektioner innan microdissection med det intressanta området markerat gult och efter microdissection. En skala bar 50 pm ingår i figuren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Klusteranalys av humana cancercell proteom. Unsupervised klusteranalys av protein expressionsprofiler för flytande och fasta tumörer utfördes med användning av beräkningsplattformen Perseus. AC - Adenocarcinom, SCC - Skivepitelcancer, SCC-Met - skivepitelcancer metastaser från huvud- och halscancer, R - teknisk replikat.
Discussion
Det behövs Masspektrometrisk profilering av patientgenererade cancercell proteom för upptäckten av nya diagnostiska / prediktiva biomarkörer samt för att ge en bättre förståelse av cancer-cellbiologi, vilket i sin tur leder till att identifiera nya potentiella läkemedelsmål. Men sådana masspektrometriska analyser är mycket utmanande, särskilt på grund av olika pre-analytiska frågor måste lösas, om man skall få robusta och biologiskt relevanta resultat.
Den experimentella arbetsflöde beskrivs här möjliggör kvantitativ proteomik karakterisering av proteom härrör från cellulära subpopulationer av både flytande och fasta tumörer. Det behövs Den inledande anrikning av tumörceller genom att antingen FACS-baserade cell sortingor microdissection att undvika föroreningar av celler i tumören mikromiljö. Dessutom är dessa tekniker tillåter en att isolera cellulära subpopulationer av intresse. Senaste cellbiologiska studier har demonstrated att vissa cellulära delpopulationer har tumör initiera egenskaper och är därmed i högsta grad relevant för cancer patogenes 19,20. Som masspektrometri har blivit känsligare på senare år, kvantitativa proteomik analyser är möjliga för de små mängder protein som kan härledas från några tusen celler, vilket gör det möjligt att fokusera på funktionellt relevanta cellpopulationer.
Upplägget presenteras här kan användas för att identifiera och validera nya diagnostiska biomarkörer i FFPE prover. Därför lovar att bea användbart verktyg för att förbättra klinisk diagnostik, som hittills finns det fortfarande en brist på molekylära biomarkörer i tillräckligt antal och kvalitet för många cancertyper. Viktiga exempel på svåra differentialdiagnoser, för vilka biomarkörer saknas, är det diskriminering mellan primär lungcancer från metastaser i lungan, intrapancreatic cholangiocellulära cancer och bukspottskörteln adenokarcinom, samt skiljerentiation av godartad neurofibrom från mycket maligna perifera nerv slida tumörer. Dessutom har vi och andra visat att kvantitativ belysning av proteomik signaturer kan vara användbart för att studera cancer cellbiologi i allmänhet och för att avslöja prediktiva biomarkörer för terapeutiskt svar hos cancerpatienter 21.
Två nuvarande nackdelar med den metod som presenteras här är kravet på omfattande manuell provbearbetning och efterfrågan på nanoLC-MS / MS-förvärvstiden. Medan den förstnämnda kan åtgärdas genom att flytta provberedning till t.ex. 96-format och med hjälp av robotbearbetning, kommer det senare att kräva en förändring av mass strategi spektrometrisk förvärvet. När delmängder av målproteiner har identifierats som kan vara förknippade med t.ex. tumörklassificering, tänka vi utformningen av riktade masspektrometri metoder som ger kvantitativa avläsning för dessa undergrupper med en kraftigt reducerad separation ansträngning, ochdärför med en motsvarande minskad förvärvstiden. Om önskad förvärvs tid som krävs kan minskas 24-36 tim (flytande tumörer) eller 3 tim (solida tumörer) till t.ex., 1 timme med hjälp riktade masspektrometri och en enkel endimensionell separation av peptider, då vinst i genomströmning skulle kunna användas för att avsevärt öka antalet biologiska och tekniska replikat undersökta, med motsvarande förbättringar i betydelsen av kvantifiering resultat. Riktade masspektrometriska metoder har redan visat sig vara ett lämpligt verktyg för kontroll av cancerassocierade protein biomarkörer-kandidater 22, och har utvecklats till en punkt där de visar lovande för validering eller ens som ett potentiellt verktyg för rutinmässig klinisk användning 23 , 24.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt eller andra frågor att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
| Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
| Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
| Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
| FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
| Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
| Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
| LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
| Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
| Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
| Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
| Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
| Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
| Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
| SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
| SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
| Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
| Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
| Buffer and solutions | |||
| Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5 mM NaF, 0.5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
| Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
| Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
| IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
| 0.05 M NH4HCO3 | |||
| 10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
| 55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
| 5% aqueous formic acid. |
References
- Walther, T. C., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics in cell biology. J Cell Biol. 190 (4), 491-500 (2010).
- Lenz, C., Urlaub, H. Separation methodology to improve proteome coverage depth. Expert Rev Proteomics. 11 (4), 409-414 (2014).
- Olsen, J. V., Mann, M. Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3444-3452 (2013).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Jimenez, C. R., Verheul, H. M. Mass spectrometry-based proteomics: from cancer biology to protein biomarkers, drug targets, and clinical applications. Am Soc Clin Oncol Educ Book. , e504-e510 (2014).
- Tang, D. G. Understanding cancer stem cell heterogeneity and plasticity. Cell Res. 22 (3), 457-472 (2012).
- Evans, C., et al. An insight into iTRAQ: where do we stand now. Anal Bioanal Chem. 404 (4), 1011-1027 (2012).
- Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wisniewski, J. R. Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).
- Malmström, J., Picotti, P., Aebersold, R. Perspectives of targeted mass spectrometry for protein biomarker verification. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 518-525 (2009).
- Gillet, L. C., et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. 41, (2010).
- Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. 8, 309 (2007).
- Liu, N. Q., et al. Proteomics pipeline for biomarker discovery of laser capture microdissected breast cancer tissue. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 155-164 (2012).
- Geiger, T., et al. Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture as a spike-in standard in quantitative proteomics. Nat Protoc. 6 (2), 147-157 (2011).
- Wisniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. J Vis Exp. (79), (2013).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics. Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Sarvi, S., et al. CD133+ cancer stem-like cells in small cell lung cancer are highly tumorigenic and chemoresistant but sensitive to a novel neuropeptide antagonist. Cancer Res. 74 (5), 1554-1565 (2014).
- Shlush, L. I., et al. Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia. Nature. 506 (7488), 328-333 (2014).
- Schaab, C., et al. Global phosphoproteome analysis of human bone marrow reveals predictive phosphorylation markers for the treatment of acute myeloid leukemia with quizartinib. Leukemia. 28 (3), 716-719 (2014).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Sci Transl Med. 4 (142), 142ra94 (2012).
- Burgess, M. W., et al. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Boja, E. S., et al. Analytical Validation Considerations of Multiplex Mass Spectrometry-based Proteomic Platforms for Measuring Protein Biomarkers. J Proteome Res. , (2014).
