Abstract
Dybdegående analyser af kræft celle proteomer er nødvendige for at belyse onkogene patomekanismer samt at identificere potentielle lægemiddelkandidater og diagnostiske biomarkører. Men metoder til kvantitativ proteomisk karakterisering af patient-afledte tumorer og især deres cellulære subpopulationer stort set mangler. Her beskriver vi en forsøgsopstilling, der tillader kvantitativ analyse af proteomer for kræft cellesubpopulationer afledt af enten flydende eller faste tumorer. Dette opnås ved at kombinere cellulære berigelse strategier med kvantitativ Super-SILAC baseret massespektrometri efterfulgt af bioinformatiske dataanalyse. At berige specifikke cellulære delmængder, er flydende tumorer først immunophenotyped ved flowcytometri efterfulgt af FACS-sortering; for faste tumorer, er laser capture microdissection anvendes til at oprense specifikke cellulære subpopulationer. I et andet trin, proteiner ekstraheret fra oprensede celler og efterfølgende kombineres med en tumor-specifik,SILAC-mærket spike-in standard, der muliggør protein kvantificering. Det resulterende protein blanding udsættes for enten gelelektroforese eller Filter Aided Prøveforberedelse (FASP) efterfulgt af tryptisk fordøjelse. Endelig tryptiske peptider analyseres ved hjælp af en hybrid quadrupol-orbitrap massespektrometer, og de opnåede data behandles med bioinformatiske softwarepakker herunder MaxQuant. Ved hjælp af arbejdsprocessen, der præsenteres her, op til 8.000 proteiner kan identificeres og kvantificeres i patient-afledte prøver, og de resulterende protein ekspressionsprofiler kan sammenlignes blandt patienter at identificere proteomiske signaturer diagnostiske eller potentielle lægemiddelkandidater.
Introduction
Massespektrometri-baserede proteomics opstået og er nu en udbredt disciplin i cellebiologi og translationel biomedicinsk forskning. Tekniske fremskridt på området har gjort det muligt at studere komplekse cellulære processer i cellelinjer og dyremodeller, som tusindvis af proteiner kan identificeres i et enkelt massespektrometrisk eksperiment 1,2. Der er gjort tilsvarende fremskridt til analyse af mange posttranslationelle modifikationer såsom phosphorylering eller ubiquitinering, selv om dette normalt kræver skræddersyede arbejdsgange for berigelse og dataanalyse for hver type ændring 2,3. Desuden inddragelse af kemiske og metaboliske strategier mærkning, herunder SILAC, muliggør nøjagtig relativ kvantificering af proteiner og PTMS, hvilket gør denne metode særligt attraktive for opdagelsen af basale cellulære processer, diagnostiske biomarkører og potentielle lægemiddelkandidater i human cancer 4.
Imidlertidflere udfordringer skal overvindes med hensyn til proteomisk analyse af primære humane cancere 5. Først og fremmest, Cancer prøver humane viser ofte en høj grad af cellulær heterogenitet, som skyldes tilstedeværelsen af forskellige celletyper, der tilhører tumormikromiljøet, herunder immunceller og fibroblaster. For det andet, klonal evolution fører til genetisk diversitet indenfor tumorerne selv, hvilket resulterer i, at der findes adskillige cellulære subpopulationer med distinkte funktionelle egenskaber. Ifølge den nuværende begreb få cancer stamceller bliver drivkræfterne bag udviklingen af kræft og progression, proteomiske analyse af disse (funktionelt yderst relevante) cellulære subpopulationer forventes at være af stor betydning for en bedre forståelse af onkogene mekanismer relevante for klinisk anvendelse 6. For det tredje er kvantitative proteinekspressionsniveauer profiler af store sæt af prøver ofte kræves til identifikation af robust klinisk BioMarKERS; dette kan ikke opnås ved kemisk mærkning såsom iTRAQ 7, mens metaboliske mærkning strategier - stole, som de gør, på cellulær proliferation 4 - er ligeledes uanvendelig. For det fjerde, de fleste til rådighed med solide tumorer prøver er formalin-fikseret, hvilket komplicerer massespektrometrisk proteomanalyse på grund af dannelsen af protein tværbindinger 8. Endelig fleste eksisterende proteomics arbejdsgange kræver betydelige mængder prøve forarbejdning og datafangst, hvilket gør analysen af prøvenumre er relevante for klinisk forskning vanskelig, og opfordrer til ny arbejdsgang paradigmer 9,10.
For at løse disse problemer har vi udviklet en forsøgsopstilling, der kombinerer begge flowcytometrisk cellesortering 11 eller laser-capture mikrodissektion 12,13 for cellulær berigelse med en Super-SILAC 14 strategi om at indføre en global intern standard for omfattende massespektrometrisk analyse. Ved at bruge den her beskrevne fremgangsmåde, er det muligt at kvantificere op til 8.000 proteiner i enkelte humane tumorprøver afledt fra enten flydende eller faste cancere.
Protocol
Alle forsøg på humane væv eller blodprøver skal godkendes af en etisk komité og udført i overensstemmelse med eventuelle retningslinjerne i den etiske stemme.
1. Cellular Enrichment
- Flydende tumorer / fluorescens-aktiveret cellesortering.
- Isoler mononukleære celler fra knoglemarv eller blodprøve ved at udføre erythrocyt-lysis under anvendelse af ammoniumchlorid eller ved Ficoll densitet-gradient-centrifugering.
- For erythrocyt-lysis, kombinere 1 ml af prøven med 4 ml ammoniumchloridopløsning. Inkubér opløsningen på is i 5 - 10 min. Tilsæt 40 ml phosphatbufret saltvand (PBS) + 2% føtalt kalveserum (FCS) og centrifugeres i 5 minutter ved 400 xg og 4 ° C.
- For Ficoll gradient centrifugering, lag 10 ml prøve på 15 ml Ficoll-Hypaque at danne 2 forskellige lag (pas på ikke at forstyrre lagene). Centrifuger ved 400 x g i 30 minutter ved stuetemperatur (15-25 ° C) forsigtigt og høste mononukleæreceller, der samler sig i interfasen.
- Spin ned cellerne og tage dem op i PBS + 2% FCS. Centrifuger ved 400 xg i 5 minutter og tage op i 1 ml PBS + 2% FCS. Udtages en alikvot som negativ kontrol og en alikvot for hver fluorescerende farvestof, der anvendes i den endelige farve.
- Inkuber med fluorescens-mærkede antistoffer er nyttige til at isolere leukæmicellepopulationen i fortynding i overensstemmelse med producentens anvisninger på is i 30 min. Plette Også portioner anvendt til erstatning med hvert antistof individuelt. Vask to gange med PBS + 2% FCS.
BEMÆRK: Antistofferne blev anvendt, var muse-anti-human mod CD117-PE (klon 95C3), CD34-FITC (Clone 8G12) og CD33-PE (Clone P67,6). - Filter celler gennem 35 um cellefilter, ideelt ved hjælp rør med cellefilter integreret i hætten.
- Tilføj cellelevedygtighed farvning (f.eks, 7-AAD). Sorter celler under anvendelse af en passende cellesorterer 11 (figur 2). Saml celler i Ise ove modificerede Dulbeccos medium (IMDM) indeholdende 10% FCS.
- Isoler mononukleære celler fra knoglemarv eller blodprøve ved at udføre erythrocyt-lysis under anvendelse af ammoniumchlorid eller ved Ficoll densitet-gradient-centrifugering.
- Solide tumorer / Laser-capture mikrodissektions.
- For de eksperimenter blev FFPE prøver fra lungekræft prøve anvendes. Til dette formål lungekræft væv blev straks fikseret i 4% pufret formalin efter kirurgisk resektion og stykker på ca. 3 x 2 x 1 cm, hvor indlejret i paraffin til yderligere analyse.
- Snit på 5 - 10 um tykkelse fra formalin-fikserede paraffin-indlejrede (FFPE) prøve med en mikrotom. Mount afsnit om film-dækket membran dias og tørre ved 37 ° C i 1 time. Afparaffiniser og rehydrere de monterede sektioner ved successiv inkubation i xylen, absolut ethanol, 70% og vand hver for 1 min.
- Farv afsnittene med hæmatoxylin i 20 sekunder og derefter skylles med vand fra hanen. Saml cellepopulationen af interesse ved hjælp af en laser-capture microdissection systemet (se også 12).
- Flydende tumorer.
- Centrifugeres cellesuspensionen fra trin 1.1.5 ved 400 xg, 4 ° C i 4 min og kassér supernatanten. Vask to gange med 500 pi kold PBS og centrifugering i 5 minutter ved 400 xg og 4 ° C
- Tilsæt 40 pi lysis buffer per 10 6 celler og inkuberes i 15 min på is (10 5 celler (ca.. 10 ug total protein) bør være det minimale antal celler). Centrifugeres lysatet ved 14.000 xg, 4 ° C i 10 minutter og overfør supernatant (blokerede cellulært lysat) til et nyt reagensglas. Kassér pellet.
- Solide tumorer.
- Tilsættes 60 pi væv lysepuffer til mikrodissekeret væv og inkuberes i 15 minutter på is, opsamle væsken ved kort centrifugering og overføre suspensionen til en ny reaktionsglas. Soniker lysatet på is i 3 min.
- Der tilsættes 15 pi 20% natriumdodecylsulfat (SDS) til en nå en endelig SDS concentration på 4%. Inkubér mikrodissekeret væv ved 99 ° C i en varmeblok i 1 time og omrøres ved 600 rpm. Centrifugeres lysatet ved 16.000 xg, 18 ° C i 10 minutter og overfør supernatant til et nyt rør.
3. Etablering af en SILAC Spike-i Kvantificering Standard (Super-SILAC Standard)
BEMÆRK: kvantificering standard består af en SILAC-mærket protein blanding afledt 4-6 cellelinier, der matcher tumortype af interesse. For at opnå den maksimale overlapning mellem SILAC-mærkede henvisning proteom og tumor-afledte proteom, skal udføres før cellelinier udvælges til kvantificering standard 14 a principal komponent analyse.
- Principal komponent analyse (PCA).
- Til bestemmelse af protein ekspressionsmønstre for cellelinjer, dyrke omkring ti forskellige cellelinier i passende celledyrkningsmedier. Lyse af celler som beskreveti trin 2.1. Forbered cellelysater for massespektrometri som beskrevet i trin 6.1.
- Analyser proteinekspression mønster af hver cellelinie på en høj opløsning, væskekromatografi koblet massespektrometer (nanoLC-MS / MS).
- Analyser de resulterende rådata ved hjælp af en gratis ware MaxQuant og udføre en principal-komponent analyse ved hjælp af den tilhørende software som Perseus 16,17.
- Vælg 4 - 6 cellelinjer, der viser den største diversitet mellem deres protein-ekspressionsprofiler og bruge dem til at generere Super-SILAC spike-in standard.
- SILAC-mærkning og etiket check.
- Dyrk de valgte cellelinjer i mindst fem cellecykler i passende SILAC celledyrkningsmedium, hvor arginin og lysin er mærket med stabile isotoper af kulstof og kvælstof (SILAC medium) 4.
- Lyse af cellerne som beskrevet i trin 3.1 og forberede cellulære lysater til massespektrometri som beskrevet i trin 6.1.Mål inkorporeringen effektivitet SILAC mærkning af nanoLC-MS / MS. Analyser de resulterende rå MS data med MaxQuant og bestemme effektiviteten af SILAC-mærkning. Dette opnås ved at tælle antallet af identificerede peptider i deres mærket (tunge) og deres endogene former (lys), og beregning af forholdet (tung) / (tung + lys). Mærkningseffekt bør overstige 98%.
- Kombination af SILAC proteomer og validering.
- Dyrk og udvide udvalgte cellelinjer ifølge fremstiller instrukser på hensigtsmæssige SILAC medium. Lyse af cellerne som beskrevet i trin 2.1 til flydende tumorer eller som beskrevet i trin 3.2 for faste tumorer og bestemme proteinkoncentrationen for hver cellelysatet.
- Bland ækvimolære proteinmængder af hver cellelinie og opdele blandingen i portion. Snap-indefryse portioner og opbevares ved -80 ° C indtil måling. For et eksperiment, du har brug 20-50 ug Super-SILAC standard. Vær omhyggelig med at forberede standard i overskud som ændring af standard inden for en række eksperimenter bør undgås.
4. Måling af proteinkoncentration og Spike-in
- Flydende tumorer.
- Anvendelse af protein kvantificeringsassayet bestemme proteinkoncentrationer af de respektive cellulære lysater og Super-SILAC standard.
- Bland lige store mængder af blokerede cellulært lysat og Super-SILAC standard og efterfølgende tilføje lithium dodecyl sulfate (LDS) puffer (25% af prøvevolumenet) og reduktionsmidlet (10% af prøvevolumenet).
- Opvarm den resulterende opløsning i en varmeblok ved 72 ° C i 10 min. Eventuelt opbevares de resulterende denaturerede proteiner ved -80 ° C.
- Solide tumorer.
- For proteinkoncentration måling på en pladelæser, blande en standard bovint serumalbumin (BSA) fortyndingsopløsning serie, lysatet og den passende Super-SILAC standard med et kommercielt tilgængeligt protein Assay i en plade med 96 brønde, og rystes i 1 min, inkuberes i angivne tid og måle absorbansen som angivet af fabrikanten.
BEMÆRK: Den høje koncentration af SDS og dithiothreitol (DTT) i lysatet er et problem for de fleste tilgængelige assays til proteinkoncentration bestemmelse. - Bland lige store mængder af klaret lysat og Super-SILAC standard med 200 pi af urinstof i filterenheden og centrifugeres ved 14.000 xg i 30 min ved 20 ° C. Brug ikke mere end 50 pi klaret lysat og Super-SILAC standard. Undgå temperaturer under 15 ° C, således at urinstof ikke krystalliserer ud.
- For proteinkoncentration måling på en pladelæser, blande en standard bovint serumalbumin (BSA) fortyndingsopløsning serie, lysatet og den passende Super-SILAC standard med et kommercielt tilgængeligt protein Assay i en plade med 96 brønde, og rystes i 1 min, inkuberes i angivne tid og måle absorbansen som angivet af fabrikanten.
5. Prøve Separation og Protein Digest
- Flydende tumorer.
- Separat 30-100 ug total protein per bane på en 4 - 12% gradient SDS-PAGE-gel. Stain proteiner med Coomassie Blue O / N. Fjern overskydende coomassieplet ved to efterfølgende vask med vand.
- Skær hver bane fra gelen og opdele deti 23 lige store skiver uanset mønsteret gel farvning. Proces gelskiverne hver for sig, hver i en i 0,6 ml hætteglas af polypropylen.
- Vask gelskiverne med vand og methanol / vand (50:50, v / v), reducere med 10 mM DTT ved inkubering i 30 minutter ved 56 ° C. Alkylere gelskiverne med 55 mM iodacetamid (IAA) ved inkubation ved 60 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Mellem prøve-handling trin, vask skiver med acetonitril i 15 minutter og tør i en SpeedVac at fjerne overskydende opløsningsmiddel og forbedre optagelsen af reagens løsning.
- Udfør proteasespaltning ved rehydrering tørrede gelskiver med den mindst mulige mængde svine trypsin opløsning (12,5 ng / pl i 0,025 M vandig ammoniumbicarbonat) i 16 timer ved 37 ° C.
- Der tilsættes 10 pi vand til gelskive og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C. Tilsættes 80 pi acetonitril og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C. Der centrifugeres ved 15.800 xg i 1 min. Saml supernatanten og opbevares i en separat 0,6 mlrør.
- Tilføj 65 pi 5% myresyreopløsning, vortex og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C. Tilføj 65 pi acetonitril og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C. Centrifuger ved 15.800 xg i 1 min. Opsaml supernatanten og tilføje den til supernatanten fra det foregående trin. Inddampes den kombinerede supernatant til tørhed i et vakuum koncentrator.
- Solide tumorer.
- Hvis du vil fjerne SDS fra væv lysat bruge følgende FASP protokollen, også beskrevet som i henvisning 15.
- Efter den første centrifugering beskrevet i trin 5.2.3 tilføje yderligere 200 pi 8 M urinstof på filteret og yderligere centrifuge ved 14.000 xg i 20 minutter ved 20 ° C. Flow-through filtrat Kassér.
- Tilsæt 100 pi IAA og blandes i en termomikser ved 600 rpm i 1 min. Inkuberes filteret i 20 minutter ved 20 ° C i mørke. Centrifugeres filteret ved 14.000 xg i 10 minutter ved 20 ° C.
- Tilsæt 100 pi af urinstof til filteret og CENtrifuge ved 14.000 xg i 15 minutter ved 20 ° C. Gentag dette trin en gang til.
- Tilsæt 100 pi NH4 HCO 3 til filter og centrifugeres ved 14.000 xg i 10 minutter ved 20 ° C. Gentag dette trin to gange.
- Tilsæt 40 pi NH4 HCO 3 + 1 pi (= 0,4 ug) trypsin og bland i thermomixer ved 20 ° C i 600 rpm, 1 min. Inkubér filter O / N i en våd kammer ved 37 ° C. Overfør filteret til nye rør kollektion.
- Centrifugeres filteret ved 14.000 xg i 10 minutter ved 20 ° C. Der tilsættes 50 pi NH4 HCO 3 og centrifuger filter ved 14.000 g i 10 minutter ved 20 ° C. Opbevar de resulterende peptider ved -20 ° C indtil massespektrometrisk måling.
- For peptid koncentration, dispensere 50 pi af den resulterende gennemstrømning og en række passende fortyndinger af ren tryptophan i en 96-brønds plade. Mål tryptophanfluorescens. Konverter den resulterende koncentration aftryptophan til peptid koncentration 0,1 ug tryptophan svarer til 9 ug protein.
6. væskekromatografi og massespektrometrianalyse
- Genopløs peptider i 30 pi loading buffer i 5 minutter i en sonication bath. Spin ned i en centrifuge ved 15.800 xg i 1 min og pipette den klare opløsning i en MS autoprøveudtagningshætteglas.
- Indsprøjtes 5 pi prøve pr analyse ved hjælp af autosampler på nanoLC-MS / MS system. Koncentrat og afsalte peptider online på en omvendt fase C18 pre-søjle (0,15 mm ID x 20 mm med 5 um porestørrelse C18 materiale) monteret i enten en ventileret kolonne opsætning eller en forkolonnen skifte setup.
- Separate peptider på en omvendt fase C18 mikrosøjlen (0,075 mm ID x 200 mm selv pakket med 3 um eller mindre porestørrelse C18 materiale i en selv-pack nanospray kolonne såsom PicoFrit under anvendelse af en 90 min gradient på 5> 35% acetonitril vs . 0,1% vandig myresyre ved 300 nl /min. Transfer eluent i en hybrid kvadrupol / orbitrap massespektrometer via en nanospray ionkilde.
- Analyser peptider under anvendelse af en Luksusvilla15 data afhængig overtagelsesmetoden (MS m / z interval 350 -. 1600, resolution mål 70.000 FWHM, AGC target 1 x 10 6, max fyld tid 60 ms MS / MS starter masse 100, opløsning mål 17.500 FWHM, AGC målrette 2 x 10 5, max fyld tid 60 ms MS / MS tærskel 3 x 10 4, omfatter opladningstilstand 2 -. 5, Normalized Collision Energi NCE 25%, dynamisk udelukkelse 15 sek).
7. Dataanalyse
- For dataanalyse bruge frit tilgængelige MaxQuant 16 software. En detaljeret protokol for bioinformatisk dataanalyse beskrives i 16,17. Til analyse kombinere rå datafiler fra alle udsnit fra en SDS-PAGE lane i et enkelt eksperiment 17.
Representative Results
Proteomisk profilering af flydende og faste tumorer fra patienter er en lovende metode til opdagelsen af nye diagnostiske og prædiktive biomarkører. Men prøveforberedelse proceduren og massespektrometrianalyse er udfordrende på grund af kompleksiteten af prøverne og behovet for præcis protein kvantificering i store sæt af prøver. Den eksperimentelle procedure beskrevet ovenfor begynder med isolering af celler af interesse, enten ved fluorescens-aktiveret celle-sortering eller ved hjælp af laser-capture microdissection.
Til dette formål er celler fra patient-afledt knoglemarvsaspirater eller blodprøver farvet med fluorescens-mærkede antistoffer mod definerede overflademarkører af interesse før FACS-baserede sortering og cellelysis.
At berige cellulære delmængder fra vævssnit disse først skal monteres på passende objektglas for at muliggøre laser capture microdissection. Til dette formål montere than vævssnit på passende membran dias og bruge en laser-capture microdissector i henhold til producentens anvisninger. Valg af områder og celler af interesse kræver passende viden om histomorphology af sunde og neoplastisk væv. De ekstraherede celler overføres derefter til en passende samling rør. Indledende forsøg skal udføres for at fastlægge den mængde væv er nødvendig for udvinding af tilstrækkelige mængder af protein (minimum 10 ug total protein) for hver ny væv af interesse. Hver mikrodissekeret prøve behandles med 60 pi væv lysisbuffer. Til effektiv lysering celler fra vævsprøver skal sonikeret i 3 minutter, og efter tilsætning af 15 pi SDS Prøverne inkuberes i en termomikser ved 99 ° C i 1 time for at fjerne formalin-induceret protein tværbindinger. Centrifugering endelig vil lette indsamlingen af den ryddet cellulære lysat.
For hver sygdom iskal etableres nterest (flydende og faste tumorer) et egnet Super-SILAC kvantificering standard har 14. En passende standard bør udgøre mere end 90% af de proteiner, der udtrykkes i prøverne af interesse. Til fremstilling af en kvantificering standard, skal cellelinjer relateret til cancer type interesse først analyseres ved massespektrometri for at bestemme deres protein udtryk profiler og efterfølgende principal komponent analyse skal udføres. 4 - 6 forskellige cellelinier med forskellen protein ekspressionsmønstre skal vælges og SILAC-mærket med "tung" arginin og lysin. Mærkningseffekt bør kontrolleres af nanoLC-MS / MS og bør være større end 98%. Bagefter bør cellelinjer lyseres på samme måde som den respektive patient-afledte prøve og efterfølgende bør ækvimolære protein mængder af hver prøve og SILAC spike-in standard blandes. Et afgørende skridt for præcis protein kvantificering af kliniske prøver of interesse er den præcise blanding af ækvimolære protein mængder af patient-afledte prøver og den SILAC spike-i kvantificering standard. For at bestemme proteinkoncentration på lysater afledt fra sorterede celler kan forskellige protein kvantificering assays anvendes. For cellulære lysater fra vævsafledte celler et assay er nødvendig, der kan håndtere høje koncentrationer af SDS og DTT i lysatet. Bør måles Proteinkoncentrationer af patienten-afledte prøver og SILAC spike-in standard hver gang før kombination med de respektive kliniske prøver for at sikre korrekt blanding, hvilket er afgørende i at gøre selv hundredvis af prøver sammenlignelige.
Efter blanding af lige mængder af spike-i standard og lysat prøver fra flydende tumorer blandet med LDS opvarmet i termomikser ved 72 ° C i 10 minutter og efterfølgende udsættes for 1D-PAGE og i-gel fordøjelse af det separerede proteiner med trypsin. Prøver opnået fravæv er befriet fra SDS og fordøjet med trypsin ved at bruge FASP tilgang som fastsat i Wisniewski et al. 15
De tryptiske peptider opnået kan kvantificeres ved at måle tryptophanfluorescens, som er af særlig interesse for vævsprøver som mængden af peptider frigøres fra filteret varierer mellem 15% og 75% i forhold til proteinet beløb, der oprindeligt er indlæst på filteret. Til dette formål måler vi fluorescensen af tryptophan. Sammenligning med en passende tryptophan fortyndingsrække muliggør kvantificering af peptider, som 1,1 ug tryptophan svarer til ca. 100 ug af peptid. Hvis det er nødvendigt, prøver stammer især fra FASP forarbejdning kan præ-oprenset på enten kommercielle eller hjemmelavede scene tips pakket med omvendt fase-C18 (RP-C18) materiale, før du lægger på nanoLC / MS / MS-system 18.
Massespektrometrisk analyse udføres på en høj-Opløsning, høj følsomhed massespektrometri system. Kort sagt, peptid prøver afsaltes og preconcentrated på en RP-C18 forkolonne, og separeret på en RP-C18-analytisk søjle koblet direkte til massespektrometeret. For at opnå tilstrækkelig dybde analyse beskæftiger vi enten en kombination af SDS-PAGE protein præfraktionering med 40 min RP-C18-gradienter (til flydende tumorer) eller enkelte injektioner med lange 2 - 3 timers RP-C18-gradienter (for solide tumorer behandles af FASP ). MS-spektre erhverves med en opløsning på 70.000 FWHM eller bedre, til nøjagtig kvantificering af SILAC par ved integration af kromatografiske peak profiler. For protein identifikation er en Luksusvilla15 dataafhængig erhvervelse metode anvendes til at generere et stort antal peptid MS / MS-spektre for peptid og protein identifikation.
Fra den resulterende rådata, er protein identifikation og kvantificering opnås ved databasesøgning med MaxQuant software mod en UniProt Knowledgebase Humant Complete Proteome sekvens database 17. I MaxQuant software (nuværende version 1.5.0.25) peptider identificeres fra den erhvervede MS / MS spektre af peptidfragment-matching mod spektre stammer i silico fra proteinsekvensen databasen. Samtidig er precursor ion isotopiske profiler ekstraheret omkring deres kromatografiske retentionstider og deres integrerede toparealer anvendes til relativ kvantificering af lys: tunge peptidpar genereret af SILAC mærkning. Peptid identiteter og relative intensiteter derefter tildeles det tilsvarende protein egenskaber. Perseus software (nuværende version 1.5.0.15) anvendes derefter til at udføre længere nedstrøms statistisk vurdering af MaxQuant forarbejdning resultaterne, herunder prøve-til-prøve sammenligninger, PCA og hierarkisk klyngedannelse.
Anvendelse af den eksperimentelle opsætning beskrevet har vi identificeret og kvantificeret op til 8.000 proteiner fra så lidt som 30 ug af totalproteinafledt af flydende tumorer.
Op til 2.500 proteiner fra faststof-tumorprøver kan identificeres og kvantificeres i et haglgevær proteomisk tilgang med en LC gradient på kun 2 timer, hvilket tillader analysen af hundreder af kliniske prøver på relativt kort tid.
Figur 1. Eksperimentel workflow. De vigtigste trin i cellulær-delmængde berigelse, protein isolation, spike-in for kvantificering standard og massespektrometrisk analyse er vist for flydende og faste tumorer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Cellular berigelse strategyes. FACS sortering og LCM. (A) Eksempler gating strategi afbilder gating på en CD117-farvet leukæmicellepopulationen erhvervet af en cellesorterer. (B) Laser capture microdissection af fast tumorvæv. Vævssnit på 5 - 10 um tykkelse blev monteret på membran slides film dækket før farvning. Region interesser blev valgt manuelt til laser capture mikrodissektion. Vist er sektioner før mikrodissektion med området af interesse markeret med gult og efter mikrodissektion. En skala bar på 50 um indgår i figuren. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Cluster analyse af humane cancer-celle proteomer. Unsupervised klyngeanalyse af protein ekspressionssystemer profiler af flydende og faste tumorer blev udført under anvendelse af den beregningsmæssige platform Perseus. AC - adenocarcinom, SCC - Pladecellekræft, SCC-Met - pladecellekræft metastaser fra hoved- og halscancer, R - teknisk kopiere.
Discussion
Massespektrometrisk profilering af patient-afledte cancer-celle proteomer er brug for opdagelsen af nye / prædiktive biomarkører diagnostiske såvel som at give en bedre forståelse af cancer-cellebiologi, hvilket måske igen føre til identifikation af nye potentielle lægemiddelkandidater. Sådanne massespektrometriske analyser er meget udfordrende, især fordi forskellige præ-analytiske problemstillinger, der skal løses, hvis man skal opnå robuste og biologisk relevante resultater.
Den eksperimentelle workflow beskrevet her giver mulighed for kvantitativ proteomisk karakterisering af proteomer afledt af cellulære subpopulationer af både flydende og faste tumorer. Den indledende berigelse af tumorceller ved enten FACS-baserede celle-sortingor mikrodissektion er nødvendig for at undgå forurening af celler fra tumormikromiljøet. Desuden er disse teknikker tillader en at isolere cellulære subpopulationer af interesse. De seneste celle-biologiske undersøgelser har dæmonstrated at visse cellulære subpopulationer har tumor-initierende egenskaber og er derfor yderst relevant for kræft patogenese 19,20. Som massespektrometri er blevet mere følsom i de senere år, kvantitative proteomikanalyser er mulige for de små mængder protein, der kan udledes fra nogle få tusinde celler, hvilket gør det muligt at fokusere på funktionelt relevante cellepopulationer.
Det set-up, der præsenteres her kan bruges til at identificere og validere nye diagnostiske biomarkører i FFPE prøver. Derfor det lover at bea nyttigt redskab til forbedring af klinisk diagnostik, som til dato er der stadig mangel på molekylære biomarkører i tilstrækkeligt antal og kvalitet for mange kræftformer. Vigtige eksempler på vanskelige differentialdiagnoser, for hvilke biomarkører mangler, er den forskelsbehandling mellem primær lungekræft fra metastaser i lungerne, intrapankreatiske cholangiocellulær karcinom og pancreas adenocarcinom samt afvigerentiering af godartet neurofibrom fra højt maligne perifere nerve-kappe tumorer. Desuden har vi og andre vist, at kvantitativ belysning af proteomiske signaturer kan være nyttige i at studere cancer cellebiologi i almindelighed og for at afsløre prædiktive biomarkører for terapeutisk respons hos cancerpatienter 21.
To aktuelle ulemper ved metoden præsenteres her er kravet om væsentlig manuel prøve behandling og efterspørgslen på nanoLC-MS / MS erhvervelse tid. Mens førstnævnte kan løses ved at flytte prøveforberedelse til fx 96-brønds formater og bruge robot behandling, vil sidstnævnte kræve en ændring i masse strategi spektrometrisk erhvervelse. Når delmængder af målproteiner er blevet identificeret, der kan være forbundet med f.eks tumorklassifikation vi forestiller udformningen af målrettede massespektrometriske metoder, der giver kvantitative udlæsninger for disse delmængder med en stærkt reduceret adskillelse indsats, ogderfor med en tilsvarende reduceret erhvervelse tid. Hvis den ønskede erhvervelse nødvendige tid kunne reduceres fra 24 til 36 timer (flydende tumorer) eller 3 timer (solide tumorer) til f.eks, 1 time ved hjælp målrettet massespektrometri og en simpel en-dimensional adskillelse af peptider, så den deraf følgende gevinst i gennemløb kunne bruges til at stige betydeligt antallet af biologiske og tekniske replikater undersøgt, med tilsvarende forbedringer i betydningen af kvantificering resultater. Målrettede massespektrometriske metoder har allerede vist sig at være et egnet redskab til kontrol af cancer-associeret protein biomarkør-kandidater 22, og er blevet udviklet til et punkt, hvor de viser lovende for validering eller endda som et potentielt redskab til rutinemæssig klinisk anvendelse 23 , 24.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter eller andre problemer at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
| Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
| Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
| Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
| FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
| Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
| Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
| LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
| Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
| Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
| Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
| Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
| Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
| Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
| SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
| SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
| Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
| Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
| Buffer and solutions | |||
| Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5 mM NaF, 0.5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
| Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
| Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
| IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
| 0.05 M NH4HCO3 | |||
| 10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
| 55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
| 5% aqueous formic acid. |
References
- Walther, T. C., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics in cell biology. J Cell Biol. 190 (4), 491-500 (2010).
- Lenz, C., Urlaub, H. Separation methodology to improve proteome coverage depth. Expert Rev Proteomics. 11 (4), 409-414 (2014).
- Olsen, J. V., Mann, M. Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3444-3452 (2013).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Jimenez, C. R., Verheul, H. M. Mass spectrometry-based proteomics: from cancer biology to protein biomarkers, drug targets, and clinical applications. Am Soc Clin Oncol Educ Book. , e504-e510 (2014).
- Tang, D. G. Understanding cancer stem cell heterogeneity and plasticity. Cell Res. 22 (3), 457-472 (2012).
- Evans, C., et al. An insight into iTRAQ: where do we stand now. Anal Bioanal Chem. 404 (4), 1011-1027 (2012).
- Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wisniewski, J. R. Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).
- Malmström, J., Picotti, P., Aebersold, R. Perspectives of targeted mass spectrometry for protein biomarker verification. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 518-525 (2009).
- Gillet, L. C., et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. 41, (2010).
- Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. 8, 309 (2007).
- Liu, N. Q., et al. Proteomics pipeline for biomarker discovery of laser capture microdissected breast cancer tissue. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 155-164 (2012).
- Geiger, T., et al. Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture as a spike-in standard in quantitative proteomics. Nat Protoc. 6 (2), 147-157 (2011).
- Wisniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. J Vis Exp. (79), (2013).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics. Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Sarvi, S., et al. CD133+ cancer stem-like cells in small cell lung cancer are highly tumorigenic and chemoresistant but sensitive to a novel neuropeptide antagonist. Cancer Res. 74 (5), 1554-1565 (2014).
- Shlush, L. I., et al. Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia. Nature. 506 (7488), 328-333 (2014).
- Schaab, C., et al. Global phosphoproteome analysis of human bone marrow reveals predictive phosphorylation markers for the treatment of acute myeloid leukemia with quizartinib. Leukemia. 28 (3), 716-719 (2014).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Sci Transl Med. 4 (142), 142ra94 (2012).
- Burgess, M. W., et al. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Boja, E. S., et al. Analytical Validation Considerations of Multiplex Mass Spectrometry-based Proteomic Platforms for Measuring Protein Biomarkers. J Proteome Res. , (2014).
