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Medicine

Un Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52436
Automatic Translation
1, 1, 1
1Swiss Institute for Experimental Cancer Research, School of Life Sciences, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne

ERRATUM NOTICE

Summary

Abbiamo sviluppato un nuovo modello di ex vivo per studiare l'azione di ormoni nel seno umano. Si basa su microstrutture tessuti isolati da campioni di tessuto del seno chirurgici che conservano l'architettura del tessuto, le interazioni intercellulari, e segnalazione paracrina.

Abstract

Lo studio di azione dell'ormone nel seno umano è stata ostacolata dalla mancanza di adeguati sistemi modello. Alla cultura in vitro, cellule epiteliali mammarie primarie tendono a perdere l'espressione del recettore dell'ormone. Ampiamente recettore ormone linee di cellule di cancro al seno positivo utilizzati sono di scarsa rilevanza per la situazione in vivo. Qui, descriviamo un modello ex vivo per studiare l'azione di ormoni nel seno umano. Campioni di tessuto mammario umano fresco da materiale di scarto chirurgico quali mammoplastiche riduzione o mammectomies sono meccanicamente ed enzimaticamente digerite per ottenere frammenti di tessuto contenenti dotti e lobuli e molteplici tipi di cellule stromali. Queste microstrutture tessuti conservati in terreno di base senza fattori di crescita mantenere i contatti intercellulari, l'architettura dei tessuti, e rimangono ormone reattivo per diversi giorni. Essi sono facilmente elaborati per l'RNA e l'estrazione di proteine, l'analisi istologica o memorizzati in congelamento medio. Fluorescenzaattivato ordinamento delle cellule (FACS) può essere utilizzato per arricchire per specifiche popolazioni cellulari. Questo protocollo offre un approccio standard semplice per gli studi traslazionali con altamente complessi, variegati campioni umani.

Introduction

Informazioni sul paesaggio mutazionale di cancro al seno sta aumentando a ritmi sostenuti. Meno attenzione è stata rivolta a fattori sistemici che influenzano lo sviluppo del cancro al seno. L'esposizione agli ormoni riproduttivi ha un impatto importante sulla progressione della malattia 1-3. Tuttavia, i meccanismi con cui gli ormoni riproduttivi incidono sul seno umano sono poco conosciuti. Lavora con modelli di topo geneticamente ha rivelato che coinvolgono cellule segnalazione intrinseca e paracrine attraverso diversi effettori a valle 4.

La conoscenza limitata su azione ormonale nel seno umano è in gran parte attribuibile alla mancanza di modelli adeguati. Maggior parte dei lavori sui meccanismi di recettore per gli estrogeni (ER) e del recettore del progesterone (PR) segnalazione è stata eseguita con linee di cellule del recettore dell'ormone positivi cancro al seno, come MCF-7 e T47D. Questi sono stati ottenuti da versamento pleurico di pazienti con carcinoma mammario avanzato che aveva already ricevuto trattamenti multipli 5. La rilevanza biologica dei risultati di tali modelli semplici in vitro del seno umano è geni discutibili e bersaglio identificati in questi modelli in vitro sono differiscono da geni bersaglio che sono identificati in modelli animali 6. Quando le cellule epiteliali mammarie umane primaria sono coltivati ​​in vitro tendono a perdere l'espressione del recettore ormonale e, quindi, la risposta ormonale 7,8. Questo problema può essere circumventd da approcci 3D sofisticati con matrigel. In questo modo, C. Clarke e colleghi sono riusciti a stabilire cellule epiteliali mammarie che hanno mantenuto l'espressione del recettore ormonale e hanno mostrato una risposta proliferativa di progesterone stimolazione 9. Tuttavia, due importanti in vivo dei recettori del progesterone geni bersaglio, Wnt-4 e RANKL, non sono state indotte dopo stimolazione progesterone in questo sistema 9. Questo approccio è stato recentemente approvato ulteriormente con in vitro 10. Un avvertimento resta che matrigel ha attività che dipendono in batch, è costoso, e richiede un disegno sperimentale che è adatto solo per il numero di cellule piccole.

Sulla base della constatazione che in ER vivo e segnalazione PR sono in gran parte mediata da interazioni paracrine 11, abbiamo sostenuto che le interazioni intercellulari devono essere mantenuti. Un altro fattore importante che si perde come tessuti sono correlate alle cellule singole per la cultura in vitro sono le interazioni delle cellule epiteliali con la matrice extracellulare; ma questi sono cruciali per la differenziazione epiteliale e la loro distruzione è importante nella tumorigenesi 12. Con questo in mente, abbiamo stabilito un metodo per isolare microstrutture del tessuto mammario da fresco materiale chirurgico scarto 13. Il parenchima mammario, costituito da un epitelio doppio strato con luminale interna ed esterna myoepithelicellule al, viene sezionato dal tessuto adiposo e sottoposti alla dissociazione enzimatica e meccanica. Dopo il lavaggio e centrifugazione, frammenti di condotti del latte si ottengono che mantengono una stretta interazione con molte cellule stromali. Queste microstrutture del tessuto rimangono ormone reattivo. Il modello è stato validato in campioni clinici 13. Come tale, il presente procedimento può aiutare a studiare l'azione ormonale nel seno in un contesto biologicamente e clinicamente rilevante.

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Protocol

Considerazioni generali: prima del tempo, istituire un protocollo etico, preparano questionari per i pazienti, e vedere per la formazione del personale clinico. Prima di usare il materiale dalla chirurgia mastoplastica riduttiva, procurarsi le autorizzazioni, e garantire il consenso del paziente. Tissue può essere contagioso e deve essere gestito di conseguenza. Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico di ISREC - Istituto svizzero di ricerca sperimentale sul cancro.

1. Tissue Recupero, lavorazione e Bio-banking

Per garantire la qualità del campione ottimale per la bio-banking, una serie di misure vengono effettuate in ospedale prima del trasporto al laboratorio.

All'ospedale:

  1. Ottenere tessuti mammari umani in condizioni sterili da campioni di chirurgia mastoplastica riduttiva e sangue, se necessario. Tissue ha bisogno di essere esaminato da patologo che campione per escludere la presenza di lesioni maligne.
  2. Posizionare la t senorilasciare sotto il cofano su una tavola sterili e preparare forbici, bisturi chirurgici e pinze che sono già sterilizzati con sterilizzatore a vapore. Fai taglio profondo in diversi siti del tessuto mammario con un bisturi per aprirlo. Nel tessuto mammario umano cercare filamenti bianchi, comprensivi di condotti e lobuli, che sono incorporati nel tessuto adiposo giallo.
    NOTA: Il rapporto tra il parenchimale bianco al tessuto adiposo giallo differisce tra le donne; in genere le donne più giovani hanno più tessuto epiteliale.
  3. Scegli pezzi di materiale bianco e tenerli con una pinza, poi separarli delicatamente dal tessuto adiposo con le forbici. Evitare di prendere i vasi sanguigni.
  4. Sciacquare pezzi di tessuto in PBS (PBS) pH 7,2 per rimuovere il sangue. Trasferire il tessuto di bottiglie di plastica da 250 ml contenenti mezzo F12 (Medium F12 Modified Eagle di Dulbecco) senza rosso con 2% di penicillina / streptomicina fenolo (comprese 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 g / ml di streptomicina) e l'1% di unantibiotica / amfotericina B (comprese le 10.000 unità / ml di penicillina, 10.000 mg / ml di streptomicina, e 25 mg / ml di amfotericina B). Negozio tessuti nel mezzo per il trasporto al laboratorio.
  5. Preparare pezzi di 3 - 5 mm di diametro per l'estrazione di RNA e proteine ​​e flash congelarli in cryovials con il freddo (ghiaccio secco) isopentano. Trasferirli contenitore di ghiaccio secco per il trasporto al laboratorio.
  6. Mettete i pezzi di 3-5 mm nel stampo e coprire con uno strato di Optimal taglio temperatura (OCT) e quindi inserire la muffa sul fondo piatto della scatola piena di isopentano freddo. Dopo aver completato il trasferimento di congelamento dello stampo alla casella ghiaccio secco.
  7. Fissare 5 pezzi di 3 - 5 mm di diametro in paraformaldeide (PFA) 4% e altri 5 pezzi in formaldeide (FA) 4% in PBS a RT analisi istologica seguito. Due diversi fissativi sono raccomandati in alcuni anticorpi funzionano meglio con uno o l'altro dei due.

In laboratorio:

  1. Farecumento tutte le informazioni sulla mastoplastica riduttiva, data di chirurgia e se i campioni sono derivati ​​da sinistra contro mammella destra.
  2. Posizionare i campioni congelati a -80 ° C e trasferire i tessuti fissi in cassette istologici dopo 2 ore di fissazione. Poi metterli sia in PBS o etanolo al 70%, per O / storage N a 4 ° C. Il giorno successivo, il trasferimento le cassette istologici alle strutture istologici per paraffina.

2. Tissue Digestione e stimolazione ormonale

  1. Trasferire le bottiglie contenenti i campioni di tessuto a un armadio flusso laminare in una camera di coltura cellulare P2. Mettere i pezzi di tessuto sul tagliere sterile (29 x 19 cm). Tenere il materiale con una pinza e raschiare il grasso e vasi rimanendo lontano dal parenchima mammario (parte bianca) con il bisturi. Posizionare il materiale bianco in PBS in un piatto di cultura 10 cm.
  2. Dopo aver rimosso il materiale grasso da tutti i pezzi e disporli secondo la regola di sicurezzas del laboratorio, posizionare le parti bianche contenenti i tessuti epiteliali di nuovo sul tagliere. Utilizzando bisturi opposte tagliare il tessuto e tagliarla a pezzi di diametro fino a 2 mm.
  3. Il materiale macinato in provette di dimensioni adeguate: fino a 1, 2,5 e 10 ml in un 5, 15 o 50 ml tubi, rispettivamente. Tipicamente a 5 ml rendimenti tubo di materiale sufficiente per paraffina embedment e ormonali stimoli, e 15 ml produce tubo di materiale sufficiente per fluorescenza cellulare Attivato (FACS). Tubi più grandi sono utilizzati per il congelamento aliquote.
  4. Preparare master mix digestione composto di media (DMEM / F12 senza rosso fenolo) con 1% di penicillina / streptomicina / amfotericina B e collagenasi A (Clostridiopeptidase A da Clostridium histolyticum). Dose collagenasi secondo i tempi di digestione.
    1. Per 12, 24, e 36 h di incubazione, utilizzare concentrazione finale di collagenasi di 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml e 0,5 mg / ml. Aggiungere mix digestione padrone fino a 4 volte ilvolume del materiale digerito per garantire un'adeguata agitazione e aerazione.
      NOTA: A seconda del disegno sperimentale e la durata della stimolazione ormonale, aggiungere ormoni durante o dopo la digestione enzimatica fase e microstruttura recupero.
  5. Aggiungere ormone (s) alla concentrazione desiderata per testare campioni ed il veicolo al controllo. Per la stimolazione con 17-β-estradiolo, e promegestone (R5020) utilizzare una concentrazione finale di 20 nM.
    NOTA: R5020 è un agonista del recettore del progesterone sintetica, che è più stabile del progesterone naturale in mezzo.
    1. Porre le provette del mixer rullo interno un incubatore a 37 ° C e 40 rpm O / N. Prima di mettere i campioni del mixer, li risospendere molto bene per garantire che tutto il materiale distribuisce lungo le provette.
  6. Come digestione richiede almeno 12 ore (O / N), per tempi di stimolazione ormonale inferiori a 12 ore, aggiungere gli ormoni dopo il recupero delle microstrutture (decoda sotto il punto 3). Aggiungere gli ormoni, come si sospendere nuovamente le microstrutture e posizionare la sospensione su piastre di fissaggio ultra-basse. Microstrutture tessuti possono essere conservati su piastre di fissaggio ultra-bassi per un massimo di 7 giorni in mezzo di crescita-libera-factor di conservazione di circa il 70% della redditività.
  7. Per RNA e l'analisi delle proteine, raccogliere microstrutture tessuti per centrifugazione a 400 xg per 5 minuti e flash freeze in provette.

3. Recupero di microstrutture del tessuto

  1. Centrifugare il tubo (s) a 400 xg per 5 min. Aspirare il grasso dalla parte superiore della provetta e trasferire il supernatante del surnatante acquoso rimanente, che si arricchisce in fibroblasti, in un provetta da centrifuga e centrifugare a 1250 xg per 5 min.
    NOTA: le microstrutture del tessuto del seno sono molto appiccicoso, per tutte le fasi successive risospendere il pellet agitando delicatamente il tubo. Pipettaggio non è raccomandato a causa del rischio di perdere materiale. Risospendere il pellet arricchiti in microstrutture ed in fibroblasti derivati ​​da surnatante acquoso in PBS, 2% Fetal Calf Serum (FCS). Successivamente girare entrambi i tubi a 1.250 xg per 5 minuti e poi scarta il surnatante.
  2. Risospendere il pellet in 3 - 5 ml rosso tampone di lisi del sangue cellulare e trasferirli a pulire i tubi. Li Incubare per 5 minuti a RT.
  3. Aggiungere 2x volume di PBS, 2% FCS e centrifugare a 1250 xg per 5 min. Lavare il pellet con PBS, 2% FCS e centrifugare a 1250 xg per 5 min. Ripetere questa operazione due volte.

4. I campioni di Citometria a Flusso

  1. Aggiungere 1 - 2 ml di tripsina 0,25% al ​​pellet e mescolare pipettando su e giù delicatamente per 2 minuti con una Pipetman 1.000 microlitri a dissociarsi cellule.
  2. Inibire l'attività tripsina aggiungendo 9 ml PBS, 2% FCS. Centrifugare a 450 xg per 5 min e risospendere il pellet in 10 ml di PBS, 2% FCS.
  3. Trasferire la sospensione cellulare su un filtro cella 40 micron posto su top di un tubo da centrifuga da 50 ml per preparare singole cellule. Se pochi microlitri di sospensione cellulare rimangono sulla sommità del filtro, aiutare passano attraverso il filtro da essi aspirando dall'altro lato del filtro con una pipetta e aggiungere alle microstrutture filtrati.
  4. Cellule immunitarie separati, fibroblasti e cellule endoteliali di microstrutture con un cocktail di anti-CD45, anti-FAP e anti-CD31 anticorpi e poi ordinare con FACS, sulla base di pan-epiteliale EpCAM marcatore CD10 e di separare le cellule luminali e basali, rispettivamente 10 .

5. I campioni di Istologia

  1. Dopo aver lavato il materiale meccanicamente enzimaticamente digerito come sopra descritto, fissare pellets da 1,5 ml materiale iniziale in 1 ml di 4% PFA in PBS a temperatura ambiente per 30 min.
  2. Centrifugare a 1.250 xg per 5 minuti e lavare con 1-2 ml di PBS due volte.
  3. Centrifugare a 16.000 xg per 10 min. Durante questo tempo, preparare 1% polivalente agarosio in Tris-acetato-EDTA (TAE) tampone e riscaldare la soluzione nel forno a microonde fino a quando la soluzione viene a ebollizione.
    1. Rimuovere la soluzione dal forno a microonde e agitare il matraccio delicatamente per miscelare la soluzione e risospendere le particelle rimanenti agarosio. Soluzione di agarosio Raffreddare a 50 ° C e versare 1 ml in uno stampo di base di paraffina dimensionato 31 × 23 × 13,5 millimetri.
  4. Eliminare il supernatante e posizionare i pellet sopra dello strato solidificato (1 - 3 mm) di agarosio utilizzando una spatola con un'estremità piatta. Tutti Coprire con un ulteriore strato di agarosio (40 ° C).
  5. Dopo le solidifica agarosio, di solito entro 5 minuti, mettere i blocchi agarosio nelle cassette per istologia paraffina incastro. Insieme con i campioni di agarosio posto un ufficio carta bianca nella cassetta con tutte le informazioni sul numero mastoplastica riduttiva, condizione sperimentale, e la data scritta in lettere minuscole a matita; questa scrittura resiste tutte le fasi di trattamento successive.
  6. Mettere le cassette inPBS O / N, o in 70% di etanolo per immagazzinaggio durante il fine settimana, a 4 ° C. Non abbiamo notato alcuna differenza tra le due soluzioni di memorizzazione. Poi il trasferimento cassette istologici alle strutture istologici per paraffina.

6. microstrutture congelamento (Future) la coltura

  1. Risospendere microstrutture del tessuto a congelamento mezzo costituito da FCS con il 10% dimetilsolfossido (DMSO) e congelare 1 ml aliquote in cryovials. Il numero di cryovials ottenuti dipende dalla quantità di materiale primario ottenuto da mastoplastica riduttiva.
  2. Bloccare le cryovials contenenti microstrutture tessuto utilizzando un tasso freezer controllata con il seguente programma: 5 min dimora a 4 ° C, diminuendo la temperatura a -7 ° C con velocità di 6 ° C / min, diminuendo la temperatura a -12 ° C con velocità di 6 ° C / min, 10 min dimora, diminuendo la temperatura a -40 ° C con velocità di 6 ° C / min, diminuzione della temperatura a -80 ° C convelocità di 6 ° C / min. Poi trasferire i cryovials a -80 ° C freezer.
  3. Il giorno dopo, trasferire i cryovials da -80 ° C a serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo.

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Representative Results

Per studiare il ruolo di estrogeni e progesterone e per capire meglio le loro funzioni molecolari nel seno umano, raccogliamo campioni freschi umani del tessuto del seno da pazienti sottoposti mammoplastiche riduzione (Figura 1) dopo aver ottenuto il loro consenso informato. Abbiamo anche ottenere medica e riproduttiva storia del paziente, così come un campione di sangue per determinare i livelli sierici di progesterone al momento dell'intervento. Tissue da mammoplastiche riduzione freschi è meccanicamente ed enzimaticamente dissociato. Le microstrutture tessuti risultanti hanno condotti e lobuli caratteristici del tessuto del seno di origine (Figura 2A). Analisi immunoistochimica di agarosio e microstrutture tessuto incluse in paraffina colorate per il marcatore ΔNp63 mioepiteliale (Figura 2B) rivelano che microstrutture conservano non solo le caratteristiche morfologiche del normale tessuto mammario ma anche il profilo molecolare del celpopolazioni l.

Per valutare la risposta ormonale, microstrutture di tessuto sono stati trattati con progesterone sintetico agonista del recettore promegestone (R5020) o il controllo di etanolo. Per arricchire per il recettore dell'ormone cellule luminali positive citometria a flusso è stata effettuata sulla base di epiteliale (EpCAM) e marcatore mioepiteliale (CALLA; figura 3A) dopo l'esaurimento per endoteliale, fibroblasti e cellule immunitarie con un cocktail di anticorpi anti CD31, anti-FAP e anti- anticorpi CD45. analisi qRT-PCR di EpCAM +, le cellule CD10- presentò regolazione del progesterone gene bersaglio Wnt-4 (figura 3B) nella cella luminale popolazione arricchita dalla R5020 esposto microstrutture del tessuto.

Figura 1
Figura 1. campione di tessuto del seno. Fotografia di riduzione appena sezionato campione mastoplastica. Le frecce indicanodi filamenti bianchi di tessuto che contengono il parenchima mammario, cioè, condotti del latte e unità lobulare duttale terminali. Incorporato entro abbondante tessuto adiposo giallo. Mentre il colore del grasso non è coerente tra pazienti, la percentuale di tessuto adiposo, generalmente la maggior parte del tessuto mammario in termini di volume, varia. Bar Scala:. 5 millimetri Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. microstrutture del tessuto. (A) campo immagine luminosa di microstrutture coltivate su una piastra di attacco basso per 48 ore dopo la dissociazione meccanica e digestione enzimatica. Scala bar: 40 micron (B) Micrografia di una sezione istologica su microstrutture del tessuto incorporato in agarosio e di paraffina dopo 3 giorni in.cultura. La sezione è stata sottoposta a colorazione immunoistochimica per il marcatore ΔNp63 mioepiteliale e di contrasto con ematossilina. Frecce indicano le interne, cellule luminali, frecce indicano le cellule mioepiteliali positive ΔNp63. Scala bar:. 40 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Citometria a flusso di smistamento di separazione e l'analisi di RNA di microstrutture del tessuto. (A) La separazione delle diverse popolazioni di cellule dalla microstruttura del tessuto trattati con R5020 o etanolo mediante citometria a flusso. Microstrutture tessuto sono stati dissociati e immunodepleto per le cellule immunitarie, fibroblasti e cellule endoteliali, con un cocktail di anti-CD45, anti-FAP, e gli anticorpi anti-CD31. Le cellule sono state marcate con Antibomuore contro cellule epiteliali Adhesion Molecule (EpCAM) (clone HEA-125) per arricchire la popolazione cellulare luminale (verde) e Common Leucemia linfoblastica acuta Antigen (CD10 / CALLA) per le cellule mioepiteliali (Clone SS2 / 36). Viene mostrato un dispersione macchia rappresentante. Grafico (B) Bar mostrando relativi Wnt-4 livelli di espressione di mRNA nel sottopopolazione luminale da microstrutture del tessuto (dot nuvola verde, pannello A) indotte con etanolo o R5050 per 24 ore. Relativi livelli di espressione di mRNA del progesterone gene bersaglio, Wnt-4 normalizzati contro livelli di mRNA di ipoxantina-guanina fosforibosil (HPRT). I dati indicati rappresentano la media ± SD di triplica. Isolamento dell'RNA e qRT-PCR sono state eseguite come descritto in precedenza 14. Sequenze Primer: Wnt-4: forward 5 '- GTGGCCTTCTCACAGTCGTT-3' e invertire 5 '- ACCTCACAGGAGCCTGACAC-3', HPRT: avanti 5 <em> '-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3' e retromarcia 5 '- CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3'. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La cultura ex vivo qui descritto fornisce microstrutture del tessuto del seno contenenti dotti e lobuli intatte, insieme ad altri tipi di cellule che normalmente si trovano in seno femminile umano. Nella lavorazione del tessuto mammario umano normalmente ottenuti da mammoplastiche riduzione, rimozione del tessuto adiposo, la digestione enzimatica e meccanica della matrice stromale, e lisi dei globuli rossi arricchisce per frammenti condotto latte e unità lobulare duttali terminali. Digestione enzimatica Gentle alla giusta concentrazione, per la durata giusta è essenziale per garantire che microstrutture del tessuto rimangono intatti, mantenere più tipi di cellule e in gran parte preservare le loro matrici extracellulari. L'attenzione deve essere prestata anche alla lavorazione del tessuto rapidamente una volta rimosso dal paziente. I campioni dei pazienti variano notevolmente e la digestione meccanica ed enzimatica può essere necessario prolungata, e / o enzimi in più deve essere aggiunto quando il tessuto è particolarmente elevata in contenuto di collagene.

Sebbene microstrutture rimangono del 90% valida per un massimo di 6 giorni, il modello ha le limitazioni per stimolazioni ormonali a lungo termine. Come diversi tipi di cellule hanno emivite diverse, la composizione cellulare è destinata a cambiare nel corso del tempo. Mentre le microstrutture tessuti conservano infiltrante cellule immunitarie, questi non sono ricostituiti come il tessuto viene rimosso dalla circolazione del corpo. Inoltre, una solida pipeline con i partner clinici che forniscono i campioni chirurgici è richiesto come un gran numero di campioni devono essere analizzati a causa della variazione inter paziente. Microstrutture del tessuto possono essere congelati per un uso successivo. Tuttavia, fino a che punto di congelamento e scongelamento influenzano la vitalità delle cellule, possibilmente in modo differenziato per diversi tipi di cellule, e come questo possono alterare la risposta ormonale, non è stato caratterizzato. Programmazione di esperimenti può essere difficile in quanto per ogni mammoplasty la quantità di microstrutture tessuto che verrà ottenuto è difficile da prevedere.

ex vivo modello presenta il primo modello per studiare l'azione dell'ormone fisiologica nel seno umano. Mentre sono stati sviluppati sofisticati sistemi di coltura 3D per cellule epiteliali mammarie primaria, questo sistema ex vivo preserva l'architettura del tessuto e la sua complessità cellulare per diversi giorni. Come risultato, non solo la risposta nelle cellule bersaglio positive recettore ormone può essere analizzato ma gli eventi a valle di segnalazione paracrina in altri tipi cellulari diventa suscettibile di studiare. Le microstrutture sono mantenute in terreno privo di fattore di crescita per tutta la durata degli esperimenti. Quindi, non vi è nessuna attivazione estrinseca confusione di cascate di segnalazione. Come tale, le microstrutture del tessuto mammario offrono la possibilità di affrontare le questioni in un ambiente che rispecchia più da vicino la complessità biologiche del seno umano.

Il sistema ex vivo può essere utilizzato per valutare la risposta del brest di ormoni naturali e sintetici. Questo è molto importante alla luce di una crescente incidenza di cancro al seno. Inoltre, i farmaci, piccole molecole, peptidi, fattori di crescita e citochine possono essere applicati e dei loro effetti sulla proliferazione cellulare, apoptosi e la segnalazione essere studiati.

La descrizione dettagliata presente intende facilitare l'utilizzo di questo metodo con altri ricercatori e per ridurre al minimo la variazione interlaboratorio. Dato che questo approccio si basa su campioni di pazienti, è della massima importanza che un metodo standardizzato viene utilizzato in modo che i risultati possano iniziare a essere confrontati tra i diversi laboratori 15 e un migliore apprezzamento di tra la variabilità del paziente diventa possibile. Gli autori apprezzano il feedback e saranno felici di integrare miglioramenti in versioni rivedute di questo protocollo. Il lavoro con i campioni umani è molto impegnativo e gli autori sperano di stimolare la ricerca traslazionale con più campioni biologici interessanti.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano M. Fiche di Ospedale universitario di Losanna per fornire la fotografia mastoplastica, M. Wirth e A. Ayyanan dell'Istituto svizzero per la ricerca sperimentale sul cancro, Centro Nazionale di Competenza nella Ricerca Oncologia Molecolare, Facoltà di Scienze della Vita, Ecole Polytechnique Fédérale de Losanna per l'assistenza tecnica e R. Clarke dell'Università di Manchester per i commenti critici. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto il sostegno di SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, e l'iniziativa sui medicinali innovativi impresa comune nell'ambito dell'accordo di concessione n. 115.188, le risorse di cui si compone del contributo finanziario dal Settimo Programma Quadro dell'Unione Europea (FP7 / 2007-2013) e la Federazione europea delle industrie e associazioni farmaceutiche aziende in contributi in natura. L'indirizzo web di medicinali innovativi è http://www.imi.europa.eu/ . </ P>

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microlitre Centrifuge Heraeus Biofuge Fresco 75005521
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810 000.327
Cryobox Nalgene   5100-0001
Controlled Rate Freezer EF600 Grant Asymptote  EF600
CO2 incubator Hera Cell Heraeus 51022391
Roller Mixer SRT9D Sturt SRT9D
Histology Cassettes Medizintechnik 81-0021-00
Cell Strainer Falcon 352340
Strile Surgical Blade  Aesculap BB536 
Scalpel Aesculap BB084R
Forceps Aesculap BD047R
Scissors Aesculap BC374R
Paraffin base mold SAKURA 4166
Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix Thermoscientific 6769006
Penicillin/Streptomycin  Life Technologies 15070-063
Antibiotic/Antimycotic Life Technologies 15240-062
DMEM F/12 Life Technologies 11039-021 Prewarm (37 °C)
Collagenase Roche 11 088 793 001 Prewarm (37 °C)
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10270 Can be replaced with Fetal Calf Serum
Cell Blood Lysis Buffer Sigma R7757
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Agarose Invitrogen 16500-500
Formaldehyde Sigma F1635
Paraformaldehyde Roth 335
Isopentane Sigma M32631
Ethanol Merck 1009831000
Cryogenic vials (5.0 ml) VWR, International 479-0820
Ultra low attachment culture dish Corning, NY 14831 3471

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Medicina segnalazione ormonale il cancro al seno mastoplastica riduttiva microstrutture del tessuto del seno, estrogeni progesterone cellule epiteliali mammarie la digestione dei tessuti di segnalazione paracrina microambiente architettura del tessuto

Erratum

Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 02/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:

Marie Shamseddin

instead of:

Marie Shamsheddin

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello per studiare Hormone azione in seno umano
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Sflomos, G., Shamseddin, M.,… More

Sflomos, G., Shamseddin, M., Brisken, C. An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. J. Vis. Exp. (95), e52436, doi:10.3791/52436 (2015).

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