Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Een Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52436
Automatic Translation
1, 1, 1
1Swiss Institute for Experimental Cancer Research, School of Life Sciences, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne

ERRATUM NOTICE

Summary

We hebben een nieuwe ex vivo model om de werking van hormonen in de menselijke borst bestuderen ontwikkeld. Het is gebaseerd op microstructuren weefsel geïsoleerd uit chirurgische borstweefsel monsters die weefselarchitectuur, intercellulaire interacties en paracrienen behouden.

Abstract

De studie van het hormoon actie in de menselijke borst is belemmerd door een gebrek aan adequate modelsystemen. Bij in vitro cultuur, primaire mamma-epitheliale cellen hebben de neiging om hormoon-receptor expressie te verliezen. Veel gebruikte hormoon-receptor positieve borstkanker cellijnen van beperkte relevantie voor de in vivo situatie. We beschrijven hier een ex vivo model om de werking van hormonen in de menselijke borst te bestuderen. Verse menselijke specimens borstweefsel van chirurgische discard materiaal zoals vermindering mammoplasties of mammectomies worden mechanisch en enzymatisch verteerd om weefsel fragmenten die leidingen en melkklieren en meerdere stromale celtypen te verkrijgen. Deze weefsel microstructuren in basaal medium bewaard zonder groeifactoren behouden hun intercellulaire contacten, het weefsel architectuur, en blijven hormoon responsieve voor meerdere dagen. Ze worden gemakkelijk verwerkt voor RNA en eiwit-extractie, histologische analyse of opgeslagen in invriesmedium. Fluorescentiegeactiveerde celsortering (FACS) kan worden gebruikt om te verrijken voor specifieke celpopulaties. Dit protocol voorziet in een eenvoudige, standaard aanpak voor translationeel onderzoek met zeer complexe, gevarieerde menselijke specimens.

Introduction

Informatie over de mutatie-landschap bij borstkanker is steeds meer in snel tempo. Minder aandacht is besteed aan systemische factoren die de ontwikkeling van borstkanker beïnvloeden. Blootstelling aan reproductieve hormonen heeft een grote invloed op het ziekteverloop 1-3. Toch zijn de mechanismen die de reproductieve hormonen van invloed zijn op de menselijke borst slecht begrepen. Werken met genetisch gemanipuleerde muis modellen is gebleken dat er sprake is cel intrinsieke en paracrienen via verschillende downstream effectoren 4.

De beperkte kennis hormoonwerking in de menselijke borst is grotendeels toe te schrijven aan een gebrek aan geschikte modellen. De meeste werken op de mechanismen van oestrogeenreceptor (ER) en progesteron receptor (PR) signalering uitgevoerd met hormoonreceptorpositieve borstkanker cellijnen, zoals MCF-7 en T47D. Deze waren afkomstig van pleuravocht van patiënten met gevorderde borstkanker bij wie alrea gehaddy ontving meerdere behandelingen 5. De biologische relevantie van de bevindingen in zulke eenvoudige in vitro modellen van de menselijke borst twijfelachtig en doelgenen die in deze in vitro modellen verschillen van doelgenen die zijn geïdentificeerd in diermodellen 6. Als primaire menselijke borst epitheliale cellen worden gekweekt in vitro ze de neiging om hormoon-receptor expressie en dus hormoon respons 7,8 verliezen. Dit probleem kan worden circumventd door geavanceerde 3D-aanpak met behulp van matrigel. Zo C. Clarke en collega's in geslaagd borst epitheelcellen die hormoonreceptor expressie onderhouden en vertoonden een proliferatieve reactie op progesteron stimulatie 9. Maar twee belangrijke in vivo progesteronreceptor doelwitgenen, Wnt-4 en RANKL, werden niet geïnduceerd na progesteron stimulatie in dit systeem 9. Deze aanpak werd onlangs genomen over verdere met in vitro 10. Een nadeel blijft dat matrigel heeft activiteiten die batch-afhankelijke, is duur, en eist een experimenteel ontwerp dat geschikt is voor slechts kleine cel aantallen.

Op basis van de bevinding dat in vivo ER en PR signalering worden grotendeels veroorzaakt door paracrine interacties 11, we betoogd dat intercellulaire interacties moeten worden gehandhaafd. Een andere belangrijke factor die verloren weefsels gedissocieerd tot afzonderlijke cellen in vitro cultuur zijn de interacties van de epitheelcellen van de extracellulaire matrix; maar deze zijn van cruciaal belang voor epitheliale differentiatie en hun verstoring is belangrijk bij het ​​ontstaan ​​van tumoren 12. Met dit in het achterhoofd, hebben we een methode om borstweefsel microstructuren te isoleren van verse chirurgische discard materiaal 13. De borst parenchym, bestaande uit twee lagen epitheel met inwendige luminale en uitwendige myoepithelial cellen, wordt verwijderd ontleed uit vetweefsel en onderworpen aan mechanische en enzymatische dissociatie. Na wassen en centrifugeren, worden fragmenten van melkkanalen verkregen die nauwe interactie met vele stromale cellen behouden. Deze weefsel microstructuren blijven hormoon reageren. Het model werd gevalideerd in klinische monsters 13. Als zodanig kan de onderhavige procedure helpen hormoonwerking in de borst bestuderen een biologisch en klinisch relevante context.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Algemene beschouwingen: Vooruitlopend op tijd, het opzetten van een ethische protocol, bereiden vragenlijsten voor patiënten, en zie aan de opleiding van de klinische personeel. Voor het gebruik van materiaal uit vermindering mammoplasty chirurgie, schaffen vergunningen, en zorgen voor toestemming van de patiënt. Weefsel kan besmettelijk zijn en dienovereenkomstig moet worden behandeld. Dit protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van ISREC - Zwitserse Instituut voor Experimenteel Kankeronderzoek.

1. Tissue Recovery, Verwerking en Bio-banking

Om een ​​optimale kwaliteit van het monster voor bio-banking te garanderen, zijn een aantal stappen uitgevoerd in het ziekenhuis voorafgaand aan het vervoer naar het laboratorium.

In het ziekenhuis:

  1. Verkrijgen menselijke borst weefsel onder steriele condities van reductie mammoplasty chirurgie en bloedmonsters, indien nodig. Weefsel moet door patholoog die zullen genieten van de aanwezigheid van kwaadaardige laesies uitgesloten te worden onderzocht.
  2. Plaats de borst tuitgifte van onder de motorkap op een steriele boord en een schaar, chirurgische scalpel en pincet die reeds gesteriliseerd met stoom sterilisator te bereiden. Maak diepe snee op verschillende plaatsen van het borstweefsel met behulp van een scalpel om het te openen. In menselijk borstweefsel kijken voor witte strengen bestaande uit leidingen en melkklieren, die zijn ingebed in het geel vetweefsel.
    OPMERKING: De verhouding van de witte parenchymale de gele vetweefsel verschilt bij vrouwen; meestal jongere vrouwen hebben meer epitheelweefsel.
  3. Pick stukjes wit materiaal en houd ze met een pincet, dan scheiden ze voorzichtig uit het vetweefsel met een schaar. Vermijd het nemen van de bloedvaten.
  4. Spoel stukjes weefsel in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,2 tot bloed te verwijderen. Breng het weefsel 250 ml plastic flessen met F12-medium (Medium F12 Dulbecco's gemodificeerd Eagle's) zonder fenol rood met 2% penicilline / streptomycine (inclusief 5.000 eenheden / ml penicilline en 5.000 g / ml streptomycine) en 1% eentibiotic / amfotericine B (waaronder 10.000 eenheden / ml penicilline, 10.000 ug / ml streptomycine en 25 ug / ml amfotericine B). Store weefsels in het medium voor transport naar het laboratorium.
  5. Bereid stukken van 3-5 mm diameter voor RNA en eiwit-extractie en flash-vries ze in cryovials met koud (droogijs) isopentaan. Overbrengen naar droog ijs doos voor transport naar het laboratorium.
  6. Zet stukken van 3-5 mm in de mal en bedek het met een laagje Optimal Cutting Temperatuur (oktober) en plaats dan de schimmel op de vlakke bodem van de doos gevuld met koude isopentaan. Na volledige bevriezing dragen de mal het droogijs box.
  7. Fix 5 stukken van 3-5 mm diameter paraformaldehyde (PFA) 4% en een 5 stuks formaldehyde (FA) 4% in PBS bij kamertemperatuur histologische analyse later. Twee verschillende fixeermiddelen worden aanbevolen als sommige antilichamen beter met één of de andere van de twee werkt.

In het laboratorium:

  1. Doencument alle informatie over de vermindering mammoplasty, na chirurgie en of de monsters zijn afkomstig van links versus rechter borst.
  2. Plaats de bevroren monsters bij -80 ° C en breng de gefixeerde weefsels in histologie cassettes na 2 uur van fixatie. Dan zet ze ofwel PBS of 70% ethanol voor O / N opslag bij 4 ° C. Op de volgende dag, de overdracht van de histologie cassettes te histologie faciliteiten voor inbedden in paraffine.

2. Tissue Spijsvertering en hormoonstimulatie

  1. Breng de flessen met de weefselmonsters van een laminaire stroming kabinet in een P2 celcultuur kamer. Plaats weefsel stukken op steriele snijplank (29 x 19 cm). Houd het materiaal met een pincet en schraap het achtergebleven vet en schepen uit de buurt van de borst parenchym (witte gedeelte) met een scalpel. Leg het witte materiaal in PBS in een 10 cm cultuur schotel.
  2. Na het verwijderen van de vette materiaal van alle stukken en weggooien ze volgens de veiligheidsvoorschriften regels van het laboratorium, plaats de witte delen met de epitheliale weefsels terug op de snijplank. Met tegengestelde scalpels snijden het weefsel en hak het in stukken tot 2 mm diameter.
  3. Plaats het gehakt materiaal in buizen van voldoende grootte: tot 1, 2,5 en 10 ml in een 5, 15 of 50 ml buizen, respectievelijk. Typisch een 5 ml buisje opbrengsten genoeg materiaal voor paraffine inbedding en hormonale stimulatie, en een buis van 15 ml levert genoeg materiaal voor Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS). Grotere buizen worden gebruikt voor het invriezen van monsters.
  4. Bereid spijsvertering master mix bestaande uit (DMEM / F12 zonder fenol rood) met 1% penicilline / streptomycine / amfotericine B en collagenase A (Clostridiopeptidase A van Clostridium histolyticum). Dosis collagenase volgens de spijsvertering tijden.
    1. Bij 12, 24 en 36 uur incubatie gebruik eindconcentratie van collagenase van 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml en 0,5 mg / ml. Voeg spijsvertering master mix tot 4 keer van devolume van het gedigereerde materiaal voldoende roeren en beluchting te verzekeren.
      OPMERKING: Afhankelijk van de proefopzet en de duur van hormonale stimulatie, hormonen toe te voegen tijdens of na de enzymatische vertering stap en microstructuur herstel.
  5. Hormoon (s) toe te voegen op de gewenste concentratie van monsters en het voertuig aan de controle te testen. Bij stimulatie met 17 β-oestradiol en promegeston (R5020) gebruiken een eindconcentratie van 20 nM.
    OPMERKING: R5020 is een synthetisch progesteron receptor agonist, die stabieler dan natuurlijk progesteron in medium.
    1. Plaats de buisjes op de roller mixer in een incubator bij 37 ° C en 40 rpm O / N. Voordat de monsters aan de mixer, resuspendeer ze goed zodat alle materiaal verdeelt langs de centrifugebuizen.
  6. Zoals digestie duurt minimaal 12 uur (O / N) voor hormonale stimulering van minder dan 12 uur, voeg de hormonen na herstel van de microstructuren (detailed onder stap 3). Voeg de hormonen zoals u resuspendeer de microstructuren en plaats de schorsing op ultra-lage bevestigingsplaten. Weefsel microstructuren kunnen op ultra-lage bevestigingsplaten tot 7 dagen groei-factor vrij medium behoud ongeveer 70% houdbaarheid ervan.
  7. Voor RNA en eiwitanalyse, verzamel weefsel microstructuren door centrifugatie bij 400 xg gedurende 5 minuten en flash bevriezing centrifugebuizen.

3. Herstel van Tissue Microstructuren

  1. Centrifugeer het buisje (s) bij 400 xg gedurende 5 minuten. Zuig het vet van de bovenkant van de centrifugebuis en breng het supernatans van de resterende waterige supernatant, dat is verrijkt in fibroblasten, een nieuwe centrifugebuis en centrifugeer bij 1250 xg gedurende 5 minuten.
    Opmerking: Als het borstweefsel microstructuren zeer kleverig, voor alle volgende stappen resuspendeer de pellet door voorzichtig schudden van de buis. Pipetteren wordt niet aanbevolen vanwege het risico van verlies van materiaal. Resuspendeer de pellets verrijkt microstructuren en in fibroblasten afgeleid van waterige supernatant in PBS, 2% foetaal kalfsserum (FCS). Vervolgens draaien beide buizen bij 1250 xg gedurende 5 minuten en dan gooi de bovenstaande vloeistoffen.
  2. Resuspendeer de pellets in 3-5 ml rode cel bloed lysebuffer en overbrengen naar buizen schoon te maken. Incubeer ze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Voeg 2x volume van PBS, 2% FCS en centrifugeer ze bij 1250 xg gedurende 5 minuten. Was de pellets met PBS, 2% FCS en centrifugeer bij 1250 xg gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap twee keer.

4. Monsters voor flowcytometrie

  1. Voeg 1-2 ml trypsine 0,25% de pellet en meng door en neer te pipetteren zachtjes gedurende 2 min met 1000 pi Pipetman cellen dissociëren.
  2. Inhibit trypsine activiteit door toevoegen 9 ml PBS, 2% FCS. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellet in 10 ml PBS, 2% FCS.
  3. Breng de celsuspensie op een 40 um cel zeef geplaatst top een 50 ml centrifugebuis om enkele cellen te bereiden. Als een paar microliter celsuspensie blijft boven op de filter, helpt hen door het filter door te aspireren van de andere zijde van zeef met een pipet en deze toevoegen aan de gefilterde microstructuren.
  4. Afzonderlijke immuuncellen, fibroblasten en endotheliale cellen van microstructuren met een cocktail van anti-CD45, anti-FAP en anti-CD31 antilichamen en vervolgens sorteren met FACS op basis van pan-epitheliale marker EpCAM en CD10 tot luminale en basale cellen respectievelijk 10 scheiden .

5. Monsters voor Histologie

  1. Na wassen van de mechanisch en enzymatisch gedigereerd materiaal zoals hierboven beschreven, vast pellets van 1.5 ml uitgangsmateriaal in 1 ml van 4% PFA in PBS bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
  2. Centrifuge bij 1250 xg gedurende 5 minuten en was met 1-2 ml PBS twee keer.
  3. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min. Gedurende deze tijd bereiden 1% polyvalente agarose in tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer en verwarm de oplossing in de magnetron tot de oplossing op kookpunt komt.
    1. Verwijder de oplossing uit de oven en schud de kolf zachtjes om de oplossing te mengen en resuspendeer de resterende agarose deeltjes. Koel agarose oplossing tot 50 ° C en giet 1 ml in paraffine basisvorm afmetingen 31 x 23 x 13,5 mm.
  4. Verwijder het supernatant en plaats de pellets bovenop de gestolde laag (1-3 mm) van agarose met een spatel met een plat uiteinde. Bedek ze allemaal met een extra laag agarose (40 ° C).
  5. Na de agarose stolt, meestal binnen 5 minuten, zet de agarose blokken in de histologie cassettes voor paraffine inbedding. Samen met de agarose monsters plaatst een witte kantoor papier in de cassette met alle informatie over de vermindering mammoplasty nummer, experimentele conditie, en datum geschreven in kleine letters met potlood; dit schrijven is bestand tegen alle daaropvolgende behandeling stappen.
  6. Plaats de cassettes inPBS O / N, of in 70% ethanol voor opslag in het weekend, bij 4 ° C. We hebben nog niet opgevallen geen verschil tussen de twee storage-oplossingen. Vervolgens transfer histologie cassettes te histologie faciliteiten voor inbedden in paraffine.

6. Freezing Microstructuren (Future kweken)

  1. Resuspendeer weefsel microstructuren in invriesmedium bestaande uit FCS met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en vries 1 ml porties in cryovials. Het aantal verkregen cryovials hangt af van de hoeveelheid primaire materiaal verkregen uit vermindering mammoplasty.
  2. Bevries de cryoflesjes die weefsel microstructuren met een geregelde snelheid vriezer met het volgende programma: 5 min woning bij 4 ° C, daalt de temperatuur tot -7 ° C met een snelheid van 6 ° C / min, verlagen van de temperatuur tot -12 ° C van 6 ° C / min, 10 min woning, verlagen van de temperatuur tot -40 ° C met een snelheid van 6 ° C / min, verlagen van de temperatuur tot -80 ° Ctarief van 6 ° C / min. Daarna brengt de cryovials tot -80 ° C vriezer.
  3. De volgende dag, breng de cryovials van -80 ° C vloeibare stikstof tank voor langdurige opslag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de rol van oestrogenen en progesteron te bestuderen en om hun moleculaire functies in het menselijk borst beter te begrijpen, verzamelen wij verse menselijke specimens borstweefsel van patiënten die een vermindering mammoplasties (figuur 1) na het behalen van hun geïnformeerde toestemming. We krijgen ook medische en reproductieve voorgeschiedenis van de patiënt, evenals een bloedmonster serum progesteron bij de operatie bepalen. Weefsel van verse vermindering mammoplasties is mechanisch en enzymatisch gedissocieerd. Het resulterende weefsel microstructuren hebben leidingen en lobben kenmerkend het borstweefsel van oorsprong (Figuur 2A). Immunohistochemische analyse van agarose en in paraffine ingebed weefsel microstructuren gekleurd voor de myoepitheliale marker ΔNp63 (figuur 2B) blijkt dat microstructuur behouden niet alleen de morfologische kenmerken van de normaal borstweefsel ook het moleculaire profiel van de CELl populaties.

Om het hormoon reactie te evalueren, werden weefsel microstructuren behandeld hetzij met synthetische progesteron receptor agonist promegeston (R5020) of ethanol controle. Om te verrijken voor de hormoonreceptor positieve luminale cellen stromingscytometrie werd uitgevoerd op basis van epitheliale (EpCAM) en myo merker (CALLA; figuur 3A) na uitputting endotheel, fibroblasten en immuuncellen met een cocktail van anti CD31, anti-FAP en anti- CD45 antilichamen. qRT-PCR analyse van EpCAM +, CD10 cellen kwamen regulatie van de progesteron doelgen Wnt-4 (figuur 3B) in de luminale cel verrijkte populatie van de R5020 blootgestelde weefsel microstructuren.

Figuur 1
Figuur 1. Borst weefselmonster. Foto van vers ontleed vermindering mammoplasty monster. Pijlen wijzennaar wit weefsel strengen die de borst parenchym bevatten, dat wil zeggen, melkkanalen en terminal ductaal lobulair eenheden. Ingebed in overvloedige geel vetweefsel. Terwijl de kleur van het vet maakt consistent tussen patiënten, het aandeel vetweefsel, in het algemeen het grootste deel van het borstweefsel in volume varieert. Schaalbalk:. 5 mm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Tissue microstructuren. Heldere veld afbeelding van microstructuren (A) gekweekt op een lage bevestigingsplaat voor 48 uur na mechanische dissociatie en enzymatische afbraak. Schaalbalk: 40 micrometer (B) Deze coupe van een histologische sectie over weefsel microstructuren ingebed in agarose en paraffine na 3 dagen in.cultuur. De sectie werd onderworpen aan immunohistochemische kleuring voor het myo marker ΔNp63 en met hematoxyline. Pijlpunten wijzen op de innerlijke, luminale cellen, pijlen wijzen naar ΔNp63 positieve myo-epitheelcellen. Schaalbalk:. 40 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Flowcytometrie sorteren scheiding en RNA analyse van weefsel microstructuren. (A) Scheiding van de verschillende celpopulaties uit weefsel microstructuur behandeld met R5020 of ethanol door flowcytometrie. Weefsel microstructuren werden gedissocieerd en immunologisch voor immuuncellen, fibroblasten en endotheelcellen met een cocktail van anti-CD45, anti-FAP en anti-CD31 antilichamen. Cellen werden gelabeld met Antibosterft tegen epitheelcellen adhesiemolecuul (EpCAM) (kloon HEA-125) te verrijken voor de luminale celpopulatie (groen) en gemeenschappelijk acute lymfatische leukemie Antigen (CD10 / CALLA) voor myo-cellen (kloon SS2 / 36). Een vertegenwoordiger scatter vlek wordt getoond. (B) Bar grafiek van relatieve Wnt-4 mRNA expressie niveaus in de luminale subpopulatie van weefsel microstructuren (groene stip wolk, paneel A) geïnduceerd met ethanol of R5050 voor 24 uur. Relatieve mRNA expressie van de progesteron doelwitgen, Wnt-4 genormaliseerd tegen mRNA niveaus van hypoxanthine-guanine fosforibosyltransferase (HPRT). De getoonde gegevens stellen het gemiddelde ± SD van drie herhalingen. RNA isolatie en qRT-PCR werd uitgevoerd zoals eerder 14 beschreven. Primer sequenties: Wnt-4: vooruit 5 '- GTGGCCTTCTCACAGTCGTT-3' en reverse 5 '- ACCTCACAGGAGCCTGACAC-3', HPRT: vooruit 5 <em> '-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3' en reverse 5 '- CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3'. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De ex vivo kweken hier beschreven is borstweefsel microstructuren die intact leidingen en melkklieren, samen met andere celtypen die normaal in het menselijke vrouwelijke borst. Bij de verwerking van de menselijke borst weefsel gewoonlijk verkregen door reductie mammoplasties, verwijdering van vetweefsel, mechanische en enzymatische digestie van de stromale matrix en lysis van rode bloedcellen verrijkt melk duct fragmenten en terminale ductale lobulaire eenheden. Gentle enzymatische digestie op de juiste concentratie, voor de juiste duur is essentieel om ervoor te zorgen dat het weefsel microstructuren intact blijven, behouden meerdere celtypen en grotendeels behouden hun extracellulaire matrices. Ook moet aandacht worden besteed aan de verwerking van het weefsel snel nadat het is verwijderd van de patiënt. Patiëntmonsters varieert aanzienlijk en mechanische en enzymatische digestie moet worden verlengd en / of extra enzym moet worden toegevoegd wanneer het weefsel is bijzonder hoog in collageengehalte.

Hoewel microstructuren blijft 90% levensvatbaar tot 6 dagen, heeft het model beperkingen voor langdurige hormonale stimulaties. Zoals verschillende celtypen hebben verschillende halfwaardetijden, de cellulaire samenstelling is waarschijnlijk veranderen in de tijd. Terwijl het weefsel microstructuur behouden infiltrerende immuuncellen, deze niet bijgevuld wanneer het weefsel verwijderd uit de circulatie van het lichaam. Verder is een vaste leiding met de klinische welke instaan ​​voor de chirurgische monsters verlangde grote aantallen monsters moeten worden geanalyseerd door inter variatie patiënt. Weefsel microstructuren kan worden ingevroren voor later gebruik. Echter, in hoeverre invriezen en ontdooien invloed cellevensvatbaarheid, eventueel verschillend voor verschillende celtypen, en hoe dit hormoon respons kunnen veranderen, is niet gekarakteriseerd. Planning experimenten kan moeilijk zijn als voor mammoplasty de hoeveelheid weefsel microstructuren die wordt verkregen moeilijk te anticiperen.

ex vivo model presenteert het eerste model om fysiologische hormoon actie in de menselijke borst te bestuderen. Terwijl hoogwaardige 3D kweeksystemen voor primaire borst epitheelcellen ontwikkeld, dit ex vivo systeem behoudt de weefselarchitectuur en de cellulaire complexiteit over meerdere dagen. Hierdoor kan niet alleen de respons in de hormoonreceptor positieve doelcellen geanalyseerd maar de gebeurtenissen stroomafwaarts van paracrienen in andere celtypes worden vatbaar te bestuderen. De microstructuren worden gehouden door groeifactor vrij medium gedurende de duur van de experimenten. Er is dus geen storende extrinsieke activatie van signaaltransductiecascades. Als zodanig, de borstweefsel microstructuren bieden de mogelijkheid om vragen in een omgeving die beter weerspiegelt de biologische complexiteit van de menselijke borst pakken.

Het ex vivo kan worden gebruikt om de reactie van het br beoordelenoost naar natuurlijke en synthetische hormonen. Dit is zeer belangrijk in het licht van een toenemende incidentie van borstkanker. Bovendien kunnen geneesmiddelen, kleine moleculen, peptiden, groeifactoren en cytokinen worden toegepast en hun effecten op celproliferatie, apoptose en signalering bestudeerd.

De onderhavige gedetailleerde beschrijving is bedoeld om de toepassing van deze methode door andere onderzoekers en te helpen minimaliseren tussen laboratoria variatie. Aangezien deze benadering berust op patiëntenmonsters, is van groot belang dat een gestandaardiseerde methode wordt toegepast zodat de resultaten kunnen beginnen te vergelijken tussen verschillende laboratoria 15 en een betere waardering van variabiliteit tussen patiënten mogelijk. De auteurs waarderen feedback en zullen gelukkig zijn om verbeteringen in de herziene versies van dit protocol te integreren. Het werk met de menselijke monsters is zeer uitdagend en de auteurs hopen meer translationeel onderzoek met interessante biologische monsters te stimuleren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs danken M. Fiche van het Universitair Ziekenhuis van Lausanne voor het verstrekken van de mammoplasty foto, M. Wirth en A. Ayyanan van Zwitserse Instituut voor Experimenteel Kankeronderzoek, National Center of Competence in Research Moleculaire Oncologie, School of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne voor technische bijstand en R. Clarke van de Universiteit van Manchester voor kritische opmerkingen. Het onderzoek leidde tot deze resultaten heeft de steun van SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, en het Innovative Medicines Initiative gemeenschappelijke onderneming onder subsidieovereenkomst kreeg geen. 115.188, middelen van die zijn samengesteld uit financiële bijdrage van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (FP7 / 2007-2013) en de European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations bedrijven 'in natura bijdrage. Het webadres van Innovative Medicines Initiative is http://www.imi.europa.eu/ . </ P>

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microlitre Centrifuge Heraeus Biofuge Fresco 75005521
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810 000.327
Cryobox Nalgene   5100-0001
Controlled Rate Freezer EF600 Grant Asymptote  EF600
CO2 incubator Hera Cell Heraeus 51022391
Roller Mixer SRT9D Sturt SRT9D
Histology Cassettes Medizintechnik 81-0021-00
Cell Strainer Falcon 352340
Strile Surgical Blade  Aesculap BB536 
Scalpel Aesculap BB084R
Forceps Aesculap BD047R
Scissors Aesculap BC374R
Paraffin base mold SAKURA 4166
Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix Thermoscientific 6769006
Penicillin/Streptomycin  Life Technologies 15070-063
Antibiotic/Antimycotic Life Technologies 15240-062
DMEM F/12 Life Technologies 11039-021 Prewarm (37 °C)
Collagenase Roche 11 088 793 001 Prewarm (37 °C)
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10270 Can be replaced with Fetal Calf Serum
Cell Blood Lysis Buffer Sigma R7757
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Agarose Invitrogen 16500-500
Formaldehyde Sigma F1635
Paraformaldehyde Roth 335
Isopentane Sigma M32631
Ethanol Merck 1009831000
Cryogenic vials (5.0 ml) VWR, International 479-0820
Ultra low attachment culture dish Corning, NY 14831 3471

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
  2. MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
  3. Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. 'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
  4. Brisken, C., O'Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
  5. Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
  6. Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
  7. Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
  8. Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
  9. Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
  10. Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
  11. Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
  12. Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
  13. Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
  14. Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
  15. Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).

Tags

Geneeskunde Hormoon signalering borstkanker vermindering mammoplasty borstweefsel microstructuren, oestrogeen progesteron mamma-epitheliale cellen weefsels spijsvertering paracrienen micro-omgeving weefselarchitectuur

Erratum

Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 02/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:

Marie Shamseddin

instead of:

Marie Shamsheddin

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model naar Hormoon Actie studie in de menselijke borst
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sflomos, G., Shamseddin, M.,… More

Sflomos, G., Shamseddin, M., Brisken, C. An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. J. Vis. Exp. (95), e52436, doi:10.3791/52436 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter