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Medicine

एक Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52436
Automatic Translation
1, 1, 1
1Swiss Institute for Experimental Cancer Research, School of Life Sciences, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne

ERRATUM NOTICE

Summary

हम मानव स्तन में हार्मोन कार्रवाई का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास पूर्व vivo मॉडल विकसित किया है। यह ऊतक वास्तुकला, कहनेवाला बातचीत, और पैराक्राइन सिगनल की रक्षा जो शल्य स्तन के ऊतकों के नमूनों से पृथक ऊतक microstructures पर आधारित है।

Abstract

मानव स्तन में हार्मोन कार्रवाई के अध्ययन के लिए पर्याप्त मॉडल प्रणाली की कमी के द्वारा बाधा उत्पन्न की गई है। इन विट्रो संस्कृति पर, प्राथमिक स्तन उपकला कोशिकाओं हार्मोन रिसेप्टर अभिव्यक्ति खो देते हैं। व्यापक रूप से इस्तेमाल हार्मोन रिसेप्टर पॉजिटिव स्तन कैंसर कोशिका लाइनों में विवो स्थिति के लिए सीमित प्रासंगिकता के हैं। यहाँ, हम मानव स्तन में हार्मोन कार्रवाई का अध्ययन करने के लिए एक पूर्व vivo मॉडल का वर्णन है। ऐसे कमी mammoplasties या mammectomies रूप में शल्य चिकित्सा त्यागें सामग्री से ताजा मानव स्तन के ऊतकों के नमूनों यंत्रवत् और enzymatically नलिकाएं और lobules और कई stromal सेल प्रकार युक्त ऊतक टुकड़े प्राप्त करने के लिए पचा रहे हैं। वृद्धि कारकों के बिना बेसल मध्यम में रखा ये ऊतक microstructures उनके कहनेवाला संपर्क, ऊतक वास्तुकला की रक्षा, और कई दिनों के लिए उत्तरदायी हार्मोन रहते हैं। वे आसानी से आरएनए और प्रोटीन निष्कर्षण, ऊतकीय विश्लेषण के लिए संसाधित या मध्यम ठंड में जमा हो जाती है। रोशनीसक्रिय सेल छँटाई (FACS) विशेष सेल आबादी के लिए समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल अत्यधिक जटिल, विविध मानव नमूनों के साथ translational अध्ययन के लिए एक सरल, मानक दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Introduction

स्तन कैंसर में उत्परिवर्तनीय परिदृश्य के बारे में सूचना तीव्र गति से बढ़ रही है। कम ध्यान स्तन कैंसर के विकास को प्रभावित है कि प्रणालीगत कारकों के लिए भुगतान किया गया है। प्रजनन हार्मोन के संपर्क में रोग प्रगति 1-3 पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है। फिर भी, प्रजनन हार्मोन मानव स्तन पर टकराना तंत्र है जिसके द्वारा खराब समझ रहे हैं। अनुवांशिक इंजीनियर माउस मॉडल के साथ काम है कि वे कई बहाव के प्रभावोत्पादक 4 सेल के माध्यम से आंतरिक और पैराक्राइन संकेतन शामिल है कि पता चला है।

मानव स्तन में हार्मोन कार्रवाई के बारे में सीमित ज्ञान पर्याप्त मॉडल की कमी काफी हद तक कारण है। एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर) और प्रोजेस्ट्रोन रिसेप्टर (पीआर) संकेतन के तंत्र पर अधिकांश काम ऐसे MCF 7 और T47D के रूप में हार्मोन रिसेप्टर पॉजिटिव स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के साथ प्रदर्शन किया गया है। ये alrea था जो उन्नत स्तन कैंसर के रोगियों से फुफ्फुस बहाव से प्राप्त किए गएवि कई उपचार 5 प्राप्त किया। मानव स्तन के ऐसे सरल इन विट्रो मॉडल में निष्कर्षों के जैविक प्रासंगिकता इन में इन विट्रो मॉडल में पहचान की संदिग्ध और लक्ष्य जीन है पशु मॉडल 6 में पहचान कर रहे हैं कि लक्ष्य जीन से भिन्न होते हैं। प्राथमिक मानव स्तन उपकला कोशिकाओं इन विट्रो में संवर्धित कर रहे हैं जब वे हार्मोन रिसेप्टर अभिव्यक्ति और इसलिए हार्मोन प्रतिक्रिया 7,8 खो देते हैं। यह समस्या Matrigel का उपयोग कर परिष्कृत 3 डी दृष्टिकोण से circumventd जा सकता है। इस तरह, सी क्लार्क और उनके सहयोगियों हार्मोन रिसेप्टर अभिव्यक्ति बनाए रखा और प्रोजेस्टेरोन उत्तेजना 9 के लिए एक proliferative प्रतिक्रिया से पता चला है कि स्तन उपकला कोशिकाओं को स्थापित करने में सफल रहा। फिर भी, विवो प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर लक्ष्य जीन में महत्वपूर्ण दो, Wnt-4 और RANKL, इस प्रणाली के नौ में प्रोजेस्टेरोन उत्तेजना पर प्रेरित नहीं कर रहे थे। यह दृष्टिकोण हाल ही में इन विट्रो साथ आगे पर लिया गया था 10 हासिल की थी। एक चेतावनी है, Matrigel बैच निर्भर कर रहे हैं कि गतिविधियों है कि रहता महंगा है, और केवल छोटे सेल नंबर के लिए उपयुक्त है कि एक प्रयोगात्मक डिजाइन की मांग।

विवो ईआर और पीआर संकेतन में काफी हद तक पैराक्राइन बातचीत 11 से मध्यस्थता कर रहे हैं कि खोज के आधार पर हम कहनेवाला बातचीत की देखरेख करने की जरूरत है कि बहस की। ऊतकों के रूप में खो दिया है कि एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू में इन विट्रो संस्कृति के लिए एकल कक्षों के लिए बाह्य मैट्रिक्स के साथ उपकला कोशिकाओं की बातचीत कर रहे हैं अलग कर रहे हैं; अभी तक इन उपकला भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण हैं और उनके विघटन tumorigenesis के 12 में महत्वपूर्ण है। इसे ध्यान में रखते, हम ताजा शल्य त्यागें सामग्री 13 से स्तन ऊतक microstructures अलग करने के लिए एक विधि की स्थापना की। भीतरी luminal और बाहरी myoepitheli के साथ एक दो स्तरित उपकला से मिलकर स्तन पैरेन्काइमा,अल कोशिकाओं, वसा ऊतकों से दूर विच्छेदित और यांत्रिक और enzymatic हदबंदी के अधीन है। कपड़े धोने और centrifugation के बाद, दुग्ध नलिकाओं के टुकड़े कई stromal कोशिकाओं के साथ निकट संपर्क बनाए रखने के लिए है कि प्राप्त कर रहे हैं। ये ऊतक microstructures उत्तरदायी हार्मोन रहते हैं। मॉडल नैदानिक ​​नमूनों 13 में मान्य किया गया था। जैसे, वर्तमान प्रक्रिया एक biologically और नैदानिक ​​प्रासंगिक संदर्भ में स्तन में हार्मोन कार्रवाई का अध्ययन करने में मदद कर सकते हैं।

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Protocol

जनरल बातें: समय के आगे, एक आचार प्रोटोकॉल सेट अप, रोगियों के लिए प्रश्नावली तैयार है, और नैदानिक ​​कर्मियों के प्रशिक्षण के लिए देखते हैं। कमी mammoplasty सर्जरी से सामग्री का उपयोग करने से पहले, प्राधिकरण की खरीद, और रोगी सहमति सुनिश्चित करते हैं। ऊतक संक्रामक हो सकता है और तदनुसार संभाला की जरूरत हो सकती है। प्रायोगिक कैंसर रिसर्च के लिए स्विस संस्थान - इस प्रोटोकॉल ISREC की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. ऊतक रिकवरी, प्रसंस्करण और जैव-बैंकिंग

जैव-बैंकिंग के लिए इष्टतम नमूना गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए कदम की एक संख्या प्रयोगशाला के लिए परिवहन करने से पहले अस्पताल में किया जाता है।

अस्पताल में:

  1. यदि आवश्यक हो, कमी mammoplasty सर्जरी और रक्त के नमूनों से बाँझ शर्तों के तहत मानव स्तन के ऊतकों प्राप्त करते हैं। ऊतक घातक घावों की उपस्थिति को बाहर करने का नमूना होगा जो रोगविज्ञानी द्वारा जांच किए जाने की जरूरत है।
  2. स्तन टी रखेंएक बाँझ बोर्ड पर हुड के तहत जारी करने और कैंची, शल्य चिकित्सा स्केलपेल और पहले से ही भाप अजीवाणु साथ निष्फल रहे हैं जो संदंश तैयार करते हैं। इसे खोलने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग कर स्तन के ऊतकों के विभिन्न स्थलों पर गहरी कटौती करें। मानव स्तन के ऊतकों में पीले रंग की वसा ऊतकों में एम्बेडेड रहे हैं जो नलिकाएं और lobules, से मिलकर सफेद किस्में देखने के लिए।
    नोट: पीला वसा ऊतकों के लिए सफेद parenchymal के अनुपात में महिलाओं के बीच अलग है; आम तौर पर युवा महिलाओं को अधिक उपकला ऊतक है।
  3. फिर कैंची से वसा ऊतकों से धीरे उन्हें अलग, सफेद पदार्थ के टुकड़े उठाओ और संदंश के साथ उन्हें पकड़। रक्त वाहिकाओं लेने से बचें।
  4. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) पीएच 7.2 में ऊतक के कुल्ला टुकड़े खून निकालने के लिए। और 1% एक (5000 यूनिट / मिलीलीटर पेनिसिलिन और 5000 ग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन सहित) 2% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ लाल फिनोल बिना F12 के माध्यम (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम F12) युक्त 250 मिलीलीटर की प्लास्टिक की बोतलों के लिए ऊतक स्थानांतरणtibiotic / Amphotericin बी (10,000 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10,000 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल, और Amphotericin बी के 25 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / सहित)। प्रयोगशाला के लिए परिवहन के लिए माध्यम में स्टोर ऊतकों।
  5. ठंड (सूखी बर्फ) isopentane साथ cryovials में उन्हें रोक आरएनए और प्रोटीन निष्कर्षण और फ्लैश के लिए 5 मिमी व्यास - 3 के टुकड़े तैयार करें। प्रयोगशाला के लिए परिवहन के लिए सूखी बर्फ बॉक्स को हस्तांतरण।
  6. मोल्ड में 5 मिमी और इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) की एक परत के साथ कवर और फिर ठंडे isopentane के साथ भरा बॉक्स के फ्लैट तल पर ढालना जगह - 3 के टुकड़े डाल दिया। पूरा ठंड के बाद सूखी बर्फ बॉक्स को ढालना हस्तांतरण।
  7. Formaldehyde में paraformaldehyde में 5 मिमी व्यास (पीएफए) 4% और दूसरा 5 टुकड़े (एफए) पर बाद में आर टी ऊतकीय विश्लेषण पर पीबीएस में 4% - 3 के 5 टुकड़े को ठीक करें। कुछ एंटीबॉडी बेहतर एक या दो का एक दूसरे के साथ काम करने के रूप में दो अलग अलग fixatives सिफारिश कर रहे हैं।

प्रयोगशाला में:

  1. करतेकमी mammoplasty के बारे में सभी जानकारी cument, शल्य चिकित्सा की और नमूने चाहे तिथि सही स्तन बनाम बाएं से निकाली गई है।
  2. -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए नमूने प्लेस और निर्धारण के दो घंटे के बाद ऊतक विज्ञान कैसेट में तय ऊतकों हस्तांतरण। फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन भंडारण के लिए, इथेनॉल पीबीएस में या 70% या तो उन्हें डाल दिया। अगले दिन, आयल embedding के लिए ऊतक विज्ञान की सुविधा के लिए ऊतक विज्ञान कैसेट हस्तांतरण।

2. ऊतक पाचन और हार्मोन उत्तेजना

  1. एक p2 सेल संस्कृति के कमरे में एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट के ऊतकों के नमूनों युक्त बोतलें स्थानांतरण। बाँझ काट बोर्ड (29 x 19 सेमी) पर ऊतक टुकड़े रखें। संदंश के साथ सामग्री पकड़ो और दूर स्केलपेल के साथ स्तन पैरेन्काइमा (सफेद हिस्सा) से शेष वसा और जहाजों परिमार्जन। एक 10 सेमी संस्कृति डिश में पीबीएस में सफेद पदार्थ रखें।
  2. सभी टुकड़ों से फैटी सामग्री हटाने और निपटान के बाद उन्हें सुरक्षा नियम के अनुसारप्रयोगशाला की है, वापस काट बोर्ड पर उपकला ऊतकों युक्त सफेद भागों जगह है। विरोध नलियां का उपयोग ऊतक में कटौती और अप करने के लिए 2 मिमी व्यास के टुकड़े करने के लिए इसे काट लें।
  3. पर्याप्त आकार की ट्यूबों में कीमा बनाया हुआ सामग्री प्लेस: 1, 2.5 और 10 मिलीलीटर अप करने के लिए एक 5, 15 या 50 मिलीलीटर ट्यूबों में, क्रमशः। आम तौर पर एक 5 मिलीलीटर ट्यूब की पैदावार काफी आयल embedment और हार्मोन stimulations के लिए सामग्री, और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब पैदावार पर्याप्त सामग्री छंटनी (FACS)। बड़ा ट्यूबों aliquots के ठंड के लिए उपयोग किया जाता है।
  4. 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / Amphotericin बी के साथ (फिनोल लाल के बिना DMEM / F12) मध्यम से मिलकर पाचन मास्टर मिश्रण तैयार करें और (क्लोस्ट्रीडियम histolyticum से Clostridiopeptidase ए) एक collagenase। पाचन टाइम्स के अनुसार कोलैजिनेज खुराक।
    1. 12, 24, और ऊष्मायन के 36 घंटे के लिए, 1.5 मिलीग्राम / एमएल, 1.0 मिलीग्राम / एमएल और 0.5 मिलीग्राम की collagenase के अंतिम एकाग्रता का उपयोग / क्रमशः एमएल। की 4 गुना करने के लिए पाचन मास्टर मिश्रण को जोड़ेंपच सामग्री की मात्रा पर्याप्त आंदोलन और वातन सुनिश्चित करने के लिए।
      नोट: प्रयोगात्मक डिजाइन और हार्मोन उत्तेजना की अवधि पर निर्भर करता है, के दौरान या enzymatic पाचन कदम और microstructure वसूली के बाद या तो हार्मोन जोड़ें।
  5. नमूने और नियंत्रण करने के लिए वाहन का परीक्षण करने के लिए वांछित एकाग्रता में हार्मोन (ओं) को जोड़ें। 17-β-एस्ट्राडियोल, और promegestone (R5020) के साथ उत्तेजना के लिए 20 एनएम के अंतिम एकाग्रता का उपयोग करें।
    नोट: R5020 माध्यम में प्राकृतिक प्रोजेस्टेरोन से अधिक स्थिर है, जो एक कृत्रिम प्रोजेस्ट्रोन रिसेप्टर agonist है।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस और 40 RPM हे / एन पर एक मशीन के अंदर रोलर मिक्सर पर प्लेस ट्यूबों। मिक्सर पर नमूने रखने से पहले, सभी सामग्री अपकेंद्रित्र ट्यूब के साथ वितरित सुनिश्चित करना है कि उन्हें बहुत अच्छी तरह resuspend।
  6. पाचन कम से कम 12 घंटा के हार्मोन उत्तेजना समय के लिए कम से कम 12 घंटा (ओ / एन) लेता है, के रूप में, (microstructures की वसूली के बाद हार्मोन जोड़ने डेचरण 3 के तहत पूंछ)। आप microstructures resuspend और अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों पर निलंबन जगह के रूप में हार्मोन जोड़ें। ऊतक microstructures के बारे में 70% व्यवहार्यता के संरक्षण वृद्धि कारक मुक्त माध्यम में से 7 दिनों के लिए अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों पर रखा जा सकता है।
  7. आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण के लिए, अपकेंद्रित्र ट्यूब में 5 मिनट और फ्लैश फ्रीज के लिए 400 XG पर centrifugation द्वारा ऊतक microstructures इकट्ठा।

ऊतक Microstructures 3. रिकवरी

  1. 5 मिनट के लिए 400 XG पर ट्यूब (ओं) अपकेंद्रित्र। अपकेंद्रित्र ट्यूब के ऊपर से वसा Aspirate और 5 मिनट के लिए 1250 XG पर एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र, fibroblasts में समृद्ध है, जो शेष जलीय सतह पर तैरनेवाला, की सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण।
    नोट: स्तन के ऊतकों microstructures के बाद के सभी चरणों के लिए, बहुत चिपचिपा रहे हैं के रूप में धीरे ट्यूब आंदोलनकारी द्वारा गोली resuspend। Pipetting कारण सामग्री को खोने का जोखिम करने के लिए सिफारिश नहीं है। Microstructures में और पीबीएस, 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) में जलीय सतह पर तैरनेवाला से निकाली गई fibroblasts में समृद्ध छर्रों Resuspend। इसके बाद 5 मिनट के लिए 1250 XG पर दोनों ट्यूबों स्पिन और फिर supernatants त्यागें।
  2. 3 में छर्रों Resuspend - 5 मिलीलीटर लाल सेल रक्त lysis बफर और ट्यूबों को साफ करने के लिए उन्हें हस्तांतरण। आरटी पर 5 मिनट के लिए उन्हें सेते हैं।
  3. पीबीएस, 2% एफसीएस की 2x मात्रा जोड़ें और 5 मिनट के लिए 1250 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। 5 मिनट के लिए 1250 XG पर पीबीएस, 2% एफसीएस और सेंट्रीफ्यूज के साथ छर्रों धो लें। दो बार इस चरण को दोहराएँ।

फ्लो के लिए 4. नमूने

  1. गोली को 0.25% trypsin 2 मिलीलीटर और कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए एक 1000 μl Pipetman के साथ 2 मिनट के लिए बहुत धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण और - 1 जोड़ें।
  2. 9 मिलीलीटर पीबीएस, 2% एफसीएस जोड़कर trypsin गतिविधि को बाधित। 5 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र और 10 मिलीलीटर पीबीएस, 2% एफसीएस में गोली resuspend।
  3. टी पर रखा एक 40 माइक्रोन सेल झरनी पर सेल निलंबन स्थानांतरणएक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के सेशन एकल कक्षों तैयार करने के लिए। सेल निलंबन के कुछ microliters के फिल्टर के शीर्ष पर बने हुए हैं, एक pipet साथ झरनी के दूसरी तरफ से उन्हें aspirating द्वारा उन्हें फिल्टर के माध्यम से पारित करने में मदद और फ़िल्टर microstructures के लिए उन्हें जोड़ने।
  4. फिर अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं, विरोधी CD45 के एक कॉकटेल के साथ microstructures से fibroblasts और endothelial कोशिकाओं, विरोधी FAP और विरोधी CD31 एंटीबॉडी और क्रमशः 10 luminal और बेसल कोशिकाओं को अलग करने के लिए पैन-उपकला मार्कर EpCAM और CD10 पर आधारित, FACS के साथ उन्हें तरह ।

प्रोटोकॉल के लिए 5. नमूने

  1. जैसा कि ऊपर वर्णित यंत्रवत् और enzymatically पचा सामग्री धोने के बाद, 30 मिनट के लिए आरटी पर पीबीएस में 4% पीएफए ​​के 1 मिलीलीटर में 1.5 मिलीलीटर प्रारंभिक सामग्री से छर्रों तय कर लो।
  2. 5 मिनट के लिए 1250 XG पर अपकेंद्रित्र और 1 से धो लें - दो बार 2 मिलीलीटर पीबीएस।
  3. 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र। इस समय के दौरान, (Tris- एसीटेट-EDTA में agarose 1% बहुउद्देश्यीय को तैयारTAE) बफर और समाधान के लिए एक फोड़ा करने के लिए आता है जब तक माइक्रोवेव ओवन में समाधान गर्मी।
    1. माइक्रोवेव ओवन से समाधान निकालें और समाधान का मिश्रण है और किसी भी शेष agarose कणों resuspend धीरे कुप्पी ज़ुल्फ़। 50 डिग्री सेल्सियस के लिए कूल agarose समाधान और एक आयल आधार मोल्ड में एक मिलीलीटर डालना 31 × 23 × 13.5 मिमी आकार।
  4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और जम परत के शीर्ष पर छर्रों जगह - एक फ्लैट अंत के साथ एक रंग का उपयोग agarose की (1 से 3 मिमी)। Agarose के एक अतिरिक्त परत (40 डिग्री सेल्सियस) के साथ उन सभी को कवर।
  5. Agarose solidifies के बाद, आमतौर पर 5 मिनट के भीतर, आयल embedment के लिए ऊतक विज्ञान कैसेट में agarose ब्लॉक डाल दिया। Agarose के नमूने पेंसिल में छोटे अक्षरों में लिखा कमी mammoplasty संख्या, प्रयोगात्मक हालत, और तारीख के बारे में सारी जानकारी के साथ कैसेट में एक सफेद कार्यालय कागज जगह के साथ; इस लेखन के बाद के सभी उपचार चरणों withstands।
  6. में कैसेट रखोपीबीएस हे / एन, या 4 डिग्री सेल्सियस पर सप्ताहांत में भंडारण के लिए 70% इथेनॉल में। हम दो भंडारण समाधान के बीच कोई अंतर नहीं देखा है। तब आयल embedding के लिए ऊतक विज्ञान की सुविधा के लिए ऊतक विज्ञान कैसेट हस्तांतरण।

6. बर्फ़ीली Microstructures (भविष्य के संवर्धन)

  1. 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के साथ एफसीएस से मिलकर मध्यम और cryovials में 1 मिलीलीटर aliquots फ्रीज ठंड में Resuspend ऊतक microstructures। प्राप्त cryovials की संख्या में कमी mammoplasty से प्राप्त प्राथमिक सामग्री की मात्रा पर निर्भर करता है।
  2. -12 डिग्री सेल्सियस तापमान के साथ कम, 6 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर के साथ डिग्री सेल्सियस के लिए -7 तापमान कम 5 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस पर रहने वाली: निम्न कार्यक्रम के साथ एक नियंत्रित दर फ्रीजर का उपयोग ऊतक microstructures युक्त cryovials रुक 6 डिग्री सेल्सियस / मिनट, 10 मिनट के निवास की दर, 6 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर के साथ डिग्री सेल्सियस -40 के लिए तापमान घटने के साथ -80 डिग्री सेल्सियस तक तापमान में घटते6 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर से। तब सेल्सियस फ्रीजर -80 को cryovials हस्तांतरण।
  3. अगले दिन, लंबे समय तक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन टैंक के लिए डिग्री सेल्सियस -80 से cryovials हस्तांतरण।

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Representative Results

एस्ट्रोजेन और प्रोजेस्टेरोन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए और बेहतर मानव स्तन में उनके आणविक कार्यों को समझने के लिए, हम उनके सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद कमी mammoplasties (चित्रा 1) के दौर से गुजर रोगियों से ताजा मानव स्तन के ऊतकों के नमूनों को इकट्ठा। हम यह भी मरीजों की चिकित्सा और प्रजनन इतिहास, साथ ही सर्जरी के समय में सीरम प्रोजेस्टेरोन स्तर निर्धारित करने के लिए एक खून का नमूना प्राप्त करते हैं। ताजा कमी mammoplasties से ऊतक यंत्रवत् और enzymatically अलग है। जिसके परिणामस्वरूप ऊतक microstructures के मूल (2A चित्रा) के स्तन के ऊतकों की विशेषता नलिकाएं और lobules है। Agarose और myoepithelial मार्कर ΔNp63 (चित्रा 2 बी) के लिए दाग आयल एम्बेडेड ऊतक microstructures के immunohistochemical विश्लेषण microstructures के सामान्य स्तन के ऊतकों के लक्षण, लेकिन यह भी सेल के आणविक प्रोफ़ाइल न केवल बरकरार रहती है कि पता चलता हैएल आबादी।

हार्मोन प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए, ऊतक microstructures सिंथेटिक प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर agonist promegestone (R5020) या इथेनॉल पर नियंत्रण के साथ या तो इलाज किया गया। हार्मोन रिसेप्टर के लिए समृद्ध करने के लिए सकारात्मक luminal कोशिकाओं फ्लो उपकला (EpCAM) और myoepithelial मार्कर के आधार पर प्रदर्शन किया था, विरोधी CD31, विरोधी FAP और कॉकटेल के साथ एन्दोथेलिअल, fibroblasts और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए कमी के बाद (calla चित्रा 3A) विरोधी CD45 एंटीबॉडी। R5020 ऊतक microstructures के उजागर से EpCAM + के QRT- पीसीआर विश्लेषण, CD10- कोशिकाओं luminal सेल समृद्ध आबादी में प्रोजेस्टेरोन लक्ष्य जीन Wnt-4 (3B चित्रा) के नियमन को दिखाया।

चित्रा 1
हौसले से विच्छेदित कमी mammoplasty नमूना चित्रा 1. स्तन ऊतक नमूना। तस्वीर। तीर इंगितसफेद स्तन पैरेन्काइमा होते हैं कि ऊतक किस्में, यानी, दुग्ध नलिकाओं और टर्मिनल वाहिनीपरक lobular इकाइयों के लिए। प्रचुर मात्रा में पीले रंग की वसा ऊतकों के भीतर एम्बेडेड। वसा के रंग के रोगियों के बीच संगत है, करता है, वसा ऊतकों के अनुपात, मात्रा के संदर्भ में स्तन के ऊतकों के आम तौर पर सबसे बड़ा हिस्सा है, बदलता रहता है। स्केल बार:। 5 मिमी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2. ऊतक microstructures। (ए) microstructures के उज्ज्वल क्षेत्र छवि यांत्रिक हदबंदी और enzymatic पाचन के बाद 48 घंटे के लिए एक कम लगाव प्लेट पर सुसंस्कृत। स्केल बार: 40 माइक्रोन (बी) के तीन दिनों में के बाद agarose और आयल में एम्बेडेड ऊतक microstructures पर एक ऊतकीय खंड की सूक्ष्मछवि।संस्कृति। खंड myoepithelial मार्कर ΔNp63 के लिए immunohistochemical धुंधला के अधीन और hematoxylin साथ counterstained गया था। तीर भीतरी, luminal कोशिकाओं को इंगित, तीर ΔNp63 सकारात्मक myoepithelial कोशिकाओं को इंगित करें। स्केल बार:। 40 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3. फ्लो जुदाई और ऊतक microstructures की शाही सेना विश्लेषण छँटाई। फ्लो द्वारा R5020 या इथेनॉल के साथ इलाज ऊतक microstructure से अलग सेल आबादी के (ए) के पृथक्करण। ऊतक microstructures अलग और प्रतिरक्षा कोशिकाओं, fibroblasts, और विरोधी CD45, विरोधी FAP, और विरोधी CD31 एंटीबॉडी के एक कॉकटेल के साथ endothelial कोशिकाओं के लिए immunodepleted थे। प्रकोष्ठों antibo साथ लेबल रहे थेluminal सेल की आबादी (हरा) और myoepithelial कोशिकाओं के लिए आम तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया एंटीजन (CD10 / Calla) (क्लोन SS2 / 36) के लिए समृद्ध करने के लिए उपकला कोशिका आसंजन अणु (EpCAM) (क्लोन HEA-125) के खिलाफ मर जाता है। एक प्रतिनिधि बिखराव धब्बा दिखाया गया है। (बी) के बार ग्राफ 24 घंटा के लिए इथेनॉल या R5050 के साथ प्रेरित ऊतक microstructures (हरी डॉट बादल, पैनल ए) से luminal उप-जनसंख्या में रिश्तेदार Wnt-4 mRNA अभिव्यक्ति के स्तर दिखा। प्रोजेस्टेरोन लक्ष्य जीन के सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति के स्तर, Wnt-4 hypoxanthine-गुआनिन phosphoribosyltransferase (HPRT) की mRNA स्तर के खिलाफ सामान्यीकृत। दिखाया गया डेटा triplicates के एसडी ± मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। पहले से 14 के रूप में वर्णित शाही सेना अलगाव और QRT- पीसीआर प्रदर्शन किया गया। प्राइमर दृश्यों: Wnt-4: आगे 5 '- GTGGCCTTCTCACAGTCGTT-3' और रिवर्स 5 '- ACCTCACAGGAGCCTGACAC-3', HPRT: आगे 5 <उन्हें> '-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3' और रिवर्स 5 '- CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3'। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ वर्णित पूर्व vivo संस्कृति सामान्य रूप से मानव महिला स्तन में पाया अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ साथ बरकरार नलिकाएं और lobules, जिसमें स्तन के ऊतकों microstructures प्रदान करता है। आम तौर पर कमी mammoplasties से प्राप्त मानव स्तन के ऊतकों के प्रसंस्करण में, वसा ऊतकों, स्ट्रोमल मैट्रिक्स के यांत्रिक और enzymatic पाचन, और लाल रक्त कोशिकाओं के सेल को हटाने के दूध वाहिनी टुकड़े और टर्मिनल वाहिनीपरक lobular इकाइयों के लिए समृद्ध करती है। सही अवधि के लिए सही एकाग्रता में कोमल enzymatic पाचन, ऊतक microstructures बरकरार रहेगा सुनिश्चित करना है कि कई प्रकार की कोशिकाओं को बनाए रखने और काफी हद तक उनके कोशिकी matrices के संरक्षित करने के लिए आवश्यक है। ध्यान भी जल्दी से एक बार रोगी से हटा ऊतक प्रसंस्करण के लिए भुगतान किया जाना चाहिए। रोगी के नमूने में काफी भिन्नता है और यांत्रिक और enzymatic पाचन लंबे समय तक किए जाने की जरूरत हो सकती है, और / या ऊतक कोलेजन सामग्री में विशेष रूप से उच्च है जब अतिरिक्त एंजाइम जोड़ा जाना चाहिए।

Microstructures अप करने के लिए 6 दिनों के लिए 90% व्यवहार्य रहना हालांकि, मॉडल लंबी अवधि के हार्मोन stimulations के लिए सीमाएं हैं। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के विभिन्न आधा जीवन है के रूप में, सेलुलर संरचना समय के साथ बदलने की संभावना है। ऊतक microstructures के प्रतिरक्षा कोशिकाओं घुसपैठ की रक्षा जबकि ऊतक शरीर के प्रचलन से हटा दिया जाता है, के रूप में इन मंगाया नहीं कर रहे हैं। नमूनों की बड़ी संख्या की वजह से इंटर रोगी विभिन्नता का विश्लेषण करने की आवश्यकता के रूप में इसके अलावा, शल्य नमूनों प्रदान करते हैं, जो नैदानिक ​​भागीदारों के साथ एक ठोस पाइप लाइन की आवश्यकता है। ऊतक microstructures बाद में उपयोग के लिए जमे हुए किया जा सकता है। हालांकि, इस हद तक ठंड और विगलन विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए संभवतः विभिन्न सेल व्यवहार्यता, प्रभावित है, और इस हार्मोन की प्रतिक्रिया को बदल सकता है कि कैसे क्या करना, विशेषता नहीं किया गया है। प्राप्त हो जाएगा कि ऊतक microstructures की राशि का अनुमान लगाने के लिए बहुत मुश्किल है किसी भी mammoplasty के लिए के रूप में प्रयोगों की योजना मुश्किल हो सकता है।

पूर्व vivo मॉडल मानव स्तन में शारीरिक हार्मोन कार्रवाई का अध्ययन करने के पहले मॉडल प्रस्तुत करता है। प्राथमिक स्तन उपकला कोशिकाओं के लिए अत्याधुनिक 3 डी संस्कृति सिस्टम विकसित किया गया है, वहीं इस पूर्व vivo प्रणाली ऊतक वास्तुकला और कई दिनों में अपने सेलुलर जटिलता को बरकरार रखता है। नतीजतन, हार्मोन रिसेप्टर सकारात्मक लक्ष्य कोशिकाओं में प्रतिक्रिया न केवल विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन नीचे की ओर अन्य प्रकार की कोशिकाओं में पैराक्राइन सिगनल की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी हो जाते हैं। microstructures के प्रयोगों की अवधि के दौरान वृद्धि कारक मुक्त माध्यम में रखा जाता है। इसलिए, संकेत Cascades का कोई confounding बाह्य सक्रियण है। जैसे, स्तन के ऊतकों microstructures और अधिक बारीकी से मानव स्तन के जैविक जटिलताओं को दर्शाता है कि एक स्थापित करने में सवालों का पता करने के लिए संभावना प्रदान करते हैं।

पूर्व vivo प्रणाली BR की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैप्राकृतिक और कृत्रिम हार्मोन के लिए पूर्व। यह स्तन कैंसर के एक बढ़ती हुई घटनाओं के प्रकाश में बहुत महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, दवाओं, छोटे अणुओं, पेप्टाइड्स, वृद्धि कारक है, और साइटोकिन्स लागू किया जा सकता है और सेल प्रसार, apoptosis और सिगनल पर उनके प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है।

वर्तमान विस्तृत वर्णन अन्य जांचकर्ताओं द्वारा इस पद्धति के उपयोग की सुविधा के लिए और अंतर प्रयोगशाला भिन्नता को कम करने में मदद करने के लिए है। इस दृष्टिकोण रोगी के नमूने पर निर्भर करता है, यह परिणाम अलग प्रयोगशालाओं 15 और इंटर रोगी परिवर्तनशीलता का एक बेहतर सराहना संभव हो जाता है के बीच तुलना करने के लिए शुरू कर सकते हैं, जिससे कि एक मानकीकृत विधि का इस्तेमाल किया जाता है कि अत्यंत महत्व का है। लेखकों प्रतिक्रिया की सराहना करते हैं और इस प्रोटोकॉल के संशोधित संस्करण में सुधार को एकीकृत करने के लिए खुश हो जाएगा। मानव नमूनों के साथ काम बहुत चुनौतीपूर्ण है और लेखकों दिलचस्प जैविक नमूने के साथ और अधिक शोधों को प्रोत्साहित करने की उम्मीद है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों mammoplasty फोटोग्राफ उपलब्ध कराने के लिए लुसाने विश्वविद्यालय अस्पताल के एम Fiche धन्यवाद, एम Wirth और प्रायोगिक कैंसर रिसर्च के लिए स्विस संस्थान, अनुसंधान आण्विक कैंसर विज्ञान में दक्षता के नेशनल सेंटर, लाइफ साइंसेज के स्कूल, इकोले पॉलीटेक्निक Federale डी ए Ayyanan महत्वपूर्ण टिप्पणी के लिए मैनचेस्टर विश्वविद्यालय के तकनीकी सहायता के लिए लुसाने और आर क्लार्क। इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान कोई अनुदान समझौते के तहत SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531,817, और अभिनव दवाओं पहल के संयुक्त उपक्रम से समर्थन प्राप्त हुआ है। यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7 / 2007-2013) और तरह योगदान में फार्मास्युटिकल इंडस्ट्रीज और संघों 'कंपनियों के यूरोपीय संघ से वित्तीय योगदान से बना रहे हैं संसाधनों जिनमें से 115,188,। अभिनव दवाओं पहल का वेब पता है http://www.imi.europa.eu/ । </ P>

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microlitre Centrifuge Heraeus Biofuge Fresco 75005521
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810 000.327
Cryobox Nalgene   5100-0001
Controlled Rate Freezer EF600 Grant Asymptote  EF600
CO2 incubator Hera Cell Heraeus 51022391
Roller Mixer SRT9D Sturt SRT9D
Histology Cassettes Medizintechnik 81-0021-00
Cell Strainer Falcon 352340
Strile Surgical Blade  Aesculap BB536 
Scalpel Aesculap BB084R
Forceps Aesculap BD047R
Scissors Aesculap BC374R
Paraffin base mold SAKURA 4166
Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix Thermoscientific 6769006
Penicillin/Streptomycin  Life Technologies 15070-063
Antibiotic/Antimycotic Life Technologies 15240-062
DMEM F/12 Life Technologies 11039-021 Prewarm (37 °C)
Collagenase Roche 11 088 793 001 Prewarm (37 °C)
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10270 Can be replaced with Fetal Calf Serum
Cell Blood Lysis Buffer Sigma R7757
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Agarose Invitrogen 16500-500
Formaldehyde Sigma F1635
Paraformaldehyde Roth 335
Isopentane Sigma M32631
Ethanol Merck 1009831000
Cryogenic vials (5.0 ml) VWR, International 479-0820
Ultra low attachment culture dish Corning, NY 14831 3471

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References

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Tags

चिकित्सा अंक 95 हार्मोन संकेतन स्तन कैंसर कमी mammoplasty स्तन के ऊतकों microstructures, एस्ट्रोजन प्रोजेस्ट्रोन स्तन उपकला कोशिकाओं ऊतकों को पाचन पैराक्राइन संकेतन microenvironment ऊतक वास्तुकला

Erratum

Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 02/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:

Marie Shamseddin

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Marie Shamsheddin

एक<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; मॉडल मानव स्तन में हार्मोन लड़ाई अध्ययन करने के लिए
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Sflomos, G., Shamseddin, M.,… More

Sflomos, G., Shamseddin, M., Brisken, C. An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. J. Vis. Exp. (95), e52436, doi:10.3791/52436 (2015).

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