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Medicine

Um Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52436
Automatic Translation
1, 1, 1
1Swiss Institute for Experimental Cancer Research, School of Life Sciences, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne

ERRATUM NOTICE

Summary

Desenvolvemos um novo modelo ex vivo para estudar a acção da hormona no peito humano. Baseia-se em microestruturas dos tecidos isolados de amostras de tecidos mamários cirúrgicos que preservam a arquitetura do tecido, as interações intercelulares, e sinalização parácrina.

Abstract

O estudo da ação do hormônio no peito humano tem sido dificultada pela falta de sistemas de modelos adequados. Após a cultura in vitro, células epiteliais mamárias primários tendem a perder a expressão de receptores hormonais. Amplamente receptores hormonais linhas celulares de cancro da mama positivo utilizados são de limitada relevância para a situação in vivo. Aqui, descrevemos um modelo ex vivo para estudar a ação hormonal no peito humano. Amostras frescas de tecido da mama humano a partir de material de descarte cirúrgico, tais como mamoplastias de redução ou mammectomies são mecanicamente e enzimaticamente digerido para obter fragmentos de tecido contendo ductos e lóbulos e vários tipos de células do estroma. Estes micro-estruturas dos tecidos conservados em meio basal sem fatores de crescimento preservar seus contatos intercelulares, a arquitetura do tecido, e permanecem hormônio que responde por vários dias. Eles são processados ​​prontamente para RNA e extração de proteínas, análise histológica ou armazenados em meio de congelamento. Fluorescênciaseparação de células activadas (FACS) pode ser usado para o enriquecimento em populações de células específicas. Este protocolo fornece uma abordagem simples, padrão para estudos translacionais com alta complexidade, amostras humanas variadas.

Introduction

Informações sobre a paisagem mutacional no câncer de mama está aumentando em ritmo acelerado. Menos atenção tem sido dada a fatores sistêmicos que influenciam o desenvolvimento do câncer de mama. A exposição a hormônios reprodutivos tem um grande impacto na progressão da doença 1-3. No entanto, os mecanismos pelos quais as hormonas reprodutivas embatem na mama humano são mal compreendidos. Trabalho com modelos de engenharia genética do rato revelou que envolvem células sinalização intrínseca e paracrine por vários efectores a jusante 4.

O conhecimento limitado sobre ação do hormônio no peito humano é largamente atribuível à falta de modelos adequados. A maioria dos trabalhos sobre os mecanismos de receptor de estrogénio (ER) e o receptor de progesterona (PR), a sinalização tem sido realizada com linhas de células positivas do receptor de hormona, cancro da mama, tais como MCF-7 e T47D. Estes foram obtidos a partir de derrame pleural de pacientes com câncer de mama avançado que tinha already recebeu vários tratamentos 5. A importância biológica dos resultados obtidos em tais modelos in vitro simples da mama humano é genes questionáveis ​​e alvo identificados nestes modelos in vitro são diferem dos genes-alvo que são identificados em modelos animais 6. Quando as células epiteliais mamárias humanas primárias são cultivadas in vitro tendem a perder a expressão de receptores hormonais e, portanto, resposta hormonal 7,8. Este problema pode ser circumventd por abordagens 3D sofisticados usando matrigel. Desta forma, C. Clarke e colegas conseguiram estabelecer as células epiteliais da mama que mantiveram a expressão do receptor da hormona e que demonstraram uma resposta proliferativa para a estimulação da progesterona 9. No entanto, importante em dois genes alvo in vivo do receptor da progesterona, Wnt-4 e RANKL, não foram induzidas por estimulação da progesterona no presente sistema 9. Esta abordagem foi tomada recentemente em mais longe com in vitro 10. A ressalva é que matrigel tem atividades que são dependentes do lote, é caro, e exige um projeto experimental que está apto apenas para o número de células pequenas.

Com base na descoberta de que em ER vivo e sinalização PR são largamente mediada por interacções parácrinos 11, que argumentaram que as interacções intercelulares precisam de ser mantidas. Outro factor importante que é perdida como tecidos estão dissociados para células únicas para a cultura in vitro são as interacções de células epiteliais com a matriz extracelular; No entanto, estes são fundamentais para diferenciação epitelial e sua perturbação é importante na tumorigênese 12. Com isto em mente, nós estabelecemos um método para isolar microestruturas tecido mamário a partir de material de descarte cirúrgico fresco 13. O parênquima da mama, que consiste de um epitélio de duas camadas com o interior do lúmen e exterior myoepithelicélulas al, é dissecado a partir de tecido adiposo e submetido a dissociação mecânica e enzimática. Após a lavagem e centrifugação, fragmentos de dutos de leite são obtidos que manter interações estreitas com muitas células estromais. Estes micro-estruturas dos tecidos permanecem hormônio responsivo. O modelo foi validado em amostras clínicas 13. Como tal, o presente processo pode ajudar a estudar a acção de hormonas na mama num contexto biológico e clinicamente relevante.

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Protocol

Considerações gerais: antes do tempo, o estabelecimento de um protocolo de ética, preparar questionários para os pacientes, e ver a formação do pessoal clínico. Antes de usar o material de cirurgia mamoplastia de redução, obter autorizações, e assegurar o consentimento do paciente. Tecido podem ser infecciosos e precisa de ser tratadas em conformidade. Este protocolo foi aprovado pelo comitê de ética do ISREC - Instituto Suíço de Experimental Cancer Research.

1. Tissue Recovery, Processamento e Bio-banking

Para garantir a qualidade da amostra ideal para o bio-banking, uma série de passos são realizados no hospital antes do transporte para o laboratório.

No hospital:

  1. Obter tecidos da mama humanos sob condições estéreis a partir de amostras de cirurgia mamoplastia de redução e de sangue, se necessário. Tissue precisa ser examinado pelo patologista que vai provar para excluir a presença de lesões malignas.
  2. Coloque o peito de temitir sob o capô em uma placa de estéril e preparar tesoura, bisturi cirúrgico e pinças que já estão esterilizados com esterilizador a vapor. Faça profundo corte em diferentes locais do tecido mamário utilizando um bisturi para abri-lo. Em tecido mamário humano olhar para fios brancos que consistem em dutos e lóbulos, que são incorporados no tecido adiposo amarelo.
    Observação: A razão entre o parênquima branco para o tecido adiposo amarelo difere entre as mulheres; Normalmente as mulheres mais jovens têm mais tecido epitelial.
  3. Escolha pedaços de material branco e mantê-los com uma pinça, então separá-los suavemente do tecido adiposo com uma tesoura. Evite tomar vasos sanguíneos.
  4. Lavar peças de tecido em solução salina fosfato tamponada (PBS) pH 7,2 para remover o sangue. Transferir o tecido para garrafas de plástico de 250 ml contendo meio F12 (F12 Meio de Eagle Modificado por Dulbecco) sem vermelho de fenol com 2% de penicilina / estreptomicina (incluindo 5.000 unidades / ml de penicilina e 5000 g / ml de estreptomicina) e 1% de umtibiotic / anfotericina B (incluindo 10.000 unidades / ml de penicilina, 10.000 ug / ml de estreptomicina, e 25 ug / ml de anfotericina B). Armazenar tecidos no meio de transporte para o laboratório.
  5. Prepare pedaços de 3-5 mm de diâmetro para extração de RNA e proteína e flash congelá-los em cryovials com frio (gelo seco) isopentano. Transferi-los para a caixa de gelo seco durante o transporte para o laboratório.
  6. Coloque pedaços de 3-5 mm no molde e cobri-lo com uma camada de Optimal temperatura de corte (OCT) e, em seguida, coloque o molde sobre o fundo plano da caixa cheia de isopentano frio. Após congelamento total transferir o molde para a caixa de gelo seco.
  7. Fix 5 pedaços de 3-5 mm de diâmetro em paraformaldeído (PFA) 4% e mais 5 peças em formaldeído (FA) de 4% em PBS a análise histológica RT mais tarde. Dois diferentes fixadores são recomendados como alguns anticorpos trabalham melhor com um ou o outro dos dois.

No laboratório:

  1. Fazercument todas as informações sobre a mamoplastia de redução, data da cirurgia e se as amostras são derivados de esquerda versus mama direita.
  2. Coloque as amostras congeladas a -80 ° C e transferir os tecidos fixados em cassetes de histologia após 2 horas de fixação. Em seguida, colocá-los tanto em PBS ou etanol a 70%, para O armazenamento / N a 4 ° C. No dia seguinte, transferir as cassetes de histologia para instalações de histologia para inclusão em parafina.

2. Tissue Digestão e Hormone Estimulação

  1. Transferem-se as garrafas contendo as amostras de tecido para uma câmara de fluxo laminar numa sala de cultura de células P2. Coloque pedaços de tecido sobre a tábua de cortar estéril (29 x 19 cm). Segure o material com uma pinça e raspar o restante gordura e vasos de distância do parênquima mamário (parte branca) com bisturi. Colocar o material branco em PBS numa placa de cultura de 10 centímetros.
  2. Depois de retirar o material gorduroso de todas as peças e descartá-los de acordo com a norma de seguranças do laboratório, coloque as partes brancas contendo os tecidos epiteliais de volta na tábua de cortar. Usando bisturis opostas cortar o tecido e corte-a em pedaços de até 2 mm de diâmetro.
  3. Inserir o material triturado em tubos de tamanho adequado: até 1, 2,5 e 10 ml para um 5, 15 ou tubos de 50 ml, respectivamente. Normalmente de 5 ml rendimentos tubo material suficiente para incrustação de parafina e hormonais estímulos, e de 15 ml produz tubos de material suficiente para fluorescência celular ativado (FACS). Tubos maiores são usados ​​para congelar alíquotas.
  4. Preparar a mistura mestre digestão consistindo em meio (DMEM / F12 sem vermelho de fenol) com 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina B e colagenase A (Clostridiopeptidase A de Clostridium histolyticum). Dose de colagenase de acordo com tempos de digestão.
    1. Para 12, 24, e 36 h de incubação, usar concentração final de colagenase de 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml e 0,5 mg / ml, respectivamente. Adicionar mix mestre digestão até 4 vezes davolume do material digerido para assegurar a agitação e o arejamento adequado.
      NOTA: Dependendo do desenho experimental e a duração da estimulação hormonal, adicionar hormônios durante ou após a etapa de digestão e microestrutura de recuperação enzimática.
  5. Adicionar hormona (s) a uma concentração desejada para testar amostras e o veículo de controlo. Para a estimulação com 17-β-estradiol, e promegestona (R5020) utilizar uma concentração final de 20 nM.
    NOTA: R5020 é um agonista do receptor de progesterona sintética, que é mais estável do que a progesterona natural em meio.
    1. Colocar os tubos sobre o misturador de rolos dentro de uma incubadora a 37 ° C e 40 rpm O / N. Antes de colocar as amostras no misturador, ressuspender-los muito bem para garantir que todo o material distribui ao longo dos tubos de centrífuga.
  6. Como a digestão demora pelo menos 12 horas (O / N), por vezes de estimulação da hormona de menos de 12 horas, adicione os hormônios após a recuperação das microestruturas (deatado na etapa 3). Adicione os hormônios como você voltar a suspender as microestruturas e coloque a suspensão em placas ultra-baixas de fixação. Microestruturas dos tecidos podem ser mantidos em ultra-baixas placas de fixação para até 7 dias em meio de cultura livre de fator de preservação de cerca de 70% de viabilidade.
  7. Para ARN e análise de proteínas, recolher microestruturas dos tecidos por centrifugação a 400 xg durante 5 min e flash congelamento em tubos de centrífuga.

3. Recuperação de microestruturas de tecidos

  1. Centrifuga-se o tubo (s) a 400 xg durante 5 min. Aspirar a gordura a partir do topo do tubo de centrifugação e transferir o sobrenadante do sobrenadante aquoso remanescente, que é enriquecido em fibroblastos, para um novo tubo de centrífuga e centrifuga-se a 1250 xg durante 5 min.
    NOTA: Como as microestruturas do tecido mamário são muito pegajoso, para todas as etapas subseqüentes colocar o agregado agitando suavemente o tubo. Pipetting não é recomendada devido ao risco de perder o material. Ressuspender as pelotas enriquecidas em microestruturas e em fibroblastos derivados de sobrenadante aquoso em PBS, 2% de Soro Fetal de Vitela (FCS). Subsequentemente girar em ambos os tubos 1250 xg durante 5 min e, em seguida, descartar os sobrenadantes.
  2. Ressuspender as pelotas em 3-5 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos e transferi-los para tubos limpos. Incubar-los durante 5 min à TA.
  3. Adicionar o volume de 2x PBS, 2% de FCS e centrifugar para a 1.250 xg durante 5 min. Lavam-se as peletes com PBS, FCS a 2% e centrifugação a 1250 xg durante 5 min. Repita esta etapa duas vezes.

4. As amostras de Citometria de Fluxo

  1. Adicionar 1-2 ml de tripsina a 0,25% ao sedimento e misture por pipetagem cima e para baixo com muito cuidado para 2 min com um Pipetman 1.000 ul dissociar células.
  2. Inibir a actividade da tripsina por adição de 9 ml de PBS, 2% de FCS. Centrifuga-se a 450 xg durante 5 min e ressuspender o sedimento em 10 ml de PBS, 2% de FCS.
  3. Transferir a suspensão de células para um filtro de células de 40 mm colocada sobre top de um tubo de centrífuga de 50 ml para preparar células individuais. Se alguns microlitros de suspensão de células permanecem na parte superior do filtro, ajudá-los a passar através do filtro por aspiração los a partir do outro lado do filtro com uma pipeta e adicioná-los para as microestruturas filtrados.
  4. Anticorpos células imunitárias separadas, fibroblastos e células endoteliais a partir de microestruturas com um cocktail de anticorpos anti-CD45, anti-PAF e anti-CD31 e depois separá-los com FACS, com base em pan-epitelial EpCAM marcador CD10 e para separar as células luminais e basais, respectivamente, 10 .

5. As amostras para histologia

  1. Depois de se lavar o material mecanicamente e enzimaticamente digerido como descrito acima, a partir de peletes de fixar o material inicial de 1,5 ml em 1 ml de 4% de PFA em PBS à temperatura ambiente durante 30 min.
  2. Centrifugar a 1.250 xg durante 5 minutos e lava-se com 1 - 2 ml de PBS, duas vezes.
  3. Centrifuga-se a 16000 xg durante 10 min. Durante este tempo, preparar 1% multiusos de agarose em tampão Tris-Acetato-EDTA (TAE) de tampão e aquecer a solução no forno de microondas até a solução começar a ferver.
    1. Remover a solução do forno microondas e agite o frasco suavemente para misturar a solução e voltar a suspender qualquer restantes partículas de agarose. Arrefecer a solução de agarose a 50 ° C e deitar 1 ml num molde da base de parafina dimensionada 31 × 23 × 13,5 milímetros.
  4. Descartar o sobrenadante e colocar os sedimentos em cima da camada solidificada (1-3 mm) de agarose utilizando uma espátula com uma extremidade plana. Cobrir todas elas com uma camada adicional de agarose (40 ° C).
  5. Após os solidifica de agarose, geralmente dentro de 5 min, colocar os blocos de agarose para as cassetes de histologia para parafina embedment. Junto com as amostras de agarose colocar um papel branco de escritório na cassete com todas as informações sobre o número de mamoplastia redutora, a condição experimental, e data escrita em letras pequenas a lápis; este documento foi escrito resiste todas as etapas de tratamento subsequentes.
  6. Coloque as cassetes emPBS S / N, ou em etanol a 70% para armazenamento no fim de semana, a 4 ° C. Nós não notei nenhuma diferença entre as duas soluções de armazenamento. Em seguida, transferir cassetes histologia às instalações de histologia para inclusão em parafina.

6. As microestruturas congelamento (Futuro) Cultivar

  1. Ressuspender as microestruturas de tecidos em meio consistindo em FCS com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e congelar em alíquotas de 1 ml criotubos congelação. O número de criotubos obtidas depende da quantidade de matéria-prima obtida a partir de mamoplastia de redução.
  2. Congelar as criotubos contendo microestruturas dos tecidos utilizando um congelador de taxa controlada com o seguinte programa: 5 minutos a 4 ° habitação C, diminuindo a temperatura de -7 ° C com uma taxa de 6 ° C / min, diminuindo a temperatura a -12 ° C com taxa de 6 ° C / min, 10 min habitação, diminuindo a temperatura a -40 ° C com uma taxa de 6 ° C / min, a diminuição na temperatura de -80 ° C comtaxa de 6 ° C / min. Em seguida, transfira os cryovials a -80 ° C congelador.
  3. No dia seguinte, a transferência dos criotubos de -80 ° C para o tanque de azoto líquido durante muito tempo de armazenagem.

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Representative Results

Para estudar o papel dos estrogênios e progesterona e compreender melhor suas funções moleculares no peito humano, coletamos amostras de tecido fresco de mama humano de pacientes submetidos a mamoplastias de redução (Figura 1), após aprovação do consentimento informado. Nós também obter história médica e reprodutiva do paciente, bem como uma amostra de sangue para determinar os níveis de progesterona no soro no momento da cirurgia. Tecido de mamoplastias de redução frescos é mecanicamente e enzimaticamente dissociada. As microestruturas dos tecidos resultantes possuem ductos e lóbulos característica do tecido mamário de origem (Figura 2A). A análise imuno-histoquímica de agarose e microestruturas de parafina do tecido manchado pela myoepithelial marcador ΔNp63 (Figura 2B) revelam que microestruturas manter não apenas as características morfológicas do tecido mamário normal, mas também o perfil molecular do cell populações.

Para avaliar a resposta hormonal, microestruturas dos tecidos foram tratados com a progesterona sintética agonista do receptor promegestona (R5020) ou controle de etanol. Para enriquecer para o receptor da hormona de células luminais positivas citometria de fluxo foi realizada com base epitelial (EpCAM) e marcador mioepitelial (CALLA; Figura 3A) depois de esgotamento para endoteliais, fibroblastos e células do sistema imunológico com um cocktail de anticorpos anti CD31, anti-FAP e anti- anticorpos CD45. análise de qRT-PCR de EpCAM +, células CD10 @ apareceu regulação do gene alvo progesterona Wnt-4 (Figura 3B) na população celular enriquecida luminal do R5020 exposta microestruturas dos tecidos.

Figura 1
Figura 1. amostra de tecido da mama. A fotografia de redução recém-dissecado amostra mamoplastia. As setas apontampara fios brancos tecidos que contêm o parênquima mamário, ou seja, dutos de leite e unidades lobular ductal terminais. Embutido no tecido adiposo abundante amarelo. Embora a cor da gordura não é consistente entre pacientes, a percentagem de tecido adiposo, em geral, a maior parte do tecido da mama, em termos de volume, varia. Barra de escala:. 5 milímetros Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Tecido microestruturas. Imagem de campo claro de microestruturas (A) cultivadas em uma placa de baixo apego por 48 horas após a dissociação mecânica e digestão enzimática. Barra de escala: 40 mm (B) micrografia de uma secção histológica de tecido embebidas em microestruturas em agarose e parafina após 3 dias em.cultura. A seção foi submetido a coloração imuno-histoquímica para o marcador ΔNp63 myoepithelial e contrastadas com hematoxilina. Pontas de flechas apontam para as células internas, luminais, setas apontam para células mioepiteliais positivos ΔNp63. Barra de escala:. 40 pm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. A citometria de fluxo e análise de triagem de separação de ARN de tecido de micro-estruturas. (A) A separação das diferentes populações de células de tecidos tratadas com microestrutura R5020 ou etanol por citometria de fluxo. Microestruturas de tecidos foram dissociados e Imunodeprimido por células imunitárias, os fibroblastos e as células endoteliais com um cocktail de anticorpos anti-CD45, anti-FAP, e anticorpos anti-CD31. As células foram marcadas com Antibomorre contra a Molécula de Adesão Celular Epitelial (EpCAM) (clone de HEA-125) para enriquecer a população de células luminais (verde) e comum leucemia linfoblástica aguda Antigen (CD10 / CALLA) para células mioepiteliais (Clone SS2 / 36). Uma mancha de dispersão representativo é mostrado. Gráfico (B) Bar mostrando relativos Wnt-4 níveis de expressão de mRNA na subpopulação luminal de microestruturas de tecido (dot nuvem verde, painel A) induzidos com etanol ou R5050 durante 24 horas. Os níveis de expressão relativos de ARNm do gene alvo da progesterona, Wnt-4 normalizados contra os níveis de mRNA de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HPRT). Os dados apresentados representam a média ± desvio padrão de triplicados. Isolamento de ARN e de qRT-PCR foram realizados como descrito anteriormente 14. As sequências dos iniciadores: Wnt-4 para a frente: 5 '- GTGGCCTTCTCACAGTCGTT-3' e inverso, 5 '- ACCTCACAGGAGCCTGACAC-3', HPRT: directo 5 <em> '-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3' e reverter 5 '- CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3'. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A cultura ex vivo descrito aqui fornece microestruturas dos tecidos mamários contendo ductos e lóbulos intactos, juntamente com outros tipos de células encontradas normalmente no peito fêmea humana. No processamento do tecido da mama humana obtidos geralmente de mamoplastias de redução, a remoção de tecido adiposo, a digestão enzimática e mecânica da matriz estromal, e a lise de células vermelhas do sangue enriquece para fragmentos de condutas de leite e unidades lobulares ductais terminais. Digestão enzimática suave na concentração correta, para a duração certa é essencial para garantir que as microestruturas dos tecidos permanecem intactos, manter vários tipos de células e em grande parte preservar suas matrizes extracelulares. A atenção também deve ser dada ao processamento do tecido rapidamente, uma vez removida do paciente. As amostras dos pacientes e pode variar substancialmente de digestão enzimática e mecânica pode precisar de ser prolongado, e / ou enzima adicional tem de ser adicionado quando o tecido é particularmente elevado teor em colagénio.

Embora microestruturas permanecer viável para 90% até 6 dias, o modelo tem as limitações para estímulos hormonais longo prazo. Como diferentes tipos de células têm semi-vidas diferentes, a composição celular é provável mudar ao longo do tempo. Embora as microstruturas se infiltrar tecidos preservar células imunitárias, estes não são repostos como o tecido é removido da circulação do corpo. Além disso, um oleoduto sólida com os parceiros clínicos que prestam os espécimes cirúrgicos é necessária como um grande número de amostras devem ser analisadas por causa da variação entre paciente. Microestruturas de tecido pode ser congelado para posterior utilização. No entanto, a medida que a congelação e descongelação afectar a viabilidade celular, possivelmente diferencialmente por diferentes tipos de células, e como esta pode alterar a resposta hormonal, não tem sido caracterizado. Planeamento de experiências pode ser difícil, pois para qualquer mamoplastia a quantidade de micro-estruturas de tecido que será obtida é difícil de prever.

ex vivo apresenta o primeiro modelo para estudar a ação do hormônio fisiológico no peito humano. Enquanto sistemas de cultura 3D sofisticadas para as células epiteliais da mama primário ter sido desenvolvido, este sistema ex vivo preserva a arquitectura do tecido e a sua complexidade celular ao longo de vários dias. Como resultado, não só a resposta nas células alvo positivas do receptor da hormona pode ser analisado, mas os eventos a jusante de sinalização parácrina em outros tipos de células se tornam passíveis de estudar. As microestruturas são mantidos crescimento em meio isento de factor de durante todo o período das experiências. Assim, não há confusão activação extrínseca de cascatas de sinalização. Como tal, as microestruturas do tecido mamário oferecer a possibilidade de abordar questões em um ambiente que reflete mais de perto as complexidades biológicas do peito humano.

O sistema ex vivo pode ser usado para avaliar a resposta da Iga leste de hormônios naturais e sintéticos. Isto é muito importante à luz de uma incidência crescente do cancro da mama. Além disso, os fármacos, pequenas moléculas, péptidos, factores de crescimento, citocinas e pode ser aplicada e os seus efeitos sobre a proliferação celular, apoptose e sinalização ser estudado.

A presente descrição pormenorizada se destina a facilitar a utilização do presente método por outros investigadores e para ajudar a minimizar a variação entre laboratório. Como esta abordagem se baseia em amostras de pacientes, é de extrema importância que um método padronizado é usado para que os resultados podem começar a ser comparadas entre os diferentes laboratórios de 15 e uma melhor apreciação da variabilidade entre paciente torna-se possível. Os autores Agradecemos o feedback e terá o prazer de integrar melhorias em versões revisadas deste protocolo. O trabalho com amostras humanas é muito desafiador e os autores esperam estimular a pesquisa mais translacional com amostras biológicas interessantes.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem M. Fiche do Hospital Universitário de Lausanne para fornecer a fotografia mamoplastia, M. Wirth e A. Ayyanan do Swiss Institute for Cancer Research Experimental, Centro Nacional de Competência em Pesquisa de Oncologia Molecular, Faculdade de Ciências da Vida, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne para a assistência técnica e R. Clarke, da Universidade de Manchester para comentários críticos. A investigação conducente a estes resultados foi recebido apoio de SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, eo Innovative Medicines Initiative empresa comum ao abrigo do contrato de concessão não. 115.188, recursos de que são compostas de contribuição financeira do Sétimo Programa da União Europeia Quadro (FP7 / 2007-2013) e Federação Europeia das Associações e Indústrias Farmacêuticas empresas »da contribuição em espécie. O endereço Web de Iniciativa sobre Medicamentos Inovadores é http://www.imi.europa.eu/ . </ P>

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microlitre Centrifuge Heraeus Biofuge Fresco 75005521
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810 000.327
Cryobox Nalgene   5100-0001
Controlled Rate Freezer EF600 Grant Asymptote  EF600
CO2 incubator Hera Cell Heraeus 51022391
Roller Mixer SRT9D Sturt SRT9D
Histology Cassettes Medizintechnik 81-0021-00
Cell Strainer Falcon 352340
Strile Surgical Blade  Aesculap BB536 
Scalpel Aesculap BB084R
Forceps Aesculap BD047R
Scissors Aesculap BC374R
Paraffin base mold SAKURA 4166
Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix Thermoscientific 6769006
Penicillin/Streptomycin  Life Technologies 15070-063
Antibiotic/Antimycotic Life Technologies 15240-062
DMEM F/12 Life Technologies 11039-021 Prewarm (37 °C)
Collagenase Roche 11 088 793 001 Prewarm (37 °C)
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10270 Can be replaced with Fetal Calf Serum
Cell Blood Lysis Buffer Sigma R7757
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Agarose Invitrogen 16500-500
Formaldehyde Sigma F1635
Paraformaldehyde Roth 335
Isopentane Sigma M32631
Ethanol Merck 1009831000
Cryogenic vials (5.0 ml) VWR, International 479-0820
Ultra low attachment culture dish Corning, NY 14831 3471

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Medicina Edição 95 a sinalização hormonal câncer de mama mamoplastia de redução microestruturas do tecido mamário, o estrogênio progesterona células epiteliais mamárias a digestão do tecido sinalização parácrina microambiente a arquitetura do tecido

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Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 02/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:

Marie Shamseddin

instead of:

Marie Shamsheddin

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano
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Sflomos, G., Shamseddin, M.,… More

Sflomos, G., Shamseddin, M., Brisken, C. An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. J. Vis. Exp. (95), e52436, doi:10.3791/52436 (2015).

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