Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה"כ

Published: September 11, 2016 doi: 10.3791/52437
Automatic Translation
1, 1
1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency

Introduction

וירוסים מעיים הם קבוצה מגוונת של וירוסים המדביקים מערכת העיכול האנושית ואשר מועברים באמצעות מחזור צואה-פה. וירוסים אלה להיכנס למים משטח הקרקע באמצעות מכון טיהור שפכים וקולחין בור ספיגה, בורות שופכין תוכנן או שבורה כהלכה, קווי ביוב שבורים, גלישות הביוב בשילוב, ומקורות נקודת והלא נקודה אחרת 1-4. זיהומים ומחלות אדם מפני וירוסי waterborne להתרחש באמצעות צריכת מים מזוהמים או לחטא כראוי או באמצעות מגע מים ופנאי. תסמיני המחלה עשויה להיות כרוכה קלה עד גסטרואנטריטיס חמור; דַלֶקֶת הַלַחמִית; קַדַחַת; מצוקת נשימת עליונות; מחלת הפה, הידיים והרגליים; דַלֶקֶת שְׁרִיר הַלֵב; דלקת קרום המוח; דַלֶקֶת הַמוֹחַ; שיתוק; אלח דם 5-8, ומוות 9,10.

USEPA שיטה 1615 מספקת הליך למדוד חלקיקי נגיף מעיים זיהומיות במי סביבה ושתייה. מים אלה יכולים להכילתערובת של virions זיהומיות שאינם מדבק, אלא רק את חלקיקי זיהומיות להוות סיכון בריאותי פוטנציאלי. חלקיקי הנגיף מדבק לאבד infectivity לאורך זמן במים הסביבה ושתייה מאיבוד שלמות קפסיד חלבון, נזק חומצות גרעין בשל קרינת UV מפני השמש, ונזק עקב כל חומרי חיטוי שעשויים להיות נוכחים 11-13. הליך הווירוס culturable הכולל שנקבע השיטה מבוסס על הייצור של תופעות cytopathic (CPE) בכליות הקוף באפלו גרין (BGM) שורת התאים. שורת תא זו נבחרה בגלל השימוש הנרחב שלה בתחום וירולוגיה הסביבתי 14,15, למרות מגוון סוגי וירוס מדבקים שיאותרו מוגבלים בעיקר enteroviruses מסוים 15. מטרת מאמר זה היא לתאר לנהלי שיטת 1615 עבור elution של מסנני מחסנית electropositive חמש אינץ ', ריכוז משני, ומדידה של וירוסי culturable הכולל. הערכה שלשיטה הכוללת מתוארת Cashdollar et al. 16.

Protocol

הערה: אזור עיין חומרים משלימים S1 עבור רשימה של הגדרות. נהלי QA קשורים שיטת USEPA 1615 מתוארי S2 הסעיף והחומרים משלימים.

1. מסנן Elution נוהל

  1. Elution ראשון
    1. מניחים 500 מ"ל של תמצית בשר בקר 1.5% שנאגרו, pH 9.0, חימם לטמפרטורת החדר בתוך גליל סיימה. פתח את דיור המחסנית המסננת ולהוסיף כמות מספקת של תמצית בשר בקר כדי לכסות את מסנן electropositive לחלוטין. החזר את מכסה בית המסנן ויוצקים את תמצית בשר הנותרים לתוך מבחנה סטרילית.
    2. לאחר 1 דקות של זמן מגע, להעביר את פתרון תמצית בשר הדיור יחד עם זה שנותר בכוס סטרילית לאט דרך המסנן באמצעות מיכל לחץ או משאבת peristaltic. אסוף את eluate לתוך כוס זכוכית 2 ליטר.
  2. elution שנית
    1. חזור על שלבי 1.1 באמצעות 500 מיליליטר נוסף של תמצית בשר בקר 1.5% שנאגרו, אך להגדיל את זמן הקשר אצל שלב 1.1.2 עד 15 דקות.
    2. מוסיפים את תמצית בשר מן elution השני אל מבחנה 2 L המכילים כי מן elution הראשון. הוספת בר ומערבבים סטרילי אל מבחנה.

נוהל ריכוז 2. אורגני הפתתה

  1. לעקר אלקטרודת שילוב מסוג עם תת-כלורי נתרן 0.525% עבור 5 דקות לפחות. יש לשטוף את האלקטרודה עם O סטרילי DH 2 ולאחר מכן טהר עם נתרן תיוסולפט 0.05 מ '. כייל את מד pH באמצעות pH 4 ו -7 סטנדרטים.
  2. מניח את הכוס המכילה את eluate בצלחת ומערבבים. הפעל את הצלחת להגדיל את מהירות ערבוב עד נוצרת מערבולת.
  3. התאם את ה- pH של eluate ל -3.5 ± 0.1 לאט על ידי תוספת חכמה ירידה של 1.2 M HCl אל eluate. מוסיפים את HCl טיפה חכם כי בנוסף מהירה יהיה להשבית וירוס. במהלך תקופה זו eluate תהפוך מעוננת בתור משקע מתחיל להיוצר.
  4. מנמיכים את SPE ערבובed כדי לרגש איטי ולאחר מכן להמשיך לפקח ולשמור את ה- pH של eluate 3.5 ± 0.1 בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  5. יוצקים את ההשעיה תמצית בשר זירז לתוך בקבוקים צנטריפוגות אחד או יותר ו צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 2500 XG ב 4 ° C.. הסר את בקבוקי מתוך צנטריפוגה ואו לשאוב או לאט למזוג supernatant כדי למנוע אובדן של המשקע pelleted. בטל supernatant.
    הערה: לא יכול להיות הבדלים ניכרים בין המון תמצית בשר בכמות והאיכות של המשקע. המשקע המופק המון כמה יתמוסס במהירות תוך כי מתוך המון אחרים מתמוסס בקושי.
  6. הוסף 30 מ"ל של 0.15 M פוספט נתרן אל בקבוק צנטריפוגות המכיל את המשקע.
    1. השתמש 0.15 M פוספט נתרן, pH 9.0 עבור משקעים מתוך המון תמצית בשר הנמסים תוך 5 דקות. מערבבים במשך 10 דקות לאחר המשקע נמס לגמרי, ואז ללכת מיד לשלב 2.7.
    2. השתמש 0.15 M פוספט נתרן, pH 7.0-7.5 לכל משקעים אחרים. מערבבים במשך 10-15 דקות עד להמסה, או משקעים קשים יותר, לשבור אותם עם מרית סטרילי, על ידי ציור הפתרון שוב ושוב מעלה ומטה במהלך ערבוב עם טפטפת, ידי רועדת המשקע ב 160 סל"ד על שייקר מסלולית, או על ידי שילוב של נהלים אלה.
      הערה: בעת שימוש ביותר מהתקן בקבוק צנטריפוגות אחד, לשלב את משקעים באמצעות פחות מ -30 מ"ל של פוספט נתרן ולאחר מכן להשתמש בחלק הנותר של 30 מ"ל לשטוף את הבקבוקים לאחר שילוב של משקעים לתוך בקבוק אחד או כוס.
    3. אם המשקע המשולב בתוך בקבוק צנטריפוגות תחתית שטוחה, מוסיפים בר ומערבבים אל הבקבוק. עבור לשלב 2.6.5.
    4. אם המשקע המשולב בתוך בקבוק צנטריפוגות עם תחתית חרוטים, ולהעביר אותו לתוך כוס זכוכית קטנה ולהוסיף בר ומערבב עד המבחנה.
    5. מניח את הבקבוק או כוס על גבי בוחש מגנטי, ומערבבים עד precipitate נמס לגמרי.
    6. Re-לעקר אלקטרודת סוג בשילוב עם תת-כלורי נתרן 0.525% ו טהר עם 0.05 מ 'נתרן thiosulfate כמתואר שלב 2.1. כייל את מד pH באמצעות pH 7 ו -10 תקנים. לאט ולהתאים את ה- pH של המשקע נמס לגמרי ל -9.0 עם 1 M NaOH ואז ומערבבים במשך 10 דקות.
  7. הסר את בר ומערבבים צנטריפוגות המשקע מומס במשך 10 דקות ב 4,000-10,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס.
  8. יוצקים בזהירות את supernatant לתוך כוס זכוכית מבלי להפריע גלולה. הוספת בר ומערבבים עד כוס וזורקים את הכדור.
  9. מניחים את הכוס על גבי בוחש מגנטי, ומערבבים הפתרון. להוסיף 1.2 M HCl טיפה חכם להתאים את ה- pH ל 7.0-7.5.
  10. סנן לעקר את supernatant על ידי מעבר דרך מסנן לסטריליזציה המכיל prefilter כי כבר pretreated עם 15 מ"ל של תמצית בשר בקר 1.5%, 0.05 מ 'גליצין, pH 7.0-7.5.
  11. Volum לדוגמא Assayחישובי דואר (S):
    1. השתמש משוואת 1 לחשב S עבור כל דגימות הבדיקה, אלא המבוצר המעבדה בלנק מגיב המעבדה בלנק,
      משוואה 1 משוואה 1
      כאשר D (היקף מדגם מים המקורי assayed) הוא 500 L עבור מי תהום, TSV (נפח דגימה סה"כ) הוא הנפח של מדגם השדה עבר דרך מסנן מחסנית 5 האינץ electropositive שקבל במעבדה, FCSV (סופי מרוכז לדוגמא Volume) נפח לאחר סינון בשלב 2.10. דוגמה מוצגת S4.1 סעיף וחומרים משלימים.
    2. חישוב S עבור המעבדת המבוצרת בלנק (LFB; כלומר, בקרת איכות חיובית באמצעות מי כיתה מגיב זרע) ואת מגיב המעבדה בלנק (LRB; כלומר, בקרת איכות שלילית באמצעות מים מגיבים בכיתה) על ידי הכפלת FCSV ב -0.3.
  12. מחלקים את FCSV לתוך thresubsamples דואר.
    1. כן subsamples 1 ו -2 עם נפח שווה 1.04 פעמים את נפח דגימת Assay. להקפיא subsamples אלה בבית או מתחת -70 ° C אם הם לא ניתן לנתח באמצעות assay הווירוס culturable הכולל (subsample 1, השלב 4) או מעובדי המבחנים המולקולריים (מוצג לא) בתוך 24 שעות; אחרת, להחזיק ב 4 ° C..
    2. להקפיא את נפח הנותרים (subsample 3) או מתחת -70 ° C.
  13. חשב את נפח הבידוד על ידי חלוקת S ב -10.

3. וירוס סה"כ culturable Assay quantal

הערה: כל השלבים תמיד להוסיף פתרונות בזהירות כדי להימנע משיבוש monolayer התא.

  1. למזוג או מדיה לשאוב מכלי בדיקה המכילים בשכבה של תאי BGM בבית הפיצול 3-6 ימים לאחר ולאחר מכן להוסיף נפח של תמיסת מלח מאוזנת שווה תקשורת סיר.
  2. למזוג או לשאוב את פתרון המלח המאוזן מן te תרבית תאיםכלי רח בשימוש ואז לחסן את כלי בדיקת תרבית תאים
    1. לחסן 10 כלי בדיקה עבור כל מדגם בדיקה עם נפח של subsample 1 שווה לנפח הבידוד יחד עם בקרות assay quantal הכוללות culturable הווירוס (S2.4 בסעיף חומרים משלימים).
    2. עבור LFB ואת מטריקס מדגם מחוזק מעבדה (LFSM; כלומר, מדגם מטריקס מים זורע), להכין 5, 25, ו 125 דילולים באמצעות subsample 3 ו 0.15 M פוספט נתרן, pH 7.0-7.5 כמו diluent. דוגמה של הליך להכנת דילולים ניתנת S3 סעיף וחומרים משלימים. לחסן 10 כלי בדיקת תרבית תאי שטף לכל סדרת דילול באמצעות נפח בידוד על כל כלי בדיקה בנוסף הכלי מחוסן עם subsample חי 1 בשלב 3.2.1.
    3. עבור כל מדגם בדיקה משלב 3.2.1 (חוץ מאלה מחוסנים בשלב 3.2.2) כי יש CPE בכל 10 המשכפל לאחר 14 ימי הדגירה (ראה שלב 3.3) קדםלקלף 5, 25, ו 125, ו 625-לקפל דילולים של subsample 3. לחסן 10 שטף כלי בדיקת תרבית תאים לכל סדרת דילול באמצעות נפח בידוד על כל כלי בדיקה יחד עם קבוצה חדשה של quantal הווירוס culturable הכולל שולט assay (S2.4 בסעיף חומרים משלימים).
    4. הפץ את הבידוד מעל פני השטח של monolayers התא על ידי הטיית הכלי הלוך ושוב. דגירת כלי הבדיקה בטמפרטורת חדר למשך דקות 80-120 על פלטפורמת נדנדה מכאנית ב 1-5 תנודות / min או עם הנדנדה של הכלי כל 15-20 דקות, כדי לאפשר לכל וירוס נוכחי כדי לספוג לתאים.
    5. הוסף בינוני תחזוקת prewarmed, ולאחר מכן דגירת כלי הבדיקה ב- C ° 36.5 ± 1.
  3. חפש את המראה של CPE בכל כלי בדיקה באמצעות מיקרוסקופ כל יום במשך 3 ד הראשון ולאחר מכן לבחון אותם כל 2-3 ימים עד העברת יום 14. כל כלי בדיקה המראים ≥75% CPE במקפיא נקבע אומתחת -70 ° C. להקפיא את כל התרבויות הנותרים ואת שולטת assay quantal הכולל culturable וירוס או מתחת -70 ° C לאחר בחינת כלי ביום האחרון.
  4. להפשיר את כל התרבויות ולסנן ≥15% של המדיום מכל כלי הבדיקה CPE חיובי דרך פילטר עיקור 0.2 מיקרומטר. אם הנפח המוגדר ולא ניתן להעברה דרך המסנן עקב סתימה, צנטריפוגה בינוני למשך 10 דקות ב 1,500-18,000 XG ו -4 ° C לפני הסינון.
  5. בצע קטע שני של כל כלי הבדיקה מעבר -1 באמצעות כלי בדיקת BGM שטף.
    1. לחסן את כלי בדיקה החדשים עם נפח חיסון מייצג 10% של המדיום המופשר מכל כלי הבדיקה השליליים מהמדיום המסונן מכלי חיובי.
    2. חזור על שלבי 3.2.4-3.4.3, אך להקפיא את כל כלי בדיקה היה שלילי ב -1 מעבר רח וחיובי על 2 nd כמתואר שלב 3.3. בצע גבה 3 rdגיל כמתואר למעבר 2 nd באמצעות הפקדים assay ו בתרביות תאים שלילי רק כי היו שליליות במהלך 1 חלוף רח וחיובי במעבר 2 nd.
  6. זיהוי כלי בדיקה אישית כמו וירוס חיובי כאשר הם מראים CPE הוא -1 ו -2 קטעי nd או, במקרה שבו CPE אינו מתרחש עד חלוף 2 nd, הוא 2 nd ו -3 הקטעים rd.
  7. לשימוש במחשבון המספר הסביר ביותר של USEPA עם הגדרות תכנית ברירת המחדל להגדיר כפי שמוצג בטבלה S2 לחשב את titers הווירוס של כל דגימות הבדיקה.
    1. הזן את מספר כלי הבדיקה לשכפל חיובית וירוס משלב 3.6 עבור כל מדגם הבדיקה לתוך המחשבון כדי לקבוע את ערך MPN / מ"ל (M מ"ל) ואת העליונות (CL UML) ונמוך (CL LML) 95% גבולות הסמך / ערכים מ"ל .
    2. Obtain ערך MPN / L (L M) של מדגם הבדיקה התואם באמצעות 2 משוואה.
      משוואה 2 משוואה 2
      M מ"ל הוא הערך MPN / ml בשלב 3.7, S הוא נפח דגימה Assay, ו- D הוא נפח של דגימת מים מקורי assayed.
    3. חשב את גבול / L אמון העליון על ידי החלפת ערך CL UML עבור הערך M מ"ל. חשב את L / גבול ביטחון נמוך על ידי החלפת ערך CL LML עבור הערך M מ"ל. חישוב דוגמא מוצג S4.2 סעיף וחומרים משלים.
    4. דווח M מ"ל ערכים של 0 כמו ≤ 1 / D. לדוגמה, ≤ 0.002 MPN / L (≤ 1/500 L) עבור דגימות מי התהום.
    5. חשבת את ערכי גבול ביטחון MPN ו -95% עבור כל מעבדה מחוזקת בלנק המעבדה Reהסוכן בלנק ידי הכפלת המ"ל / הערכים הראשונים שהושג במחשבון ידי S ולאחר מכן חלוקת התוצאה ב -0.3.

Representative Results

וירוס התרכז מהמקור מי התהום של מתקני טיהור מי שלוש שתייה מסננת electropositive באמצעות היטב פרטי. שני סטים מדגמים, מורכבת מדגם שדה ובקרת LFSM, נאספו מתקני הטיהור בהזדמנויות נפרדות, וערכת דגימה אחת נאספה מן הבאר הפרטית. התאוששות וירוס בסך הכל נקבע באמצעות דגימות LFSM משני של צמחים ובעלי הבאר פרטית (שתי דגימות מצמח אחד מדגם אחד למשנהו לא נכללו בחישוב מפני ששווי MPN מזרע בשימוש עם כל דגימה לא ניתן לקבוע במדויק בשל לתוצאות CPE נורמליות בין צלוחיות לשכפל). Mean התאוששות poliovirus ממדגמים תהום בממוצע 58% עם מקדם השונה של 79% (איור 2) 16. אין וירוסי culturable זוהו באף אחד דגימות תחום מים הכפולות unseeded קרקע.

ביצועי שיטה גם נמדדו באמצעות LFB samples שונה באמצעות שתי רמות זרע שונות. כייל "נמוך" של 300 MPN של poliovirus שמש להעריך את ביצועים ברמות פחות מאשר 500 MPN LFB הרמה "הסטנדרטית" המשמשת USEPA שיטת 1615. כייל "גבוה" של 1,000 MPN של poliovirus שמש כדי לבדוק ביצועים בבית רמת השליטה LFSM. בקרות אלה באופן דומה עם התאוששות ממוצעת של 111% וכן מקדם שונה של 100% (איור 2). כל LRB הדגימות היו שליליות וכל דגימות LFB בצעו בטווח הקבלה (S1 טבלת חומרים משלימים).

איור 1
איור 1. מסנן Elution. סכימטי לשימוש במיכל הלחץ elution מסנן מחסנית מוצג. לחץ אוויר חיובי משמש לדחוף פתרון תמצית בשר במיכל הלחץ דרך con דיור מחסניתtaining מסנן מחסנית electropositive. משאבת peristaltic ניתן להחליף עבור מיכל הלחץ, עם הכניסה של המשאבה שתוצב בתוך המכל מחזיק פתרון תמצית בשר.

איור 2
איור 2. ממוצע poliovirus Recovery (%) מגראונד ו מגיב-כיתה מים. ההתאוששות אחוז ממוצע מוצג עבור שנגיף הפוליו מן הקרקע ( איור 3 ; n = 4) ומים מגיבים כיתה ( איור 4 ; n = 12) דגימות. שנים עשר דגימות מים כיתה מגיב כלל שישה זורעים עם 300 MPN ושישה זורעים עם 1,000 MPN של poliovirus. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן.

Discussion

USEPA שיטת 1615 פותחה לשימוש במהלך מחזור הניטור השלישי של תקנת הניטור המזהמת ללא פיקוח (UCMR3) 17 ו מיועדת בעיקר למדידת התרחשות וירוס במי תהום. היא חולקת מספר צעדים משותפים עם כלל איסוף מידע (ICR) השיטה, 15,18 אבל יש שני הבדלים קלים. שניהם להשתמש מבחני quantal למדוד וירוס מייצרי CPE על משטחי תא BGM עם quantitation בהיותה מבוססת על חישובים רוב מספר Probable (MPN). השיטה 1615 מאפשרת השימוש במסנן electropositive חדש לריכוז מוירוס מטריצות מים שונים מפחיתה את מספר כלי בדיקת תרבית תאים משכפל לכל דילול מ -20 עד 10. שניהם שינויים קלים להפחית עלויות שיטה כוללות. הירידה במספר משכפל מפחית עבודה, אבל התוצאה היא גבול הגילוי נמוך במקצת. למרות groundwaters צפוי להיות בעלי ריכוזים נמוכים של וירוסים מאשר מים עיליים, 19,20 הכמות מדגם E assayed גבוה פי חמישה מריכוז של מים עיליים, פיצוי בין השאר על ההבדלים. השימוש משכפל יהיה פחות נאות עבור המים העיליים ביותר, אבל כמה ידרשו דילול מדגם.

יש שיטה 1615 מספר צעדים ומגבלות קריטיים. תמציות בשר להשתנות ממגרש למגרש. כל הרבה צריך ייבדקו אפקטיבי של elution הווירוס ואת יכולת ריכוז וירוס לאורך שלבי ריכוז משני כמתואר הוא S2.3 סעיף וחומרים משלימים. השיטה משתמשת בנוסחאות מדויקות לחישוב כמות מדגם לחסן על תרביות תאים BGM ולקבוע titers וירוס. תוצאות לא מדויקות תופקנה אם נוסחות אלה אינן אחריו בקפדנות. טכניקת aseptic פרופר חייבת לשמש לשמירה על תרביות תאים. שולט נגוע תרבית תאי BGM המראים מצוקה במהלך תקופת דגירת 14 היום להצביע על בעיות סבירות עם תחזוקת תרבית תאים. בזהירות רבה גם חייבת להיות taקן במהלך pipetting השלבים הכרוכים עם חיסון של והוספת בינוני עד צלוחיות תרבית תאים, כדי למנוע זיהום צולב. פקדי האיכות המתוארים S2 סעיף חומרי משלים חייבים להיות מלווה בקפדנות. סעיף S2 גם מספק ייעוץ לפתרון בעיות איכות.

המנגנון העיקרי של ספיחת נגיף electropositive מסנן אינטראקצית תשלום הקשורים לחוזק של המטען החיובי על המסנן ואת הכח של המטען השלילי "הווירוס הקשורים חודה איזואלקטרית ואת ה- pH של המים נבדקים 21. Elution ממסנני מושפע גם את עוצמת האינטראקציות הללו. כי הם משתנים בין סוגי וירוס ואפילו בין זנים בתוך אותו הסוג, elution מהמסננים אינו אחיד. משמעות הדבר היא כי כל תוצאה שעלולה להמעיט בהערכת רמת בפועל של וירוס נוכחי במי סביבה. השימוש של הקו הסלולרי BGM היחיד גם מזלזל התרחשות וירוס. הטווחשל וירוס מעיים שיכולים לייצר CPE בתור תא זה בעיקר מוגבל polioviruses ו קפסיד מינים enterovirus B, כמו גם כמה reoviruses 14,15,22. סוגי וירוס מדבק אחרים לא יזוהו.

החלמת poliovirus ממי קרקע כיתה המגיבה עמדה בקריטריונים לקבלת ביצועי USEPA שיטת 1615 הן הערכת הביצועים (PE; כלומר, דגימות מי כיתה מגיבה זורעת עם טיטר הידוע אנליסט המשמשים כדי להעריך את הביצועים של המטפל לפני התחילה מחקר) ודגימות LFB (S1 טבלת חומרים משלימים). התאוששות 58% ממי תהום באמצעות הליך התרבות דומה לזו שדווחה על ידי אחר באמצעות ברז מים 23,24. ההתאוששות הממוצעת מתחיילת דגימות LFB של 111% עם מקדם שונה (CV) של 100% גם פגשה את הקריטריונים לקבלת ביצועי שיטה למרות שהם גבוהים מזה שנצפה עבור דגימות PE during ICR. ICR מתכוון התאוששות מעבדתיות הייתה 56% עם מקדם השונה (CV) של 92% תוך החלמת intralaboratory ממוצע נעה בין 36 ל -85% (קו"ח 58 כדי 131%; נתונים שלא פורסמו ממסד נתוני PE ICR). החלמה גבוהה נצפתה במחקר זה עבור דגימות נמוכות זרע LFB מאשר דגימות זרע גבוהות יותר (122 לעומת 42%). בזמנו כי ICR היה מתוכנן, זה היה צפוי כי דגימות PE קבלת ערכי זרע נמוכים תצטרכנה התאוששות נמוכה כי מקבלי זרעים גבוהים. דומה לזה שנצפה כאן עבור דגימות LFB, התאוששות poliovirus עבור דגימות PE ICR היו 71% (CV 100%), 54% (CV 69%), ו -44% (CV 71%) עבור ערכים זרע ≤300 MPN, 300 1,500 MPN, ו> 1,500 MPN, בהתאמה.

ישנן שיטות רבות למדידת וירוס מדבק בדגימות מי 25. שיטה זו היא משמעותית ביחס לשיטות אחרות במידת סטנדרטיזציה. הסטנדרטיזציה לא רק כוללת בקרות איכות וביצועים,אלא גם משתמש כרכים ונוסחות מוגדרים על מנת להבטיח כי כל מעבדות האנליטיות לבצע את השיטה זהה. ללא סטנדרטיזציה, קשה להשוות את התוצאות על פני מעבדות, ולכן תקינה חיונית בעת ביצוע מחקרים רחבי היקף מעבדות אנליטיות מרובות. עם סטנדרטיזציה מובנית בשיטה זו ניתן להרחיב בעתיד לכלול סוגי וירוס נוספים שורות תאים. מחקר מתנהל כדי לספק נתונים עבור הכללת אדנו לתוך השיטה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beef extract, desiccated powder BD Bacto 211520
Cryogenic tubes Thermo Fisher 3775/945373
Hank’s balanced salt solution Invitrogen 14170-112
Mechanical rocking platform Daigger EF4907G
Orbital shaker Thermo Fisher 14-285-729
Sterilizing filter with prefilter VWR 28143-295
Sterilizing syringe filter Corning 431219
pH Standards Sigma-Aldrich 33643, 33646, 33648
MEM Sigma-Aldrich M1018 or M4642
Leibovitz L-15 Sigma-Aldrich L4386
Sodium bicarbonate, 7.5% Sigma-Aldrich S8761
Fetal bovine serum Invitrogen 10082-139
Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062
Trypsin, EDTA Invitrogen 25200072

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bradbury, K. R., et al. Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells. Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).
  2. Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters. J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).
  3. Begier, E. M., et al. An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico. Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).
  4. Anderson, A. D., et al. A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001. J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).
  5. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. Norovirus gastroenteritis. N.Engl.J. Med. 361 (18), 1776-1785 (2009).
  6. Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. Enterovirus surveillance--United States. MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).
  7. Sawyer, M. H. Enterovirus infections: diagnosis and treatment. Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).
  8. Abzug, M. J. The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative. Hot Topics in Infection and Immunity in Children. Finn, A., Pollard, A. J. , Springer. (2008).
  9. Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).
  10. Ho, M., et al. An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan. New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).
  11. Bae, J., Schwab, K. J. Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater. Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).
  12. Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water. Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).
  13. Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus. Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).
  14. Dahling, D. R., Wright, B. A. Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).
  15. Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W. 3rd, Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178. ICR Microbial Laboratory Manual. , U.S. Environmental Protection Agency, I. (1996).
  16. Cashdollar, J. L., et al. Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water. Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).
  17. USEPA. 40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule. Federal Register. 77 (85), 26072-26101 (2012).
  18. USEPA. 40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule. Federal Register. 61 (94), 24353-24388 (1996).
  19. Shaw, S., Regli, S., Chen, J. Virus occurrence and health risks in drinking water . Information Collection Rule Data Analysis. McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. , AWWA Research Foundation and American Water Works Association. 437-462 (2002).
  20. Lieberman, R. J., et al. Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies. , American Water Works Association. Denver, CO. (2002).
  21. Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. Influence of salts on virus adsorption to microporous filters. Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).
  22. Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994. Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).
  23. Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).
  24. Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).
  25. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).

Tags

במדעי הסביבה גיליון 115 וירוס זיהומיות המועברות במים ריכוז איתור התרחשות assay וירוס culturable הכולל
מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה"כ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA… More

Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (115), e52437, doi:10.3791/52437 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter