Abstract
In de meeste vertebraten, de lever produceert gal die nodig is om emulgeren vetten geabsorbeerd en kan de vertering van vetten in de dunne darm en aan bilirubine en andere metabole producten uitscheiden. In de lever, de experimentele obstructie van de extrahepatische galwegen een complexe cascade van pathologische gebeurtenissen die leidt tot cholestase en ontsteking resulteert in een sterke fibrotische reactie afkomstig van de periportale velden. Daarom chirurgische ligatie van de galwegen is uitgegroeid tot de meest gebruikte model om obstructieve cholestatische letsel bij knaagdieren induceert en de studie van de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die deze pathofysiologische mechanismen veroorzaakt door ongepast galstroom ten grondslag liggen. De afgelopen jaren zijn verschillende chirurgische technieken beschreven die ofwel toestaan opnieuw verbinden of reanastomosis na galkanaal ligatie (BDL), bijvoorbeeld gedeeltelijk BDL of andere microchirurgische methoden voor bepaalde vraagstellingen. De meest gebruikte model is de volledige obstructie van de galwegen dat een sterke fibrotische respons na 21 tot 28 dagen induceert. Het sterftecijfer kan hoog zijn als gevolg infectieuze complicaties of technische onnauwkeurigheden. Hier geven we een gedetailleerde chirurgische procedure voor de BDL model in muizen die zeer reproduceerbare fibrotische reactie volgens de 3R regel voor dierenwelzijn geponeerd door Russel en Burch in 1959 induceren.
Introduction
Leverfibrose wordt gedefinieerd als overmatige productie en de accumulatie van extracellulaire matrix (ECM) dat afkomstig interactienetwerk van matrixproducerende hepatische stellaatcellen en diverse lever gevestigde en infiltrerende cellen bloedcellen 1,2. Hoewel hepatische fibrose kan worden veroorzaakt door een veelheid van verschillende stimuli de moleculaire mechanismen fibrose algemeen vergelijkbaar. Naar aanleiding van leverschade, is een zeer georkestreerd programma van de moleculaire en cellulaire veranderingen geïnitieerd. In dit programma een nauwe interactie tussen inflammatoire signalen, monocyten / macrofagen en leverstellaatcellen gebeurt dat aan het einde resultaten in stellaatcellen cel activatie en transdifferentiatie tot myofibroblasten, ECM afzetting en opeenvolgende anatomische en functionele veranderingen van leverweefsel integriteit 3. Activering van leverstellaatcellen wordt vooral gedreven door inflammatoire signalen en interacties met de leverwoon macrofagen (dat wil zeggen de kupffercellen). Pathogeen geassocieerde moleculaire patronen worden herkend door specifieke receptoren patroonherkenning, zoals de Toll-achtige receptoren die bij activering signaal door een complex netwerk van verschillende paden die de expressie en uitscheiding van een veelheid van inflammatoire cytokines en chemokines dat het ontstekingsproces 3 trigger station. De ontstekingsreactie en de gevormde hepatische insult slechts tijdelijk wanneer de ziekteverwekkende factor verwijderd. Als daarentegen de verwonding voortduurt, chronische ontsteking evolueert in de lever en de expressie en accumulatie van ECM drukte in de voorgrond waardoor geleidelijke vervanging van normale leverparenchym door littekenvorming.
Aangezien de lever fibrogenese bij de mens is een wereldwijd klinisch probleem, hebben verschillende experimentele diermodellen voor acute en chronische leverfalen is vastgesteld tijdens de laatste decennia. In de muRine systeem bijvoorbeeld gangbare modellen zijn de toediening van een verscheidenheid van verschillende hepatotoxines, de ligatie van de galbuis, inductie van immuungemedieerde leverbeschadiging en de gerichte invoering van gendefecten of vice versa de overexpressie van transgenen die essentieel beïnvloeden signaaltransductiewegen betrokken bij de pathogenese van leverfibrose 4.
Ligatie van de galbuis bij knaagdieren is uitgevoerd als een experimentele procedure onderzoek dat gedurende vele jaren 5-8. Een eerste zeer reproduceerbare protocol Langdurige galkanaal ligatie (BDL) bij knaagdieren werd nu al meer dan dertig jaar geleden 9 gepresenteerd. In dit protocol beide infusen / obstructie en ligatie induceerde een hoge opbrengst van cirrose in ratten met morfologische veranderingen die met die waargenomen in menselijke biliaire cirrose 9 waren. De respectieve protocol is eenvoudig, de chirurgische procedure is relatief snel toepasbare, En de overlevingskansen van de dieren zijn hoog met meer dan 95%. In de klassieke rat canulering / obstructie-protocol, wordt een korte incisie van 2 cm net onder de zwaardvormig proces gemaakt. Daarna wordt een canule in het proximale deel van de galwegen geplaatst en in positie met zijden hechtingen vast. In een volgende stap wordt het distale gedeelte van de canule geblokkeerd met 3 knopen gebracht door het ondereinde van de middellijn incisie en begraven subcutaan in het kwadrant rechtsonder 9. Aan het eind wordt de buik gesloten en dieren zich herstellen. In de ligatie protocol, worden de ratten onderworpen aan dubbele ligatie van de galbuis met of zonder ontleding van de galwegen tussen de ligaturen 9.
Deze experimentele model is goed geaccepteerd en wereldwijd gebruikt in honderden laboratoria aan de lever cholestase en fibrose veroorzaken. Het induceert intrahepatische galwegen epitheelcelproliferatie, myofibroblastische differentiation portaal fibroblasten rond prolifererende biliaire epitheelcellen, hetgeen resulteert in een zeer reproduceerbare, massieve expressie en afzetting van ECM 10,11. Daarom wordt de toepassing van dit model in ratten en muizen zijn populair onder wetenschappers die gericht zijn op de pathogenese van leverontsteking en fibrose begrijpen.
In ons laboratorium hebben we uitgebreid gebruikt dit protocol in het verleden bij ratten in verschillende experimentele studies gericht op speciale moleculaire en cellulaire aspecten van de lever fibrogenese onderzoeken en om nieuwe antifibrotische concepten en drugs 12-15 testen.
Onlangs, passen wij deze methodologie aan het systeem van muizen en vond dat het galkanaal ligatie chirurgie is ook een aantrekkelijk middel om tijdsafhankelijke fibrose leggen met lage variatie en mortaliteit bij muizen 16-18. Vanwege de kleinere grootte van de dieren echter een aantal belangrijke wijzigingen ten opzichte van anesthesie, chirurgische interventie inention en nabehandeling observatie noodzakelijk om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te verkrijgen in dit model. De volledige aanpassing is samengevat in het volgende protocol en de bijbehorende videodocumentatie.
Protocol
OPMERKING: Alle experimenten werden goedgekeurd door de officiële State dier zorg en gebruik commissie (LANUV, Recklinghausen, Duitsland). De muizen zijn gehuisvest onder specifieke-pathogeen-vrije omstandigheden volgens de richtlijnen van de Federatie voor Proefdierkunde Verenigingen (FELASA). Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse federale wet betreffende de bescherming van dieren en de 'Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren' (National Institutes of Health publicatie 8 e editie, 2011).
1. prechirurgische Voorbereiding
OPMERKING: Alle bewerkingen onder schoon, maar niet-steriele omstandigheden. Alle instrumenten en andere herbruikbare materialen zoals chirurgische forceps, scharen, en Colibri oprolmechanisme die worden gebruikt voor chirurgie moet worden gesteriliseerd volgens de protocollen die strikt volgens de institutionele richtlijnen voor het uitvoeren van operaties bij dieren.; Voor een gedetailleerde lijst van noodzakelijke reagentia, materialen en apparatuur, verwijzen wij u naar de lijst van specifieke materialen / apparatuur.
- Gedurende de volledige proefneming, blijven de dieren op een verwarmingsplaat op een temperatuur van 37 ° C, permanent verbonden met een anesthesie-systeem, en het deksel het operatiegebied overall met vloeistofondoorlaatbaar, zelfklevend gordijnen. Goed leg alle instrumentatie en oplossingen die worden gebruikt tijdens de experimenten voor de operatie (figuur 1).
- Verdoven de muis met inhalatie van 4 vol% isofluraan in 100% zuurstof met een stroomsnelheid van 4 l / min voor de inductie van de anesthesie. De diepte van de verdoving voldoende is wanneer de volgende essentiële criteria worden bereikt: regelmatige spontane ademhaling, geen reflex na het instellen van pijnprikkels tussen de tenen, en geen reactie op pijn.
- Scheer de buik vacht van de muis met een elektrisch scheerapparaat vacht en de ogen te beschermen tegen uitdroging door het gebruik van oog en nose zalf.
- Plaats de muis op een temperatuur van 37 ° C verwarmd hete plaat, plaatst u de muis snuit in de Fluovac masker van de Fluovac anesthesie-systeem, en bevestig de poten van het dier met strepen van zijde tape.
- Handhaaf verdoving van de muis door inademing van 1,5-3 vol% isofluraan in 100% zuurstof bij een debiet van 1 l / min en introduceren perioperatieve analgesie via intraperitoneale injectie van buprenorfine-oplossing (0,1 mg / kg opgelost in 0,9% NaCl-oplossing) .
- Steriliseer de geschoren buikhuid met een gaasje wattenstaafje dat bevochtigd is met een standaard antiseptische, klaar voor alcoholische oplossing gebruiken voor preoperatieve behandeling van de huid. Opmerking: In onze protocollen gebruiken we een poly-alcohol huid antisepticum. Dit is volledig in overeenstemming met de Duitse federale wet betreffende de bescherming van dieren en de richtlijnen van de Federatie voor Proefdierkunde Verenigingen. Deze antiseptische bevat 70% (v / v) 2-propanol, butaan-1,3.diol en sporen van chinolinegeel en perfume.
2. Chirurgische ingrepen
- Open de buik met een middellijn laparotomie een lengte van ongeveer 2 cm hierdoor de cutis plus fascia tegelijkertijd een 11.5 cm chirurgische schaar.
- Prepareer het bindweefsel bovenop het peritoneum door de schaar als spreader.
- Knip het buikvlies langs de linea alba de peritoneale holte te openen.
- Vergroot de holte door het invoegen van een deelneming hechtdraad in het borstbeen, het verhogen van de gloeidraad van de hechtdraad, en de vaststelling van het op de top van de Fluovac masker.
- Verdeel het operatiegebied door het met een Colibri oprolmechanisme in de peritoneale holte (figuur 2).
- Til de lever met een gehydrateerd (0,9% NaCl-oplossing) wattenstaafje zodat de ventrale kant vastzit aan het membraan en de hilus duidelijk zichtbaar.
- Expose de galwegen door caudale beweging van de darm (figuur 3).
- Scheid voorzichtig de galwegen van deflankerende poortader en de leverslagader behulp van een micro-vertanding pincet (Figuur 4A).
- Plaats de met 5-0 hechtdraad rond de galwegen en bevestig deze met twee chirurgische knopen. Wanneer koppelverkoop de knopen verhogen de trekkracht voortdurend om effectieve obstructie garanderen zonder het doorsnijden van de galwegen (Figuur 4B).
- Voeg een tweede craniale ligatie op dezelfde wijze maar niet ontleden de galwegen tussenruimte (figuur 4C). Anders is er een aanzienlijk risico dat de gal lekken als men knoop niet veilig is, en de dieren geen cholestase maar ernstige peritonitis ontwikkelen.
- Snijd de uiteinden van de hechtingen (Figuur 4D), hoe lager het borstbeen, en verwijder het oprolmechanisme.
- Spoel de peritoneale holte met een 0,9% NaCl-oplossing en vervang de buikorganen de fysiologische functies.
- Sluit beide buik lagen (buikvlies en cutis plus dashboard) met aparte lopende hechtingen met 6-0 Mersilk.
- Snijd de ends van de hechtingen en steriliseer het operatiegebied met een gaasje wattenstaafje bevochtigd met een antiseptische oplossing.
OPMERKING: Bij het uitvoeren van de operatie voor de eerste keer, het uitvoeren van alle procedures in het kader van een chirurgische microscoop bij een vergroting van 16X-20X. Dit maakt een betere erkenning van de galwegen en duidelijk onderscheidt van de poortader en leverslagader (figuren 5 en 6). Sommige laboratoria raden de dissectie van de galwegen in tussen de twee ligaturen. Laat de galwegen intact omdat eventuele lekken in een van de knopen leidt tot ernstige acute peritonitis, ascites, en systemische endotoxemie bij de galwegen wordt ontleed.
3. Postoperatieve behandeling en follow-up
- Laat de muis te herstellen in een kooi opgewarmd door een infrarode lamp totdat de muis volledig wakker en actief.
- Daarna beweegt u de muis naar een normale kooi en zorgen voor ad libitum toegang tot water en voedsel.
- Eenfter de operatie, toezicht houden op de dieren op geregelde tijdstippen en uitvoeren van follow-up postoperatieve behandeling met geschikte analgesie (bv buprenorfine oplossing) naar aanleiding van de lokale aanbeveling van de interne verzorging van dieren en het gebruik van de commissies.
OPMERKING: Voer pijnstillende therapie voor 3 dagen. Elke abnormaal gedrag kunnen zeldzame complicaties zoals peritonitis, sepsis of interne bloeden te vermelden en moet behandeld worden als mens eindpunt om het experiment te beëindigen. - Dieren worden gehouden met vrije toegang tot voedsel en water ad libitum tot het einde van het experiment. Er is geen noodzaak voor bloedafname zijn gaande fibrogenese wordt aangegeven met geelzucht.
- Wanneer de dieren worden geofferd, wordt bloed afgenomen voor het meten van klinische chemie parameters (AST, ALT, bilirubine etc.) en de lever wordt opgehaald voor histochemische en biochemische analyse.
Representative Results
In een typisch experiment werd BDL uitgevoerd in 40 mannelijke C57BL / 6 wild-type muizen gewicht ongeveer 18-20 gram. Dit experiment werd gedaan om lever fibrogenese in de initiatiefase (3 en 7 dagen) gedurende progressie (10, 14, en 20 dagen) te onderzoeken, en bij langdurige (30 en 60 dagen) 16. In dit model is persinusoidal fibrose reeds ontwikkelde op dag 10 na de operatie, terwijl periportale fibrose die permanent verhoogd tot het einde van het experiment was volledig ontwikkeld na 20 dagen. In de genoemde experiment alle dieren met een eenvoudige sham-operatie ontvingen overleefden en slechts twee van de 40 muizen (5%) dat BDL ontvingen ontwikkelden een slechte algehele conditie en werden daarom voortijdig gedood vóór het beoogde eindpunt van het experiment. De activiteit van schijn-geopereerde dieren was zonder uitzondering al normale dag na laparotomie terwijl de meeste dieren die aan BDL vertoonden verminderde activiteit gedurende de eerste drie dagen. Jaundiced huid reeds duidelijk was in alle BDL dieren één of twee dagen na het instellen van de BDL 16.
De waarden van zowel alanine aminotransferase (ALT) en aspartaat transaminase (AST) die gevestigde serum markers voor leverbeschadiging vertegenwoordigen snel toegenomen en piekte gedurende dag 7 en dag 20 na BDL (Tabel 1). Daarna, ALT en AST gestaag gedaald tot en met dag 30 en bleef stabiel tot 60 dagen na de operatie. In lijn met de cholestatische blessure, serumconcentraties van totaal bilirubine waren gestaag verhoogde en een plateau bereikt na 7 dagen 16. Vergelijkbare tijdsverloop van ALT en AST serum activiteiten werden ook gemeld voor ratten die BDL onderging. In een recente studie werd aangetoond dat serum AST en ALT niveaus verhoogd tot 5 of 10 maal normaal in de eerste week na de operatie en BDL af na twee weken 19.
Kenmerkend is dat de levers van schijn-geopereerde dieren kijken nog smooth aan het einde van het experiment, terwijl de levers van dieren die BDL ontvangen blijkt architecturale veranderingen die voornamelijk gekenmerkt door de vorming van oedeem en fibrotische knobbeltjes op het oppervlak van overeenkomstige levers en hydrops van de galblaas die is gevuld met grote hoeveelheden gal (Figuur 7). De karakteristieke morfologische veranderingen van de lever die worden geïnduceerd door de BDL operatie ook aantoonbaar in standaard histologische analyse (figuur 8).
In dezelfde reeks experimenten, de ontwikkeling van leverfibrose was semi-kwantitatief beoordeeld op basis van de leverhistologie geëvalueerd door een geblindeerde patholoog met behulp van een scoresysteem waarbij periportale fibrose werd opgevoerd 0-4 en perisinusoïdale fibrose 0-2, waardoor een maximale waarde die gelijk is aan cirrose van 6. was, zoals verwacht, de gemiddelde score voor fibrose in de groep van schijn-geopereerde dieren was 0.00 ± 0.00. Daarentegen in de groep dieren thoed ontvangen BDL, de score gestaag toegenomen tot en met dag 60 tot een waarde van 4,83 ± 0,17. Het maximum van 3 voor periportale fibrose werd bereikt op dag 20. Alle dieren geanalyseerd perisinusoïdale fibrose afwezig gedurende de eerste 10 dagen van het experiment was eerst zichtbaar na twee weken. Daarna gestaag verhoogd tot het einde van het experiment met waarden van 1,8 ± 0,17 (Tabel 1).
In verscheidene andere onafhankelijke dierproeven die werden uitgevoerd, werd waargenomen dat de vorming van fibrose was zeer reproduceerbaar showing tijdsafhankelijke toename van intrahepatische collageen expressie en afzetting als gevolg van voortdurende fibrogenese (figuur 9). Ook de werkwijze van lopende fibrogenese merkbaar tot verhoogde expressie van α-gladde spier actine (α-SMA) die een merker van fibroblast cellen vormt: geactiveerde hepatische stellaatcellen en myofibroblasten portal,en hepatische hydroxyproline, een aminozuur overvloedig in collageenmatrices 18 (figuur 9). Verder wordt de expressie van vimentine die aangeeft toenemende hoeveelheden myofibroblasten en fibroblasten toe na het instellen van de BDL operatie 20. De gelijktijdigheid van ontsteking in gewonden levers worden verder weerspiegeld door verhoogde expressie van Lipocaline 2 (LCN2) dat sterk wordt geïnduceerd tijdens acute en chronische leverschade en evolueert lever en beschermende effecten tijdens acute leverschade 21,22.
Ontstekingscellen dat de levers van dieren die BDL ontvangen infiltreren kan worden gedetecteerd door specifieke kleuring met een antilichaam dat specifiek is voor CD45 (Figuur 10). Deze celoppervlak marker die ook bekend staat als PTPRC (proteïne tyrosine fosfatase, receptor type) specifiek uitgedrukt in alle gedifferentieerde hematopoëtische cellen behalve erytrocyten en plasmacellen.
| Tijd na galweg ligatie (dagen) | Totaal bilirubine | AST (U / L) | ALT (S / L) | Portal fibrose | Perisinusoïdale fibrose | Totaalscore |
| (Mg / dl) | ||||||
| 0 (n = 3) | 0.17 ± 0.06 | 192,67 ± 30.50 | 50.33 ± 6.03 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 |
| 3 (n = 5) | 6.85 ± 2.21 | 1159,25 ± 319,27 | 566,50 ± 335,25 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 |
| 7 (n = 5) | <td> 14.38 ± 2.14 ±976,60 ± 477,16 | 448,20 ± 259,47 | 0.60 ± 0.25 | 0.0 ± 0.0 | 0.60 ± 0.25 | |
| 10 (n = 5) | 15.92 ± 2.60 | 1916,60 ± 868,25 | 560,40 ± 80.88 | 1.40 ± 0.25 | 0.25 ± 0.25 | 1.67 ± 0.25 |
| 14 (n = 5) | 17.90 ± 3.84 | 1088,60 ± 276,32 | 505.00 ± 96.15 ± | 2.4 ± 0.25 | 1.0 ± 0.0 | 3.40 ± 0.24 |
| 20 (n = 4) | 18.00 ± 2.12 | 1072,67 ± 364,27 | 404,00 ± 195,48 | 3.0 ± 0.0 | 1.0 ± 0.0 | 4.0 ± 0.0 |
| 30 (n = 5) | 16.04 ± 4.79 | 446,40 ± 169,75 | 260,20 ± 126,97 | 2,8 ±; 0.2 | 1.4 ± 0.25 | 4.20 ± 0,20 |
| 60 (n = 6) | 16.02 ± 1.19 | 484,67 ± 117,79 | 257,17 ± 50,97 | 3.0 ± 0.0 | 1,8 ± 0,17 | 4.83 ± 0.17 |
Afkortingen gebruikt zijn: ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartaataminotransferase.
Tabel 1: Fibrose maken in een representatief experiment De gegevens van deze tabel is overgenomen uit een studie waarin leverfibrose werd geïnduceerd door galkanaal ligatie in C57BL / 6 muizen. 16. In deze studie, het sterftecijfer na de BDL operatie was 5% (2 van de 40 dieren werden voortijdig opgeofferd omdat arme dier omstandigheden ontwikkeld).
Figuur 1: Experimentele opstelling voor het uitvoeren van een galduct ligatie. Het dier er op een verwarmingsplaat op een temperatuur van 37 ° C en het operationele gebied algemeen bedekt met vloeistof ondoorlaatbare, zelfklevend gordijnen. Tijdens de volledige chirurgische ingreep, wordt het dier permanent met een anesthesiesysteem. Alle bezettingen en oplossingen (analgetica, anesthetica, antiseptische oplossing, 0,9% NaCl) zijn overzichtelijk.
Figuur 2:. Bereiding van de operatiekamers Voorafgaande opening van de peritoneale holte, dient de buikhuid worden geschoren met een elektrisch scheerapparaat bont en ontsmet met een antiseptisch doekje gaas. De operatie gebied wordt vervolgens bedekt met vloeistof ondoorlaatbare, zelfklevend gordijnen. Het abdomen wordt geopend met een middellijn laparotomie (~ 2 cm lang). De holte wordt vergroot door het inbrengen van een hechtdraad die in het borstbeen en het operatiegebied verspreid doorinbrengen van een Colibri oprolmechanisme waardoor ongehinderde experimenten tijdens de operatie.
Figuur 3: Blootstelling van de galwegen. (A) voor het uitvoeren van de galwegen ligatie, wordt de buikzijde van de lever opgeheven, zodat het kan vasthouden aan het middenrif en de lever hilus duidelijk zichtbaar wordt. (B) Om de galwegen beter bloot te leggen, wordt de darm caudaal verplaatst met een bevochtigd wattenstaafje. De galweg wordt aangegeven met een pijl.
Figuur 4: ligeren van de galwegen. (A) In een eerste stap wordt de galwegen zorgvuldig gescheiden van de flankerende poortader en leverslagader behulp van een micro-vertanding pincet. (B) Vervolgens wordt een hechting geplaatst rondde galwegen en vastgezet met een chirurgische knoop. (C) Daarna wordt een tweede hechtdraad geplaatst in de nabijheid van de eerste hechting en geknoopt rond de galwegen. (D) De hechtdraad wordt verkort, de holte gespoeld met 0,9% NaCl-oplossing en alle organen vervangen om de fysiologische functie.
Figuur 5:.. Nauwkeurige weergave knoop- Om de plaatsing van de hechtingen en de instelling van de twee knopen die galstroom verhinderen documenteren dezelfde procedure van figuur 4 werd gedocumenteerd onder een binoculaire (A) Beperking van de galwegen met eerste hechtdraad. (B) Knopen van de eerste hechting. (C) Opsluiting van de galwegen met de tweede hechtdraad. (D) Knopen van de tweede hechtdraad. (E) Dubbelklik geligeerd gal duct na inkorten van overtollige hechtingen. (E) Dit paneel toont een schets van (E). De posities van de rechter (rl), links (ll) en mediane (ml) lobben van de lever en de galwegen, maag en duodenum worden letters. In de schets van de galwegen wordt dubbel geligeerd door twee hechtingen.
Figuur 6:. Anatomie van de galwegen, de poortader en de leverslagader bij muizen Voor een betere anatomische locatie van de galwegen, de poortader en de leverslagader worden afgeschilderd als een regeling. Gemarkeerd zijn ook de posities van de rechter (rl), links (ll) mediaan (ml) en de caudate (d) lobben van de lever.
Figuur 7: Vertegenwoordiger appearanvu van levers 2 weken na schijnoperatie en BDL. C57BL / 6 muizen werden onderworpen aan bewerking of BDL sham operatie. Na twee weken is de viscerale holte werd geopend. Terwijl de levers van schijn-geopereerde dieren vertoonden geen teken van fibrose, de levers van dieren die ligatie van het galkanaal had een onregelmatige oppervlaktestructuur met oedeemvorming en fibrotische knobbeltjes op het oppervlak van overeenkomstige levers.
Figuur 8:. Hematoxyline en eosine kleuring lever secties werden bereid uit C57BL / 6 wildtype dieren die sham bediende waren (A) of ontvangen BDL drie weken (B). De secties werden gekleurd met hematoxyline en eosine volgens standaardprocedures. Let op de typische veranderingen binnen de BDL lever die tekenen van ontsteking (infiltreren cellen), parenchymale (lever bevattencyte) necrose, en proliferatie van galwegen. De schaal bar in elke figuur panel vertegenwoordigt 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9: histologische en biochemische uitlezingen voor de lever fibrogenese. (A) Lever secties werden bereid uit dieren die schijnoperatie of BDL na 2 weken en gekleurd met Sirius Red (bovenste paneel, collageenvezels in rood) of voor expressie van α-gladde spier actine (α-SMA) (onderste paneel geanalyseerd , α-SMA positieve cellen in bruin) door immunohistochemie. De schaal bar in elke figuur panel vertegenwoordigt 100 micrometer. (B) Eiwitextracten uit levers werden onderworpen aan Western blot en voor Expre geanalyseerdssion van collageen type I, α-SMA, en Vimentin die goed zijn gevestigd markers van de lever fibrogenese. De expressie van Lipocaline-2 (LCN2) geeft de ontstekingsreactie die wordt geassocieerd met de lopende fibrogenese. In deze analyse werd gelijk eiwitbelading aangetoond door het sonderen van de vlekken met een antilichaam specifiek voor β-actine. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 10:. Immunologische kleuring van infiltrerende cellen Seriële leversecties werden bereid uit een lever van een dier dat bile duct ligatie na 3 weken. De secties werden gekleurd met hematoxyline en eosine (A) of met een antilichaam dat specifiek is voor CD45 (B). Let op,het hoge aantal CD45 positieve cellen rondom de galwegen. Deze massieve infiltraten die ontsteking geven niet zichtbaar in leversecties verkregen uit schijn-geopereerde dieren (niet getoond). De schaal bar in elke figuur panel vertegenwoordigt 500 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Cholestatische leverschade is een van de belangrijkste oorzakelijke factoren voor de ontwikkeling van leverfibrose en cirrose bij patiënten met chronische leverziekte. Gebaseerd op het feit dat deze ziektes onweegbare gezondheidszorgkosten, het begrijpelijk dat veel onderzoekers proberen de pathogene mechanismen van lopende leverfibrose begrijpen. Daarom zijn experimentele modellen zijn gegenereerd die verschillende aspecten van de complexe mechanismen die leiden tot leverontsteking, fibrose en cirrose 1 nabootsen.
Chirurgische BDL is één van de meest wijdverspreide experimentele modellen die wordt gebruikt voor obstructieve cholestatische letsel bij muizen en ratten 4,23,24 induceren. In de meeste protocollen worden de dieren verdoofd en een middengedeelte laparotomie wordt uitgevoerd. Vervolgens wordt de galwegen blootgelegd uit de buikholte en tweemaal geligeerd met behulp van chirurgische touw. Bijgevolg muizen en ratten die deze operatie d ontvangenEvelop een sterke fibrotische reactie die aanvankelijk afkomstig van de periportale velden 25. Gedurende de jaren verschillende chirurgische technieken en modificaties zijn beschreven. Speciale procedures zelfs heraansluiting of reanastomosis toestaan na BDL 23. Andere technieken berusten op gedeeltelijke BDL resulteert in aanzienlijk minder necrose vorming en bijgevolg hepatocyt proliferatie 24. Gedeeltelijke BDL in combinatie met de daaropvolgende verwijdering van de galblaas (cholecystectomie) dat de vorming voorkomt van cholecystitis vertegenwoordigt ook een uitstekend experimenteel model voor acute cholestase. Voorgesteld werd een model dat dichter bij de menselijke toestand 24 zijn. En inderdaad, tijdens de oprichting van dit model, het was al aangetoond dat het reproduceerbaar veroorzaakt cholestase met slechts minimale histologische weefselschade en let niet op chronische cholestase 25. Daarom werd gesuggereerd dat dit model is ideaal voor lat studerene effecten omgekeerd cholestase 24. Nog meer verfijnde methoden zijn gebaseerd op microchirurgie en maken een snelle en reproduceerbare manier cholestatische schade toebrengen alleen geselecteerde delen van de lever 26.
Hoewel deze geavanceerde wijzigingen van de oorspronkelijke BDL-protocol hebben bewezen zeer nuttig zijn bij het onderzoeken van specifieke onderzoeksvragen, veel laboratoria wereldwijd in principe gericht op het gebruik van de BDL model als een zeer reproduceerbaar en betrouwbaar model voor cholestatische leverfibrose. Echter, veel complicaties optreden die kunnen de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de verkregen door dit model, indien technische onjuistheden niet worden vermeden resultaten wezenlijk veranderen. Zo bloedingscomplicaties gerelateerd aan schade van de bloedvaten bij de galwegen (zie figuren 3-4) kunnen tijdens of spoedig na de operatie. Overdosering van anesthesie met aansluitend cardiodepression of respiratory falen zijn ook vermijdbare complicaties van de procedure. Ernstige infecties, van peritonitis sepsis kan optreden gedurende de gehele periode van het experiment wanneer de hechtingen niet nauwkeurig uitgevoerd en gal lekken in de peritoneale holte. Accidentele verwondingen aan de darm tijdens operatie kan ook leiden tot peritonitis. Daarom is het duidelijk dat gestandaardiseerde protocollen die in strikte richtlijnen hanteren sterk vereist. Deze bepaling werd onlangs ook gevraagd binnen de landen van de Europese Unie, die nieuwe regels voor dierenwelzijn in 2013 1 uitgevoerd. De respectieve eisen die worden geassocieerd met deze regeling zijn niet nieuw en werd reeds in 1959 voorgesteld, toen Russell en Burch stelde een ethische kader voor het uitvoeren van wetenschappelijke experimenten met dieren die voornamelijk is gebaseerd op een vervanging, verfijning en vermindering (3R) principe 27.
Wanneer na outlined protocol zijn er slechts een paar complicaties die kunnen voortvloeien uit de technische onjuistheden. Drie specifieke problemen kunnen optreden in plaats van een lage frequentie.
Zoals bij alle chirurgische procedures, de overdosis verdovingsmiddel is een mogelijk gevaar voor de dieren, met name in combinatie met hypothermie. Als tijdens de operatie cardiovasculaire complicaties voordoen, moet de levering van anesthetica onmiddellijk worden gestopt en de bestuurder moet proberen om zoveel mogelijk zuurstof om de muis te voorzien. Dit kan gebeuren door middel van een plastic spuit die gevuld is met lucht en gepompt in de mond van het dier aangetast. Ook het gebruik van een kleine Peleusball ventilatie van het zieke dier vaak nuttig voor het revitalisatieproces.
Problemen bij wondgenezing
Na de BDL operatie, kan muizen hun eigen pijnlijke naden of die van andere dieren bijten. Als dit gebeurt, moet respectieve muizen afzonderlijk wordengekooid. Dieren met open wonden worden verdoofd, het gebied rond de wond voorzichtig gesteriliseerd met een standaard antiseptische en de wond moet opnieuw worden genaaid. Gedurende de volgende 3 dagen, moet de wond van deze dieren regelmatig gecontroleerd (2-3 maal daags).
Distensies van de buik of de vorming van ascites zijn indicatief voor bacteriële infecties. Dit kan voorkomen door niet steriele werkende tijdens de operatie. Allerlei infecties moeten zonder uitzondering worden behandeld als een humaan eindpunt en de zieke dieren moeten worden opgeofferd.
We voorzien in een eenvoudig protocol dat de prestaties van BDL bij muizen die eenvoudig te implementeren en roept slechts lage dier sterfte gecombineerd met een hoge reproduceerbaarheid laat volgen. Alle chirurgische protocollen snel worden aangehouden door deskundige wetenschappers. Gedurende de volledige proefneming worden de dieren gehouden op een verwarmingsplaat bij 37 ° C en permanentom een anesthesie-systeem minimaliseert pijn en angst. Voor de operatie wordt de buik geopend met een middellijn laparotomie en de galwegen dubbel-geligeerd zonder ontleden. De representatieve resultaten die hier zijn besproken tonen dat de fenotypische wijzigingen met betrekking tot de lever morfologie (ontsteking, fibrose, cirrose) zijn zeer reproduceerbaar en laat verschillende aspecten van fibrogenese bestuderen (bijv., Initiatie, ontsteking, progressie, eindstadium) op welbepaalde tijdstippen.
We hopen dat de samenvatting van ons protocol zal helpen om de leercurve die nodig is om dit fibrose model in andere laboratoria met succes te vestigen en om betrouwbare en reproduceerbare resultaten op verschillende locaties te garanderen verkorten. Daarbij denken wij dat de gepresenteerde protocol ondersteunt het 3R principe dat verondersteld werd door Russell en Burch in 1959 en vormt de basis van de nieuwe regels voor dierenwelzijn dat momenteel in veel landen wi worden geïmplementeerddun de European Framework.
Acknowledgments
De auteurs willen de financiële steun van de Duitse Stichting voor Onderzoek (SFB / TRR57, Q3 en Q2) erkennen. De auteurs danken Mareike Schulz, Pascal Paschenda, en Klaudia Warzecha voor hun hulp bij de voorbereiding van de foto's.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Shaver Favorita II | Aeskulap | GT104 | |
| Cutter head | Aeskulap | GT730 | |
| Bepanthen eye and nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Warming plate and controller | Labotect | HP 062 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Scotch Tape | commercially available | ||
| Tissue paper | commercially available | ||
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Raucodrape OR adhesive drapes | Lohmann & Rauscher GmbH | 33013 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| 6-0 Mersilk suture | Ethicon | K889H | Silk, non-absorbable/Abdominal closure |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools Inc. | 17000-03 | |
| Cotton swabs | Noba Verbandmittel | 974202 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1032238 | |
| 25mL beaker | Schott Duran | 50-1150 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Micro-serrations forceps Moria MC31 | Fine Science Tools Inc. | 11370-31 | Bile duct separation |
| 5-0 Mersilene suture | Ethicon | EH6731H | Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation |
| 5mL syringe | BD Discardit II | 300296 | |
| 1mL syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Sterican needle 26 G x 1 | B. Braun | 4657683 | |
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Infrared lamp | Petra Electric | IR 11 |
References
- Liedtke, C., et al. Experimental liver fibrosis research: update on animal models, legal issues and translational aspects. Fibrogenesis Tissue Repair. 6 (1), 19 (2013).
- Aller, M. A., Arias, J. L., García-Domínguez, J., Arias, J. I., Durán, M., Arias, J. Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 6 (2008).
- Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
- Weiler-Normann, C., Herkel, J., Lohse, A. W. Mouse models of liver fibrosis. Z. Gastroenterol. 45 (1), 43-50 (2007).
- Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. J. Pathol. 35 (5), 769-798 (1932).
- Cameron, G. R., Hasan, S. M. Disturbances of structure and function in the liver as the result of biliary obstruction. J. Pathol. 75 (2), 333-349 (1958).
- Accatino, L., Contreras, A., Fernańdez, S., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile flow and bile acid excretion: postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 93 (5), 706-717 (1979).
- Accatino, L., Contreras, A., Berdichevsky, E., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile secretion. Studies on the mechanisms of postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 97 (4), 525-534 (1981).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Tuchweber, B., Desmoulière, A., Bochaton-Piallat, M. L., Rubbia-Brandt, L., Gabbiani, G. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74 (1), 265-278 (1996).
- Desmoulière, A., et al. Extracellular matrix deposition, lysyl oxidase expression, and myofibroblastic differentiation during the initial stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 76 (6), 765-778 (1997).
- Arias, M., et al. Adenoviral expression of a transforming growth factor-β1 antisense mRNA is effective in preventing liver fibrosis in bile-duct ligated rats. BMC Gastroenterol. 3 (29), (2003).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Dominant-negative soluble PDGF-β receptor inhibits hepatic stellate cell activation and attenuates liver fibrosis. Lab. Invest. 84 (6), 766-777 (2004).
- Borkham-Kamphorst, E., Huss, S., Van de Leur, E., Haas, U., Weiskirchen, R. Adenoviral CCN3/NOV gene transfer fails to mitigate liver fibrosis in an experimental bile duct ligation model because of hepatocyte apoptosis. Liver Int. 32 (9), 1342-1353 (2012).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. The anti-fibrotic effects of CCN1/CYR61 in primary portal myofibroblasts are mediated through induction of reactive oxygen species resulting in cellular senescence, apoptosis and attenuated TGF-β signaling. Biochim. Biophys. Acta. 1843 (5), 902-914 (2014).
- Huss, S., et al. Development and evaluation of an open source Delphi-based software for morphometric quantification of liver fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 3 (1), 10 (2010).
- Borkham-Kamphorst, E., Drews, F., Weiskirchen, R. Induction of lipocalin-2 expression in acute and chronic experimental liver injury moderated by pro-inflammatory cytokines interleukin-1β through nuclear factor-κB activation. Liver Int. 31 (5), 656-665 (2011).
- Karlmark, K. R., et al. The fractalkine receptor CX3CR1 protects against liver fibrosis by controlling differentiation and survival of infiltrating hepatic monocytes. Hepatology. 52 (5), 1769-1782 (2010).
- Tarcin, O., et al. Time course of collagen peak in bile duct-ligated rats. BMC Gastroenterol. 11, 45 (2011).
- Takase, S., Leo, M. A., Nouchi, T., Lieber, C. S. Desmin distinguishes cultured fat-storing cells from myofibroblasts, smooth muscle cells and fibroblasts in the rat. J. Hepatol. 6 (3), 267-276 (1988).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Protective effects of lipocalin-2 (LCN2) in acute liver injury suggest a novel function in liver homeostasis. Biochim. Biophys. Acta. 1832 (5), 660-673 (2013).
- Labbus, K., et al. Proteomic profiling in Lipocalin 2 deficient mice under normal and inflammatory conditions. J Proteomics. 78, 188-196 (2013).
- Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J. Surg. Res. 164 (2), 221-227 (2010).
- Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
- Scholten, D., et al. Genetic labeling does not detect epithelial-to-mesenchymal transition of cholangiocytes in liver fibrosis in mice. Gastroenterology. 139 (3), 987-998 (2010).
- Aller, M. A., et al. A half century (1961-2011) of applying microsurgery to experimental liver research. World J Hepatol. 4 (7), 199-208 (2012).
- Russell, W. M. S., Burch, R. The Principles of Humane Experimental Technique. , London, Methuen. (1959).
