Abstract
대부분의 척추 동물에서는 간장을 흡수 및 지방을 유화 빌리루빈 및 기타 대사 배설 제품뿐만 아니라 소장 지질의 분해를 가능하게 할 필요가 담즙을 생성한다. 간에서 간외 담도 시스템의 실험 방해은 담즙 분비와 염증이 문맥 주위 필드에서 발생하는 강한 섬유 성 반응의 결과로 연결 병리학 적 사건의 복잡한 폭포를 시작합니다. 따라서, 담관의 수술 적 치료는 설치류의 폐쇄성 담즙 정체성 부상을 유도하는 부적절한 담즙의 흐름에 의해 유도 이러한 병태 생리 학적 메커니즘을 기초 분자 및 세포 이벤트를 연구하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 모델이되고 있습니다. 최근, 다양한 수술 기법은 특정 연구 질문 재접속 reanastomosis 담관 결찰술 (BDL) 후, 예를 들면, 부분 BDL 또는 기타 미세 수술 방법 중 하나를 허용하는 것이 설명되었지만. 그러나, 가장 자주 사용되는 모델은 21-28일 후 강한 섬유 성 반응을 유도하는 담관의 완전한 폐쇄이다. 사망률로 인해 감염성 합병증 또는 기술적으로 부정확 한 내용에 높은 수 있습니다. 여기에서 우리는 1959 년에 러셀과 버치으로 가정 동물 복지에 대한 3R 규칙에 따라 재현성이 높은 섬유 성 반응을 유도 쥐에 BDL 모델에 대한 자세한 수술 과정을 제공합니다.
Introduction
간 섬유증은 매트릭스 - 제조 간 성상 세포의 상호 작용의 복잡한 네트워크 간 상주 침윤 세포 및 혈액 세포의 1,2- 다양한 유래 과잉 생산과 세포 외 기질 (ECM)의 축적으로 정의된다. 간 섬유화가 다른 자극의 다수에 의해 야기 될 수 있지만 섬유증을 기본 분자 메커니즘은 일반적으로 매우 유사하다. 간 손상에 따라, 분자 및 세포 변화의 고도로 조율 된 프로그램이 시작됩니다. 이 프로그램에서는 염증 신호, 단핵구 / 대 식세포와 간 성상 세포 사이에 밀접한 상호 작용이 발생하는 근육 섬유 모세포, ECM 증착 및 간 조직의 무결성 3 연속 해부학 적 및 기능적 변화에 별 모양의 세포 활성화와 분화의 최종 결과에. 간 성상 세포의 활성화는 특히 염증성 신호 간 상호 작용에 의해 구동되고(쿠퍼 세포 즉) 숙박업 대 식세포. 병원체 관련 분자 패턴 등 수신자 같은 수용체로서 특수 패턴 인식 수용체에 의해 인식되는 염증 과정 (3)를 구동 염증성 사이토 카인 및 케모카인 중 다수의 발현 및 분비를 유발 다른 경로의 복잡한 네트워크를 통해 신호가 활성화 될 때. 질병 인자의 생산이 제거 될 때 염증 반응 및 형성 간 무례한 일시적인. 부상이 지속되면 반대로, 만성 염증은 간 및 반흔 조직 형성에 의한 정상 간 실질의 진보적 인 교체의 결과로 전경 표현과 ECM 군중의 축적에서 진화.
인간의 간 섬유화가 전세계 임상 문제이므로, 급성 및 만성 간부전의 몇몇 설치류 모델 실험은 지난 수십 년 동안 확립되었다. 뮤에피네프린 시스템은 예를 들어, 일반적인 모델이 중요한 영향을 미칠 다른 hepatotoxins의 다양한 투여, 담관 결찰술, 면역 매개 성 간 손상 유도 유전자 결함 타겟팅 도입하거나 유전자의 반대의 과발현 아르 간 섬유증 (4)의 병인에 관여하는 신호 전달 경로.
설치류 담관 결찰술 수년 5-8 대한 연구 실험 절차에 따라 실시되었다. 설치류에서 장기간 담관 결찰 (BDL)에 대한 최초의 재현성이 높은 프로토콜은 이미여 년 전 9 지금 제시했다. 이 프로토콜에서 삽관 / 폐쇄 및 결찰 모두 인간의 담즙 성 간경변 구에서 관찰 된 것과 차이가 없었다 형태 학적 변화와 쥐의 간경변의 높은 수율을 유도. 각 프로토콜은 수술이 비교적 신속하게 적용될 수있다, 간단및 동물의 생존율은 95 % 이상으로 높다. 고전 쥐 삽관 / 방해 프로토콜에서 2cm의 짧은 절개 바로 칼 모양의 과정을 아래에 이루어집니다. 그 후, 정맥은 담관의 근위부에 삽입 실크 봉합과의 위치에 고정되어있다. 다음 단계에서, 상기 캐 뉼러의 말단부는 하부 오른쪽 사분면 9 피하 정중선 절개의 하단부를 통해 넣어 매립 3 매듭 방해된다. 마지막에, 복부 닫히고 동물을 회복 할 수있다. 결찰 프로토콜에서, 래트 또는 합자 9 사이 담관 절개없이 어느 담관 이중 결찰을 실시한다.
이 실험 모델은 잘 받아 간 담즙과 섬유화를 유도하기 위해 실험실의 수백에서 전 세계적으로 사용된다. 그것은 간내 담즙의 상피 세포 증식을 유도 근섬유 differentiatio포털 섬유 아세포의 n은 약 ECM (10, 11)의 재현성이 뛰어나고, 대규모 표현과 증착 결과, 담도 상피 세포 증식. 따라서, 쥐에서이 모델의 응용 프로그램 간 염증과 섬유화의 기전을 이해하는 것을 목표로 과학자들에게 인기가되고있다.
우리의 실험실에서, 우리는 광범위하게 간 섬유화의 특별한 분자 및 세포 측면을 조사하고 새로운 antifibrotic 개념과 약물 12-15을 테스트하는 것을 목표로 여러 가지 실험 연구에서 쥐의 과거에이 프로토콜을 사용하고 있습니다.
최근에, 우리는 쥐의 시스템에이 방법을 적용하고 담관 결찰 수술은 또한 쥐 16-18 낮은 변화와 사망률과 시간에 따라 섬유증을 설정하는 매력적인 평균 것으로 나타났습니다. 동물의 작은 크기로, 그러나, 마취와 관련하여 몇 가지 중요한 변형으로 인해 수술 intervention 및 후 처리 관측이 모델에서 안정적이고 재현성있는 결과를 얻기 위해 필요하다. 완전한 적응은 다음 프로토콜 및 첨부 된 비디오 문서에 요약되어있다.
Protocol
참고 : 모든 실험은 공식 국가 동물 관리 및 사용위원회 (LANUV, 레 클링 하우젠, 독일)에 의해 승인되었다. 마우스는 실험 동물 과학 협회의 연맹 (FELASA)의 지침에 따라 특정 병원균이없는 조건에서 보관되어 있습니다. 모든 실험은 (건강 발행 제 8 판의 국립 연구소, 2011) '실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서'동물의 보호에 관한 독일 연방 법에 따라 실시 하였다.
1. 수술 전 준비
참고 : 깨끗하지만 비 멸균 상태에서 모든 절차를 수행합니다. 수술을 수행하는 데 사용되는 수술 용 집게, 가위, 그리고 콜리 브리 리 트랙터 등 모든 악기 및 기타 재사용 가능한 장비는 동물에서 수술을 수행하기위한 제도적 가이드 라인을 엄격하게 준수 프로토콜에 따라 사용하기 전에 소독해야합니다.; 필요한 시약, 재료 및 장비에 대한 자세한 목록은 특정 재료 / 장비의 목록을 참조하시기 바랍니다.
- 전체 실험 기간 동안, 유체 불 투과성, 자체 접착 커튼으로 전체 커버를 운영 영역을 영구적으로 마취 시스템에 연결 37 ° C의 온도에서 온난화 판에 동물을 유지합니다. 제대로 모든 측정 장치 및 수술 전에 실험하는 동안 사용되는 솔루션 (그림 1) 정렬합니다.
- 마취의 유도를위한 4 L / min의 유량에서 100 % 산소 4 용량 %의 이소 플루 란을 흡입 또는 마우스를 마취. 다음과 같은 중요한 기준에 도달하면 마취의 깊이는 충분하다 : 일반자가 호흡, 발가락 사이에 통증 자극의 설정 후 아무 반사, 통증에 대한 응답.
- 전기 모피 면도기와 마우스의 복부 털을 면도하고 눈과 N의 사용에 의해 건조에서 눈을 보호OSE 연고.
- , 37 ° C 가열 된 핫 플레이트에 마우스를 놓고 Fluovac 마취 시스템의 Fluovac 마스크 마우스 주둥이를 삽입하고 실크 테이프의 줄무늬 동물의 다리를 고정합니다.
- 1 L / min의 유량에서 100 % 산소 1.5-3 부피 % 이소 플루 란 흡입에 의해 마우스를 마취를 유지 및 부 프레 노르 핀 용액 (0.1 ㎎을 / kg BW 0.9 % NaCl 용액에 용해)의 복강 내 주사를 통해 수술 마취 입회 .
- 피부의 수술 전 치료를 위해 알코올 솔루션을 사용할 준비가 살균 표준, 묻힌 거즈 면봉으로 면도 복부 피부를 소독. 참고 : 우리의 프로토콜에서 우리는 폴리 알코올 피부 antisepticum를 사용합니다. 이 동물의 보호 및 실험 동물 과학 협회의 연맹의 지침에 관한 독일 연방 법률에 전체 따른다. 이 균은 70 %를 포함 (v / v)의 2- 프로판올, 부탄 - 1,3.diol과 노란색 퀴놀린의 추적 및 퍼퓸전자.
2. 외과 적 치료
- 11.5 cm 수술 가위와 동시에 커티스 플러스 밴드를 절단하여 약 2cm의 길이의 중간 선 개복 수술과 복부를 엽니 다.
- 확산기로 가위를 사용하여 복막의 상단에 결합 조직의 해부.
- 복강을 열고 원격 교육 알바 함께 복막을 잘라.
- , 흉골에서 유지 봉합을 삽입 봉합사의 필라멘트를 제기하고 Fluovac 마스크의 상단에 고정하여 공동을 크게한다.
- 복강 콜리 블리 권취 장치를 (도 2)을 삽입하여 작업 영역을 확산.
- 그것의 복부 측면이 다이어프램을 고수하고 폐문 명확하게 볼 수 있도록 수분 (0.9 % 염화나트륨 용액)을 면봉으로 간을 올립니다.
- 창자 (그림 3)의 꼬리 이동에 의해 담관 노출.
- 에서주의 깊게 담관을 분리마이크로 톱니 모양의 집게를 (그림 4A)를 사용하여 문맥과 간동맥의 측면에.
- 담관 주위에 5-0 봉합사를 놓고 두 수술 매듭으로 고정합니다. 묶는 경우 매듭 담관 (그림 4B)을 절단하지 않고 효과적인 장애물을 보장하기 위해 지속적으로 견인력을 증가시킨다.
- 동일한 방식으로 제 뇌 결찰 추가하지만 (도 4C) 사이에서 담관 해부 않는다. 그렇지 담즙 유출 한 매듭이 확보되지 않은 경우, 동물 및 담즙 정체가 더 발생할 없지만 심한 복막염 것을 상당한 위험이있다.
- , 봉합 (그림 4D)의 끝을 잘라 흉골을 절감하고, 트랙터를 제거합니다.
- 0.9 % NaCl 용액과 복강을 씻어 생리 학적 위치로 복부 장기를 교체합니다.
- 모두 닫습니다 복부 층 6-0 Mersilk와 별도의 실행 봉합과 (복막과 커티스 플러스 간판).
- 전자를 잘라봉합의 NDS와 소독액을 묻힌 거즈 면봉으로 작업 영역을 소독.
주 : 처음 수술을 수행 할 때, 16X-20X의 배율로 현미경 모든 수술 절차를 수행. 이 담관 잘 인식 가능하고 명확 간문맥과 간동맥 (도 5 및 6)과 구별. 일부 실험실은 두 합자 사이에서 담관의 절개를 권장합니다. 담관이 해부 할 때 노트의 한 잠재적 누수가 중증 급성 복막염, 복수, 전신 독소 혈증을 초래할 것이기 때문에 그대로 담관을 남겨주세요.
3. 수술 후 치료 및 후속
- 마우스가 완전히 깨어 있고 활성화되어 있지 않으면 마우스가 적외선 램프에 의해 따뜻하게 새장에 복구 할 수 있습니다.
- 그 후, 정상 케이지에 마우스를 이동하고 물과 음식에 광고 무제한 액세스를 제공합니다.
- 따고 수술 정기적으로 동물을 모니터하고 내부 동물 관리의 로컬 권고 다음 적합한 진통제 (예를 들면, 부 프레 노르 핀 용액)으로 후속 수술 후 처리를 수행하고위원회를 사용한다.
참고 : 3 일 동안 진통 치료를 수행합니다. 모든 비정상적인 행동은 복막염, 패혈증 또는 내부 출혈 등의 희귀 한 합병증을 나타낼 수와 실험을 종료하는 인간의 엔드 포인트로 처리해야합니다. - 동물 실험이 끝날 때까지 음식과 물을 광고 무제한 무료로 이용할로 유지됩니다. 섬유화가 진행 황달 의해 표시되기 때문에, 채혈은 필요 없다.
- 동물을 희생하는 경우, 혈액 임상 화학 매개 변수 (AST, ALT, 빌리루빈 등) 및 간 조직 화학 및 생화학 분석을위한 검색의 측정을 위해 수집됩니다.
Representative Results
전형적인 실험에서, BDL은 18-20 그램 (40) 가중 수컷 C57BL / 6 야생형 마우스에서 수행 하였다. 이 실험은 진행 (10, 14, 및 20 일) 동안 개시 단계 (3, 7 일)에서의 간 섬유화를 조사하기 위해 수행하고, 장기 (30 일 60 일) 동안 16 하였다. 영구적 실험의 단부까지 증가 문맥 주위 섬유증 완전히 이십일 후에 개발하면서이 모델에서 이미 persinusoidal 섬유증, 수술 후 10 일째에 개발했다. 한 실험에서, 간단한 가성 조작을받은 모든 동물이 생존 만 BDL받은 40 마우스 (5 %)의 두 불량한 일반적인 조건을 개발하기 때문에 조기에 실험 계획 종점 전에 희생시켰다. BDL 실시 동물의 대부분은 제 3 일간은 감소 된 활성을 보였다 가짜 조작 동물의 활성은, 개복 수술 후 예외없이 이미 실제 섬광 날이었다. Jaundiced 피부 BDL (16)의 설정 후 모든 BDL 동물 하나 또는 두 개의 일 이미 분명 있었다.
간 손상의 잘 확립 된 혈청 마커를 대표하는 두 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT) 및 아스 파르 테이트 트랜스 아미나 제 (AST)의 값은 급격히 증가하고 BDL (표 1) 후 7 일 및 20 일 동안 만족. 그 후, ALT 및 AST는 하루에 30 일까지 꾸준히 감소 60 일 수술 후까지 안정적으로 유지. 담즙 정체성 부상 라인에서, 총 빌리루빈의 혈중 농도는 꾸준히 상승했다 7 일 16 후 고원에 도달했다. ALT 및 AST 혈청 활동 비슷한 시간 코스는 BDL을 시행 한 쥐에 대해보고했다. 최근의 연구에서이 BDL 수술 후 첫 주에 정상의 5 ~ 10 배까지 증가 2 주 (19) 이후 감소하는 혈청 AST와 ALT 수준을 입증했다.
일반적으로 가짜로 작동하는 동물의 간은 여전히 스무 트 봐실험의 끝에서 H, BDL받은 동물들의 간 주로 간과 다량으로 가득 담낭의 수종의 대응 표면에 부종과 섬유화 결절의 형성을 특징으로 구조적 변경을 표시하는 동안 담즙 (그림 7). BDL 수술에 의해 유도 된 간장의 특성 형태 학적 변화는 또한 표준 조직 학적 분석 (그림 8)에서 입증된다.
실험 동일한 세트에서, 간 섬유증의 개발은 최대주고, 반 정량적으로 평가 문맥 주위 섬유증 0-2 0-4과 perisinusoidal 섬유증에서 준비된시킨 점수 시스템을 사용하여 맹검 병리학 자에 의해 평가 간 조직 학적 기준 할 예상 한 바와 같이 제 간경변 동등했다 값은 가짜 조작 동물 군의 평균 섬유화 점수 0.00 ± 0.00이었다. t 동물 군 대비에서,모자 BDL가, 점수가 4.83 ± 0.17의 값으로 하루 60까지 꾸준히 증가 받았다. 문맥 주위 섬유증 (3)의 최대 분석 모든 동물에서 20 일에 도달하고, perisinusoidal 섬유증 실험의 처음 10 일 동안 결석 2 주 후에 우선 두드러졌다. 그 후, 1.8 ± 0.17 (표 1)의 값을 실험의 단부까지 점차 증가 하였다.
또 다른 몇몇 실시 하였다 독립적 동물 실험에서는, 섬유화가 진행 섬유화 형성 (도 9)의 결과로서 간내 콜라겐 발현 및 증착 재현성을 보여주는 시간 - 의존적 증가가 관측되었다. 이와 유사하게, 지속적으로 섬유화의 과정은 α-평활근 액틴 섬유 아세포의 세포의 마커를 나타냅니다 (α-SMA)의 높은 발현 눈에 띄는, 즉, 별 모양의 세포 및 포털 근섬유 간 활성화및 간 하이드 록시 프롤린은 콜라겐 풍부에서 발견 된 아미노산 (18) (도 9) 행렬. 또한, 근섬유 아세포 또는 양을 증가 나타낸다 멘틴의 발현은 수술 BDL (20)의 설정 후 증가된다. 부상 간에서 염증이 수반 더 강하게 급성 및 만성 간 손상 중 유도 된 급성 간 손상 (21, 22) 중 간세포 보호 효과를 진화한다 리포 칼린 2 (LCN2)의 발현 증가에 의해 반영됩니다.
BDL받은 동물들의 간 침투 염증 세포는 CD45 (도 10)에 특이적인 항체로 염색하여 특정 검출 할 수있다. 또한 PTPRC (단백질 티로신 포스파타제, 수용체 타입)으로 알려진이 세포 표면 마커 특이 적 적혈구와 혈장 세포를 제외한 모든 분화 된 조혈 세포에서 발현된다.
| 담관 결찰 후 시간 (일) | 총 빌리루빈 | AST (U / L) | ALT (U / L) | 포털 섬유증 | Perisinusoidal 섬유증 | 총 점수 |
| (㎎ / dL 이상) | ||||||
| 0 (N = 3) | 0.17 ± 0.06 | 192.67 ± 30.50 | 50.33 ± 6.03 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 |
| 도 3 (N = 5) | 6.85 ± 2.21 | 1159.25 ± 319.27 | 566.50 ± 335.25 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 |
| 도 7의 (N = 5) | <TD> 14.38 ± 2.14 ±976.60 ± 477.16 | 448.20 ± 259.47 | 0.60 ± 0.25 | 0.0 ± 0.0 | 0.60 ± 0.25 | |
| 10 (N = 5) | 15.92 ± 2.60 | 1916.60 ± 868.25 | 560.40 ± 80.88 | 1.40 ± 0.25 | 0.25 ± 0.25 | 1.67 ± 0.25 |
| 14 (N = 5) | 17.90 ± 3.84 | 1088.60 ± 276.32 | 505.00 ± 96.15 ± | 2.4 ± 0.25 | 1.0 ± 0.0 | 3.40 ± 0.24 |
| 20 (N = 4) | 18.00 ± 2.12 | 1072.67 ± 364.27 | 404.00 ± 195.48 | 3.0 ± 0.0 | 1.0 ± 0.0 | 4.0 ± 0.0 |
| 30 (N = 5) | 16.04 ± 4.79 | 446.40 ± 169.75 | 260.20 ± 126.97 | 2.8 ±; 0.2 | 1.4 ± 0.25 | 4.20 ± 0.20 |
| 60 (N = 6) | 16.02 ± 1.19 | 484.67 ± 117.79 | 257.17 ± 50.97 | 3.0 ± 0.0 | 1.8 ± 0.17 | 4.83 ± 0.17 |
사용 된 약어는 다음과 같다 : ALT, 알라닌 아미노 전이 효소; AST, 아스파 테이트 아미노 전이 효소.
표 1 : 섬유증 대표적인 실험에서 기록이 테이블의 데이터 간 섬유증가 C57BL / 6 마우스 16 담관 결찰에 의해 유도 된 연구로부터 재생 하였다.. 이 연구에서, BDL 수술 후 사망률이 5 % (2 (40)의 중간에 동물을 동물 열악한 조건 개발 때문에 희생시켰다).
그림 1 : 담즙을 수행하기위한 실험 설정덕트 결찰. 동물 37 O C의 온도로 보온 판에 유지되고 연산 영역은 유체 - 불 투과성의, 자체 접착 드레이프 전체적으로 덮는다. 완전한 수술 중에 동물 영구적 마취 시스템에 접속된다. 모든 측정 장치 및 솔루션 (진통제, 마취제, 소독액, 0.9 % 염화나트륨)을 명확하게 배열되어있다.
그림 2 :. 수술 영역의 준비 복강의 전 개방, 복부 피부 전기 모피 면도기로 면도 살균 거즈 면봉으로 소독해야한다. 수술 영역이어서 유체 - 불 투과성, 자체 접착 드레이프 덮여있다. 복부 정중선 개복술 (~ 길이 2cm)로 열립니다. 공동은 흉골에 들고 봉합사 및 연산에 의해 확산 영역을 삽입하여 확대수술하는 동안 방해받지 않고 실험을 허용하는 콜리 브리 견인기를 삽입.
그림 3 : 담관의 노출. 이 다이어프램에 충실하고 간 나 hilus가 눈에 잘되도록 담관 결찰술을 수행하기위한 (A)는, 간 복부 측이 들어 올려진다. (B)보다 담관을 노출하기 위해, 장내는 미부로 이동 가습 면봉. 담관이 화살표로 표시됩니다.
그림 4 : 담관을 결찰. (A) 제 1 단계에서, 담관은 톱니 형 마이크로 핀셋을 사용하여 문맥과 간동맥을 플 랭킹으로부터 조심스럽게 분리된다. (B) 다음으로, 봉합사가 주위에 배치되고담관 수술 매듭 고정. (C) 그 후, 제 봉합 제 봉합사에 근접 배치 담관 주위 결착되어있다. (D) 봉합사 짧게는, 공동은 0.9 % NaCl 용액으로 세정 모든 장기는 생리 학적 위치로 대체했다.
그림 5 :..과 담관의 매듭의 정확한 표현 봉합의 배치 및 담즙의 흐름을 방해하는 두 노트의 설정을 문서에이 그림 4에 설명 된 동일한 절차가 양안에서 문서화 된 (A) 감금 먼저 봉합. 첫 번째 봉합의 (B) 매듭. 두 번째 봉합과 담관의 (C) 감금. (D) 두 번째 봉합사의 매듭. (E)은 담즙 D를 두 번 결찰UCT 초과 봉합의 단축 후. (E ')이 패널 (E)의 스케치를 보여줍니다. 왼쪽에서 오른쪽 (RL), (LL) 및 메디안 (ML)의 돌출부 간뿐만 아니라 담관, 위 및 십이지장의 위치가 글자된다. 스케치에서 담관은 두 개의 봉합사로 결찰한다.
그림 6 :. 담관, 문맥과 생쥐의 간 동맥의 해부학 담관의 더 나은 해부학 적 위치는 문맥과 간동맥을 구성표로 묘사된다. 또한 표시됨 오른쪽 (RL)의 위치이며, 좌측 (LL) 중앙값 (ml) 및 간 미상핵 (CL) 엽.
그림 7 : 대표 appeara이주 가짜 운영 및 BDL 후 간의 NCE. C57BL / 6 마우스를 조작 BDL 또는 가짜 수술을 행 하였다. 이주 후 내장 공동 열렸다. 가짜 조작 동물의 간 섬유증의 흔적을 보이지 않았다 동안 담즙 덕트의 결찰을받는 동물의 간 대응은 간 표면에 부종 형성 및 섬유 성 결절 요철 구조를 가지고 있었다.
그림 8 :. 헤 마톡 실린 및 에오신 얼룩 간 부분은 (A) 가짜로 작동했다 3 주 (B)에 대한 BDL를받은 C57BL / 6 야생형 동물로부터 제조 하였다. 섹션은 헤 마톡 실린 및 에오신 다음과 같은 표준 절차를 염색 하였다. 염증의 징후 (침윤 세포), 실질 (간세포를 포함 BDL 간 내에서 일반적인 변경을 유의하시기 바랍니다cyte) 괴사 및 담관의 확산. 각각의 그림 패널의 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9 : 간 섬유화에 대한 조직 학적 및 생화학 적 판독. (A) 간 섹션 2 주 동안 가짜 조작 또는 BDL를받은 동물에서 준비하고 시리우스 레드 (상단 패널, 빨간색 콜라겐 섬유)로 염색 또는 α-smooth muscle actin의 발현 (α-SMA) (하단 패널 분석 하였다 면역 조직 화학 염색에 의한 갈색, α-SMA 양성 세포). 각각의 그림 패널의 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. (B)이 간에서 단백질 추출물 웨스턴 블롯을 실시하고 expre 분석 하였다콜라겐 타입 I, α-SMA, 잘 간 섬유화의 마커를 설립 멘틴의 ssion. 리포 칼린 2 (LCN2)의 발현은 지속적인 섬유화과 연관된 염증 반응을 나타낸다. 이 분석에서, 동일한 단백질 로딩은 β - 굴지에 대한 특이적인 항체로 말을 프로빙에 의해 입증되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 10 :. 염증 세포 침윤의 면역 염색 간 직렬 섹션 3 주 동안 담관 결찰술을받은 동물의 간으로부터 제조 하였다. 절편을 헤 마톡 실린 및 에오신 (A) 또는 CD45 (B)에 특이적인 항체로 염색 하였다. 유의하시기 바랍니다,담관 주변 CD45 양성 세포 수의 높은. 염증을 나타내는 이러한 대규모 침윤이 가짜로 작동하는 동물에서 유래 간 섹션에 표시되지 않습니다 (도시하지 않음). 각각의 그림 패널의 스케일 바는 500 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
담즙 정체성 간 손상은 만성 간 질환 환자에서 간 섬유화 및 간경변의 개발을위한 주요 원인이되는 요인 중 하나이다. 이들 질환은 평가할 수없는 의료 비용을 생성한다는 사실에 기초하여, 많은 연구자들이 간 섬유화의 진행 발병 기전을 이해하려고하는 것을 이해할 수있다. 따라서, 실험 모델은 간 염증, 섬유증 및 경변증으로 이어질 한 복잡한 메커니즘의 다양한 측면을 모방가 생성되었다.
수술 BDL 쥐와 쥐 4,23,24의 폐쇄성 담즙 손상을 유도하는 데 사용되는 가장 널리 실험 모델 중 하나입니다. 대부분의 프로토콜에서, 동물을 마취하고 중앙부 개복술 행한다. 그 후, 담관은 복강에서 발견되어 수술 꼬기를 사용하여 두 번 결찰. 결과적으로, 마우스 및 래트이 수술을받은 그 Develop 처음에는 문맥 주위 필드 (25)에서 발생하는 강한 섬유 성 반응. 수년 동안 여러 가지 수술 기법 및 수정이 설명되었다. 특별 절차도 BDL 23 재 연결 또는 reanastomosis 할 수 있습니다. 다른 기술은 상당히 적은 괴사 형성 및 결과적 간세포 증식 24 초래 BDL 부분에 기초한다. 담낭염의 형성을 방지 쓸개 (담낭 절제술)의 후속 제거와 함께 부분 BDL 또한 급성 담즙을위한 훌륭한 실험 모델을 나타냅니다. 이것은 인간 상황 (24)에 가까운 모델이 제안되었다. 그리고 사실,이 모델의 설립 동안, 그것은 이미 재현성 최소한의 조직 학적 조직 손상으로 담즙의 원인과 만성 담즙 정체 (25)를 진행하지 않는 것을 증명했다. 따라서,이 모델은 위도 공부에 이상적입니다 것을 제안했다반대로 담즙 (24)의 전자 효과. 더욱 정교한 방법은 미세 기반으로 빠르고 재현 방법은 간 (26)의 선택된 부분에서 담즙 정체성 간 손상을 입힐 수있다.
원래 BDL 프로토콜에서 이러한 복잡한 수정은 특정 연구 질문을 조사에 매우 도움이 입증되었지만, 많은 실험실 전세계 기본적으로 담즙 정체성 간 섬유증에 대한 높은 재현성 및 신뢰성있는 모델로 BDL 모델을 채용 목표로하고 있습니다. 그러나, 많은 합병증은 실질적으로 기술적으로 부정확 한 내용이 피하지 않을 경우,이 모델에 의해 얻어진 결과의 재현성과 신뢰성을 변경할 수있는 발생할 수 있습니다. 중 또는 빠르게 수술 후 발생할 수있는 - 예를 들어, 담관에 수반되는 혈관의 손상과 관련된 합병증 출혈 (4 그림 3 참조). 이후 cardiodepression 또는 R과 마취의 과다 복용espiratory 실패는 절차의 피할 수있는 합병증입니다. 봉합 정확하게 복강 내로 수행 담즙 유출하지 않으면 복막염 패혈증에 이르는 심각한 감염은, 실험 전 기간 동안 발생할 수있다. 수술 중 소장에 사고 부상은 복막염으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 엄격한 취급 지침에 따라 표준화 된 프로토콜이 강력하게 요구되는 것은 명백하다. 이 규정은 최근 2013 일에 새로운 동물 복지 규칙을 구현 유럽 연합 (EU)의 국가에서 요구되었다.이 규정과 관련된 각각의 요구 사항은 새로운 것이 아니다 이미 1959 년에 제안 된, 러셀과 버치는 윤리를 제안 할 때 주로 교체, 정제 및 감소 (3R) 원리 (27)을 기반으로 동물들과 함께 과학 실험을 수행하기위한 프레임 워크입니다.
개 요를 다음과 같은 경우에드 프로토콜 기술적으로 부정확 한 내용으로 인해 발생할 수있는 몇 합병증이 있습니다. 세 가지 특정 문제가 다소 낮은 주파수에서 발생할 수 있습니다.
모든 수술과 마찬가지로 마취의 과다 복용은 특히 저체온증과 함께 동물에 잠재적으로 위험성을 내포하고있다. 수술 중 심혈관 합병증이 발생하면, 마취제의 공급은 즉시 중단되어야하고 오퍼레이터는 마우스에 가능한 한 많은 산소를 제공하기 위해 노력한다. 이것은 공기로 채워지고 손상된 동물의 입으로 펌핑 작은 플라스틱 주사기를 이용하여 수행 될 수있다. 대안 적으로, 동물의 영향 환기 작은 Peleusball의 사용은 활성화 공정에 종종 도움이된다.
상처 치유의 문제
BDL 수술 후, 마우스는 자신의 아픈 솔기 또는 다른 동물들 물린 수 있습니다. 이 경우, 각각의 마우스는 별도로해야한다갇힌. 열린 상처와 동물은 상처 주위의 영역을 부드럽게 표준 살균 소독, 상처는 다시 봉합해야한다, 마취해야합니다. 다음 3 일 동안이 동물의 상처는 정기적 (하루에 2-3 회)를 검사한다.
복부 또는 복수의 형성 Distensions은 세균 감염에 대한 나타낸다. 이 때문에 수술 중 비 멸균 작업에 발생할 수 있습니다. 감염의 모든 종류의 인간 엔드 포인트로 예외없이 처리되어야하고, 영향을받는 동물을 희생해야한다.
우리는 쉽게 구현이 간단하고 높은 재현성과 결합 만 낮은 동물의 사망률을 불러 일으키는 쥐 BDL의 성능을 제공 프로토콜을 수행하기 위해 제공. 수술 프로토콜 모두 신속 당업자 과학자 체포 될 수있다. 전체 실험 기간 동안, 동물은 37 ° C에서 온난화 접시에 보관하고 영구적으로 연결되어마취 시스템에 통증과 고통을 최소화한다. 수술의 경우, 복부 정중선 개복술과를 해부하지 않고 두 번 결찰 담관으로 열립니다. 여기에서 논의 된 대표적인 결과는 간 형태 (염증, 섬유화, 간경화)에 관해서 형질 변경이 매우 재현성 및 섬유화의 다양한 측면을 연구 할 수 있음을 입증 (예., 개시, 염증, 진행, 말기 질환) 정의 된 시간 지점에서.
우리는 우리의 프로토콜의 개요가 성공적으로 다른 실험실에서이 섬유증 모델을 수립하고, 다른 위치에서의 신뢰성과 재현성있는 결과를 보장 할 필요가있다 학습 곡선을 단축하는 데 도움이되기를 바랍니다. 이에 우리는 제시된 프로토콜은 1959 년 러셀과 버치에 의해 가정 된 3R 원칙을 지원하며, 현재 많은 국가 위스콘신에서 구현되는 새로운 동물 복지 규칙의 기초를 나타낸다는 것을 생각얇은 유럽 프레임 워크입니다.
Acknowledgments
저자는 독일 연구 재단 (SFB / TRR57, Q3 및 Q2)의 재정 지원을 인정하고 싶습니다. 저자는 사진을 준비하는 그들의 도움을 Mareike 슐츠, 파스칼 Paschenda 및 Klaudia Warzecha 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Shaver Favorita II | Aeskulap | GT104 | |
| Cutter head | Aeskulap | GT730 | |
| Bepanthen eye and nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Warming plate and controller | Labotect | HP 062 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Scotch Tape | commercially available | ||
| Tissue paper | commercially available | ||
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Raucodrape OR adhesive drapes | Lohmann & Rauscher GmbH | 33013 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| 6-0 Mersilk suture | Ethicon | K889H | Silk, non-absorbable/Abdominal closure |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools Inc. | 17000-03 | |
| Cotton swabs | Noba Verbandmittel | 974202 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1032238 | |
| 25mL beaker | Schott Duran | 50-1150 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Micro-serrations forceps Moria MC31 | Fine Science Tools Inc. | 11370-31 | Bile duct separation |
| 5-0 Mersilene suture | Ethicon | EH6731H | Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation |
| 5mL syringe | BD Discardit II | 300296 | |
| 1mL syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Sterican needle 26 G x 1 | B. Braun | 4657683 | |
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Infrared lamp | Petra Electric | IR 11 |
References
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