Abstract
I de fleste virveldyr, produserer leveren galle som er nødvendig for å emulgere absorbert fett, og muliggjøre spalting av lipider i tynntarmen, så vel som til å skille ut bilirubin og andre metabolske produkter. I leveren, initierer den eksperimentelle obstruksjon av ekstrahepatiske gallesystemet en kompleks kaskade av patologiske hendelser som fører til kolestase og betennelse som resulterer i en sterk fibrotisk reaksjon som stammer fra periportal felt. Derfor har kirurgisk ligation av felles gallegang blitt den mest brukte modellen for å indusere obstruktiv kolestatisk skade hos gnagere, og å studere de molekylære og cellulære hendelser som ligger til grunn for disse patofysiologiske mekanismer indusert av upassende galle flyte. I de senere årene har ulike kirurgiske teknikker blitt beskrevet som enten tillate gjeninnkobling eller reanastomosis etter gallegang ligation (BDL), for eksempel, delvis BDL, eller andre mikrokirurgiske metoder for spesifikke forskningsspørsmål. Imidlertid er den mest brukte modellen komplett obstruksjon av felles gallegang som induserer en sterk fibrotisk respons etter 21 til 28 dager. Dødeligheten kan være høy på grunn av smittsomme komplikasjoner eller tekniske unøyaktigheter. Her gir vi en detaljert kirurgisk prosedyre for BDL modell i mus som induserer en svært reproduserbare fibrotisk respons i henhold til 3R regelen for dyrevelferd postulert av Russel og Burch i 1959.
Introduction
Leverfibrose er definert som den overdreven produksjon og akkumulering av ekstracellulær matriks (ECM) som stammer fra et komplekst nettverk av interaksjoner av matriks-produserende hepatiske stel celler og et bredt utvalg av lever-resident og en infiltrerende celle blodlegemer 1,2. Selv hepatisk fibrose kan være forårsaket av en rekke forskjellige stimuli de molekylære mekanismer som ligger under fibrose er generelt svært like. Etter hepatisk skade, er en høyt organisert program av molekylære og cellulære endringer initiert. I dette programmet oppstår et tett samspill mellom inflammatoriske signaler, monocytter / makrofager og leverstel celler som på sluttresultatet i stelcelleaktivering og transdifferensiering til myofibroblasts, ECM deponering og påfølgende anatomiske og funksjonelle endringer i levervev integritet tre. Aktivering av leverstel celler er spesielt drevet av betennelsessignaler og interaksjoner med levereni private makrofager (dvs. Kupffer celler). Patogen assosiert molekylære mønstre er anerkjent av spesialiserte mønstergjenkjenning reseptorer slik som Toll-lignende reseptorer som når aktivert signal gjennom et komplekst nettverk av ulike baner som utløser uttrykk og sekresjon av et mangfold av inflammatoriske cytokiner og chemokiner som driver den inflammatoriske prosessen tre. Den inflammatoriske respons og den dannede lever fornærmelse er bare midlertidig når sykdommen-dannende faktor er fjernet. I motsetning til dette, dersom skaden vedvarer, utvikler kronisk betennelse i leveren, og ekspresjon og akkumulering av ECM publikum i forgrunnen som resulterer i progressiv substitusjon av normal lever parenchyma av arrvev dannelse.
Siden lever fibrogenese hos mennesker er et verdensomspennende klinisk problem, har flere eksperimentelle gnager modeller av akutt og kronisk leversvikt er etablert i løpet av de siste tiårene. I murine system for eksempel vanlige modeller er administrering av en rekke forskjellige hepatotoxins, ligering av den felles gallegang, induksjon av immun-mediert leverskade, og målrettet innføring av gen-defekter eller omvendt overekspresjon av transgener som påvirker kritisk signalveier som er involvert i patogenesen av leverfibrose 4.
Ligering av den felles gallegang hos gnagere er utført som en eksperimentell prosedyre i forskning i mange år 5-8. Et første svært reproduserbare protokoll for langvarig gallegang ligation (BDL) hos gnagere var allerede presenteres nå mer enn tre tiår siden 9. I denne protokollen både kanylering / obstruksjon og ligering indusert en høy avkastning av skrumplever i rotter med morfologiske endringer som kunne sammenlignes med det som ble observert i menneskelig gallecirrhose 9. De respektive protokoll er enkel, den kirurgiske prosedyren er relativt hurtig anvendeligOg overlevelse av dyrene er høy med over 95%. I den klassiske rotte kanylering / obstruksjon protokollen, er en kort snitt på 2 cm laget like under xifoid prosessen. Deretter blir en kanyle innføres i den proksimale delen av gallegang og fiksert i sin stilling med silkesuturer. I et neste trinn blir den distale delen av kanylen hindret med 3 knop, satt gjennom den nedre ende av midtlinjesnitt, og begravet subkutant i nedre, høyre kvadrant 9. Til slutt blir buken lukket og dyrene får lov til å komme seg. I ligation protokollen, rottene utsatt for dobbel ligering av den felles gallegang enten med eller uten disseksjon av gallegang mellom ligaturer 9.
Dette eksperimentelle modellen er godt akseptert og brukes over hele verden i hundrevis av laboratorier for å indusere lever kolestase og fibrose. Det induserer intrahepatisk galle epitelcelleproliferasjon, myofibroblastic differentiation portal fibroblaster rundt prolifererende galle epitelceller, noe som resulterer i en meget reproduserbar, massiv ekspresjon og avsetning av ECM 10,11. Derfor er anvendelsen av denne modellen i rotter og mus være populær blant forskere som tar sikte på å forstå patogenesen av leverbetennelse og fibrose.
I vårt laboratorium har vi mye brukt denne protokollen i fortiden i rotter i flere eksperimentelle studier tar sikte på å undersøke spesielle molekylære og cellulære aspekter av lever fibrogenese og for å teste nye antifibrotic konsepter og narkotika 12-15.
Nylig har vi tilpasset denne metodikken til muse-systemet og fant at gallegang ligation kirurgi er også et attraktivt middel for å etablere tidsavhengig fibrose med lav variasjon og dødelighet hos mus 16-18. På grunn av den mindre størrelse av dyrene imidlertid noen viktige modifikasjoner med hensyn til anestesi, kirurgi intervention og etterbehandling observasjon er nødvendig for å oppnå pålitelige og reproduserbare resultatet i denne modellen. Den fullstendig tilpasning er oppsummert i den følgende protokoll, og i den tilhørende videodokumentasjon.
Protocol
MERK: Alle forsøkene ble godkjent av den offisielle stats dyr omsorg og bruk komité (LANUV, Recklinghausen, Tyskland). Musene er plassert under spesielle-patogen frie forhold i henhold til retningslinjene fra Federation for forsøksdyrlære Associations (FELASA). Alle forsøkene ble utført i samsvar med den tyske føderale loven om beskyttelse av dyr og 'Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr' (National Institutes of Health publikasjon 8. utgave, 2011).
1. presurgical Forberedelse
MERK: Utfør alle prosedyrer i henhold til rene, men ikke-sterile forhold. Alle instrumenter og andre gjenbrukbare utstyr som for eksempel kirurgiske tang, saks, og Colibri retractor som brukes til å utføre kirurgi må steriliseres før bruk i henhold til protokoller som er i strengt samsvar med de institusjonelle retningslinjer for å utføre operasjoner i dyr.; For en detaljert liste over nødvendige reagenser, materialer og utstyr, se listen over konkrete materialer / utstyr.
- Under komp eksperimentering, holde dyret på en varmeplate ved en temperatur på 37 ° C, permanent forbundet med en anestesi-system, og dekselet operasjonsområdet samlet med væske-ugjennomtrengelig, selvklebende gardiner. Skal ordne alle besetninger og løsninger som brukes under eksperimentering før operasjonen (figur 1).
- Bedøve mus med inhalering av 4 vol% isofluran i 100% oksygen ved en strømningshastighet på 4 l / min, for induksjon av anestesi. Dybden av bedøvelsen er tilstrekkelig når følgende viktige kriterier er nådd: regelmessig spontan pusting, ingen refleks etter innstilling av smertestimuli mellom tærne, og ingen reaksjon på smerte.
- Barbere abdominal pels av musen med en elektrisk pels barbermaskin og beskytte øynene mot uttørking ved bruk av øyet og nose salve.
- Plasser musen på en 37 ° C oppvarmet kokeplate, sett muse snute i Fluovac maske av Fluovac anestesi system, og fikse beina på dyret med striper av silke tape.
- Opprettholde anestesi i mus ved inhalering av 1,5 til 3 vol% isofluran i 100% oksygen ved en strømningshastighet på 1 l / min og induct perioperativ analgesi via intraperitoneal injeksjon av buprenorfin-oppløsning (0,1 mg / kg kroppsvekt oppløst i 0,9% NaCl-løsning) .
- Steriliser barbert abdominal hud med et gasbind dott som er fuktet med en standard antiseptisk, klar til bruk alkoholisk oppløsning for pre-operativ behandling av huden. Merk: I våre protokoller bruker vi en poly-alkohol hud antisepticum. Dette er i full overensstemmelse med den tyske føderale loven om beskyttelse av dyr og retningslinjene fra Federation for forsøksdyrlære foreninger. Dette antiseptisk inneholder 70% (v / v) 2-propanol, butan-1,3.diol og spor av kinolin gul og perfume.
2. kirurgiske prosedyrer
- Åpne bukhulen med et midtlinje laparotomi av en lengde av omtrent 2 cm ved å kutte cutis pluss fascia samtidig med en 11,5 cm kirurgisk sakse.
- Dissekere bindevev på toppen av peritoneum ved hjelp av sakse som en spreder.
- Skjær peritoneum langs linea alba å åpne bukhulen.
- Forstørre hulrommet ved å sette inn en beholdning sutur i sternum, heve filament av sutur, og fikse det på toppen av Fluovac maske.
- Spre operasjonsområdet ved å sette inn en Colibri rullen i bukhulen (figur 2).
- Løft leveren med en fuktig (0,9% NaCl-løsning) bomullspinne slik at den ventrale siden av det holder seg til membranen og hilus er godt synlig.
- Utsett gallegang ved hale bevegelse i tarmen (figur 3).
- Separer nøye gallegangen fraflankerer portvenen og leverpulsåren ved hjelp av en mikro serrateringer tang (Figur 4A).
- Plasser 5-0 sutur rundt gallegang og fest den med to kirurgiske knop. Når binde knop øke trekkraften kontinuerlig for å sikre en effektiv hindring uten severing galle duct (Figur 4B).
- Legg et sekund kranie ligation på samme måte, men ikke dissekere gallegang i mellom (Figur 4C). Ellers er det en betydelig risiko for at galle lekkasjer hvis en knute ikke er sikker, og dyrene opplever ingen kolestase men utvikle alvorlige peritonitt.
- Skjær endene av sting (Figur 4D), senk sternum, og fjern rullen.
- Skyll bukhulen med 0,9% NaCl-løsning og erstatte abdominal organer til de fysiologiske stillinger.
- Nære både mage lag (bukhinne og cutis pluss dashbord) med separate drifts sting med 6-0 Mersilk.
- Kutt ends av sting og sterilisere operasjonsområdet med et gasbind pinne fuktet med antiseptisk løsning.
MERK: Når du utfører operasjonen for første gang, utføre alle prosedyrer i en kirurgisk mikroskop ved en forstørrelse på 16X-20X. Dette gir bedre anerkjennelse av gallegang og tydelig skiller den fra portvenen og leverpulsåren (figur 5 og 6). Noen laboratorier anbefaler disseksjon av gallegang i mellom de to ligaturer. Forlate gallegang intakt fordi potensielle lekkasjer i en av knutene vil resultere i alvorlig akutt bukhinnebetennelse, ascites, og systemisk endotoksemi når gallegang er dissekert.
3. Postoperativ behandling og oppfølging
- Tillate musen til å komme i et bur varmet opp av en infrarød lampe til musen er helt våken og aktiv.
- Etterpå, flytte musen til en normal bur og gi ad libitum tilgang til vann og mat.
- After operasjonen, overvåke dyrene med jevne mellomrom og gjennomføre oppfølging postoperativ behandling med egnet analgesi (f.eks buprenorfin løsning) etter den lokale anbefaling av den interne dyr omsorg og bruk komiteer.
MERK: Utfør analgetisk terapi for 3 dager. Unormal atferd kan tyde på sjeldne komplikasjoner som peritonitt, sepsis eller indre blødninger og skal behandles som menneskelig endepunkt for å avslutte forsøket. - Dyrene holdes med fri tilgang til mat og vann ad libitum inntil slutten av forsøket. Det er ikke behov for blodprøvetaking da fast fibrogenese er angitt med gulsott.
- Når dyr blir ofret, er blod samles for måling av klinisk-kjemiske parametere (ASAT, ALAT, bilirubin etc.) og leveren blir hentet for histokjemisk og biokjemisk analyse.
Representative Results
I et typisk forsøk BDL ble utført i 40 hann C57BL / 6 villtype-mus som veier omtrent 18 til 20 gram. Dette eksperimentet ble gjort for å undersøke lever fibrogenese i initieringsfasen (3 og 7 dager), i løpet av progresjon (10, 14, og 20 dager), og ved langtids (30 og 60 dager) 16. I denne modellen har persinusoidal fibrose som allerede er utviklet på dag 10 etter operasjonen, mens periportal fibrose som permanent økes opp til slutten av eksperimentet var fullt utviklet etter 20 dager. I nevnte forsøk, alle dyr som mottok en enkel sham-drift overlevde, og bare to av de 40 mus (5%) som mottok BDL utviklet en dårlig allmenntilstand, og ble derfor tidlig avlivet før den planlagte sluttpunktet av forsøket. Aktiviteten av humbug-opererte dyr var uten unntak allerede normal en dag etter laparotomi, mens de fleste av dyrene utsatt for BDL viste redusert aktivitet i løpet av de tre første dagene. Jaundiced hud hadde vært allerede tydelig i alle BDL dyr en eller to dager etter at innstillingen av BDL 16.
Verdiene for både alaninaminotransferase (ALAT) og aspartattransaminase (AST) som representerer veletablerte serummarkører for leverskade økt raskt og toppet seg under dag 7 og dag 20 etter BDL (tabell 1). Deretter ALAT og ASAT sank jevnt fram til dag 30 og holdt seg stabil inntil 60 dager etter operasjonen. I tråd med kolestatisk skade, serumkonsentrasjoner av total bilirubin var jevnt forhøyet og nådde et platå etter 7 dager 16. Lik tid løpet av ALAT og ASAT serum aktiviteter ble også rapportert for rotter som gjennomgikk BDL. I en fersk undersøkelse ble det demonstrerer at serum ASAT og ALAT økt opp til 5 eller 10 ganger for det normale ved den første uken etter at BDL kirurgi og redusert etter to uker 19.
Vanligvis leveren hos humbug-opererte dyr fortsatt ser Smoott ved slutten av forsøket, mens leveren hos dyr som fikk BDL viser arkitektoniske forandringer som hovedsakelig kjennetegnes ved dannelse av ødem og fibrotiske knuter på overflaten av tilsvarende lever og hydrops av galleblæren som er fylt med store mengder galle (figur 7). De karakteristiske morfologiske forandringer i leveren som er indusert av BDL operasjon er også demonstreres i standard histologisk analyse (figur 8).
I det samme settet med eksperimenter, utvikling av leverfibrose var semi-kvantitativt vurdert basert på leverhistologi evaluert av en blindet patolog ved hjelp av et poengsystem der periportal fibrose ble iscenesatt 0-4 og perisinusoidal fibrose 0-2, noe som gir en maksimal verdi som tilsvarte skrumplever av 6. Som forventet, var gjennomsnittlig fibrose score i gruppen av humbug-opererte dyr var 0,00 ± 0,00. I motsetning til dette, i gruppen av dyr that mottatt BDL, økte resultatet jevnt fram til dag 60 til en verdi av 4,83 ± 0,17. Den maksimalt 3 for periportal fibrose ble oppnådd ved dag 20. I alle dyr som ble analysert, perisinusoidal fibrose var fraværende i løpet av de første 10 dager av forsøket, og ble først merkbar etter to uker. Deretter økes det jevnt opp til slutten av forsøket til verdier på 1,8 ± 0,17 (tabell 1).
Også i en rekke andre uavhengige dyreeksperimenter som ble utført, ble det observert at dannelsen av fibrose var svært reproduserbare viser tidsavhengig økning av intrahepatisk kollagen ekspresjon og deponering som en følge av kontinuerlig fibrogenese (figur 9). Tilsvarende, er merkbar i forhøyet ekspresjon av α-glattmuskel aktin (α-SMA) som representerer en markør for fibrino-blastcellene prosessen pågår fibrogenese, dvs. aktivert hepatisk stel celler og portal myofibroblasts,og hepatisk hydroksyprolin, en aminosyre rikelig funnet i kollagen matriser 18 (figur 9). I tillegg er ekspresjonen av vimentin som indikerer økende mengder av myofibroblasts eller fibroblaster økes etter innstilling av BDL kirurgi 20. Den concomitance av betennelse i skadede lever er videre reflektert av økt uttrykk av lipokalin 2 (LCN2) som er sterkt indusert under akutt og kronisk leverskade og utvikler leverbeskyttende effekter under akutt leverskade 21,22.
Inflammatoriske celler som infiltrerer leveren hos dyr som fikk BDL kan påvises ved spesifikk farging med et antistoff som er spesifikt for CD45 (figur 10). Denne celleoverflatemarkør som også er kjent som PTPRC (protein tyrosin fosfatase, reseptor type) er spesielt uttrykt i alle differensierte hematopoetiske celler unntatt erytrocytter og plasmaceller.
| Tid etter gallegang ligation (dager) | Total bilirubin | AST (U / L) | ALT (U / L) | Portal fibrose | Perisinusoidal fibrose | Total poengsum |
| (Mg / dl) | ||||||
| 0 (n = 3) | 0,17 ± 0,06 | 192,67 ± 30.50 | 50.33 ± 6.03 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 |
| 3 (n = 5) | 6,85 ± 2.21 | 1159,25 ± 319,27 | 566,50 ± 335,25 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 |
| 7 (n = 5) | <td> 14.38 ± 2.14 ±976,60 ± 477,16 | 448,20 ± 259,47 | 0,60 ± 0,25 | 0.0 ± 0.0 | 0,60 ± 0,25 | |
| 10 (n = 5) | 15.92 ± 2.60 | 1916,60 ± 868,25 | 560,40 ± 80,88 | 1,40 ± 0,25 | 0,25 ± 0,25 | 1,67 ± 0,25 |
| 14 (n = 5) | 17.90 ± 3.84 | 1088,60 ± 276,32 | 505,00 ± 96,15 ± | 2.4 ± 0.25 | 1.0 ± 0.0 | 3,40 ± 0,24 |
| 20 (n = 4) | 18.00 ± 2.12 | 1072,67 ± 364,27 | 404,00 ± 195,48 | 3.0 ± 0.0 | 1.0 ± 0.0 | 4.0 ± 0.0 |
| 30 (n = 5) | 16.04 ± 4.79 | 446,40 ± 169,75 | 260,20 ± 126,97 | 2.8 ±; 0.2 | 1.4 ± 0.25 | 4.20 ± 0.20 |
| 60 (n = 6) | 16.02 ± 1.19 | 484,67 ± 117,79 | 257,17 ± 50.97 | 3.0 ± 0.0 | 1.8 ± 0.17 | 4,83 ± 0,17 |
Forkortelser som brukes er: ALT, alaninaminotransferase; AST, aspartataminotransferase.
Tabell 1: fibrose scoring i et representativt eksperiment Dataene fra denne tabellen ble gjengitt fra en studie hvor leverfibrose ble indusert av gallegang ligering i C57BL / 6 mus 16.. I denne studien, var dødeligheten etter BDL kirurgi 5% (2 av 40 dyr ble tidlig ofret fordi dårlige dyreforhold utvikles).
Figur 1: Eksperimentell oppsett for å utføre en gallekanal ligering. Dyret blir holdt på en varmeplate ved en temperatur på 37 ° C og det operative området er dekket samlet med væsketette, selvklebende gardiner. Under hele operasjonen, blir dyret permanent forbundet med en anestesi-system. Alle besetninger og løsninger (analgetika, anestetika, antiseptisk løsning, 0,9% NaCl) er ordnet klart.
Figur 2:. Forberedelse av kirurgi området Før åpning av bukhulen, bør magehuden bli barbert med en elektrisk pels barbermaskin og desinfiseres med en antiseptisk gasbind pinne. Operasjonen Området er deretter dekket med væske-ugjennomtrengelig, selvklebende gardiner. Buken åpnes med en midtlinje laparotomi (~ 2 cm i lengde). Hulrommet er forstørret ved å sette inn en holde sutur i sternum og operasjonsområdet spres avsette inn en Colibri retractor tillater uhindret eksperimentering under operasjonen.
Figur 3: Eksponering av gallegang. (A) For å gjennomføre gallegang ligation, er ventral side av leveren løftet slik at den kan holde seg til membranen og lever hilus blir godt synlig. (B) For å bedre utsett gallegang, er tarmen caudally flyttet med en fuktet bomullspinne. Gallegangen er merket med en pil.
Figur 4: ligere gallegang. (A) I et første skritt, er gallegang skilles nøye fra flankerer portvenen og leverpulsåren ved hjelp av en mikro sagtakkete tang. (B) Deretter en sutur plassert rundtgallegangen og sikret med en kirurgisk knute. (C) Deretter blir en andre sutur plassert i umiddelbar nærhet til den første suturen og knyttet rundt gallegang. (D) Suturen blir forkortet, hulrommet skyllet med 0,9% NaCl-oppløsning og alle organer erstattes av deres fysiologisk stilling.
Figur 5:.. Presis representasjon av knuter å dokumentere plassering av sting og innstillingen av de to knop som hindrer galle flyte, ble samme prosedyre skissert i figur 4 dokumentert under en kikkert (A) Confinement av gallegang med først sutur. (B) Knot av den første sutur. (C) Confinement av gallegang med andre sutur. (D) Knot av andre sutur. (E) Dobbelt ligert galle dduktet etter forkorting av overskytende suturer. (E ') Dette panelet viser en skisse av (E). Posisjonene til høyre (rl), venstre (ll) og median (ml) fliker i leveren så vel som gallegang, mage og duodenum har bokstav. I skissen gallegang er dobbel bundet av to sting.
Figur 6:. Anatomy av gallegang, portvenen og leverpulsåren hos mus For bedre anatomisk plassering av felles gallegang, er portvenen og leverpulsåren avbildet som en ordning. Merkede er også posisjonene til høyre (rl), venstre (ll) median (ml) og caudatus (CL) fliker av leveren.
Figur 7: Representant appearance av lever to uker etter humbug drift og BDL. C57BL / 6-mus ble utsatt for imitert operasjon eller BDL kirurgi. Etter to uker visceral hulrom ble åpnet. Mens leveren hos skinn-opererte dyr viste ingen tegn til fibrose, leveren hos dyrene som fikk ligering av gallekanalen hadde en ujevn overflatestruktur med dannelse av ødemer og fibrotiske knuter på overflaten av tilsvarende lever.
Figur 8:. Hematoxylin og eosin flekken Lever snitt ble fremstilt fra C57BL / 6 vill-type dyr som ble skamoperert (A) eller mottatte BDL i tre uker (B). Snittene ble farget med hematoksylin og eosin følgende standardprosedyrer. Vær oppmerksom på de typiske forandringer innenfor BDL leveren som inkluderer tegn på betennelse (infiltrere celler), parenchymal (i levercyte) nekrose, og spredning av galleganger. Målestokken i hver figur panel representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Histologiske og biokjemiske avlesninger for lever fibrogenese. (A) Lever snitt ble fremstilt fra dyr som fikk falske operasjon eller BDL i 2 uker og farget med Sirius rød (øvre panel, kollagenfibrene i rød) eller analysert for ekspresjon av α-glattmuskel-aktin (α-SMA) (nedre panel , α-SMA positive celler i brunt) ved immunhistokjemi. Målestokken i hver figur panel representerer 100 mikrometer. (B) Protein utdrag fra leveren ble utsatt for Western blot og analysert for EXPREssion av kollagen type I, α-SMA, og vimentin som er godt etablert markører for lever fibrogenese. Ekspresjon av lipokalin-2 (LCN2) indikerer den inflammatoriske respons som er forbundet med løpende fibrogenese. I denne analysen ble lik protein lasting demonstrert ved sondering de blotter med et antistoff spesifikt for β-aktin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 10: Immunologisk farging av infiltrering av inflammatoriske celler serieleversnitt ble fremstilt fra en lever av et dyr som mottok gallegang ligering i 3 uker. Snittene ble farget med hematoksylin og eosin (A), eller med et antistoff som er spesifikt for CD45 (B). Vær oppmerksom på,det høye antallet CD45 positive celler som omgir gallegangene. Disse massive infiltrater som indikerer betennelse er ikke synlig i leversnitt avledet fra humbug-opererte dyr (ikke vist). Målestokken i hver figur panel representerer 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Kolestatisk leverskade er en av de viktigste årsaksfaktorer for utvikling av leverfibrose og skrumplever hos pasienter med kronisk leversykdom. Basert på det faktum at disse sykdommene produsere umåtelige helsekostnader, er det forståelig at mange forskere prøver å forstå de sykdomsfremkallende mekanismene for pågående leverfibrose. Derfor har eksperimentelle modeller blitt generert som etterligner ulike sider ved de komplekse mekanismene som fører til leverbetennelse, fibrose og cirrhose en.
Kirurgisk BDL er en av de mest utbredte eksperimentelle modeller som brukes til å indusere obstruktiv cholestatisk skade i mus og rotter 4,23,24. I de fleste av de protokoller, blir dyrene bedøvd, og et midtparti laparotomi utføres. Deretter blir gallegang avdekket fra bukhulen og ligert to ganger ved hjelp av kirurgisk hyssing. Som en konsekvens av mus og rotter som har fått denne operasjonen develop en sterk fibrotisk reaksjon som ved første stammer fra periportal felt 25. I løpet av årene har flere forskjellige kirurgiske teknikker og modifikasjoner er blitt beskrevet. Spesielle prosedyrer med tillate gjeninnkobling eller reanastomosis etter BDL 23. Andre teknikker er basert på partiell BDL resulterer i betydelig mindre nekrose dannelse og følgelig hepatocytt proliferasjon 24. Delvis BDL i kombinasjon med etterfølgende fjerning av galleblæren (cholecystektomi) som hindrer dannelse av kolecystitt representerer også en utmerket eksperimentell modell for akutt cholestase. Det ble foreslått å være en modell som er nærmere den menneskelige situasjonen 24. Og ja, under etableringen av denne modellen, det var allerede vist at det reproduserbart fører kolestase med bare minimal histologisk vevsskade og går ikke videre til kronisk kolestase 25. Derfor ble det foreslått at denne modellen er ideell for å studere late effekter av reversert kolestase 24. Enda mer sofistikerte metoder er basert på mikrokirurgi og tillate en rask og reproduserbar måte å påføre kolestatisk leverskade kun i utvalgte deler av leveren 26.
Selv om disse avanserte modifikasjoner fra den opprinnelige BDL protokollen har vist seg svært nyttig i å undersøke konkrete problemstillinger, mange laboratorier over hele verden i utgangspunktet sikte på å ansette BDL-modellen som en svært reproduserbar og pålitelig modell for kolestatisk leverfibrose. Imidlertid kan mange komplikasjoner oppstå som kan vesentlig endre reproduserbarheten og påliteligheten av resultatene som oppnås ved denne modellen, hvis tekniske unøyaktigheter ikke unngås. For eksempel, blødningskomplikasjoner i forbindelse med skade på blodkar medfølgende gallegangen (se figurene 3-4) kan oppstå ved eller raskt etter operasjonen. Dosering av anestesi med påfølgende cardiodepression eller respiratory svikt er også unødvendige komplikasjoner av prosedyren. Alvorlige infeksjoner, som strekker seg fra peritonitis til sepsis, kan opptre under hele perioden av eksperimentet, hvis suturer ikke er nøyaktig utført og galle lekker inn i bukhulen. Utilsiktede skader i tarmen under operasjonen kan også føre til bukhinnebetennelse. Derfor er det åpenbart at standardiserte protokoller som er i samsvar med strenge retningslinjer for håndtering er sterkt nødvendig. Denne bestemmelsen ble også nylig krevde innenfor landene i Den europeiske union, som implementert nye dyrevelferdsregler i 2013 en. De respektive krav som er knyttet til denne forskriften er ikke ny, og ble allerede foreslått i 1959, da Russell og Burch foreslo en etisk rammeverk for gjennomføring av vitenskapelige eksperimenter med dyr som er i hovedsak basert på en erstatning, raffinement og reduksjon (3R) prinsipp 27.
Ved å følge outlined protokollen er det bare noen få komplikasjoner som kan oppstå fra tekniske unøyaktigheter. Tre spesifikke problemstillinger kan oppstå i ganske lav frekvens.
Som med alle kirurgiske prosedyrer, overdose bedøvelse er en potensiell kilde til fare for dyrene, spesielt i kombinasjon med nedkjøling. Hvis under operasjonen kardiovaskulære komplikasjoner oppstår, bør tilførsel av bedøvelse stoppes umiddelbart, og operatøren skal prøve å gi mye som mulig oksygen til musen. Dette kan gjøres ved hjelp av en liten plastsprøyte som er fylt med luft og pumpes inn i munningen av svekket dyret. Alternativt, er bruken av en liten Peleusball for ventilasjon av det angrepne dyr ofte nyttig for revitalisering prosessen.
Problemer i sårtilheling
Etter BDL kirurgi, kan mus bite sine egne såre sømmer eller de av andre dyr. Hvis dette skjer, bør respektive mus være separatbur. Dyr med åpne sår skal bedøves, regionen rundt såret forsiktig sterilisert med en standard antiseptisk middel, og såret skal sys igjen. I løpet av de neste tre dagene, bør såret av disse dyrene bli jevnlig inspisert (to til tre ganger om dagen).
Distensions av magen eller dannelse av ascites er veiledende for bakterielle infeksjoner. Disse kan oppstå på grunn av ikke-sterile arbeids under operasjonen. Alle slags infeksjoner bør håndteres uten unntak som en human endepunkt og de berørte dyrene skal bli ofret.
Vi følger en enkel å følge protokoll som gjør at ytelsen til BDL i mus som er enkel å implementere og fremkaller dødelighet bare lav dyr kombinert med en høy reproduserbarhet. Alle de kirurgiske protokoller kan raskt pågrepet av dyktige forskere. Under komp eksperimentering, ble dyrene holdt på en varmeplate ved 37 ° C og fast forbundettil en anestesi systemet minimerer smerte og ubehag. For kirurgi, er magen åpnet med en midtlinjen laparotomi og gallegang dobbelt ligert uten å dissekere det. De representative resultater som ble diskutert her vise at de fenotypiske endringer i forhold til lever morfologi (betennelse, fibrose, skrumplever) er svært reproduserbare og la til å studere ulike aspekter av fibrogenese (f.eks., Initiering, betennelse, progresjon, end-stage sykdom) ved definerte tidspunkter.
Vi håper at sammendraget av vår protokoll vil bidra til å redusere læringskurve som er nødvendig for å kunne etablere denne fibrose modellen i andre laboratorier og for å garantere pålitelige og reproduserbare resultater på ulike steder. Dermed tror vi at den presentprotokollen støtter 3R-prinsippet som skulle av Russell og Burch i 1959 og representerer grunnlaget for nye dyrevelferdsreglene som i dag er implementert i mange land witynn det europeiske rammeverket.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke finansiell støtte fra den tyske Research Foundation (SFB / TRR57, Q3 og Q2). Forfatterne takker Mareike Schulz, Pascal Paschenda, og Klaudia Warzecha for deres hjelp i utarbeidelsen av fotografier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Shaver Favorita II | Aeskulap | GT104 | |
| Cutter head | Aeskulap | GT730 | |
| Bepanthen eye and nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Warming plate and controller | Labotect | HP 062 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Scotch Tape | commercially available | ||
| Tissue paper | commercially available | ||
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Raucodrape OR adhesive drapes | Lohmann & Rauscher GmbH | 33013 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| 6-0 Mersilk suture | Ethicon | K889H | Silk, non-absorbable/Abdominal closure |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools Inc. | 17000-03 | |
| Cotton swabs | Noba Verbandmittel | 974202 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1032238 | |
| 25mL beaker | Schott Duran | 50-1150 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Micro-serrations forceps Moria MC31 | Fine Science Tools Inc. | 11370-31 | Bile duct separation |
| 5-0 Mersilene suture | Ethicon | EH6731H | Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation |
| 5mL syringe | BD Discardit II | 300296 | |
| 1mL syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Sterican needle 26 G x 1 | B. Braun | 4657683 | |
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Infrared lamp | Petra Electric | IR 11 |
References
- Liedtke, C., et al. Experimental liver fibrosis research: update on animal models, legal issues and translational aspects. Fibrogenesis Tissue Repair. 6 (1), 19 (2013).
- Aller, M. A., Arias, J. L., García-Domínguez, J., Arias, J. I., Durán, M., Arias, J. Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 6 (2008).
- Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
- Weiler-Normann, C., Herkel, J., Lohse, A. W. Mouse models of liver fibrosis. Z. Gastroenterol. 45 (1), 43-50 (2007).
- Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. J. Pathol. 35 (5), 769-798 (1932).
- Cameron, G. R., Hasan, S. M. Disturbances of structure and function in the liver as the result of biliary obstruction. J. Pathol. 75 (2), 333-349 (1958).
- Accatino, L., Contreras, A., Fernańdez, S., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile flow and bile acid excretion: postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 93 (5), 706-717 (1979).
- Accatino, L., Contreras, A., Berdichevsky, E., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile secretion. Studies on the mechanisms of postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 97 (4), 525-534 (1981).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Tuchweber, B., Desmoulière, A., Bochaton-Piallat, M. L., Rubbia-Brandt, L., Gabbiani, G. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74 (1), 265-278 (1996).
- Desmoulière, A., et al. Extracellular matrix deposition, lysyl oxidase expression, and myofibroblastic differentiation during the initial stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 76 (6), 765-778 (1997).
- Arias, M., et al. Adenoviral expression of a transforming growth factor-β1 antisense mRNA is effective in preventing liver fibrosis in bile-duct ligated rats. BMC Gastroenterol. 3 (29), (2003).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Dominant-negative soluble PDGF-β receptor inhibits hepatic stellate cell activation and attenuates liver fibrosis. Lab. Invest. 84 (6), 766-777 (2004).
- Borkham-Kamphorst, E., Huss, S., Van de Leur, E., Haas, U., Weiskirchen, R. Adenoviral CCN3/NOV gene transfer fails to mitigate liver fibrosis in an experimental bile duct ligation model because of hepatocyte apoptosis. Liver Int. 32 (9), 1342-1353 (2012).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. The anti-fibrotic effects of CCN1/CYR61 in primary portal myofibroblasts are mediated through induction of reactive oxygen species resulting in cellular senescence, apoptosis and attenuated TGF-β signaling. Biochim. Biophys. Acta. 1843 (5), 902-914 (2014).
- Huss, S., et al. Development and evaluation of an open source Delphi-based software for morphometric quantification of liver fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 3 (1), 10 (2010).
- Borkham-Kamphorst, E., Drews, F., Weiskirchen, R. Induction of lipocalin-2 expression in acute and chronic experimental liver injury moderated by pro-inflammatory cytokines interleukin-1β through nuclear factor-κB activation. Liver Int. 31 (5), 656-665 (2011).
- Karlmark, K. R., et al. The fractalkine receptor CX3CR1 protects against liver fibrosis by controlling differentiation and survival of infiltrating hepatic monocytes. Hepatology. 52 (5), 1769-1782 (2010).
- Tarcin, O., et al. Time course of collagen peak in bile duct-ligated rats. BMC Gastroenterol. 11, 45 (2011).
- Takase, S., Leo, M. A., Nouchi, T., Lieber, C. S. Desmin distinguishes cultured fat-storing cells from myofibroblasts, smooth muscle cells and fibroblasts in the rat. J. Hepatol. 6 (3), 267-276 (1988).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Protective effects of lipocalin-2 (LCN2) in acute liver injury suggest a novel function in liver homeostasis. Biochim. Biophys. Acta. 1832 (5), 660-673 (2013).
- Labbus, K., et al. Proteomic profiling in Lipocalin 2 deficient mice under normal and inflammatory conditions. J Proteomics. 78, 188-196 (2013).
- Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J. Surg. Res. 164 (2), 221-227 (2010).
- Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
- Scholten, D., et al. Genetic labeling does not detect epithelial-to-mesenchymal transition of cholangiocytes in liver fibrosis in mice. Gastroenterology. 139 (3), 987-998 (2010).
- Aller, M. A., et al. A half century (1961-2011) of applying microsurgery to experimental liver research. World J Hepatol. 4 (7), 199-208 (2012).
- Russell, W. M. S., Burch, R. The Principles of Humane Experimental Technique. , London, Methuen. (1959).
