Abstract
Exosomes والهياكل صغير الحويصلات التي تلعب دور الوسيط في الاتصالات بين الخلايا. ومن مصلحة لدراسة البضائع الداخلية للexosomes لتحديد ما إذا كانت تحمل مرض المؤشرات الحيوية التمييزية. لأداء تحليل exosomal، فمن الضروري وضع طريقة لاستخراج وتحليل exosomes من biofluids الهدف دون الإضرار المحتوى الداخلي.
الإفراج الكهربائية الناجم عن الميدان والقياس (EFIRM) هي طريقة لاستخراج تحديدا exosomes من biofluids، تفريغ حمولتها، واختبار داخلي المحتوى RNA / البروتين. باستخدام CD63 محددة الأجسام المضادة microparticle المغناطيسي مكافحة الإنسان، وعجلت exosomes أول من biofluids. وتطبق التالية الاستخراج، ذات الجهد المنخفض الموجات مربع دوري الكهربائية (CSW) لتعطيل الغشاء الحويصلي وتسبب تفريغ البضائع. والمهجنة محتوى exosome إلى الاشعال DNA أو الأجسام المضادة يجمد على سطح القطب للغنى عنهntification من المحتويات الجزيئي.
طريقة EFIRM هو مفيد لاستخراج exosomes والبضائع تفريغ للتحليل دون تحلل العازلة. هذا الأسلوب هو قادرة على أداء كشف معين من كل من RNA والبروتين العلامات البيولوجية أهداف في exosome. EFIRM مقتطفات exosomes تستند بشكل خاص على علامات سطحها بدلا من التقنيات المعتمدة على الحجم.
المجهر انتقال الإلكترون (TEM) والفحص تبين وظيفة طريقة لالتقاط exosome والتحليل. تم تطبيق طريقة EFIRM إلى exosomal تحليل 9 الفئران المحقونة مع رئة الإنسان خلايا H640 السرطان (خط الخلية transfected للتعبير عن علامة exosome البشري CD63-GFP) من أجل اختبار الشخصية exosome ضد 11 الفئران تلقي الضوابط المالحة. وعثر على مستويات مرتفعة من المؤشرات الحيوية exosomal (المرجع GAPDH الجينات والبروتينات السطحية علامة البشري CD63-GFP) لH640 حقن الفئران في كل من المصل واللعاب العينات. وعلاوة على ذلك، ساليوقد أثبتت فا وعينات المصل لديك الخطي (R = 0.79). هذه النتائج توحي للبقاء المؤشرات الحيوية exosome اللعابية للكشف عن الأمراض البعيدة.
Introduction
البحث Exosome هو المجال الناشئ من التحقيق الذي يدرس microvesicles الدهون التي تحمل RNA 1، 2 DNA، والبروتين 3 البضائع. وقد أدت التحقيقات السابقة من exosome الأحياء لتحديد exosomes في biofluids مثل الدم 4، 5 البول وحليب الثدي 6، واللعاب 7. وقد أثبتت الدراسات أن exosomes تلعب دورا في مسارات الخلوية المختلفة، التأمل التواصل بين أنظمة مختلفة من الجسم 8 عن بعد. بسبب الدور الذي تلعبه في التواصل بين الخلايا exosomes، والافتراض أنهم قد حزمة أهداف جزيء حيوي (البروتين، RNA، DNA و) المترابطة مع الحالات المرضية. في المختبر 3 والحيوان نموذج تظهر 9 الدراسات لإثبات هذه الفرضية. في التحقيق المحتوى exosomal لاكتشاف العلامات البيولوجية، فمن الضروري وضع منهجية لانتقائية العزلة exosome من biofluids، expulsi يسببهاعلى البضائع من exosomes، وتقدير حجم الجزيئات الحيوية exosome. في نطاق هذا العمل، وسيتم تحديد exosomes كهيكل وجود قطرها حوالي 70-100 نانومتر وتملك سطح علامة CD63.
الباحثون عادة أولا تنقية exosomes بواسطة تنبيذ فائق 10 ثم معالجة المحتوى exosomal من خلال استخدام مجموعات تحلل العازلة. استخدام أساليب تحلل العازلة يتطلب مرات حضانة تتراوح بين دقائق إلى ساعات. هذه العملية قد يحتمل أن تضر البضائع exosome وتؤدي إلى تدهور عينة. على سبيل المثال، اللعاب RNA exosome صدر عن طريق تحلل العازلة في البيئة المحيطة خارج الخلية يمتلك عمر نصف أقل من 1 دقيقة، مما يجعل قياس exosomal RNA بعد تحلل العازلة مهمة صعبة للغاية بدون إضافة الكواشف لتحقيق الاستقرار 11. تأثير مركب مضيفا الكواشف المختلفة للتحلل والاستقرار قد يعرض العوامل التي تعقد وتتداخل مع analyجهاز الأمن والمخابرات من المحتويات exosomal. قد يكون نهجا بديلا مفيدة لتفريغ بسرعة المحتوى exosomal والحفاظ بأمان البضائع لتوصيف.
في هذا العمل، نقترح استخدام حقل كهربائي غير موحدة للإفراج عن المحتوى exosomal. من المعروف أن الحقول الكهربائية لنقل القدرة على استقطاب وتعطيل طبقة ثنائية المادة الدهنية التي تشكل أغشية الخلايا. لدينا العمل التجريبي يستكشف استخدام موجات مربع دوري غير موحدة (CSW) لتعطيل البنية microvesicle من exosomes والإفراج عن البضائع المنقولة. وتستخدم هذه الطريقة الفولتية في عدة مئات من مجموعة الميليفولت، وهذا يعني أن معظم الجزيئات الحيوية لن يعرقلها. علينا أن نبرهن على استخدام موجة دوري مربعا قادر على تحفيز إطلاق سراح اللعابية exosome المحتوى مرنا في البيئة المحيطة الموائعية. تم دمج هذا الإصدار من المحتويات exosomal بسلاسة مع نظام الكهربائي التي يمكن استخدامها لقياس مستويات التعبير العلامات البيولوجية 12،13. وتسمح هذه الطريقة المقترحة لالسريع، حساسة، وتحلل العازلة تحليل خالية من المحتوى exosome.
الشكل 1. نظرة عامة على EFIRM سير العمل. وينقسم طريقة EFIRM على نطاق واسع في المراحل الرئيسية الثلاث التي هي ضرورية لتنقية وتحليل exosomes.
ويستخدم هذا استنادا الإفراج المحتوى exosomal وتحليل طريقة لجنة وضع المرأة بالتعاون مع ميكروبيدات CD63 محددة المغناطيسية لexosome العزلة. هذه الخرز CD63 تقارب تسمح لعزل انتقائية من exosomes من عينات اللعابية (وbiofluids أخرى). وبعد حضانة واستخراج exosomes باستخدام الخرز الممغنطة، يتم ترحيل حبات إلى نظام الاستشعار الكهروكيميائية للجنة وضع المرأة استنادا الإفراج المحتوى وتحليل جزء من التجربة. الشكل 1 لمحة عامة عن عملتدفق طريقة EFIRM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. المغناطيسي Exosome استخراج مقرها الخرزة-
- ماصة حل تمتزج جيدا من 5 ميكرولتر من المجهرية الدقيقة المغناطيسي Streptavidin المغلفة إلى 495 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) عازلة في أنبوب microcentrifuge ل resuspend الخرز. غسل و resuspend حبات مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ثلاث مرات باستخدام رف المغناطيسي. رف هو مجموعة من مغناطيس على جانب وحدة سكنية التي يمكن أن تعقد الأنابيب عينة ميكروسنتريفوج.
- لكل غسل، دعونا أولا الأنابيب الجلوس على الرف لمدة 1 دقيقة، ثم استخدام طرف ماصة لإزالة بعناية المخزن المؤقت طاف دون إزعاج الخرز.
- وضع أنابيب على رف منتظم دون المغناطيس في الجانب. إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنابيب، واستخدام ماصة لخلط الحل والخرز معا. ثم وضع الأنابيب مرة أخرى على رف المغناطيسي لفصل حبات مرة أخرى من الحل.
- تنفيذ هذا إزالة عازلة عن طريق مغنطة وإعادة تعليق في برنامج تلفزيوني لمجموعه ثلاث مرات. هذا ينفذ غسل الأولي من الجسيمات المغناطيسية.
- resuspend والخرز في 490 ميكرولتر من العازلة PBS، مع أنبوب يوضع على الجزء غير ممغنط من رف المغناطيسي. الماصة 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة الماوس المعقدة البيروكسيديز CD63 مكافحة الإنسان في 1.0 ملغ / مل تركيز الأسهم في خليط من الخرز. استخدام ماصة لخلط حبات والأجسام المضادة في الحل.
- وضع أنابيب microcentrifuge مع حبة والمعقدة البيروكسيديز مزيج الأجسام المضادة على محور دوار العينة. تعيين المعلمات المدورة لمحور دوار عينة للتناوب المتبادل في 90 درجة إمالة لمدة 5 ثوانى وتهتز في 5 درجة ل1 ثانية. تدوير أنابيب خليط عينة حبة في هذه المعلمات لمدة 30 دقيقة في RT.
- إزالة الأجسام المضادة غير منضم بعد الاقتران.
- وبعد 30 دقيقة من الدوران في RT، ووضع الأنابيب مرة أخرى في رف المغناطيسي لمدة 5 دقائق.
- تنفيذ ثلاث يغسل من الخرز عن طريق إزالة الطور السائل باستخدام micropipette ويغسل مع 500 μ؛ ل من برنامج تلفزيوني. بعد غسل الثلاثي، resuspend والخرز في 490 ميكرولتر من الكازين-PBS ومكان على الجزء unmagnetized من الرف.
- استخراج Exosome باستخدام الخرز المغلفة الأضداد.
- تسمية كل أنبوب مع استهدافا ID العينة. ماصة عينة 10 ميكرولتر من المصل أو اللعاب في أنبوب microcentrifuge. استخدام ماصة لخلط العينة وحبات مغناطيسية من قبل pipetting عدة مرات.
- وضع أنابيب مع عينة ومكافحة الإنسان الخرز CD63 الأجسام المضادة على محور دوار وتناوب لمدة 2 ساعة على RT. استخدام نفس المعلمات المدورة كما هو موضح في الخطوة 1.2.
- بعد 2 ساعة من عينة الدورية، إجراء غسل الثلاثي التي كتبها جذب لحبات منفصلة عن حل، وإزالة الطور السائل مع ممص مكروى، وإعادة التعليق الخرز في 500 ميكرولتر من العازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك. حبات الناتجة الآن منضمة إلى exosomes ونحن على استعداد لإطلاق سراح مجال كهربائي والقياس.
صدر 2. الكهربائية المستحثة الميداني لالثانية قياس Exosomal المحتوى
- Precoating الأولي الكهربائي مع GADPH التمهيدي
- تطبيق البلاستيك بشكل جيد لمجموعة القطب لمنع انتقال التلوث من الأقطاب الكهربائية الفردية. لهذه التجربة، واستخدام مجموعة الكهربائي 16 أجهزة الاستشعار مع كل قطب كهربائي وحدة في مجموعة تتألف من العمل، ومكافحة، والقطب إشارة مصنوعة من الذهب العارية.
- تحضير خليط الأسهم من 100 نانومتر التحقيق DNA، 0.3 M بوكل، و 10 ملي بيرول من قبل pipetting الكواشف الأسهم في أنبوب مع الماء المقطر عالى النقاء. مزيج دقيق من قبل vortexing.
ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة، التحقيق DNA اختيار يتوافق مع الجين إشارة GAPDH، والذي يعرف في الوجود ضمن exosomes. تسلسل التحقيق المستخدمة هي: 5'-البيوتين-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 ". استخدام هذا الخليط على كل الأقطاب. - الماصة 60 ميكرولتر من الحمض النووي مونومر خليط التحقيق على سطح كل قطب كهربائي الذهب. دراسة الأقطاب لضمان عدم وجود التغطية الكافية للعمل، جounter، وإشارة كهربائية من الخليط السائل.
- Electropolymerize خليط مونومر مسبار لخلق طبقة البوليمر إجراء على سطح القطب من خلال تطبيق دوري موجة مربع (CSW) لمحة الحقل الكهربائي إلى سطح القطب. ويتكون هذا الحقل الكهربائي تطبيق +350 بالسيارات لمدة 9 ثانية والتحول فورا إلى +950 بالسيارات ل1 ثانية. تطبيق هذا دوري مربع الملف الشخصي موجة إلى القطب لمدة 10 دورات، أي ما مجموعه 100 ثانية من الحقل الكهربائي تطبيقها.
- شطف السطح الاستشعار 3 مرات بالماء المقطر والجافة مع غاز النيتروجين لإزالة السائل من سطح القطب. ضمان أن تتم إزالة السائل بشكل صحيح من القطب.
- Exosome البضائع التفريغ
- تحميل 5 ميكرولتر من 1 ميكرومتر من التحقيق للكشف في 495 ميكرولتر من خليط حبة exosome المعقدة واستخدام ماصة لخلط.
ملاحظة: لجنة التحقيق كاشف هو تسلسل الحمض النووي التمهيدي مترافق إلى جزيء فلوريسئين في نهاية 3 '. وغالبا كاشفتسلسل الإلكترونية المستخدمة في هذه الدراسة يتوافق مع مرنا GAPDH وجدت داخل exosomes. تسلسل فلوريسئين كاشف مترافق التحقيق هو: 5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-فلوريسئين-3 ". - ماصة 60 ميكرولتر من التحقيق وحبة exosome خليط معقد على سطح القطب الذهب مع مجموعة المغناطيس تحتها. تتكون هذه المجموعة من ستة عشر المغناطيس 2.54 ملم مغناطيس النيوديميوم قطر الانحياز لتتوافق مع أقطاب العمل من أجهزة الاستشعار. ويوضح الشكل 2A موضع المغناطيس وحل حبة exosome.
- مرة واحدة يتم تحميل العينة على سطح القطب، وتطبيق 20 دورات من الحقل الكهربائي جنة وضع المرأة مع 9 ثانية في -300 بالسيارات و1 ثانية على +200 بالسيارات (200 ثانية المجموع). سوف البضائع exosomal التي يتم تحريرها هجن لالاشعال على سطح القطب. إذا علامات سطح exosome هي موضوع التحقيق، وتخطي هذا الجزء من التجربة. الشكل يوضح 2B هذه العملية. <لى> غسل قبالة التحاليل غير منضم على سطح القطب من ثلاثة أضعاف الشطف سطح القطب مع الماء المقطر. تجفيف الكهربائي مع غاز النيتروجين.
- تحميل 5 ميكرولتر من 1 ميكرومتر من التحقيق للكشف في 495 ميكرولتر من خليط حبة exosome المعقدة واستخدام ماصة لخلط.
- إضافة 60 ميكرولتر من 150 وحدة / مل الأضداد المضادة للفلوريسئين مترافق إلى البيروكسيديز الفجل (HRP في 1: 1،000 التخفيف) المخفف في الكازين / برنامج تلفزيوني.
- استخدام اقتران مدفوعة الكهربائية ميدانية لمجمع HRP المضادة للفلوريسئين إلى شطيرة التحقيق. تطبيق -200 بالسيارات ل1 ثانية و+500 بالسيارات ل1 ثانية لمدة 5 دورات لسطح القطب. ويبين الشكل 2A القبض والتحقيق للكشف عن المجمعات لكل من بروتين ونظام الحمض النووي.
- الثلاثي سطح استشعار غسل استخدام الماء المقطر والجافة مع غاز النيتروجين.
- بعد غسل حالا من غير منضم الزائد الأضداد المضادة للفلوريسئين، إضافة 60 ميكرولتر من 3،3 '، 5،5'-Tetramethylbenzidine (TMB) الركيزة. تحميل هذا الركيزة على كل سطح مستشعر باستخدام الماصة الأقنية.
- أداء قراءات amperometric للتيار عن طريق قياس التيار الكهربائي في -200 بالسيارات لمدة 60 ثانية باستخدام potentiostat الكهروكيميائية قادرة على قياس وقت واحد من 16 قنوات الشكل 2C مثال على التعريف الحالي خلال قراءات.
الشكل 2. مكونات EFIRM الطريقة. (A) طريقة استخراج exosomes من سائل حيوي باستخدام CD63 مكافحة الإنسان المغلفة المجهرية الدقيقة المغناطيسية ومن ثم تفريغ البضائع exosome باستخدام موجات مربع دوري تطبيقها على مجمع الجسيمات exosome. (ب) مخطط الكهربائي جهاز الاستشعار البيولوجي المستخدمة للكشف عن أهداف RNA / DNA / البروتين من exosome الافراج عنهم. (C) مثال ممثل قراءات amperometric من منهجية EFIRM حيث الحجم الحالي أكبر يتوافق رس مستويات أعلى من جزيء حيوي. هذا الرقم هو من وي وآخرون 14 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التحقق من Exosome القبض على الخرز عن طريق TEM
تم التحقق من صحة عزل exosomes من اللعاب باستخدام CD63 حبات مغناطيسية مكافحة الإنسان التالية بروتوكول استخراج باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) الصور. TEM معارض حبات مغناطيسية مع 70-100 حبيبات نانومتر المجاورة مباشرة (انظر الشكل 3A، و3B)، بما يتفق مع خصائص المعروفة من exosomes. لم يلاحظ أي 70-100 حبيبات نانومتر لحبات مغناطيسية في اللعاب الذي لم يكن لديهم أجسام مضادة CD63 مكافحة الإنسان مترافق لهم سابقا (انظر الشكل 3C و 3D).
الشكل 3. الصور TEM من microparticle المغناطيسي. (A) صورة CD63 النانوية المغناطيسية المضادة للالإنسان مع حبيبات صغيرة من 70-100 نانومتر المجاورة. (B) Enlaعرض rged من جسيمات متناهية الصغر المغناطيسية وحبيبات ملاحظتها. (C) صورة من حبات مغناطيسية مع عدم وجود الأجسام المضادة مترافق. (D) عرض تضخيم حبات مغناطيسية مع عدم وجود الأجسام المضادة مترافق. هذا الرقم هو من وي وآخرون 14 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
دراسة الإفراج عن Exosomal المحتوى عن طريق لجنة وضع المرأة المجال الكهربائي
الصور TEM من الخرز CD63 مكافحة الإنسان تظهر حبيبات 70-100 نانومتر المجاورة لحبات مغناطيسية (انظر الشكل 3A). وبعد القبض على exosomes باستخدام حبات مغناطيسية، تتم معالجة العينات مع طريقتين مختلفتين في نفس الوقت. وكان أول الطرق المستخدمة تريتون-X 100 المنظفات لليز exosomes وكان الأسلوب الثاني موجة مربع دوري (CSW) الكهربائية الميدان العازلة تحلل طريقة مجانا مناقشتها في هذا العمل (تفاصيل تريتون-X 100 طريقة عالبريد صفها وي ه ر آل 14). وقد تم تحليل هذه المجمعات exosome حبة معالجتها بواسطة TEM وكميا الجين إشارة مرنا باستخدام طريقة الكهروكيميائية وصفها في هذا العمل. كان هذا الجين المرجعية المستخدمة في هذه الدراسة GAPDH، التي هي موجودة في معظم exosomes.
تظهر الصور TEM أنه في كلتا العينات المعالجة تريتون-X 100 والحقل الكهربائي جنة وضع المرأة، وكان هناك غياب لافت للهياكل exosome انضمت إلى حبات مغناطيسية بعد كل من لجنة وضع المرأة وتريتون-X 100 طرق العلاج (انظر الشكل 4B الثاني و الشكل 4B-IV). قياس مستويات GAPDH التعبير في كل من عينات تعامل تريتون-X 100 والحقل الكهربائي جنة وضع المرأة تمتلك صورة مماثلة: وهي أنه في أعقاب بروتوكولات الناشر مختلفة، كان هناك انخفاض في مستويات GAPDH قياس مع تقدم الوقت، مما يشير إلى تعرض exosomal مرنا للبيئة extravesicular من لعاب (انظر الشكل 4C).
<ص الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما">
الشكل 4. نتائج تتعلق دائرى ساحة الموجة Exosome البضائع الإصدار. (A) رسم تخطيطي لجنة وضع المرأة الكهربائية طريقة الافراج عنهم. (B) صور TEM من exosomes: (ط) وقبل الإفراج جنة وضع المرأة، (ب) بعد طريقة لجنة وضع المرأة، (ج) قبل طريقة تحلل العازلة، (د) بعد طريقة تحلل العازلة. خلفية الصور TEM هي دعم لاسي. (C) الكمي لexosome مستويات GAPDH مرنا عند تطبيق تحلل العازلة وCSW الحقل الكهربائي. هذا الرقم هو من وي وآخرون 14 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
دراسة أداء EFIRM للكشف عن البروتينات السطحية ومرنا آوى
تقييم EFIRM والمقارنة وقد أجريت ريسون للأساليب التقليدية. تم مقارنة EFIRM لتقدير حجم البروتين باستخدام طخة غربية (لالبشري CD63-GFP، علامة السطح لexosomes) وQPCR لتقدير حجم RNA (باستخدام GAPDH كهدف مرنا). لأن الإنسان CDP63-GFP كان على سطح exosome، لم يطبق لجنة وضع المرأة لتفريغ البضائع exosome. وأظهرت نتائج البروتين والحمض النووي الريبي الاختبارات على التوالي في 5A الشكل و5B.
وأجريت الاختبارات خصوصية أيضا لEFIRM عن طريق خلط exosomes الإنسان مع exosomes من عينات الماوس. هذه الاختبارات خصوصية شملت مخاليط نسبة مختلفة من الماوس لعينات الإنسان. نتائج التجارب تثبت أنه عندما كان المحتوى الماوس exosomal خمس مرات أكبر من المحتوى الإنساني، والبروتينات exosomal الإنسان ومرنا لا يزال من الممكن تحديدها كميا و(انظر الشكل 5C و5D للبروتين وRNA، على التوالي).
س: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 5. EFIRM تقييم الأداء لمرنا ومستويات البروتين باستخدام عينات المخففة من exosomes. (A) مقارنة EFIRM وصمة عار الغربية على GFP شاردة. (B) مقارنة EFIRM وQPCR لGAPDH مرنا. (C) النسبية مستويات الإشارات GFP الكشف عن exosomes الإنسان مخففة في كميات مختلفة من الماوس exosome. (D) إشارة الكشف عن النسبية لGAPDH مرنا لexosomes الإنسان مخففة في كميات مختلفة من الماوس exosome. هذا الرقم هو من وي وآخرون 14 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
المحتوى Exosomal كميا من ماوس اللعاب
من أجل تحديد صلاحية الكشف عن إكسوالمحتوى somal في عينات اللعابية، تم استخدام نموذج الفأر عارية. تلقى هذا نموذج الفأر عارية حقنة الجنبة من 1 × 10 6 خلايا سرطان الرئة الإنسان H460 (خط الخلية التي تم transfected أيضا للتعبير عن علامة exosome البشري CD63-GFP) أو المالحة. كان هناك 11 الفئران التي تلقت سيطرة سلبية من 100 ميكرولتر من المياه المالحة، وحصل على 9 الفئران حقن الخلايا. وبعد 20 يوما، تم جمع عينات مصل الدم واللعاب من المجموعتين من الفئران.
استخدام طريقة EFIRM يسمح الكمي من المستويات النسبية للالبشري البروتين CD63-GFP في مصل الفئران واللعاب. مقارنة بين المستويات النسبية بين المصل اثنين وعاب الفئران أظهرت علاقة خطية بين biofluids اثنين (R = 0.79). بالإضافة إلى ذلك، لوحظ اختلاف كبير في مستويات CD63-GFP الإنسان لH460 حقن الفئران ضد المالحة حقن الفئران. هذا يشير إلى أن exosomes من الخلايا السرطانية البعيدة يتم الاتجار كثافة العملياتس الأوعية الدموية واللعاب. وأظهرت نتائج المقارنة بين المصل واللعاب في الشكل (6).
الرقم 6. تقييم EFIRM من المستويات النسبية للالبشري CD63-GFP في مصل الدم واللعاب. دراسات مقارنة بين المستويات النسبية للبشرية CDP63-GFP من الفئران حقنها بخلايا سرطان الرئة الإنسان. توجد الخطي بين المصل واللعاب عينات لالبشري CD63-GFP. ورفع مستويات البشري CD63-GFP في الفئران حقنها بخلايا (مقارنة المالحة الفئران المحقونة). هذا الرقم هو من وي وآخرون (14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما تشير النتائج، CD63 مكافحة الإنسان المغلفة الجسيمات النانوية المغناطيسية هي قادرة على التقاط تحديدا الجسيمات الصغيرة التي لديها حجم تتراوح 70-100 نانومتر. هذه الجسيمات القبض يتسق مع الملف الشخصى لوحظ سابقا من exosomes. وعلاوة على ذلك، يظهر الاستخدام للجنة وضع المرأة ذات الجهد المنخفض في أعقاب أسر الجسيمات لإزالتها من على سطح حبة وتسبب ملامح تدهور DNA مماثلة لتلك التي من الطريقة التقليدية القائمة على تحلل العازلة للإفراج البضائع. وتشير هذه البيانات إلى أن سير العمل للإفراج عنهم البضائع exosomal يمكن تبسيط من خلال تطبيق موجة مربعة دوري لتعطيل الغشاء exosome الدهون. يسمح هذا طريقة مبسطة لإطلاق سراح البضائع السريع دون الحاجة إلى الناشر المخازن المؤقتة التي قد تؤثر سلبا على البضائع exosome، ونتيجة لذلك يظهر طريقة EFIRM أن تكون طريقة الأفضل للدراسات المحتوى exosomal بالمقارنة مع الطرق التقليدية في تنبيذ فائق واستخدام تحللالمخازن المؤقتة. والحساسية، والنوعية، وسهولة طريقة EFIRM يجعلها مثالية لاستخراج exosomes من سائل حيوي وسريع اختبار المحتوى الداخلي لكل من الأحماض النووية والأهداف البروتين.
تم تطبيق منهجية EFIRM لدراسة نموذج الفأر عارية التي تم حقن مع H460 خلية سرطان الرئة الإنسان. خلايا سرطان الرئة الإنسان H460 و transfected بالإضافة إلى ذلك مع الإنسان CD63-GFP بحيث علامات سطح exosome CD63 سيكون له خاصية الفلورسنت. بعد فترة من 20 يوما، تم جمع عينات من مصل الفأر وعينات من اللعاب، وكان يستخدم منهجية EFIRM لتحليل المحتوى exosomal بهم. وأظهرت هذه الدراسة الارتباط الخطي بين المصل واللعاب عينات (R = 0.79). الآثار المترتبة على هذه النتائج هي ذات شقين: أولا، القدرة على التقاط exosomes من biofluids تشير إلى أن الخلايا السرطانية البعيدة هي قادرة على نقل exosomes إلى قطاعات أخرى من الجسم، وعلى الأخص في هذه الدراسة تجويف الفم. Second، الخطي لوحظ بين عينات مصل الدم واللعاب تشير إلى أن اللعاب يمكن أن تكون ذات مصداقية سائل حيوي للقبض على exosomes التي يتم إنتاجها في حالة المريضة من الجسم (أي السرطان) وتحليل محتواها الجزيئي.
ووصف الطريقة وتظهر النتائج اللاحقة أن طريقة مناسبة لاستخراج exosomes من biofluids على أساس علامات سطحها (في نطاق هذا العمل، CD 63 هو علامة السطح مختارة). للمشاريع المستقبلية، فمن الجدارة لدراسة ما إذا كان استهداف إضافية علامات سطح exosomes (مثل CD 9) أو الجمع بين طريقة EFIRM مع تقنيات أخرى من شأنها تحسين استخراج واختبار المحتوى exosome.
Exosome البيولوجيا هو مجال واعد الدراسة للطب متعدية، وتشير بيانات الدراسة التالية أن تحليل اللعاب exosomal يمكن أن يكون مكانا للتعرف على المرض المؤشرات الحيوية التمييزية. التحقيق في المستقبليبدو مناسبا في تحديد ما إذا كانت المؤشرات الحيوية المرض البعيدة يمكن استخدامها لتشخيص غير الغازية. EFIRM كوسيلة من وسائل قد تساعد في تمهيد الطريق لمزيد من التحليل الفعال لهذه الأهداف ضمن exosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ديفيد وونج هو المؤسس المشارك لRNAmeTRIX المحدودة، وهي شركة التشخيص الجزيئي. PeriRx LLC sublicensed الملكية الفكرية المتعلقة التشخيص الجزيئي من RNAmeTRIX. ديفيد وونج هو مستشار لPeriRx.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المركز الوطني للبحوث الموارد والمركز الوطني للنهوض بالحركة العلوم والمعاهد الوطنية للصحة، من خلال منحة UL1TR000124 (لFW)؛ فيليكس وميلدريد ييب هبوا الأستاذية وصندوق العائلة بارنز (لDTWW)، والمعهد الوطني طب الأسنان والجمجمة البحوث في المعاهد الوطنية للصحة تحت بجائزة عدد T90DE022734 (لMT). المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16x Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3 M KCl Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
References
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer. Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Lau, C. S., Wong, D. T. W. Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In. Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037 (2012).
- Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).
- Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling. Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).
- Lässer, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9 (2011).
- Palanisamy, V., et al. Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes. PLoS ONE. 5 (1), e8577 (2010).
- Camussi, G., et al. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lau, C., et al. Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development. The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids. Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).
- Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. Characterization of RNA in Saliva. Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).
- Wei, F., et al. Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis. Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).
- Wei, F., et al. Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection. Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).
- Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM). Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).
